DETERMINAÇÃO DE PROLINA

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DISCIPLINA: FISIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO VEGETAL – 2014
Aula Prática: Estresse em Plantas
Plantas de feijão e milho, com 14 dias de idade, foram divididas em dois grupos, sendo que
um permaneceu sob irrigação diária (controle) durante sete dias, enquanto que o outro sofreu
deficiência hídrica pelo mesmo período. Cada grupo irá determinar as concentrações de prolina nas
folhas das duas espécies, separadamente, comparando-se as plantas do grupo controle com as do
tratamento de déficit hídrico. A hipótese de trabalho é a de que o estresse induza um aumento na
concentração de prolina em comparação com o grupo controle.
DETERMINAÇÃO DE PROLINA ( Bates et al. 1973. Plant and Soil 39: 205-207, modificado)
Obtenção do extrato bruto
- macerar 400 mg (0,4g) de folha em 10 mL de ácido sulfosalicílico a 3%;
- centrifugar por 5min.
Reação
- em tubo de ensaio contendo 2 mL do sobrenadante, adicionar 2 mL de ninidrina ácida* e 2 mL de
ácido acético glacial. Manter em banho-maria fervente por 1h. Resfriar em banho de gelo.
* 1,25 g de ninidrina em 30 mL de ácido acético glacial e 20 mL de ácido fosfórico 6M (404,58 mL
de H3PO4 85% em 1L de água), com agitação até a dissolução. Estocar o reagente a 4C por até 24h.
Leitura: ler a absorbância a 520 nm, colocando-se os dados no Quadro abaixo. Como “branco” usar
um tubo com 2 mL de ácido sulfosalicílico 3% + 2 mL de ninidrina ácida + 2 mL de ácido acético.
Absorbância (A520)
milho
feijão
g prolina/grama de folha
milho
feijão
controle
estresse
Curva padrão ilustrativa (com a respectiva equação da reta):
Passos:
a) determinar a concentração de prolina (g/2mL) (C) correspondente à A520 observada, usando-se a
equação da reta da curva padrão. C = (A520+a)/b, onde ‘a’ e ‘b’ são parâmetros da equação da reta.
b) determinar a concentração de prolina no extrato bruto. Fazer uma regra de três: se temos n g de
prolina em 2mL de extrato (C), em 10 mL de extrato bruto teremos x g.
c) determinar a concentração de prolina por grama de folha. Nova regra de três: se em 0,4g de tecido
havia x g de prolina (item b), em 1g teremos y microgramas.