Linfócitos

Fraccionamento celular e
cultura de células
Células do SI
(vulgarmente isoladas)
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•
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Eritrócitos
Plaquetas
Polimorfonucleados (PMNs)
Macrófagos
NK
Linfócitos B e T - imunidade humoral e
celular
Separação de células sanguíneas
Centrifugação em gradiente
• Envolve a separação de partículas com base
na sua massa e forma numa solução de
densidade e/ou concentração decrescente
• A amostra é colocada no cimo do tubo e
durante a centrifugação migra de acordo com
a sua velocidade e sedimentação, ex:
gradiente de Ficoll-Hypaque
Separação de células sanguíneas
Centrifugação em gradiente
Eritrócitos+
PMNs - mais
densos
Células
mononuclear
es (linfócitos/
monócitos)menos
densos:
recuperados
à superfície
Separação de células sanguíneas
Centrifugação em gradiente
Análises Clínicas (Linfócitos)
• Colheita + Heparina
• Decantar sobre tubo com um gradiente de FicollHypaque.
– O gradiente é formado por uma mistura de soluções de
concentrações progressivamente crescentes que se
distribuem ao longo do tubo de centrífuga, ficando as
soluções de maior densidade no fundo
• Coloca-se a amostra de sangue heparinizado sobre o
gradiente e centrifuga-se. As células distribuem-se
em camadas distintas ao longo do gradiente, de
acordo com a sua densidade.
Análises Clínicas
(Linfócitos)
• O Ficoll possui uma densidade
maior que a dos linfócitos mas
menor que os glóbulos vermelhos
e granulócitos; após centrifugação
os glóbulos vermelhos e os PMNs
passam pelo Ficoll formando um
pellet no fim do tubo.
• Os linfócitos ficam na interface do
meio e do Ficoll
• A camada correspondente aos
linfócitos e algumas células
mononucleares- anel branco pode ser aspirada.
Separação de células sanguíneas
Panning
• Aderência celular a uma superfície sólida
Separação de linfócitos por Panning
Análises Clínicas (Linfócitos)
• Técnica usada no isolamento de
subpopulações de linfócitos, em que estes
podem aderir á superfície se esta estiver
coberta com os anticorpos apropriados
• Método eficaz na separação Th de Tc usando
anticorpos CD4+ e CD8+
• Eficaz também na separação de linfócitos T
e B usando anti-Igs
Separação de células
sanguíneas
Separação imunomagnética
• Acoplamento de esferas
magnéticas a anticorpos
monoclonais que
reconhecem moléculas
da superfície das células
• Os anticorpos acoplados
ás esferas magnéticas,
são misturados com as
células a separar;a
mistura passa por uma
coluna magnética, que
retêm as células ligadas
ao anticorpo.
Separação de células sanguíneas
Separação imunomagnética
Separação de células sanguíneas
(Linfócitos, ...................)
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•
•
•
Centrifugação
Panning
Separação imunomagnética
Cromatografia de afinidade
Citometria de Fluxo
FACS ( fluorescence- activated cell
sorter)
Separação de células sanguíneas
(Linfócitos, ...................)
• O isolamento de de linfócitos é um passo fundamental
na avaliação qualitativa e quantitativa da imunidade
celular
• Em análises clínicas estes estudos centram-se na
caracterização de defeitos primários ou adquiridos da
imunidade:
– quantitativamente podemos totalizar e diferenciar o
nº de células representantes das populações
linfocitárias
– qualitativamente podemos caracterizar
funcionalmente estas células e avaliar a sua
capacidade efectora
CULTURA DE CÉLULAS
APLICAÇÕES
• Estudos imunológicos
- Resposta celular in vitro
- Migração celular
- Estudos de sensibilidade a drogas
- Citotoxicidade
- Adesão celular
- Proliferação celular
Requisitos das culturas
celulares
 Como se processa?
É necessário mimetizar as condições fisiológicas
• Meio de cultura apropriado:
- Soro e nutrientes
- Factores de crescimento
- Antibióticos
• Atmosfera adequada
• Superfície de adesão
Meio de cultura apropriado
SORO e NUTRIENTES
• Soro, a parte não celular do sangue, contém centenas de
proteínas e factores necessários ao crescimento celular:
- Insulina, Transferrina e Proteínas transportadoras de ferro;
• Vitaminas
Biotina, Folatos, Tiamina, riboflavina, ácido pantoténico,etc
• Sais
NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2
• Glucose
Exs de meios comerciais :
PBS,DMEM,RPMI,Iscove`s
Culturas primárias
• Derivam directamente dos tecidos ou orgãos (pele, rim,
fígado) Estes devem ser obtidos em condições assépticas e levados
ao laboratório rapidamente, imersos em meio de cultura, para
manutenção da viabilidade celular.
•Ponto de partida para linhas celulares
contínuas
•resultam da selecção, de culturas primárias, de clones
capazes de sobreviver e de se multiplicar (50 gerações)
• estes clones (qq população de células descendentes de uma
célula única ancestral) originam linhas celulares diplóides ou
aneuplóides
Linhas Celulares Imortais
Têm origem em células tumorais, que sofreram
transformações oncogénicas. Não só crescem
indefinidamente em cultura, mas também o fazem máis
rapidamente, duplicando o seu nº em menos de 24 horas.
Apesar da sua proveniência tumoral mantem as
propriedades básicas celulares, o que permite ao
imunologista a transferência de genes no intuito de
investigar a sua função e regulação.
Ex:
• Infecção por vírus
- HTLV-1 - para células T
- EBV - para células B