Injetar e deixar 20 horas
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Injetar e deixar 20 horas • Células injetadas e reveladas para ativação de lacZ 20 horas depois da injeção • Todavia, a idade da célula no momento da injeção era calculada sabendo a posição dela na placa (grid) e acompanhando o ciclo de divisão Outros promotores, tecidoespecíficos, tb funcionam mais se injetados no início da fase S Mas elas passam por +1 ciclo nessas 20 horas! • O fato sugere que a competência foi adquirida logo na hora da injeção e não foi recuperada pelo ciclo • Vamos esperar só 3 horas? – Injetar depois da div. – Tem que usar PCR controle – Deu igual! controle Duas injetadas na mesma célula • O repórter pode ser LacZ ou EGFP • Células injetadas, espera-se algumas horas de acordo com protocolo • Early S sempre mais ativa (na mesma célula) Preparar nucleossomo e fazer PCR • A detecção de lacZ (injetado) ou de actina (celular) foi igual, logo o DNA injetado virou nucleossomal! Injeção de dois plasmídios com genes de tamanho diferente • • • • Um injetado no início e outro no final da fase S Preparação nucleossomal Precipitação de cromatina com anti - H4 acetilada PCR quantitativo do precipitado: early tem mais acetilação Input ml Bound Controles • Gene ativo: actina • Gene Inativo: Ig-kappa ml early late TSA inibe desacetilase • Early: não adianta inibir desacetilase • Late: – Tratamento simultâneo reverte – Tratamento tardio não – Já empacotou! Estável! RT-PCR Plasmídio que replica (origem BPV, célula com E1/E2) • Qdo replica, plasmídio perde padrão de metilação bacteriana e fica resistente a Dpn I • Em 3 horas eles replicam (30-40%) • Imunoprecipitação do plasmídio com anti – H4 acetilada • Elimina-se quem não replica com Dpn I H4 desacetilada é comum no X tardio e bandas G • Inseriram pUC por transfecção (ops, esse DNA agora é cromossômico) – Deve ter inserido em diferentes tipos de bandas • Marcaram Early e Late replication com Budr • Precipitaram com anti – H4 acetilada • O ppt era enriquecido de cópias de pUC marcadas com BUdr early (mas não com BUdr late) – early = desacetilado Onde fica a HDAC2? • Em bandas G, de replicação tardia • Competência transcricional é dependente da fase S • Replicação precoce é montada em estrutura de cromatina mais acessível • Replicação tardia em regiões inativas • Eixo ao longo do tempo do ciclo celular que permite a manutenção de efeitos epigenéticos
