- Ministério do Meio Ambiente

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Instituto de Ciências Biomédicas
Departamento de Microbiologia
Laboratório de Vírus Entéricos Humanos e Animais
Av. Prof. Lineu Prestes 1374, 2o andar, sala 235
CEP 05508-900 São Paulo – SP
Fone: (0xx11) 3091-7341 Fax: (0xx11) 3091-7354
São Paulo, 04 de abril de 2005.
Ilma. Sra.
Dominique Alouette
DD. Coordenadora do GT Lodo - CONAMA/MMA
Prezada Senhora
Tem esta por finalidade encaminhar alguns documentos que visam justificar e/ou
suplementar as discussões sobre Patógenos no lodo de esgoto, especialmente vírus,
na próxima reunião do GT Lodo de Esgoto, sob sua coordenação. Lamentavelmente não
estaremos presentes nesta reunião, uma vez que estamos em pleno semestre letivo na
Universidade.
Assim sendo, gostaria de apresentar algumas considerações sobre o assunto e sobre a
documentação que segue em anexo:
1. As classes de lodo versus parâmetros:
Lodo classe A – manutenção dos parâmetros já definidos em reuniões anteriores para vírus.
Lodo classe B – manutenção dos parâmetros de redução de ovos de helmintos, que
possivelmente implicarão também na redução do número de partículas virais. A liberação total
destes dois parâmetros poderá vir a agravar ainda mais a já precária saúde da população (ver
justificativa em anexo);
2. A metodologia para vírus
Apresentamos em anexo a proposta contendo os tipos de vírus que consideramos
bons indicadores, além de serem agentes de extrema importância em saúde
pública no país (vide justificativa em anexo) e que requerem metodologias mais
simplificadas para detecção em amostras ambientais, viabilizando a implantação
de um sistema de controle de qualidade do lodo produzido no país. Esta
simplificação da metodologia já está em fase de avaliação no Laboratório de Vírus
Entéricos Humanos e Animais (ICB/USP) e estará disponibilizada rapidamente. A
sua relevância é destacada em parecer emitido por Assessor da Fapesp, em anexo.
Aspectos virológicos a serem considerados na aplicação de lodo de ETE
para fins agrícolas
Dra. Dolores U. Mehnert
ICB/USP
Sob ponto de vista econômico, a aplicação de lodo na Agricultura é positiva
devido à presença de nutrientes como Nitrogênio, Fósforo e Potássio, bem como de
micronutrientes (Zn, Cu, Mn, Mo). Além disso, a matéria orgânica auxiliaria na melhora da
estrutura do solo, aumentando a capacidade de retenção de água e na aeração do
mesmo (BITTON, 1997c). No Brasil, diversos estudos têm enfatizado o lado positivo
desta opção (ANDREOLI et al., 1999; VALIM et al., 1999; ANDREOLI et al., 2000;
COSTA et al.,2001; SILVA, 2001).
Entretanto, a aplicação do lodo proveniente das ETEs, sem tratamento preliminar
adequado, representa um risco à Saúde Pública, pois pode levar à contaminação de
águas subterrâneas, solos e grãos com patógenos, metais pesados, nitrato e compostos
orgânicos
tóxicos
e
carcinogênicos
(SCHWARTZBROD
&
MATHIEU,
1986;
SCHWARTZBROD, 1995; BITTON, 1997d).
Os lodos provenientes de ETEs possuem, comprovadamente, inúmeros
microrganismos patogênicos, cuja variedade dependerá das condições socioeconômicas
e epidemiológicas das diferentes comunidades (RÉNDON et al., 2002). RÉNDON et al.
(2002) realizaram uma avaliação microbiológica em lodo no México e detectaram
colifagos, coliformes fecais, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, cistos de
protozoários e ovos de helmintos em números bastante superiores aos níveis relatados
na bibliografia internacional.
A exposição dos seres humanos e animais aos patógenos presentes no lodo pode
ser por contato direto, ao manipular ou caminhar na área com lodo, ou indireto, através
da ingestão de grãos cultivados nessas áreas ou de produtos de animais que pastam em
pastos tratados com lodo (BITTON, 1997d).
Dentre os patógenos presentes no lodo, destacam-se os vírus entéricos humanos,
que não são necessariamente inativados após o tratamento de efluentes (RAO &
MELNICK, 1986b). No tratamento de efluentes, qualquer procedimento de sedimentação
resulta na remoção de um grande número de vírus do efluente para o lodo devido à
adsorção às partículas sólidas e capacidade de se agregarem espontaneamente, em
estruturas pseudocristalinas que não são rompidas espontaneamente, razão pela qual os
vírus são altamente resistentes a agentes desinfetantes ou à pressão da seleção
ambiental (RAO & MELNICK, 1986c; WARD, 1987; FARRAH, 1987; SCHWARTZBROD,
1995; GERBA, 2000).
Apesar dos indicadores bacterianos como coliformes fecais e estreptococos
serem tradicionalmente considerados como indicadores de contaminação ambiental, eles
não são indicadores satisfatórios do conteúdo de vírus e da eficiência dos tratamentos de
desinfecção na eliminação de vírus entéricos (SCHWARTZBROD, 1995; MEHNERT &
STEWIEN, 1993).
Há quase 150 tipos de vírus entéricos humanos conhecidos que entram no corpo
humano pela via oral, multiplicam-se no trato gastrintestinal e são excretados em grande
número nas fezes dos indivíduos infectados (portadores sintomáticos ou não), atingindo
números em torno de 108 a 1011 partículas por grama de fezes. A presença de vírus no
lodo está diretamente relacionada aos vírus presentes no efluente doméstico, que, por
sua vez, dependerá dos vírus que estão sendo excretados pela população no momento.
A epidemiologia dos vírus entéricos humanos é influenciada pelo nível de higiene e
saneamento ambiental no ambiente, pois há explosão de surtos em populações que
ingerem água ou alimentos contaminados com efluente doméstico (RAO & MELNICK,
1986b; ABAD et al., 1994; SCHWARTZBROD, 1995; ABBASZADEGAN et al., 1999).
No caso da cidade de São Paulo, diversos tipos de vírus entéricos foram
detectados nas águas de córrego e de esgoto da cidade de São Paulo, como vírus
pertencentes ao gênero Enterovirus, adenovírus humanos, vírus da Hepatite A e rotavírus
(CHRISTOVÃO et al., 1967, MARQUES, 1987; MEHNERT & STEWIEN, 1993;
MEHNERT et al.,1997; QUEIROZ, 1999; SASSAROLI, 2002; PAULI, 2003; SANTOS,
2002).
Estes vírus poderão estar presentes no lodo tratado, ainda infecciosos. Assim, o
lodo proveniente das ETEs pode ser uma fonte de contaminação ao meio ambiente e aos
seres humanos quando é introduzido como fertilizante na agricultura sem nenhum
tratamento, razão pela qual é de extrema importância a realização de estudos que visem
a detecção, quantificação e distribuição de vírus que circulam no meio ambiente
(ABBASZADEGAN et al., 1999).
STRAUB et al (1995) realizaram estudos durante 7 anos em uma fazenda, cujo
solo foi irrigado com lodo digerido anaerobicamente. Os pesquisadores detectaram
partículas virais em 21 das 24 amostras examinadas por PCR e demonstraram um
transporte significativo de vírus no solo tanto horizontal quanto verticalmente.
A manutenção da viabilidade das partículas virais no solo depende principalmente
do tipo de solo, nível de umidade e temperatura. Os vírus entéricos presentes no solo
como resultado da pulverização ou irrigação migram para estratos mais profundos do
solo, podendo atingir a água subterrânea como resultado do sucessivo fenômeno de
adsorção-desorção, dependentes dos tipos de vírus presentes, as características do solo
e precipitação pluviométrica. Os fatores que mais controlam o transporte de vírus no solo
são: tipo de solo, tipo do vírus, comprimento iônico da solução do solo, pH, compostos
orgânicos solúveis presentes nos efluentes e taxa hidráulica de escoamento
(SCHWARTZBROD, 1995).
O vírus de Norwalk, rotavírus e os adenovírus estão entre os principais agentes
etiológicos dos casos de gastrenterite e diarréia aguda em crianças e são transmitidos,
mesmo em um baixo número, pela via fecal-oral. A veiculação destes agentes é
mundialmente associada à origem hídrica pela ingestão de água e de alimentos
contaminados. A gastrenterite viral é causa de óbito de 5 a 10 milhões de pessoas por
ano no mundo devido à diarréia intensa, associada ou não a febre e vômitos, que pode
levar crianças a uma grave desidratação (UHNOO et al., 1984; HUDSON et al., 2004).
O vírus de Norwalk atualmente é o principal agente responsável por surtos de
gastrenterites virais agudas e diarréia esporádica em comunidades no mundo.É um vírus
altamente debilitante que causa surtos repentinos de gastrenterite. Altamente infectivo e
estável, é mais resistente às técnicas de desinfecção que a maioria das bactérias e
outros agentes virais,
tais como níveis de cloro inferiores a 10 ppm, congelamento,
aquecimento a 60°C. Também podem persistir no meio ambiente, sendo proposto que
podem circular no ambiente em pequeno número em uma população até que um
indivíduo infectado contamine uma fonte comum de água ou alimento, resultando em um
surto explosivo (DOLIN et al., 1972; FANKHAUSER et al., 1998; ROPER et al, 1990;
GRAHAM et al., 1994; HUDSON et al., 2004). A detecção deste agente em amostras
ambientais, apesar de possível, é ainda bastante onerosa.
Os adenovírus, mais especificamente os sorotipos HAdV40 e HAdV41,
pertencentes à espécie F (UHNOO et al., 1984; ALLARD et al., 1990; HÁRSI et al., 1995)
são os patógenos que ocupam o terceiro lugar em termos de importância no
estabelecimento de diarréia em nosso país. Os adenovírus também causam infecções
persistentes
caracterizadas
pela
excreção
fecal
prolongada
e
intermitente.
Aproximadamente metade das crianças menores de 5 anos de idade infectadas com
adenovírus tipos HAdV1, HAdV2, HAdV3 ou HAdV5 excretam vírus nas fezes por
períodos longos (ALLARD et al., 1992).
Há 51 sorotipos de adenovírus conhecidos que são divididos em 6 subgêneros (A
a F) baseado na homologia de DNA e propriedades biológicas e bioquímicas (BENKÔ,
1999). Dos 51 sorotipos, são associados a gastroenterite infantil: HAdV1, HAdV7,
HAdV12, HAdV28, HAdV31, HAdV40 e HAdV41, dos quais HAdV40 e HAdV41 possuem
uma estabilidade a ação de agentes físicos e químicos, possibilitando uma permanência
prolongada no meio ambiente.Também se apresentam resistentes a fase inicial em
tratamentos de esgoto, facilitando, portanto, a contaminação da população por estes
agentes virais (ENRIQUEZ, 1995). A detecção destes agentes em amostras ambientais é
possível e pouco onerosa (SANTOS et al., 2004).
O vírus da Hepatite A tem grande importância devido ao alto número de surtos no
mundo. Estima-se que a incidência mundial seja superior a 1,4 milhões de casos ao ano,
com uma maior incidência em jovens e adultos com mais de 50 anos. Sua infecção
ocorre pela via fecal-oral, pela ingestão de material contaminado; cerca de 50% dos
casos são subclínicos, com isso os indivíduos não procuram tratamento, mas liberam os
vírus nas fezes, contaminando o meio ambiente. A excreção do vírus nas fezes do
paciente ocorre em concentrações relativamente altas 2 a 3 semanas antes do
estabelecimento de sintomas clínicos e 8 dias após estabelecimento da icterícia
(HOLLINGER & TICEHURST, 1996; FAGAN & HARRISON, 2000). A detecção deste
patógeno é possível, mas um pouco mais onerosa dadas suas características
moleculares (SASSAROLI, 2002).
A presença destes diversos tipos de vírus no lodo torna clara a necessidade de
um tratamento do lodo produzido pelas estações de tratamento de efluentes para uma
disposição adequada desse material. SCHWARTZBROD (1995) afirma que o método de
tratamento de lodo que eliminará totalmente os vírus é o tratamento térmico.
Apesar do tratamento por digestão anaeróbia e aeróbia ou a remoção de água
reduzirem a população numérica de agentes patogênicos no lodo, um número
significativo destes presentes no efluente doméstico bruto muitas vezes permanecem no
lodo, pois eles são concentrados durante a sedimentação primária. Grandes organismos,
como helmintos, são concentrados devido à sedimentação, enquanto os vírus adsorvem
ao lodo (GERBA, 2000).
A temperatura é um dos fatores mais críticos na compostagem e as elevadas
temperaturas atingidas durante o processo são fundamentais para a alta taxa de
decomposição, para destruição de coliformes e inativação de vírus. O sucesso da
compostagem também depende da construção da leira e do nível de oxigênio (GERBA,
2000). METCALF et al. (1995) afirmam que os processos de tratamento de lodo, incluindo
compostagem reduzem, mas não eliminam os vírus entéricos, que permanecem viáveis
por um período superior a 30 dias de digestão a 50°C, período que pode ser superior no
caso do vírus da hepatite A (HAV) por ser termoresistente.
Assim sendo, sugerimos que a aplicação de lodo de ETE para fins agrícolas seja
extremamente criteriosa, uma vez que os danos à saúde pública e, principalmente, ao
meio ambiente poderão ocorrer, talvez até de forma irreversível para o país.
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Proposta de metodologia para pequisa de vírus entéricos em lôdo de
esgoto:
Vírus entéricos a serem pesquisados preferencialmente: adenovírus e/ou vírus do Gênero
Enterovirus (Poliovírus, Echovírus, Coxsackievírus). Em situações especiais (surtos de diarréia,
hepatite A e outras viroses de transmissão fecal-oral): rotavírus, vírus da hepatite A e outros
39. Processamento e concentração de vírus entéricos :
Manter no presente a Norma 40CFR part 503 da USEPA, revisada em 2003, mas com
vistas a possível substituição por método mais simplificado que ainda está em fase de avaliação
laboratorial.

Ensaios de detecção viral rápida:
Reação de amplificação em cadeia pela polimerase (PCR) para pesquisa de vírus DNA
como adenovírus (Ref. Santos et al., 2004);
Reação de transcrição reversa seguida de amplificação em cadeia pela polimerase (RTPCR) para pesquisa de vírus RNA como Gênero Enterovirus (Poliovírus, Echovírus,
Coxsackievírus), Rotavírus, Hepatite A e outros (Formiga-Cruz et al., 2005; Arraj et al., 2005)

Ensaios de infectividade viral e quantificação viral em culturas celulares (opção pelo mais
acessível):
Método de plaqueamento com resultado expresso em Unidades Formadoras de Placa
(UFP) por 4g (USEPA, Norma 40CFR part 503);
Método de diluição end-point com cálculo de título por método de Reed-Muench e
resultado expresso em DICT50 por 4 g (Ref.: Hawke, 1979);
Método de imunofluorescência ou de imunoperoxidase em cultura de células com
resultado expresso em Unidades Formadoras de Focos (UFF) por 4 g (Ref.: Mehnert & Stewien,
1993; Barardi et al, 1998).
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Custo das Análises
Avaliação da qualidade virológica de lodo de esgoto
DESCRIÇÃO
METODOLOGIA DE
CONCENTRAÇÃO, DETECÇÃO E
INFECTIVIDADE/QUATIFICAÇÃO
QUANTIDADE
MENSAL A
CUSTO POR
AMOSTRA
COMPOSTA B
Pesquisa de
vírus
preferenciais
(adenovírus e/ou
vírus do Gênero
Enterovirus)
PCR + infectividade em cultura celular
30
R$680,00
aCapacidade
b
de análises por mes por laboratório envolvido
Valores definidos considerando custo bruto + encargos fiscais e sociais por amostra
Prazos de entrega de Resultados
20 dias para ensaios detecção e 30 dias para verificação da infectividade.
Laboratórios capacitados para realização das análises
Uma rede de laboratórios está em fase de implantação visando atender a demanda a curto
prazo dos ensaios virológicos. Trâmites burocráticos estão em andamento visando obter a
regularização junto à cada Instituição Universitária.
Os laboratórios atenderão às demandas de suas regiões, conforme apresentado a seguir:
Região Sudeste e Nordeste
Laboratório de Vírus Entéricos Humanos e Animais
Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas II
Universidade de São Paulo
Endereço: Av. Prof. Lineu Prestes 1374
5508-900 São Paulo – SP
Tel: 0xx11-3091-7341
Fax: 0xx11-3091-7354
Docente responsável: Profa. Dra. Dolores Ursula Mehnert
Região Centro-Oeste e Norte
Laboratório de Virologia Animal / Laboratório de Virologia Humana
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
Universidade Federal de Goiás
Rua 235 s/n Setor Universitário
CEP 74605-050 Goiânia GO
Fone: 0xx62 – 261-3912 / 209-6122
Fax 0xx62 – 521-1839
Docentes responsáveis: Profa. Dra. Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito
Profa. Dra. Divina das Dores de Paula Cardoso