universidade federal..

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LISTAS DE ABREVIAÇÕES
APC
CÉLULA APRESENTADORA DE ANTÍGENOS
IFN-γ
INTERFERON
IL-2
INTERLEUCINA-2
IL-12
INTERLEUCINA-12
LTH
LINFÓCITOS T AUXILIAR
LT-CD4+ LINFÓCITOS T ESPECÍFICOS PELA CLASSE II DO MHC
LT-CD8+ LINFÓCITOS T ESPECÍFICOS PELA CLASSE I DO MHC
LT-CTL LINFÓCITOS T CITOLÍTICOS
MHC
COMPLEXO DE HISTOCOMPATIBILIDADE PRINCIPAL
MPO
MIELOPEROXIDASE
NAG
N-ACETILGLICOSAMINIDASE
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RESUMO
Neste trabalho procuramos verificar a viabilidade do modelo de implante subcutâneo
de discos de esponjas de poliéster-poliuretana
como suporte para células alogênicas
visando o desenvolvimento de um método para estudos de rejeição de transplantes. Para
tanto, discos de esponjas foram implantados em uma linhagem doadora (C57BL/6) e
transplantados para animais de uma linhagem diferente ou receptora (BALB/c).
Constatamos que o 21º dia é o período de implantação com maior colonização celular, bem
como observamos que a reposta inflamatória nos receptores é diferente entre discos
singênicos e alogênicos, sendo que nos últimos a inflamação é semelhante ao fenômeno de
rejeição. Assim, o implante dos discos mostrou-se útil na obtenção de células alogênicas e
na geração de reação inflamatória característica de rejeição.
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1-INTRODUÇÃO:
Transplante consiste em retirar células, tecidos ou órgãos de um indivíduo e colocálos em outro indivíduo, constituindo então um enxerto. Quando este é realizado entre
organismos sem parentesco, por exemplo, entre duas linhagens distintas de camundongos
(aloenxerto), ele é rejeitado pelo receptor em sete a dez dias. Este processo é caracterizado
por uma reação inflamatória do tipo corpo estranho e foi denominado de rejeição primária
ao enxerto (ABBAS et al., 2000).
A rejeição primária é causada por respostas imunes (celular e humoral) a aloantígenos
no enxerto, que são proteínas que variam entre indivíduos, sendo, portanto, percebidas
como não-próprias pelo receptor.
A resposta celular é, em geral, mais importante do que a resposta humoral para a
rejeição de órgãos transplantados, envolvendo o recrutamento de diferentes tipos celulares
dentro de uma ordem temporal, espacial e causal definida.
Os principais alvos moleculares na rejeição dos transplantes são as formas alélicas
não-próprias (alogênicas) das moléculas do MHC classe I e II em complexo com peptídeos
próprios. Muitos clones de diferentes linfócitos T específicos para diferentes tipos de
peptídeos estranhos acrescidos de moléculas próprias do MHC têm reação cruzada com
toda a molécula alogênica. Esta alta freqüência de reconhecimento das moléculas
alogênicas do MHC que são apresentadas ás células T diretamente, isto é, sem
processamento, e em associação com moléculas próprias do MHC, explica o modo pelo
qual a resposta alogênica é tão mais forte do que a resposta aos antígenos estranhos
convencionais (SHERMAN, 1992).
Assim, descrevemos dois mecanismos de alorreconhecimento, sendo que no primeiro
ocorre a apresentação das moléculas alogênicas do MHC às células T sem a exigência de
processamento do antígeno, fenômeno designado de apresentação direta do aloantígeno,
que pode envolver o alorreconhecimento por linfócitos T CD4+ como pelos CD8+. No
segundo mecanismo ocorre o processamento das moléculas alogênicas do MHC dentro de
APCs e apresentação como não-próprias convencionais, fenômeno denominado de
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apresentação indireta do aloantígeno, e envolve alorreconhecimento somente pelas células
T CD4+, porque o aloantígeno é adquirido primariamente pelas APCs do receptor através
da via vesicular endossômica resultando na apresentação pelas moléculas da classe II do
MHC. (ABBAS, 2000).
Em geral, as moléculas alogênicas MHC classe I estimulam os linfócitos citolíticos
CD8+ alorreativos, que lisam diretamente as células parenquimatosas dos enxertos,
enquanto as moléculas da classe II estimulam os linfócitos auxiliares CD4+ alorreativos,
que podem recrutar e ativar macrófagos que fagocitam o enxerto (ABBAS et al., 2000).
Quando os tecidos transplantados são reconhecidos pelas células T CD4+ e CD8+,
em geral, resultam reações vigorosas de rejeição do aloenxerto. Transplantes que ocorrem
entre animais de uma mesma linhagem (isogênicos) ou singênicos não produzem este tipo
de resposta inflamatória.
Podemos entender porque a rejeição é o evento principal que determina o destino de
um órgão ou tecido transplantado; e definir novos modelos para o estudo deste fenômeno é
fundamental para o entendimento desta rede imunológica complexa.
Modelos que envolvem transplantes de pele em coelhos e entre linhagens de
camundongos, permitem entender diversos mecanismos da rejeição de aloenxertos
(ROSENBERG et al., 1992), no entanto não são procedimentos simples.
No presente estudo procuramos utilizar uma variação do MODELO DE
IMPLANTAÇÃO SUBCUTÂNEA DE ESPONJAS de poliéster para o estudo de rejeição,
promovendo o transplante de tecidos entre duas linhagens diferentes de camundongos
(C57BL/6 – linhagem doadora, e BALB/c –linhagem receptora). Ao longo do tempo, este
modelo provou ser eficiente para estudo de tecido de granulação (EDWARDS et al.,
DAVIDSON et al., 1985), de imunização (GONTIJO, et al.1998) e de angiogênese
(ANDRADE et al.,1987; FAJARDO et al., 1988; FERREIRA,1990) demonstrando ser uma
técnica simples e objetiva.
O modelo de implantação subcutânea de matrizes esponjosas em animais foi descrito
inicialmente por GRINDLAY & WAUGH (1951) e posteriormente modificado por
ANDRADE et al., em 1987. O modelo original desenvolvido por ANDRADE et al., 1987,
é denominado MODELO DA ESPONJA EM RATO (“IN VIVO RAT SPONGE MODEL”)
e se baseia no implante subcutâneo interescapular de discos de esponjas de poliéster
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estéreis com uma cânula adaptada para avaliações subseqüentes do fluxo sanguíneo nos
implantes, à medida que estes se tornam vascularizados.
A vantagem deste método está na possibilidade de se avaliar com eficiência o
processo de neovascularização além daqueles envolvidos no fenômeno inflamatório
instalado na matriz esponjosa, por um período prolongado, num mesmo animal
(MAHADEVAN et al., 1989).
Uma variação do método descrito por ANDRADE et al., 1987, e semelhante ao
MODELO DO SISTEMA DO DISCO EM ANGIOGÊNESE (“DISC ANGIOGENESIS
SYSTEM-DAS”) consiste na implantação subcutânea de discos de esponjas de poliéster
estéreis sem cânula (FAJARDO et al., 1988). Assim, após intervalos de tempo
determinados, os discos de esponja são removidos, fixados e analisados através de técnicas
histológicas.As vantagens deste segundo modelo estão relacionadas à fácil obtenção e baixo
custo do material; à simplicidade da técnica; e à possibilidade de se implantar várias
esponjas num mesmo animal. Suas limitações são a necessidade de se retirar o disco para
avaliação e a impossibilidade de se acompanhar a neovascularização e o processo
inflamatório num só animal durante todo o experimento.
O disco de esponja implantado desencadeia no organismo uma reação inflamatória do
tipo corpo estranho semelhante ao modelo de ANDRADE et al., 1987. Observa-se invasão
progressiva no local do implante por exsudato inflamatório caracterizado por células
mononucleares e polimorfonucleares, além da indução de tecido de granulação rico em
novos vasos sanguíneos (FAJARDO et al., 1988).
No estudo do processo inflamatório, este modelo permite a coleta e a análise
bioquímica de fluidos, o efeito de drogas sobre o processo, além de estudos histológicos e
morfométricos (BAILEY, 1988; JAN et al., 1997).
Assim, a escolha deste modelo para o estudo proposto reside principalmente no fato
de se obter um conjunto celular heterogêneo, expondo o animal receptor a um conjunto de
aloantígenos semelhante ao verificado em transplantes executados pela prática médica,
candidatando-se como um novo modelo experimental para o estudo de rejeição de
transplantes.
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2- OBJETIVOS
2-1 Objetivos Gerais:
Verificar se discos de esponja poliéster-poliuretana implantados no dorso de animais
poderiam servir como matriz de crescimento celular e consequentemente se comportar
como um falso-órgão no que tange à composição, volume e organização tecidual.
Verificar a resposta inflamatória dirigida sobre o disco de esponja previamente
implantado em camundongos isogênicos e posteriormente transplantados em receptores
alogênicos; e se ela se assemelha ao padrão esperado no fenômeno de rejeição.
2.2- Objetivos específicos:
Avaliar o tempo ideal para o implante dos discos esponjosos na linhagem doadora,
assim como definir os intervalos de tempo pós-transplante para a remoção dos discos nos
animais receptores.
Comparar as variações do peso úmido dos discos de poliéster-poliuretana pósimplante, nas linhagens doadoras, e dos discos pós-transplante nos intervalos de tempo, na
linhagem receptora.
Avaliar macroscopicamente o aspecto dos discos no momento da dissecação cirúrgica
dos mesmos nos animais doadores e receptores.
Avaliar o perfil dos cortes histológicos dos discos de esponjas pós-implante e
naqueles pós-transplante, caracterizando o processo inflamatório induzido pelo implante
subcutâneo das matrizes esponjosas.
Investigar o perfil temporal da colononização celular nos discos pós-implante e póstransplante a partir da contagem do número médio de células por campo nestes cortes
através de uma análise morfométrica.
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Investigar o padrão de infiltração inflamatória através de dosagens das atividades
enzimáticas da MIELOPEROXIDASE (MPO), e N-ACETILGLICOSAMINIDASE (NAG)
nos discos de esponjas pós-transplantes nos intervalos de tempo: 13º ao 21º dia.
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3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1- Animais:
Nestes experimentos utilizamos camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6 e
BALB/c, fêmeas com 8 a 10 semanas de vida e pesando aproximadamente 20 gramas,
provenientes do Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências Biológicas –
UFMG.
3.2-Tratamento dos discos esponjosos:
Esponjas de resina de poliéster-poliuretana foram cortadas em discos de 11mm de
diâmetro por 2mm de espessura, tratados em solução de etanol a 70% por 1 hora e a seguir
fervidos em água destilada por 30 minutos. As esponjas foram secadas sob condições
estéreis e imersas em solução salina também estéril.
Os discos foram centrifugados (1000rpm, 5min.) para assegurar que toda a sua
superfície interna estivesse em contato com a solução.
3.3-Implantes:
:
Camundongos da linhagem C57BL/6 receberam implantes discos de poliésterpoliuretana que foram removidos cirurgicamente após intervalos de tempo variados Para a
realização dos implantes, estes animais da linhagem C57BL/6 foram anestesiados. A
solução usada para tal fim foi feita adicionando-se 0,2 mL de Ketalar ® (sedativo,
analgésico e relaxante muscular), 0,2mL de Rompum ® (anestésico) e 2,0 mL de uma
solução salina. Cada camundongo foi injetado com 0,2 mL desta solução i.p.
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Os animais anestesiados foram submetidos a tricotomia na região dorsal e, após uma
assepsia local com álcool a 70%, em capela de fluxo laminar, foi feita uma incisão mediana
dorsal entre as espinhas ilíacas com divulsão do tecido subcutâneo em direção cranial. Um
disco de esponja foi cuidadosamente introduzido e acomodado na região interescapular de
cada animal, e sobre ele foi injetado 0,30mL de solução salina estéril. A incisão foi
suturada com fio de sutura (categute) usando ponto duplo, seguindo-se de aplicação local
de spray anti-séptico (Johnson & Johnson – São Paulo) Após recuperação da anestesia os
animais eram colocados em gaiolas com água e ração.
3.4- Transplantes:
No 21º dia após implante, os discos de esponja foram removidos da linhagem
C57BL/6 e transplantados em animais da linhagem receptora BALB/c.
Os animais C57BL/6 foram sacrificados através de inalação de éter (Labsynth) e
deslocamento cervical. Os implantes foram removidos e rapidamente pesados. Em seguida
cada implante foi transferido para um animal da linhagem receptora BALB/c, que foram
submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico descrito anteriormente para realização do
implante.
3.5- Colheita dos discos esponjosos:
Do grupo receptor BALB/c foram colhidos os discos de esponja em diferentes
intervalos de tempo: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21 dias após o transplante. Os animais
foram sacrificados por inalação de éter e deslocamento cervical.
Após a incisão, os discos transplantados eram avaliados macroscopicamente em
relação a presença de cápsula conjuntiva, fluido e necrose. Em seguida foram dissecados,
removidos, preparados para as dosagens bioquímicas, histológicas e morfométricas.
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3.6- Análise do peso úmido:
Os discos de esponjas implantados e transplantados dos grupos controle e
experimental foram pesados sobre papel alumínio em uma balança digital no momento em
que foram removidos dos animais doadores e receptores.
3.7- Análise histológica e morfométrica dos discos pós-implante e pós-transplante:
3.7.1- Análise histológica
Os discos de esponjas provenientes dos implantes (doador-C57BL6) e dos
transplantes (receptor-BALB/c) reservadas para a técnica histológica foram imediatamente
fixadas em solução de formol 10%, pH 7,4 durante 24 horas e colocadas em álcool 70% até
o processamento histológico que incluía desidratação, diafanização, banhos de parafina e
inclusão em bloco de parafina.
Após esse procedimento foi feita microtomia dos blocos com cortes de 7 μm e
coloração com hematoxilina –eosina (H.E.).
Cada lâmina continha três cortes de discos implantados ou transplantados de um
mesmo intervalo de tampo. Foram confeccionadas 3 lâminas, num total de 9 animais por
intervalos de tempo pós-implante e pós-transplante.
Os cortes dos discos examinados ao microscópio óptico foram avaliados
qualitativamente observando-se as seguintes características: presença de linfócitos,
neutrófilos, células gigantes, fibroblasto, tecido conjutivo, vasos sanguíneos, adipócitos e
regiões de necrose.
3.7.1- Análise morfométrica:
As lâminas coradas na histologia foram examinadas por um analisador de imagens
(ZEISS-KS300) acoplado a um microscópio (ZEISS) com câmara digital.
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O software analisou as imagens capturadas e selecionou a partir de uma plataforma
algorítmica, denominada MACRO, os núcleos corados por campo na lâmina.
A MACRO é o controle de leitura e pode ser ajustada segundo a intenção da análise.
No presente estudo uma MACRO específica foi desenvolvida para contar os núcleos por
campo nas lâminas coradas.
As lâminas analisadas foram os cortes histológicos dos discos de esponjas do doadorC57BL/6 e receptor-BALB/c e os dados obtidos descreveram o total de células para cada
condição experimental.
3.8- Análises bioquímicas da atividade das enzimas:
Para as análises bioquímicas, os discos removidos foram pesados em papel alumínio
e cortados ao meio com um bisturi. Os dois fragmentos foram separados e congelados em
tubos (Falcon) de 15mL com 2,0mL de solução filtrada PBS 1X para as análises da
presença das enzimas mieloperoxidase (GRUPO 1) e n-acetilglicosaminidase (GRUPO 2).
3.8.1- MIELOPEROXIDASE (MPO):
As amostras dos discos transplantados removidos dos animais BALB/c, GRUPO 1,
foram homogeneizadas (Powergen – Fisher Scientific) em tubos (Falcon) de 15mL. Em
seguida, elas foram transferidas para microtubos (Eppendorf) de 1,5mL contendo 2,0mL de
tampão fosfato, pH 4,7 e centrifugadas a 10000g durante 15 minutos a 4ºC.
O sobrenadante foi desprezado e o precipitado remanescente ressuspendido em
2,0mL de HTAB (brometo de hexadeciltrimetilamonio) (Sigma) 0,5% diluído em tampão
fosfato, pH 5,4.
Após homogeneização (Vortex) por aproximadamente 30 segundos, segui-se à
transferência de 1mL de cada amostra para microtubos (Eppendorf) de 1,5mL, os quais
sofreram processo de congelamento/descongelamento (3 vezes) em nitrogênio
líquido.
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As suspensões foram, então, centrifugadas a 10000g por 15minutos a 4ºC e o
sobrenadante foi coletado para posterior utilização no ensaio enzimático.
A seguir, adicionou-se 25,0μL das amostras a uma placa de 96 poços. Às amostras,
adicionou-se 25,0μL do substrato TMB (3,3’, 5,5’ –tetrametilbenzina) (Sigma) diluído em
DMSO (Dimetil sulfóxido) (Merck) e procedeu-se à incubação da placa a 37ºC por 5
minutos. Após esse período, foram adicionados 100,0μL de peróxido de hidrogênio 0,003%
à cada poço. A placa foi novamente incubada a 37ºC por 5 minutos e areação foi
interrompida através da adição de 100,0μL de H2SO4, 4M. A absorbância foi medida por
espectrofotometria em comprimento de onda de 450nm.
A quantidade de neutrófilos contidos nas amostras foi estimada a partir de uma curvapadrão que relaciona linearmente a atividade enzimática (MPO) medida pela absorbância e
a concentração de neutrófilos. Esta foi elaborada após a determinação da atividade de
MPO por neutrófilos isolados da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c
previamente estimulados com caseína 5%. Os resultados foram expressos em número
relativo de neutrófilos por miligrama de peso úmido de esponja (neutrófilo / mg peso
úmido do disco transplantado).
3.8.2- N-ACETILGLICOSAMINIDASE (NAG):
As amostras transplantados removidos dos animais BALB/c, GRUPO 2, foram
homogeneizadas (Powergen – Fisher Scientific) em tubos (Falcon) de 15mL. Em seguida,
elas foram transferidas para microtubos (Eppendorf) de 1,5mL contendo 2,0mL de
solução salina 0,9% / Triton x-100 (Promega) 0,1% v/v. Em seguida, as amostras foram
transferidas para microtubos (Eppendorf) de 1,5mL e centrifugadas a 3000g durante 10
minutos a 4ºC. O sobrenadante foi então coletado.
A seguir, adicionou-se 100,0μL das amostras diluídas em tampão
citrato/fosfato, pH 4,5 a uma placa de 96 poços. Às amostras, adicionou-se 100,0μL
do substrato p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glicosaminida (Sigma) diluído em tampão
citrato-fosfato, pH 4,5, e procedeu-se à incubação da placa a 37ºC por 10 minutos.
Após este período, a reação foi interrompida através da adição de 100,0μL de
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tampão glicina, 0,2M, pH 10,6. A absorbância foi medida por espectrofotometria em
comprimento de onda de 400nm.
A quantidade de macrófagos presentes nas amostras foi estimada a partir de
uma curva-padrão que relaciona linearmente a atividade enzimática (NAG) medida
pela absorbância e a concentração de macrófagos. Esta foi elaborada após
a
determinação da atividade de NAG por macrófagos isolados da cavidade peritoneal
de camundongos BALB/c previamente estimulados com tioglucolato 3%. Os resultados
foram expressos em número relativo de macrófagos por miligrama de peso úmido de
amostra (macrófago / mg peso úmido do disco transplantado).
3.9- Análise estatística:
Em todos os experimentos os resultados foram analisados através do teste T de
Student, considerando-se significativas as diferenças onde p > 0,05.
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média de cada grupo
de animais.
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4- RESULTADOS
4.1- Peso úmido dos discos pós-implante e pós-transplante.
Os discos pós-implante dos animais doadores foram pesados no momento em que
eram removidos dos animais doadores a fim de se comparar o ganho de massa a partir do
peso seco da matriz esponjosa nos intervalos de implantação: 12; 15; 21 e 30 dias. As
media do peso úmido dos discos foram apresentadas na Tabela 1.
Estes dados demonstraram que houve um aumento de peso úmido nos discos do
grupo experimental e controle durante o período de implantação. No entanto percebemos
que este acréscimo de peso não foi contínuo, sendo que no 30º dia pós-implantação houve
ligeira perda de massa dos discos.
O ganho de peso foi máximo no intervalo de 21 dias pós-implante em ambos os
grupos.
Estes dados foram cruzados com a análise histológica dos discos nestes intervalos a
fim de obter um intervalo ideal de implantação.
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TABELA 1: PESO ÚMIDO (mg) DOS DISCOS DE ESPONJAS DOADORES
ANTES DO TRANSPLANTE.
GRUPO
DISCOS DE ESPONJAS SECOS
TEMPO PÓS-IMPLANTE
PESO ÚMIDO
(DIAS)
(g)
0
0,007± 0,03 (7)
12
0,09± 0,07 (9)
15
0,11± 0,05 (9)
21
0,26 ± 0,02 (7)
30
0,16 ± 0,03 (7)
12
0.10 ± 0,04 (7)
15
0,11 ± 0,09(5)
21
0,24 ± 0,07 (6)
30
0,14 ± 0,09 (7)
ANTES DOS IMPLANTES.
DOADOR C57BL6
(Experimental)
DOADOR BALB/c
(Controle)
Legenda:
Valores representam média ± erro padrão da média
O número de animais usados em cada experiência está indicado entre parênteses.
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A Figura 1 apresenta a variação do peso úmido dos discos de esponjas
transplantados, colhidos dos animais receptores-BALB/c dos grupos experimental e
controle nos intervalos de tempo: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21 dias pós-transplante.
O grupo experimental consistiu de animais que receberam implantes provenientes de
linhagem diferente, discos doadores-C57BL/6, enquanto o grupo controle consistiu de
animais que receberam discos doadores da mesma linhagem, isto é, BALB/c.
Os dados descreveram um aumento do peso úmido dos discos transplantados ao
longo do tempo, sendo que podemos observar um pico de crescimento no peso úmido no 7º
dia pós-transplante, no grupo experimental, e um pico no 9º dia pós-transplante, no grupo
controle.
Um segundo pico foi identificado no 13º dia pós-transplante no grupo experimental,
no entanto este ponto não apareceu no grupo controle, pois a partir do 13º dia verificamos
uma queda neste parâmetro que passa a oscilar dentro de uma cinética constante até o 21º
dia.
Podemos verificar que o aumento do peso úmido é ligeiramente maior no grupo
experimental quando comparado ao grupo controle
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FIGURA1: PESO ÚMIDO (mg) DOS DISCOS DE ESPONJAS TRANSPLANTADOS,
DISSECADOS DE BALB/c EM INTERVALOS DIFERENTES DE TEMPO.
Peso úmido dos discos transplantados
700
Peso úmido (mg)
600
500
400
300
200
grupo experimental
100
grupo controle
0
1
3
5
7
9
11
13
15
19
21
Dias pós-transplante
Legenda:
Os pontos representam a média de peso úmido para cada intervalo de tempo póstransplante. O número de animais por ponto foi de 5 animais. O ponto 1° dia descreve o
peso úmido dos discos no momento em que estes foram removidos dos animais doadores e
transplantados para os receptores, neste ponto o número de animais foi maior.
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4.2.- Observação macroscópica
4.2.1.-Implantes:
Os discos de esponjas implantados nos animais doadores (C57BL/6 -grupo
experimental e BALB/c – grupo controle) nos intervalos de tempo: 12, 15, 21 e 31 foram
dissecados e avaliados macroscopicamente quanto à aderência na tela subcutânea dos
animais, presença de cápsula e colonização celular (aspecto da matriz esponjosa após o
implante).
Os discos dissecados após 12 e 15 de implante não apresentavam cápsula apesar de
estarem razoavelmente aderidos à tela subcutânea.
Os discos de esponjas dissecados após 21 dias pós-implante apresentavam-se
firmemente aderidas ao tecido subcutâneo da região dorsal do doador, no entanto muitos
discos foram dissecados aderidos a região ventral .
Uma cápsula de tecido extremamente delgado preenchido com edema de coloração
incolor-amarelada envolvia os discos.
Quando os discos eram retirados verificou-se uma extensa rede de vasos na região de
aderência na tela subcutânea. Havia nitidamente a ligação de tecidos do doador com os
discos o que dificultava a remoção dos mesmos.
Identificou-se também a presença de gordura parda aderida à face ventral dos discos.
Os discos dissecados no 30º dia apresentavam características macroscópicas
semelhantes aos dissecados no 21º dia diferindo apenas na aderência à tela subcutânea, que
naqueles era maior
4.2.2.- Transplantes:
Após 3 dias de transplante não se constatou a presença de cápsula, estando os discos
do grupo controle e experimental pouco aderidos às faces ventral ou dorsal da região
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subcutânea. Em muitos discos transplantados, em que se verificou certa aderência,
observou-se a presença de edema de coloração amarelada.
Após 5 dias de transplante os discos do grupo controle e experimental encontravamse aderidos e envolvidos por uma cápsula de tecido translúcido e delgado com edema de
coloração amarelada.
Após 7 dias os disco dos dois grupos adquiriram uma coloração amarelada
homogênea. A cápsula se manteve e o edema adquiriu maior viscosidade.
Nos dias seguintes até o 15º dia não houve mudanças visíveis da coloração, no
entanto a partir deste dia observou-se marcante redução do volume dos discos dissecados.
Apesar destes estarem cada vez mais aderidos à tela subcutânea, o edema diminuiu em
quantidade e viscosidade em ambos os grupos.
Após 19º e 21º dias de transplante os discos estavam aderidos firmemente ao tecido
subcutâneo com a presença de gordura parda. A redução de volume dos discos é clara.
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4.3.- Histologia:
4.3.2.- Implantes:
Os dados da histologia foram obtidos a partir da observação das lâminas dos discos
de implante nos intervalos de 12; 15; 21 e 30 dias do grupo experimental e controle.
Os discos de implante em todos os intervalos apresentaram-se invadidos por tecido
conjuntivo frouxo, e este adquiriu maiores amplitudes nos intervalos 21º e 30º dias. Nestes
discos, observaram-se vasos irrigando todo o disco, principalmente na sua periferia, onde a
proliferação de tecido conjuntivo frouxo foi maior.
Nos discos com 30 dias pós-implante a concentração de substância fundamental
amorfa foi elevada, além disto os discos possuíam baixa celularidade quando comparados
aos discos com 21 dias de implantação (Figura 2). Estes apresentavam infiltrado
inflamatório (macrófagos, neutrófilo e poucos linfócitos) concentrado na periferia dos
discos e em torno das trabéculas de esponja.
Células gigantes estavam sempre próximas às trabéculas esponjosas dos discos em
todos os intervalos. Fibroblastos eram mais abundantes no centro dos discos dos intervalos
21º e 30º dias. Regiões de necrose eram pequenas e ausentes nos intervalos 12º e 15º.
Não foi observada diferença quanto aos tipos celulares e seu número nos discos de
doadores C57BL/6 e BALB/c colhidos no mesmo intervalo de tempo.
4.3.2.- Transplante:
Os resultados da histologia indicaram que os discos transplantados dos grupos
experimental e controle apresentavam os mesmos tipos celulares predominantes.
A Tabela 2 resume as observações da histologia descrevendo a freqüência qualitativa
dos tipos celulares nos intervalos de tempo pós-transplante. A partir destes dados, podemos
verificar uma flutuação de tipos celulares específicos ao longo do tempo de transplantação.
29
Os neutrófilos surgiram inicialmente a partir do 5º dia atingindo no grupo
experimental uma concentração máxima no 7º dia (Figura 4), se distribuindo extensamente
na periferia dos discos.
Os macrófagos surgiram a partir do 9º dia e seu pico ocorreu por volta do 11º dia.
Os linfócitos foram observados em maior número no 13º dia nas lâminas do grupo
experimental (Figura 6), localizados na periferia dos discos. Estes estavam pouco
freqüentes nos cortes dos discos do grupo controle
Identificamos algumas áreas de necrose principalmente no centro dos discos nos
intervalos 3º ao 21º dias de pós-transplante. Não foram distinguidos vasos sanguíneos
nestas regiões desde então.
Células gigantes se localizavam em volta das trabéculas esponjosas na região central.
Elas se multiplicaram por volta do 13º dia estando preferencialmente agregadas à matriz
esponjosa.
No 17º ao 21° dias observou-se uma mobilização de macrófagos para a região central
do disco. Os neutrófilos permaneceram freqüentes na periferia.
Os fibroblastos foram mais tardios estando mais freqüentes a partir do 15º e
predominando nos intervalos 19º e 21º dias nos discos do grupo controle. Estas células
estão envolvidas com a fase proliferativa característica de processos de reparo e
regeneração de tecidos lesionados.
30
TABELA 2: AVALIAÇÃO QUALITATIVA DAS FREQUÊNCIAS DOS TIPOS
CELULARES OBSERVADOS NOS DISCOS TRANSPLANTADOS EM
DIFERENTES INTERVALOS DE TEMPO.
Neutrófilos
D
Exp
Cont
3
++
+
5
+++
7
Macrófagos
Exp
Linfócitos
Fibroblastos
Cont
Exp
Cont
Exp
Cont
+
+
-
-
+
+
++
++
++
+
-
+
+
++++
++++
+++
++
++
+
+
+
9
+++
+++
++++
+++
++
+
+
+
11
+++
+++
+++
+++
+++
++
++
+
13
++
++
+++
+++
++++
+
++
++
15
++
++
++
++
++
+
++
+++
19
+
+
+++
++
+
-
+++
++++
21
+
++
+
+
-
-
+++
++++
Legenda:
A letra D se refere ao dia pós-transplante em dias.
Os dados das freqüências foram confeccionados a partir de 3 lâminas por intervalo póstransplante, num total de 9 animais.
Exp identifica o grupo experimental. Cont identifica o grupo controle. (-) nenhum; (+)
presente; (++) freqüente; (+++) bastante freqüente; (++++) predomina.
31
FIGURA 2: VISÃO MICROSCÓPICA DO DISCO PÓS- IMPLANTE:
Legenda:
Disco de esponja de poliéster implantado em C57BL/6 e retirado após 21 dias.
Coloração: H. E. Aumento: 10x 40x
FIGURA 3: VISÃO MICROSCÓPICA DO DISCO PÓS –TRANSPLANTE:
Legenda:
Disco de esponja de poliéster pós-trransplante após 7 dias- grupo controle.
Coloração: H.E. Aumento: 10x 40x
32
FIGURA 4: VISÃO MICROSCÓPICA DO DISCO PÓS –TRANSPLANTE
Legenda:
Disco de esponja de poliéster pós-transplante após 7 dias- grupo experimental.
Coloração: H.E. Aumento: 10x 40x
FIGURA 5: VISÃO MICROSCÓPICA DO DISCO PÓS –TRANSPLANTE
Legenda:
Disco de esponja de poliéster pós-transplante após 13 dias- grupo controle
Coloração: H.E.
33
FIGURA 6: VISÃO MICROSCÓPICA DO DISCO PÓS –TRANSPLANTE
Legenda:
Disco de esponja de poliéster pós-transplante após 13 dias- grupo experimental.
Coloração: H.E. Aumento: 10x 40x
34
4.3.3- Análise morfométrica:
As análises morfométricas realizadas a partir da lâminas da histologia descreveram
um crescimento celular em ambos os grupos, controle e experimental, no intervalo de
tempo do transplante, porém esta técnica não permite identificar e quantificar um tipo
celular individualmente.
O software (KS300- ZEISS) gera uma grandeza numérica a partir da análise das
imagens digitalizadas capturadas das lâminas, que é o total de núcleos por campo, mas não
consegue diferenciar entre duas células diferentes (Figura 7). No entanto a contagem de
núcleos totais por campo através do analisador gerou dados mais objetivos quanto à
colonização dos discos de esponja transplantados.
A Figura 8 descreve os resultados da contagem dos núcleos totais por campo de
lâminas nos intervalos de tempo pós-transplantes. Nesta percebemos um aumento
expressivo da celularidade nos cortes dos discos no 7º e 13º dias pós-transplante (grupo
experimental) e nos cortes dos discos no 9º dia pós-transplante (grupo controle. Estes
resultados foram bastante semelhantes aos dados obtidos com o peso dos discos póstransplantes apresentados anteriormente.
No 21º dia pós-transplante, nos cortes dos discos do grupo controle, percebemos um
pico de celularidade que não cruza com os resultados do peso úmido para o mesmo período.
FIGURA 7: ÁREA DE TRABALHO DO SOFTWARE KS300-ZEISS:
35
FIGURA 8: RESULTADO QUANTITATIVO DO NÚMERO MÉDIO DE
CÉLULAS
POR CAMPO NOS DISCOS OBTIDO ATRAVÉS DOANALISADOR
DIGITAL DE IMAGENS.
Número médio de núcleos por campo
450
Número de núcleos
400
350
300
250
200
150
grupo experimental
100
grupo controle
50
0
1
3
5
7
9
11
13
15
19
21
Dias pós-transplantes
Legenda:
Os pontos na Figura 8 indicam a média da contagem dos núcleos totais por campo para
cada intervalo de tempo pós-transplante.
Para cada ponto foram capturadas 24 imagens por lâmina. Foram analisadas 3 lâminas
para cada intervalo de tempo, perfazendo um total de 9 animais para cada ponto.
36
4.4- Análise das enzimas NAG E MPO:
O resultado destas análises confirmou a presença de neutrófilos (atividade da MPO)
e macrófagos (atividade da NAG) nos discos transplantados.
Estes tipos celulares desempenham papel importante na rejeição uma vez que
promovem a remoção de tecidos estranhos e participam da atração e ativação de outras
células para o sítio de inflamação, assim podemos verificar que atividade positiva destas
enzimas confirma a presença destes tipos celulares nos discos dos grupos controle e
experimental.
Os testes foram realizados nos discos transplantados removidos nos intervalos de
tempo 13, 15, 15, 17, 19 e 21 dias e os dados preliminares indicaram que o grupo
experimental apresentou maior quantidade destas células por mg de peso úmido quando
comparado ao grupo controle.
37
FIGURA 9 : TOTAL DE NEUTRÓFILOS POR PESO ÚMIDO DOS DISCOS PÓS
TRANSPLANTES
Neutrófilos (x1000)/ peso úmido
do tansplante (mg)
Total de Neutrófilos
160
140
120
100
80
60
40
20
0
13
15
17
19
21
grupo controle
grupo experimental
Dias pós-transplante
Legenda:
Os resultados representam a média de cada grupo de animais (n=3).
FIGURA 10 : TOTAL DE MACRÓFAGOS POR PESO ÚMIDO DOS DISCOS PÓS
TRANSPLANTES:
Macrófagos (x1000)/ peso
úmido do discos pós
transplante
Total de Macrófagos
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
13
15
17
19
Dias pós-transplante
21
grupo controle
grupo experimental
Legenda:
Os resultados representam a média de cada grupo de animais (n=3).
38
5.-DISCUSSÃO:
A rejeição é uma reação inflamatória dirigida a um tecido ou órgão não-próprio
(alogênicos) desencadeada, principalmente, pela ativação de células T via moléculas de
MHC alogênicas classe I e classe II. A ativação destas células causa a destruição do enxerto
e as terapias de inibição da rejeição envolvem o bloqueio da IL-2, principal citocina
responsável pela progressão dos linfócitos T da fase G1 para a fase S do ciclo celular.
O desenvolvimento de um modelo experimental para o estudo da rejeição de órgãos
e tecidos é fundamental para as pesquisas de novas tecnologias de transplantes e de
tratamento para os transplantados. Uma vez que esta metodologia é consideravelmente mais
complexa em animais de laboratório, torna-se necessário buscar alternativas simples, porém
objetivas para se entender este intricado mecanismo imunológico.
Um modelo eficiente seria aquele que expusesse o animal receptor a uma carga
contínua de aloantígenos de um animal doador, nas condições de espaço e tempo que
simulem a prática médica.
O modelo de implantação de discos de esponjas de poliéster-poliuretano na região
subcutânea no dorso de animais tem se mostrado eficiente no estudo de tecido de
granulação, angiogênese (ANDRADE et al., 1987) e imunização ( LIMA, 1998). O fato de
desencadear no organismo receptor uma reação inflamatória do tipo corpo estranho que
promove uma intensa colononização celular, observada na matriz esponjosa, despertou
nosso interesse em utilizar este método em estudos de rejeição de transplantes.
Para isto era nosso objetivo verificar se os discos de esponja de poliéster-poliuretana
implantados eram colonizados pelas células da linhagem doadora. Interessava descobrir
qual era a amplitude desta colonização e o tempo necessário para se obter o máximo de
células
Observamos através dos resultados do peso úmido (Figura 1), bem como das análises
histológicas (Figura 2) e morfométricas (Figura 8) que os discos pós-implantados
(controle e experimental) apresentavam uma composição celular variada com extensa
colonização. Esta foi maior nos discos com 21 dias de implantação, o que nos levou a fixar
39
este intervalo como o tempo limite ou ideal de implantação e data do transplante para os
animais receptores.
Quando analisamos os resultados do peso úmido dos discos pós-transplantados
verificamos que eles são muito semelhantes aos produzidos pelas análises histológicas e
morfométricas. Estes resultados descrevem um aumento celular no 7º dia pós-transplante
(grupo experimental) e no 9º dia (grupo controle) que pode ser atribuído principalmente à
migração de neutrófilos para os discos transplantados (Figuras 3 e 4).
Quando ocorre o transplante dos discos para os animais receptores, a vascularização
dos discos pós-implante é rompida o que promove a morte celular, localizada
principalmente, no centro dos discos. O fenômeno de necrose derivado desta condição ativa
uma variedade de mecanismos humorais e celulares. O organismo interpreta estes sinais
bioquímicos gerando uma resposta inflamatória.
Esta primeira reação inflamatória local é semelhante à observada em lesões teciduais
e, segundo ROBBINS (1996) caracteriza-se, inicialmente, por vasoconstrição arteriolar
transitória, seguida por vasodilatação e por aumento da permeabilidade dos capilares,
resultando em aumento do fluxo sanguíneo local (hiperemia) e na exsudação de líquido rico
em proteínas (edema). Segue-se, então, migração direcional e seletiva de leucócitos do
sangue periférico para o sítio lesado (diapedese).
Nos estágios iniciais do processo, neutrófilos são particularmente prevalentes no sítio
da lesão e são responsáveis pela resposta fagocítica rápida e não específica e pela ação
potencialmente destrutiva de seus conteúdos granulares.
No presente estudo observamos um certo atraso e menor amplitude da resposta
neutrofílica do grupo controle em relação ao experimental. Neste caso os mediadores
liberados pelo tecido necrosado não sustentam esta diferença, uma vez que os discos dos
dois grupos foram submetidos aos mesmos procedimentos no momento do transplante e
transferidos para um receptor idêntico (BALB/c), sujeitos aos mesmos fenômenos
biológicos causados pela perda de vascularização. Assim, esta diferença pode está agregada
à natureza do enxerto, ou melhor, dos aloantígenos, presentes na matriz esponjosa do grupo
experimental.
Os macrófagos apareceram nos discos por volta do 9º dia nos discos pós-transplante
experimental e por volta do 11º dia nos discos do grupo controle. Na resposta inflamatória,
40
eles surgem no sítio alvo em um segundo momento, uma vez que derivam da maturação de
monócitos, que atravessaram os vasos da tela subcutânea seguindo os estímulos
quimiotáticos de mediadores inflamatórios e neutrófilos.
Os macrófagos produzem moléculas inflamatórias responsáveis pela amplificação do
processo, atraindo, por sua vez, mais neutrófilos, através de quimiocinas (ROLLINS, 1997)
e estimulando a ativação e diferenciação de linfócitos T a partir da liberação de IL-12 ou
funcionando como células apresentadoras de antígenos (APC). Nesse estágio, os
macrófagos exercem importante atividade fagocítica, estando envolvidos na destruição
celular e na remoção de restos celulares e teciduais (DAVIDSON, 1985).
Os linfócitos, segundo a histologia, foram abundantes nos discos transplantados do
grupo experimental no 13º dia ( Figura 6). Os resultados do peso úmido (Figura 1) e da
morfometria (Figura 8) também indicam um pico no 13ºdia nos discos transplantados do
grupo experimental, assim podemos inferir que este pico no peso úmido e no número de
núcleos seja atribuído à migração de células T ativadas para as matrizes esponjosas, uma
vez que os neutrófilos e macrófagos estavam com suas freqüências reduzidas neste
intervalo (tabela 2).
Novamente, não podemos afirmar que esta migração no grupo experimental foi
determinada exclusivamente por mediadores inflamatórios, provenientes da necrose ou
liberados pelos neutrófilos e macrófagos, ou da própria quimiotaxia e ativação (IL-12)
promovida por estas células que surgiram no sítio primeiro. A IL-12, produzida por
macrófagos potencializa as funções citolíticas das células T CD8+, além de induzir os
linfócitos a secretarem IFN-γ, potente ativador de fagócitos mononucleares e neutrófilos
Segundo MASON (1986), linfócitos do organismo receptor atravessam os vasos
sanguíneos (diapedese), no sítio alvo: discos transplantados, atraídos pela inflamação e
ação de quimiocinas liberadas, principalmente, por neutrófilos e macrófagos, presentes na
matriz tecidual. Quando alcançam o foco quimiotático que, no presente estudo, são os
discos transplantados são expostos a várias moléculas, próprias (grupo controle) e nãopróprias ou alogênicas (grupo experimental).
Moléculas singênicos processadas e apresentadas pelas APC, via MHC classe I e
classe II, aos linfócitos T presentes no sítio de transplantação dos discos do grupo controle,
não são capazes de promover a ativação eficiente destas células (SHERMAN, 1992).
41
Segundo KRENSKY (1990), as moléculas alogênicas, especialmente as do MHC,
classe I e classe II, processadas e apresentadas pelas APCs, ativam as células T CD4+ e
CD8+, que uma vez ativadas liberam IL-2 que induz a ativação e o crescimento de outros
linfócitos, atuando também nas mesmas células que a produziram, fator de crescimento
autócrino, promovendo uma resposta proliferativa ( expansão clonal), que gera suficientes
células específicas ao antígeno alogênico. Esta citocina estimula ainda a síntese de outras
citocinas derivadas das células T, tais como linfotoxina e o IFN-γ.
O IFN- γ é um ativador das células endoteliais vasculares, promovendo a adesão dos
linfócitos T CD4+ e as alterações morfológicas que facilitam o extravasamento dos
linfócitos (diapedese). Assim, esta rede de eventos promove a entrada de um número maior
de células T no sito alvo. Além disto, o IFN- γ produzido pelas células T ativadas promove
a expressão de mais moléculas de MHC classe II e co-estimuladora nos macrófagos
ampliando a resposta.
A quantidade de IL-2 sintetizada pelas células T CD4+ ativadas é um importante
determinante da magnitude das respostas imunes dependentes das células T, como é o caso
da rejeição de transplantes (COHEN, 1996).
No grupo controle observou-se maior quantidade de fibroblastos e tecido conectivo a
partir do 19º ao 21º dia que, segundo DAVIDSON, (1992) estão envolvidos em processos
fibroproliferativos típicos de reparo e regeneração de tecidos lesados.
O perfil enzimático (Figuras 9 e 10) confirmou a presença das enzimas NAG e
MPO, indicando a presença de macrófagos e neutrófilos nos discos, sendo que, nos
aloenxertos, o número destas células foi maior.
Segundo ROLLINS, (1997) os linfócitos T ativados liberam quimiocinas da
subfamília C-C e linfotoxina, potentes estimuladoras da motilidade e quimiotaxia de
monócitos e neutrófilos respectivamente. Assim as células T promovem reações
inflamatórias ricas em neutrófilos e macrófagos, semelhantes ao fenômeno de rejeição.
A diferença entre as médias dos grupos pode ser atribuídas a maior participação de
linfócitos T ativados no processo de ativação e direcionamento daquelas células para o sítio
inflamatório nos transplantes alogênicos, porém estudos complementares serão conduzidos
para determinar melhor o perfil destas enzimas ao longo dos dias de transplantes.
42
6.- CONCLUSÃO:
Nossos experimentos comprovaram que o modelo de implantação de discos de
esponjas de poliéster-poliuretana pode, semelhante ao observado por ANDRADE (1992),
funcionar como matriz de colonização celular alogênica, sendo útil como método de estudo
de rejeição.
Definimos que o melhor tempo de implantação nos animais doadores é de 21 dias,
assim como conseguimos caracterizar, através dos experimentos propostos, a resposta
inflamatória nos dois grupos. Estas respostas apresentavam uma dinâmica celular diferente,
estando os neutrófilos, macrófagos e, principalmente, linfócitos mais abundantes nos discos
pós-transplantes ou alogênicos, de acordo com o descrito por MASON, (1986)
A resposta inflamatória observada nos transplantes do grupo controle ou singênico
assemelhou-se àquelas típicas de lesão tecidual, onde o esforço celular conjunto está
empregado para o reparo funcional ou regeneração do tecido lesado, substituindo as células
parenquimatosas do enxerto por tecido conjuntivo ( DAVIDSON, 1992)
A inflamação verificada no grupo experimental foi mais intensa e dirigida para a
eliminação do agente agressor (aloenxerto). Segundo KRENSKY, (1990) este padrão está
intimamente associado à atuação dos linfócitos T do receptor, ativados a partir de
interações estabelecidas principalmente com as moléculas alogênicas do MHC pelas vias
direta e indireta de apresentação de aloantígenos.
A partir das análises, observamos um padrão de resposta inflamatória nos discos
transplantados do grupo experimental bastante semelhante àquele esperado nos fenômenos
de rejeição de transplantes descritos por ROSENBERG (1992). Este comportamento mostra
os potenciais deste modelo em simular in vivo a rejeição de transplantes.
Esperamos realizar novos testes para caracterizar melhor a participação de cada tipo
celular neste modelo de estudo e iniciar outros experimentos para elucidar melhor este
processo inflamatório chamado rejeição.
.
43
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
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