Questões Seminários – Parte I Clarck, David (2005). Protein
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Questões Seminários – Parte I Clarck, David (2005). Protein Structure and Function. In: Molecular Biology: Understanding the Genetic Revolution. London, Elsevier. Tema: Estrutura e Função das Proteínas. Chapter 7: 154-196. 1. Grupo 1 Quais são os quatro níveis de organização estrutural das proteínas? Explique sumariamente cada um deles. a) Estrutura primária: Os aminoácidos são ligados por uniões peptídicas entre os grupos α-carboxila e α-amino. A sequência polipeptídica resultante tem um terminal N e um C. b) Estrutura secundária: Os polipeptídios e podem se dobrar em várias estruturas regulares. A α-hélice tem 3,6 aminoácidos por giro e é estabilizada por pontes de hidrogênio entre os grupos peptídicos N – H e C = O, distantes três unidades. As folhas β-pregueadas antiparalelas são estabilizadas por pontes de hidrogênio entre partes diferentes da cadeia polipeptídica. c) Estrutura terciária: As diferentes seções da estrutura secundária r e regiões de conexão se dobram em uma bem definida estrutura terciária, com aminoácidos hidrofílicos principalmente na superfície e os hidrófobos no interior. A estrutura é estabilizada por interações não covalentes e as vezes por pontes dissulfídricas. A desnaturação leva a uma perda da estrutura terciária. d) Estrutura quaternária: Muitas proteínas têm uma subunidade polipeptídica. A hemoglobina tem duas cadeias α e duas β. Grandes complexos tais como microtúbulos são construídos pela associação quaternária de cadeias polipeptídicas individuais. Os efeitos alostéricos geralmente dependem de interações de subunidades. 2. O que são domínios protéicos? Qual a importância de domínios de ligação ao DNA? Domínios proteicos são regiões de uma cadeia polipeptídica que se dobra mais ou menos independente, para formar a estrutura 3-D da proteína. Sua importância em relação ao DNA, é que muitos fatores de transcrição consistem em dois domínios: um que se liga ao DNA e outro que se liga ao sinal molecular receptor. 3. O que é cristalografia de raios-X e como esta técnica auxilia no entendimento das proteínas? É uma técnica usada para determinar a estrutura 3D de moléculas, particularmente de proteínas e ácidos nucléicos. Conhecer suas formas tridimensionais permite entender melhor como as moléculas biológicas se encaixam e interagem. Quando um feixe de raios-x é lançado através de uma substância, os raios-x são espalhados pelos átomos que encontram. Se a substânciaalvo for um cristal com estrutura regular, a dispersão dos raios-x vai causar um padrão de difração regular, ainda que complexo (Fig. 7.20). Na prática, o cristal de proteína é rotacionado em uma série de posições em uma plataforma controlada por computador. Os padrões de difração são gravados e, após a análise do computador, são usados para gerar um mapa atômico tridimensional da molécula de proteína. A cristalografia de raios-x precisa de cristais grandes e bem-formados de proteína altamente purificada. A cristalografia de raios-x é sofisticada e demorada, e cada proteína deve ser purificada e examinada individualmente. Como muitas proteínas são membros de famílias relacionadas, uma vez que uma estrutura tridimensional está disponível para uma, ela fornece dicas sobre a conformação de toda uma série de moléculas relacionadas. FIGURA 7.20 Cristalografia de raios-x A) Conforme a luz passa pelo objeto, as ondas de luz são distorcidas de seus caminhos originais. Usar uma lente permite que as ondas luminosas distorcidas sejam focalizadas novamente para uma imagem do objeto. B) Raios-x também são distorcidos quando passam por um objeto. A estrutura dessas proteínas em um único cristal determina o padrão pelo qual os raios-x são difratados. Mover o cristal altera o padrão pelo qual os raios-x são difracionados, e todos os padrões diferentes podem ser combinados em um para formar um modelo da estrutura real da proteína. 4. O que é desnaturação protéica e qual sua importância para a análise de uma determinada molécula? É a perda da estrutura 3-D, ou seja, a perda da estrutura terciária e quaternária. Envolve a quebra de ligações não covalentes. A perda de atividade biológica normalmente acompanha esta desnaturação. Para se analisar uma molécula proteica, é necessário que a mesma seja desnaturada por um detergente, ou agente caotrópico, para estar na sua forma secundária (polipepitídica). Somente desta forma poderá, por exemplo, correr um gel, onde a amostra será separada por peso molecular. Além disto, é importante, para a corrida em gel, que o número de cargas negativas fornecidas pelas ligações do detergente, seja proporcional ao comprimento do polipepitídeo, ou seja, seu peso molecular. Tema: Regulação da Transcrição em Eucariotos. Chapter 10: 262-277. 1. Grupo 2 O que são fatores de transcrição e quais são suas propriedades gerais? Fator de transcrição: É uma proteína que se liga a um elemento de ação cis (ex. um acentuador) e direta ou indiretamente afeta o início da transcrição.Suas propriedades gerais são: eles respondem a um estímulo o qual sinaliza que um ou mais genes devem ser ligados 2. Defina: (a) Mediador; (b) Enhancer; (c) Isolador (elemento-limite). A) O mediador é um complexo protéico que se senta (liga) no topo da RNA polimerase II, e proovê um lugar de contato para os ativadores, especialmente para aqueles que se ligam aos acentuadores. B) Os enhancer ou elemento acentuador é uma sequencia de ação cis que pode elevar os níveis de transcrição de um promotor adjacente (obs: eles podem estar a dezenas de quilobases de DNA e podem estar a 5’ ou 3’ dos promotores que eles regulam. C) Isolador é uma sequência de DNA que o promotor da ação do enhancer e também previne a heterocromatina de se esticar. 3. O que é remodelagem da cromatina e quais os principais processos que envolve? A remodelagem da cromatina é a mudança da posição dos nucleossomos sendo uma mparte integrante do processo de expressão eucariótica pois quando as sequências se encotram enroladas nos nucleossomos ela fica inacessível a ação da RNA polimerase II, estando a expressão do mesmo reprimida. Os processo envolvem a acetilação dos resíduos de lisinas das histonas afetando a agregação dos nucleossomos (lembrando que Tb ocorre a desacetilação voltando a compactação), e o complexo remodelador da cromatina que é responsável pelo deslizamento dos nucleossomos expondo a molécula de DNA para a transcrição como também o rearranjamento das histonas remodelando os nucleossomos em uma estrutura frouxa que permite o acesso ao DNA. 4. O que é imprinting genômico e qual a sua importância? Fenômeno no qual um gene parental não expresso embora ambas as cópias gênicas presentes sejam funcionais . sendo assim embora haja dois genes eles são expressos como se fosse uma única cópia do gene presente sendo portanto um exemplo de herança monoalélica. Tema: Evolução Molecular. Chapter 20: 535-566. 1. Grupo 3 Qual molécula é considerada primordial? DNA ou RNA? Justifique. Considerando o fato que moléculas de RNA podem ser formadas ao acaso e se duplicar sob as condições prováveis da atmosfera primitiva e que as mesmas são muitas vezes capazes de desempenhar funções atualmente realizadas pelas proteínas, como por exemplo, a catálise de reações pelas ribozimas, surgiu a idéia do “Mundo do RNA”. De acordo com essa hipótese, o RNA, uma molécula de ácido nucléico muito mais simples e versátil que o DNA teria sido a molécula primordial, ao mesmo tempo carregando o código genético e desempenhando funções enzimáticas necessárias à replicação. Em seguida teriam surgido as proteínas e o DNA. A atual gama de funções e processos desempenhados pelo RNA e a importância das sequências de RNA não-codificantes suportam essa hipótese. 2. Quais os principais mecanismos para a origem de novos genes? O surgimento de novos genes envolve mutações que muito comumente resultam na duplicação de uma sequência ancestral de DNA. Essa duplicação pode resultar no surgimento de um único grande gene ou de muitos genes que podem sofrer mutações sendo extensivamente alterados. Outro evento que pode resultar no surgimento de novos genes, conhecido como shuffing ou “embaralhamento”, corresponde à fusão de dois ou mais genes, seguida por rearranjos de suas sequências. 3. Explique: origem e significado de sequências parálogas e ortólogas. Genes parálogos são aqueles originados dentro do genoma de um organismo através da duplicação de uma sequência gênica. Em um evento seguinte, quando dois grupos de organismos divergem a partir de um mesmo grupo cujo genoma portava genes parálogos, e essas seqüências parálogas também divergem entre os dois grupos, são caracterizados os genes ortólogos. Os grupos sanguíneos do sistema ABO são exemplos de sequências parálogas, formadas pela duplicação de uma sequência ancestral por duplicação gênica dentro de uma mesma espécie. Genes que codificam a cadeia de α-globina em animais de espécies diferentes exemplificam genes ortólogos. 4. Quais as propriedades do DNA ribossomal e do DNA mitocondrial que colaboram para seu uso em análises filogenéticas? A análise da evolução de alguns marcadores moleculares (DNA, RNA ou proteínas) pode ser empregada no estabelecimento de relações evolutivas entre diferentes grupos taxonômicos e consequentemente na construção de árvores filogenéticas. O sequenciamento de regiões do DNA que estejam presentes em diferentes grupos de organismos tem sido bastante empregado nesse contexto. Entretanto, dois critérios devem ser observados: 1) Sequências que se encontram conservadas, ou seja, aquelas sujeitas a uma pequena taxa de mutação, devem ser utilizadas para análise das relações entre grupos evolutivamente distantes e 2) Seqüências sujeitas a uma alta taxa de mutação devem ser empregadas em estudos envolvendo espécies muito próximas ou raças dentro de uma mesma espécie, pois nessa situação a seqüência determinada é encontrada quase inalterada. O DNA que codifica a subunidade 16S do ribossomo, devido à sua função especializada, está sujeita a uma baixa taxa de mutação, desde que estas geralmente resultam em alterações deletérias. Esta característica faz do RNA ribossomal um marcador fortemente aplicável em análises filogenéticas envolvendo grupos distantes. Por sua vez, o DNA mitocondrial encontra-se sujeito a uma alta taxa de mutação, sendo aplicável em análises de grupos muito próximos. Adicionalmente, o DNA mitocondrial é herdado apenas da mãe, o que evita a ocorrência de recombinações. Esse fato permitiu, por exemplo, que dentro da espécie humana o DNA mitocondrial permanecesse tão conservado entre os grupos étnicos que foi possível se chegar à “hipótese da Eva Africana”. Tema: Tecnologia do DNA Recombinante. Chapter 22: 599-633. Grupo 4 1. O que são enzimas de restrição, como atuam e como se classificam? Enzimas de restrição são endonucleases que cortam DNA de dupla fita. Elas se ligam ao DNA em uma sequência específica de bases, chamada sítio de reconhecimento e, em seguida, cortam o DNA. Os sítios de reconhecimento das enzimas de restrição têm geralmente quatro, seis ou oito bases de comprimento e a sequência forma uma repetição invertida. Assim, a sequência da parte superior da fita de DNA é a mesma que a sequência da fita inferior lida no sentido inverso. Existem duas classes principais de enzimas de restrição que diferem no local onde será feito o cortedo DNA, em relação ao sítio de reconhecimento. As enzimas de restrição Tipo I cortam o DNA mil ou mais pares de bases após o local de reconhecimento, através de um looping no DNA de modo que a enzima se liga tanto no local de reconhecimento quanto no local de corte. Já as enzimas de restrição Tipo II cortam o DNA no meio do sítio de reconhecimento. Algumas enzimas cortam as duas fitas de DNA no mesmo ponto, gerando extremidades cegas. Outras podem cortar as duas fitas de DNA em sítios diferentes, o que gera extremidades coesivas. 2. Explique a base funcional e as principais características de: a. Plasmídeo comum: são pequenas moléculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessários para a sua replicação e pelo menos um gene que confere resistência a antibiótico. Um plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve possuir uma origem de replicação (O), ou seja, uma seqüência de DNA que permita que o vetor seja replicado na célula hospedeira; apresentar dois ou mais sítios únicos de clivagem para endonucleases de restrição, sendo este o local onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem; possuir um gene que codifica um produto que distingue a célula transformada da célula não transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere resistência à ampicilina (AmpR). As células transformadas com tais vetores são capazes de crescer num meio contendo o antibiótico, enquanto que as células não tranformadas acabam morrendo. Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, normalmente aceitam uma inserção de DNA de até 4.000 pares de base, esta molécula híbrida deverá ser introduzida numa célula hospedeira geralmente bactérias, onde o vetor sofre replicações consequentemente e amplifica o número de cópias do inserto. A bactéria transformada será facilmente reconhecida pela aquisição de um novo fenótipo dado pelo plasmídeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibiótico. b. BAC: são vetores de cópia única com base no F-plasmídeo de Escherichia coli, sendo moléculas de DNA circulares que carregam uma marca de seleção a antibiótico e podem aceitar inserções de 300 kilobases ou mais. Esses vetores podem transportar grandes segmentos de DNA genômico exógeno de eucariotos e o produto da reação de ligação é introduzido por eletroporação em cepas de E. coli, onde é mantido como um plasmídio de cópia única. Os vetores BACs carregam marcadores que permitem a discriminação dos clones vazios e cheios. c. Cosmídeo: São pequenas multicópias de plasmídeos que carregam duas extremidades coesivas, um pequeno cosmídio de 4 kilobases pode inserir DNA de até 45 kilobases. Para clonar um gene de interesse dentro desse vetor, ambos o DNA alvo e o cosmídio são cortados com a mesma enzima de restrição ou com 2 enzimas diferentes que resultem em extremidades coesivas. A ligação das duas extremidades do cosmídio com cada ponta do DNA alvo resulta em um comprimento de DNA com um sítio cos (coesivas) em cada ponta. Esse construto pode ser embalado dentro de partículas lamba in vitro e então usada para infectar Escherichia coli. Essas partículas virais são importantes porque aumentam a eficiência da infecção na bactéria. d. YAC: São cromossomos artificiais de levedura (YAC) que conduzem enormes fragmentos de DNA de eucarioto, em torno de 2000 kilobases ou 2 milhões de pares de base. Os YACs se apresentam de duas formas, uma circular para crescimento em bactéria e uma linear para crescimento em levedura. A forma circular para ser manipulada em bactéria deve ter uma origem de replicação e um gene resistente a antibiótico. Para usá-lo em levedura a forma circular é isolada e linearizada de modo que as sequências teloméricas para levedura ficam expostas em cada ponta. Este vetor é formado de uma região de origem de replicação específica para levedura e uma sequência que reconhece o centrômero e sequências teloméricas nas extremidades. Por essas características a célula da levedura tratará essa estrutura artificial como um cromossomo. Para a prática deve-se usar um marcador selecionável e incluir também vários sítios adequados de clonagem. Os grandes fragmentos de DNA podem ser inseridos no YAC e assim serem replicados dentro das células de levedura. 3. Quais os principais processos usados para a transformação de células (inserção de DNA exógeno e seu vetor)? A maneira mais simples para inserir um segmento de DNA em um vetor é cortar o DNA alvo e o vetor com a mesma enzima de restrição.Se uma enzima de restrição que gera extremidades coesivas é utilizada, o vetor eo inserto terão extremidades correspondentes, que serão ligadas pela DNA ligase. Porém, se uma enzima de restrição que gera extremidades cegas é utilizada, a ligação é mais difícil e deve-se fazer a ligação com a T4 ligase. Caso o vetor tenha mais de um sítio de corte, deve-se inserir também um “polylinker”, para evitar que o gene clonado seja inserido em um gene importante para o plasmídeo. 4. Como detectar se a célula submetida à transformação realmente incorporou o fragmento de interesse? Explique pelo menos dois sistemas. Pode-se detectar se houve incorporação do fragmento de interesse utilizando diversos sistemas. O menos sofisticado é examinar um grande números de colônias que receberam o plasmídeo com o inserto e cresceram em tubos diferentes. Faz-se a extração de seus DNAs e usa a enzima de restrição utilizada na clonagem. Se o inserto estiver presente, dois pedaços de DNA serão visualizados na eletroforese, um do plasmídeo e outro do inserto. Se não houver inserto, apenas uma banda será visualizada no gel. Um sistema menos trabalhoso é usar o plasmídeo com dois genes de resistência a antibióticos, um para selecionar as células que receberam o plasmídeo e o outro para detectar o DNA clonado. O sítio de corte da enzima de restrição deve situar-se dentro deste gene de resistência ao segundo antibiótico. Quando o fragmento de DNA é inserido, o gene de resistência ao segundo antibiótico será inativado. Consequentemente, as células que receberem um plasmídeo sem inserção será resistente a ambos os antibióticos. Aqueles que receberem um plasmídeo com uma inserção será resistente a apenas o primeiro antibiótico. O procedimento mais conveniente utiliza -galactosidase e X-gal para produzir colônias bacterianas que mudam de cor quando uma inserção está presente no vector. O processo, denominado blue/ whitescreening, tem um vector único que transporta o gene truncado lacZ, que codifica o fragmento alfa da -galactosidase. Uma linhagem hospedeira bacteriana especializada é necessária, cujo cromossomo contenha um gene lacZ com a porção inicial ausente mas que codifique o resto da proteína galactosidase. Se os segmentos de genes plasmidiais e cromossômicos são ativos eles produzem dois fragmentos de proteínas que se associam para dar uma enzima ativa. Se um segmento de DNA estranho é inserido, o fragmento alfa da -galactosidase é interrompido e não forma a enzima ativa. A forma ativa de -galactosidase cliva X-gal, que produz uma cor azul. Os plasmídeos sem inserto de DNA vão produzir -galactosidase e as células bacterianas que os transportam vão ficar azuis. Os plasmídeos com uma inserção serão incapazes de fazer -galactosidase e as células vão ficar brancas. Tema: Reação em Cadeia da Polimerase. Chapter 23: 634-661. 1. Grupo 5 Quais os principais componentes da reação de PCR e que papel cada um desempenha na reação? 1 - Molécula de DNA original que está para ser copiado e que contenha a sequencia alvo. Pode ser o DNA total de um organismo ou cDNA proveniente de uma biblioteca (inteiro ou fragmento) 2 - Dois primers, Forward e Reverse, são necessários para iniciar síntese de DNA nas fitas sense e antisense respectivamente, isso em se tratando da PCR convencional e em algumas variantes da técnica, contudo em métodos como RAPD, apenas um primer é necessário. 3. A enzima DNA polimerase é necessária para fabricar as cópias de DNA. Taq Polimerase de Thermus aquaticus é mais utilizado. 4 - Suprimentos de nucleótideos (dNTPs) são necessários pela polimerase para fazer o novo DNA. Estes são fornecidos como os Trifosfatos de nucleosídeos. Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima propriamente dita para a síntese das fitas-filhas. São compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados no carbono 5´ da desoxirribose. São adicionados pela polimerase complementarmente à fita-mãe. Adiciona-se uma mistura de todos os dNTP´s em concentrações iguais à reação. Os dNTP´s são ligados à fita-mãe pela polimerase numa área delimitada pelos primers, que são pequenas seqüências de DNA (12 a 35 bases) complementares às bordas 5 – Termociclador – Fará os ciclos de temperaturapara a desnaturação da dupla-fita (± 90º), anelamento dos primers (± 60º) e extensão da fita (± 70º). 2. O que são primers degenerados e em que situações são necessários? Primers com bases alternativas em certas posições. São usados quando a Informação de uma sequência parcial é disponível, mas a sequência completa é desconhecida ou quando se deseja obter um primer dito “universal” para uma determinada proteína, usa-se a sequencia proteica de alguns organismos e a partir daí as variantes do código genético são vistas in silico para os sítios do primer. 3. Como a reação de PCR pode ser usada para produzir mutantes gene-específicos? O desenvolvimento de mutantes e muito importante para o desenvolvimento de novas pesquisas sejam elas agrícolas, animais ou até com projeções para humanos. Pode ser feita basicamente de três formas: primer contendo a mutação pontual em um sitio ou dois, com a utilização de íons manganês (o que diminuiria a acurácia da polimerase e causaria mutações aleatórias) ou utilizando primers overlap o que possibilitaria a obtenção de segmentos de DNA de diferentes fontes. Nesse âmbito a técnica de PCR é essencial para realização desses experimentos. A PCR é necessária para a manipulação do fragmento gênico de interesse, que vai ocasionar em mudanças na fita de DNA, sejam elas para silenciar o gene, superexpressar, ou para alterações diversas. Após a mutação essa região é amplificada por PCR e inseridas nas células germinativas do ser em estudo (planta, animal, bactéria), por eletroporação, lipossomas, vírus ou outras técnicas. Essas células então formaram os mutantes através de técnicas de cultura de células com genes de resistência antibióticos. E formaram os mutantes para estudos. 4. Defina e diferencie RT-PCR e PCR quantitativa em Tempo Real? Cite uma aplicação para cada uma delas. A RT-PCR é uma técnica que produz múltiplas cópias de DNA a partir de um mRNA, que é convertido a DNA de novo através da ação da enzima transcriptase reversa, formando um cDNA. Uma vez o cDNA feito, a PCR é usada para amplificar e clonar as sequências livres de introns, partir do mRNA. Possui muitas aplicações, mas a mais utilizada é para avaliação da expressão de genes. A técnica de PCR quantitativa em Tempo Real é uma variante da PCR convencional só que ela representa grandes avanços, pois permite o monitoramento da reação em tempo real, a partir da emissão de fluorescência por fluorófilos. Um dos seus usos é para diagnósticos de doenças, como leucemia mielóide crônica, na detecção de genes BCR e ABL. Tema: Genômica e Sequenciamento de DNA. Chapter 24: 622-692. 1. Grupo 6 Explique a técnica de chip de DNA (micro-array) usando oligonucleotídeos. Os chips de DNA foram desenvolvidos para permitir a análise de múltiplas sequências ao mesmo tempo, sendo utilizados desde sua criação para diversos propósitos, incluindo o sequenciamento, detecção de mutações e expressão gênica. A técnica consiste basicamente na hibridização entre uma fita simples de DNA (permanentemente ligada ao chip, onde cada fita forma um “spot” específico no chip) e DNA ou RNA em solução, geralmente marcados com sondas fluorescentes. Havendo a hibridização entre a solução de DNA ou RNA e os diferentes spots plotados no chip, o sinal é captado por softwares apropriados. Recentemente muitos chips se utilizam de sequências de oligonucleotídeos, podendo ser sintetizados diretamente sobre a superfície do chip, onde mais 100.000 ou mais oligonucleotídeos podem ser plotados em um mesmo chip. Na detecção de oligonucleotídeos vários fragmentos simultâneos podem ser identificados, podendo esta informação ser utilizada tanto para o diagnóstico ou sequenciamento de larga escala, baseando-se no princípio de hibridização de DNA. Se um segmento desconhecido de DNA se liga a uma sonda plotada no chip, significa que esta é complementar ao segmento desconhecido, assim ao se verificar todas as interações positivas entre o segmento desconhecido e os oligonucleotídeos do chip, pode-se procurar regiões de sobreposição (via computadores) entre os a oligonucleotídeos, e assim montar a sequência do fragmento desconhecido. No caso de fragementos maiores, este é primeiro quebrado para depois ser hibridizado com o chip, mas os procedimentos são os mesmos. Esta técnica é bastante eficiente no diagnósticos de doenças, além de serm utilizadas para a análise da expressão em genomas completos. [Cap 24 – Páginas 672 e 673] ----------------------------------------------------------------------------------------------------------Micro-array: Conceito extra-livro O micro-array é uma técnica experimental da Biologia Molecular que busca medir os níveis de expressão de transcritos em larga escala, ou seja, medindo muitos (em alguns casos todos os) transcritos simultaneamente. Um DNA microarray, ou DNA-chip, consiste num arranjo pré-definido de moléculas de DNA (fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou oligonucleotídeos) quimicamente ligadas à uma superfície sólida, usualmente lâminas de microscópio revestidas com compostos que conferem carga positiva. Os microarrays são utilizados na detecção e quantificação de ácidos nucleicos (RNAm na forma de cDNA ou DNA genômico) provenientes de amostras biológicas, as quais são postas para hibridar com o DNA fixado no array (hibridação por complementariedade de bases). A detecção é possível pois as amostras são "marcadas" com fluorocromos, onde a imagem de hibridação é obtida por meio de leitores a laser ou leitores de fósforo (para o isótopo 33-P). O uso mais freqüente dos microarrays é na determinação da expressão gênica (perfil do transcriptoma). O alto desempenho desta técnica permite a determinação da expressão diferencial de milhares de genes num único experimento, impulsionando de maneira importante as pesquisas de genômica funcional dos diferentes organismos, desde bactérias até o homem, incluindo situações normais e patológicas (câncer, doenças autoimunes, doenças degenerativas entre outras). 2. Defina STS e informe como podem ser mapeados. Fragmentos de DNA de um genoma podem ser correlacionados com mapas genéticos, mostrando a localização do gene em questão, No entanto em organismo superiores os genes correspondem a uma pequena porção do DNA, exigindo uma quantidade maior de marcadores além de apenas genes, como por exemplo as STS’s (sequence tagged sites). As STS são regiões de sequência conhecida, curtas (100-500pb), únicas e que podem ser identificadas via PCR, através da utilização de primers que amplificam um segmento de tamanho conhecido internamente a eles [Cap 14, p.676]. Para mapear um STS, fragmentos cromossômicos são examinados para a presença deste. Inicialmente um segmento cromossômico é submetido a ação de enzimas de restrição, que cortam o segmento em fragmentos de diversos tamanhos, onde o número de vezes que dois STS são encontrados juntos no mesmo fragmento revela o quão próximos estes dois marcadores estão. Os fragmentos devem ser originados de um mesmo cromossomo ou de um mesmo genoma. Assim, a chance de dois STS localizarem-se em um mesmo fragmento, depende do quão próximo eles estão no cromossomo original, pois STS vizinhos tendem a ficar juntos na maioria dos fragmentos gerados, podendo estes dados serem utilizados na geração de mapas de ligação; [Cap 24, p.678, fig. 24.18] 3. O que são SNPs e qual sua importância comparando-se populações humanas? O SNP (“snip”) é um polimorfismo de base única, que corresponde a alteração de um base (A, T, G, C) entre duas sequências de DNA iguais de indivíduos diferentes. No genoma humano existem centenas de milhares de SNPs em regiões gênicas e muitos mais em regiões não-codificantes. Os SNPs são amplamente utilizados para a análise de defeitos hereditários, além de testes de variações individuais em genes que afetem respostas faramacológicas. [Os SNPs podem se localizar em regiões críticas no genoma dos indivíduos]. Em muitos casos análises de SNPs individuais de pacientes pode revelar quais as melhores opções de tratamentos e dosagens de drogas (farmacogenômica). [Cap 24, p. 686 e 687] ----------------------------------------------------------------------------------------------------------SNPs: Conceito extra-livro Os SNPs são alterações da seqüência de DNA que ocorrem quando um único nucleotídeo (A, T, C, ou G) na seqüência do genoma é modificada. Um exemplo de SNP poderia ser a mudança em seqüência de DNA: ACGGCTAA a ATGGCTAA, ocorrendo uma mudança da base nitrogenada C para T. Os SNPs são o tipo de polimorfismos mais importante e mais estudados, pois perfazem cerca de 90% de toda a variação genética humana. Muitos destes não têm qualquer efeito sobre a função celular; entretanto há alguns SNPs que modificam o aminoácido resultante, podendo acarretar mudanças na estrutura e/ou função da proteína final. Esse tipo de SNP é o mais comumente estudado. Aplicações: • Estudo da diversidade genética populações humanas (GENÉTICA POPULACIONAL). • Estudos de associação: identificação de genes responsáveis por doenças multifatoriais (incidência de polimorfismo marcador em populações de indivíduos afetados e normais). • Estudos de ligação gênica (linkage analysis): identificação de genes responsáveis por doenças mendelianas (cosegregação de polimorfismo com alelos responsáveis por fenótipo clínico, em famílias afetadas). • Farmacogenética: Estudo da variabilidade genética dos indivíduos em relação a drogas específicas. 4. Explique em linhas gerais como funciona o método de pirosequenciamento. O pirosequenciamento é um método que pode ser utilizado para o sequenciamento de pequenas regiões de DNA. O processo se baseia da geração de pulsos de luz por reações enzimáticas a cada base que é incorporada na sequência. Cada uma das quatro bases (A, T, C , G) é adicionada em turnos, uma de cada vez na reação, assim, se um pulso é captado, significa que a abase foi incorporada na cadeia. As bases são nucleosídeos difosfatos (dNTPs), onde em cada incorporação um pirofosfato é liberado, então a enzima ATP sulfurilase converte Adenosina Fosfosulfato (APS) + o pirofosfato liberado em ATP, este ATP é utilizado pela luciferase para oxidar a luciferina e então emitir luz (captada por uma câmera CCD). Os restos da reação (dNTPs não incorporados e ATP) são então degradados por ação da Apirase antes do próximo ciclo de incorporação de nucleotídeos. Tanto o ATP quanto o dATP podem ser utilizados pela luciferase, para evitar este problema, no lugar do dATP é utilizado um análogo (alfa-thio-dATP), que não é utilizado pela luciferase, mas que é incorporado a cadeia liberando pirofosfato como um dNTP convencional. Este método é bastante robusto para a análise de sequências já conhecidas, que diferem em poucas bases, permitindo comparações entre as mesmas, favorecendo a identificação de modificações pontuais. [Cap 24, p.674 e 675, fig. 24.15]. Modelo esquemático: Tema: Análise da Expressão Gênica. Chapter 25: 693-716. 1. Grupo 7 O que é um gene repórter? Explique como o sistema β-galactosidase pode atuar no sistema gene repórter. São genes que são utilizados na análise genética porque os seus produtos são fáceis de detectar. O uso de genes repórteres é uma técnica bastante utilizada para estudar a regulação de um gene específico, onde se utiliza a região regulatória do gene alvo fundida a um gene repórter (só a parte codificada, sem o promotor) e, portanto, pode-se verificar sua regulação por observação da expressão do gene repórter. A β-galactosidase é uma enzima codificada pelo gene lacZ. Esta enzima catalisa a hidrólise da lactose e galactosídeos artificiais, entre eles os mais utilizados são ONPG (o-nitrofenil galactósido) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil βD-galactósido), esse galactosídeos quando clivado libera coloração, sendo assim possível sua vizualização no interior de células e tecidos. A β galactosidade, quando está presente em meios de cultura específico contendo o galactosídeo (x-gal), romperá a ligação glicosídica com a formação de subprodutos menores, galactose e outros percursores, que possuem coloração (azul) medível em equipamentos como espectrofotômetro e luminímetros. Assim verificamos se a clonagem foi realmente eficaz e pelo nível de coloração, através de sua intensidade. A medida fenotípica produzida pela β-galactosidase através da clivagem desses galactosídeos artificiais, é fácil de medir quantitativamente, podendo assim ser utilizada para o monitoramento da expressão gene alvo, sendo isto possível através da fusão do gene alvo com o gene lacZ. 2. O que é GFP e quais as vantagens de seu uso comparativamente a outras moléculas bioluminescentes? A GFP (proteína verde fluorescente) é uma proteína e não uma enzima, assim não necessita de cofatores para que sua atividade seja percebida. É uma proteína de cadeia de aminoácidos pequena, sendo assim , quando expressa em associação com outras proteínas, não causará alterações na configuração da proteína de interesse. É uma proteína estável e não tóxica e pode observada no organismo vivo sem a necessidade da adição de qualquer reagente. 3. Como é possível localizar sítios de ligação de proteínas na região a montante do DNA? Alguns métodos são utilizados para localização de sítios de ligação de proteínas reguladoras na região à montante do DNA. Entretanto, dois métodos se destacam, são eles: Técnica de retardação em gel e método de footprint. O primeiro método, baseia-se na mobilidade do DNA em gel de agarose que é alterado pela ligação da proteína reguladora, este permite determinar, após seqüenciamento, a sequência de DNA reconhecida por uma determinada proteína reguladora de um gene. Já o método de footprint determina a precisa localização do sítio de ligação da proteína na região à montante, para isso, marca-se radioativamente o DNA (para orientar a análise eletroforética posterior), e adiciona-se DNAse que corta o DNA em locais não específicos. Como o local onde a proteína se encontra ligada está protegido do corte desta enzima, quando se efetuar uma eletroforese e autorradiografia dos fragmentos formados, a zona de interação DNA- proteína não apresentará fragmento. 4. Como funciona a técnica de SAGE? Qual sua vantagem sobre o método de micro-array? A técnica de SAGE consiste extração de todos os mRNAs da célula, em uma determinada condição ou momento, e convertendo os mesmos em cDNA. Esses cDNAs obtidos são cortados obtendo-se diversos tags e em seguida esses tags são concatenados para formarem uma única molécula cDNA que é clonada e seqüenciada permitindo a identificação e contagem das sequências (tags) indicando os níveis relativos das moléculas de mRNA original e consequentemente da expressão gênica. A vantagem é um método mais preciso quantitativamente em relação ao micro-array, e esse método gera uma biblioteca de 3’terminais, muitas sendo regiões 3’- não codificadoras. A seqüência 3'- não codificadora é mais divergente, portanto, mRNAs de famílias de gens com alta homologia podem ser mais facilmente distinguidas com este procedimento, enquanto no microarray pode ocorrer hibridização cruzada. Tema: Proteômica: Análise Global de Proteínas. Chapter 26: 717-744. 1. Grupo 8 Como funcionam as técnicas de: (a) eletroforese bidimensional; (b) western blotting? a) A eletroforese bidimensional é uma técnica de separação de proteínas, possibilitando a separação de até mais de 10.000 proteínas. O nome bidimensional vem da junção de dois tipos de eletroforese utilizadas. Primeiramente é realizada a eletroforese por focalização Isoelétrica, a qual separa as proteínas pelo ponto isoelétrico (pH no qual a carga líquida das proteínas é zero). Em seguida é feita a eletroforese em SDS-PAGE (em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio), a qual separa as proteínas pelo peso molecular. O resultado é uma eletroforese bidimensional, em que as proteínas estarão separadas tanto pelo ponto isoelétrico quanto pelo peso molecular. Posteriormente é feita a revelação, utilizando, por exemplo, coloração de prata, e a análise da separação das proteínas. Obs: Primeiro é feita a focalização isoelétrica com gradiente de pH em gel de poliacrilamida e depois esse gel é transportado para a cuba eletroforética vertical onde é realizada uma segunda migração (sobre ação de uma diferença de campo elétrico), onde serão separadas, nesse momento, pelo Peso Molecular. b) A técnica de Western Blotting permite a identificação de uma única proteína dentro de uma amostra contendo várias proteínas. Primeiramente, a amostra de proteínas é separada por tamanho por eletroforese, seja SDS-PAGE ou 2D-SDSPAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida associada a dodecil-sulfato de sódio). Em seguida, as proteínas são transferidas através de um sanduiche formado pela membrana de nitrocelulose e o gel, entre espumas, cátodo e ânodo. Um potencial é aplicado e a amostra do gel passa para a membrana por um princípio semelhante à eletroforese. Então, para detectar uma proteína específica, um anticorpo específico para ela precisa estar disponível. Como a membrana de nitrocelulose possui muita afinidade por proteínas (inclusive anticorpos), então ela precisa ser tratada com uma solução bloqueadora, composta por proteínas inespecíficas, como uma solução feita de leite em pó desnatado, ou polividina(quando o leite for interferir no seu experimento). Após o bloqueio dos sítios ativos com o leite,o anticorpo primário é adicionado à solução e se liga à proteína de interesse. O complexo proteína-anticorpo primário é detectado usando um anticorpo secundário, que é ligado a uma enzima (como a fosfatase alcalina) e a adição do substrato dessa enzima produz um precipitado insolúvel que pode ser visualizado. Por exemplo, para a fosfatase alcalina: adição de lumiphos ou X-phos à membrana permite a detecção da banda da proteína. 2. Como funciona a espectrometria de massas e quais as suas principais variações? As Espectrometrias de massa medem a relação massa/carga (m/z) de uma amostra em questão. No esquema geral temos uma fonte de ionização, um analisador de massas e um detector. As principais variações são a espectroscopia de dessorção por laser em uma matriz sólida associada à medida do tempo de voo da proteína (MALDI-TOF) e a espectrometria por eletrodispersão (ESI), que também pode estar atrelada a um analisador do tempo de vôo. Na técnica de MALDI-TOF peptídeos previamente digeridos por proteases são depositados em quantidades menores que um microlitro numa matriz sólida constituída de pequenas moléculas orgânicas (principalmente o ácido alfaciano-4-hidroxinâmico e o ácido diidrobenzóico), na qual se faz incidir um laser. As moléculas orgânicas da matriz absorvem a energia do laser e a transmitem para as moléculas da amostra depositadas na sua superfície, principalmente por protoná-las. Estas, por absorverem essa energia, são dessorvidas (arrancadas) da superfície. A nuvem de íons produzidas pelo pulso de laser é acelerada num campo elétrico de alta voltagem, adquirindo todos a mesma energia cinética por unidade de carga na câmara de aceleração, voando livremente em um longo tubo a vácuo até atingir o detector ( um conjunto de microplacas e um ânodo). Assim podemos obter um espectro do tempo de voo. Tendo ao final da aceleração mesma quantidade de movimento por unidade de carga (mv/z), os íons mais leves apresentarão maior velocidade e atingirão o alvo antes dos íons mais pesados. Como a distância do detector é fixa, a medida do tempo de voo é proporcional à razão massa carga e assim, obtemos um espectro de tempo de voo dos íons produzidos pela aceleração da matriz. Na técnica de espectrometria por eletrodispersão(ESI) a amostra de um solvente contendo peptídeos é injetada através num capilar numa câmara submetida à alta voltagem, sendo esta capaz de vaporizar o líquido estrostáticamente, produzindo uma nuvem de pequenas gotas altamente carregadas. Esta vaporização é produzida em ambiente atmosférico na presença de um gás inerte que induz a dessolvatação dos íons (retirada da água), induzindo a uma diminuição do raio da partícula e assim, aumentando a densidade de cargas e provocando uma explosão coulombiana (de cargas) que libera os íons para serem analisados na fase gasosa. Esses íons então são dirigidos para um analisador de massas, sendo conduzidos para o ambiente de alto vácuo do equipamento através de um orifício. O ESI é acoplado a analisadores quadrupolares em que quatro bobinas posicionadas em paralelo ao tubo analisador selecionam os íons através de uma radiofrequência sobreposta a um campo elétrico. Dependendo da amplitude do campo aplicado, só alguns íons com determinada razão m/z passam pela câmara, sendo os demais desviados da trajetória que conduz ao detector. O espectro de massas é obtido variando-se o campo aplicado e registrando a colisão de íos num detector. O processo de eletrodispersão gera múltiplas cargas num mesmo peptídeo ou proteína, sendo o aminoácido facilmente protonado e gerando um envelope de múltiplas cargas que pode ser desconvoluído através de um algoritmo. 3. Como é possível a partir da seleção por amostragem de fago chegar da proteína ao gene? A seleção por amostragem de fagos disponibiliza ao mesmo tempo a proteína, fusionada ao lado exterior de uma proteína do envoltório do fago, e o DNA que a codifica, dentro do bacteriófago. A seleção, chamada de Biopanning, é feita utilizando moléculas específicas como alvo, ligadas a um suporte sólido que permita separação posterior. Esses alvos podem ser outra proteína (enzimas, anticorpos), RNA, ou outras moléculas de interesse que se liguem à proteína fusionada ao envoltório do fago. Assim, o Biopanning consiste em: (1) incubar a biblioteca de fagos com a moléculaalvo; (2) os fagos com proteínas que se associem à molécula-alvo se ligam às mesmas; (3) é feita uma “lavagem” dos fagos que não se ligaram, deixando apenas os fagos que se ligaram à molécula alvo, presa pelo suporte sólido; (4) os fagos que se ligaram são eluídos e separados da molécula-alvo e amplificados por reinfecção em E. coli. Após alguns ciclos de Biopanning, a biblioteca de fagos estará enriquecida em proteínas que melhor se ligaram à molécula-alvo. Finalmente, os clones individuais da bilbioteca serão identificados por sequenciamento, chegando assim ao gene. 4. Como funciona e quais as principais aplicações do sistema di-híbrido de leveduras? O sistema di-híbrido de leveduras é um método de verificação em massa das interações entre proteínas, baseado na estrutura dos fatores de ativação de transcrição: o domínio que se liga ao DNA (DBD) e o domínio de ativação (AD), que se liga à RNA polimerase. Se os dois domínios interagirem, irão ativar a transcrição de um gene repórter. Os genes das proteínas a serem estudadas são clonados em dois tipos de vetores. Em um tipo, o gene será fusionado com o DBD e servirá de “isca”, e no outro será fusionado com o AD e servirá de “presa”. Linhagens haploides de cruzamento de levedura diferentes são então transformadas com um tipo de vetor. Por exemplo, a biblioteca de vetores “isca” na linhagem a e a de vetores “presa” na linhagem α. O cruzamento dessas linhagens haploides é feito automaticamente, de maneira que todas as combinações sejam testadas. Na levedura diploide resultante do cruzamento, ambos vetores estarão presentes. Se as respectivas proteínas “isca” e “presa” interagirem, o fator de ativação de transcrição irá funcionar e o gene repórter será expresso. Colônias de leveduras em que houve a interação serão selecionadas pelo meio de cultura, de acordo com o gene repórter. Este sistema serve para estudar proteínas cujos genes possam ser expressos em leveduras. Ainda, a interação só poderá ser verificada se ocorrer no núcleo, local onde ocorre a transcrição. Entre as principais aplicações, estão a identificação das sequências essenciais para a interação e a inferência de função das proteínas por associação a uma proteína com função conhecida.
