Slide 1 - Paulo Margotto
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Atresia das vias biliares extra-hepáticas: Expressão gênica em um modelo experimental Autora: Elisa de Carvalho Brasília - 2005 Orientador: Luiz Alberto Simeoni Co-orientador: Jorge A. Bezerra Universidade de Brasília Cincinnati Children's Hospital Medical Center I - Introdução AVBEH: principal indicação de transplante hepático AVBEH: principal indicação de transplante hepático AVBEH: 50% dos transplantes hepáticos pediátricos BALISTRERI, W. F. et al. Biliary atresia: current concepts and research directions. Summary of a symposium. Hepatology 23, 1682-1692 (1996). Nenhuma outra patologia, nem na idade adulta, é responsável por essa monta de indicação para o transplante. AVBEH Complicações da portoentorostomia Complicações da doença Colangite Colestase ? Progressão da hepatopatia Hipertensão portal Cirrose biliar Varizes esofagogástricas Hiperesplenismo Ascite Insuficiência hepática Síndrome hepatopulmonar Síndrome heparorrenal Terapêutica: portoenterostomia Evolução pósDiagnóstico tardio portoenterostomia Etiopatogênese ? Etiopatogênese Predisposição genética Desenvolvimento do fígado e vias biliares Injúria durante o desenvolvimento dos ductos biliares (primeiro trimestre) Defeitos na morfogênese: Genes da lateralidade INV CFC1 ZIC3 Má-formação da placa ductal JAG 1 HNF-6 HNF-1β Fatores ambientais (infecção viral) Reovírus Rotavírus Citomegalovírus HLA Fatores anatômicos Toxicidade Ácidos biliares tóxicos AVBEH (embrionária) Artéria hepática Canal pancreatobiliar AVBEH (perinatal) Embrionária 20 % Disfunção imune no neonato Resposta TH1 Células T CD8+ Células NK Macrófagos Auto-imunidade Perinatal 80 % Histologia das vias biliares Obstrução progressiva das VBEH Modelo animal: AVBEH Rotavírus rhesus do grupo A PHILLIPS, P. A. et al. Chronic obstructive jaundice induced by Reovirus type 3 in weanling mice. Pathology 1, 193-203 (1969). SCHMELING, D. J. et al. Experimental obliterative cholangitis. A model for the study of biliary atresia. Ann. Surg. 213, 350-355 (1991). RIEPENHOFF-TALTY, M. et al. Group A rotaviruses produce extrahepatic biliary obstruction in orally inoculated newborn mice. Pediatr. Res. 33, 394399 (1993). PETERSEN, C. et al. New aspects in a murine model for extrahepatic biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 32, 1190-1195 (1997). Camundongos Balb/c Modelo animal: AVBEH Rotavírus rhesus do grupo A Indução: AVBEH Idade do animal < 12 horas Camundongos Balb/c Carga viral 106 PFU/mL Via de inoculação Intraperitoneal Modelo animal: bem estabelecido, como adequado para pesquisas experimentais relacionadas à atresia. Modelo animal: AVBEH Rotavírus rhesus do grupo A RRV Fator inicial: Infecção Expressão gênica Camundongos Balb/c Inflamação e fibrose obliterante As modificações da expressão gênica comandam os processos biológicos que influenciam a evolução da doença após o a lesão inicial. Hipótese do estudo Genoma Inoculação de RRV Ativação ou desativação reacional de genes Reprogramação da função celular (Estimulação ou inibição de processos biológicos) Fibrose progressiva com obliteração das VBEH II - Objetivos Objetivo geral Analisar o transcriptoma (expressão gênica) das vias biliares extrahepáticas, em modelo experimental de AVBEH, nas diferentes fases da evolução dessa doença. Objetivos específicos Identificar os genes ativados e os desativados, nos camundongos infectados pelo RRV, em relação ao grupo controle, nos diferentes estágios da obstrução biliar. Avaliar os processos biológicos que se correlacionam ao desenvolvimento da atresia das vias biliares extra-hepáticas. Identificar e analisar as vias moleculares que regulam o dano celular e a obliteração das vias biliares extra-hepáticas. III - Métodos Desenho do estudo Estudo experimental, randomizado e controlado. 114 camundongos Balb/c: menores que 24 horas de vida filhos de mães negativas para o RRV Grupo A (modelo animal de AVBEH): 63 camundongos injeção intraperitoneal: 1,5 x 106 UFF de Rotavírus rhesus do grupo A (20 μL) primeiras 24 horas de vida Excluídos: animais do grupo A que não desenvolveram AVBEH. Grupo B (grupo controle): 51 camundongos Injeção intraperitoneal: 20 μL de soro fisiológico 0,9%, primeiras 24 horas de vida. 102 Camundongos Balb/c (< 24 horas de vida) Inoculação intraperitoneal com RRV Inoculação intraperitoneal com SF 0,9% Grupo A: 51 camundongos (modelo animal de AVBEH) Grupo B: 51 camundongos (grupo controle) Clínica: peso, icterícia, colúria e acolia fecal Laboratorial: bilirrubinúria Anestesia: Microdissecção e ressecção das vias biliares Retirada de dois fragmentos hepáticos Animais sacrificados com: 03 dias de vida: subgrupos A1 e B1 07 dias de vida subgrupos: A2 e B2 14 dias de vida subgrupos: A3 e B3 03 amostras RNA: Microarranjos 03 amostras RNA: RT PCR 03 amostras Histologia: VB Dia 3 Dias 7 e 14 Amostra 01 Amostra 01 Avaliação da expressão gênica Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip® Reação em cadeia da polimerase em tempo real Novas tecnologias GeneChip: permite a avaliação do transcriptoma (perfil de “funcionamento” de todos os genes em um momento específico níveis de mRNAs dos genes expressos) em um único ensaio. RT PCR: teste de maior acurácia para determinação da expressão gênica. Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip® Várias seqüências de nucleotídeos (representando todo o genoma) são depositadas em uma superfície de vidro (o chip) e cada oligonucleotídeo configura uma sonda para um gene específico. Extração: RNA das vias biliares Homogeneização e lise celular (TRIzol) Fase da separação (fenol/clorofórmio) RNA Lipídeos Carboidratos Proteínas Precipitação (isopropanol) RNA RNA TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA Qualidade do RNA Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip® Local de origem do sinal de fluorescência e a intensidade deste identifica o gene em questão e seu nível de expressão. Quantificação do sinal de fluorescência: sistema GeneChip® Unidade de expressão: pixel Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring Avaliação conjunta dos resultados de todas as amostras. Comparação entre os grupos experimental e controle. Avaliação estatística. Classificação dos genes em funções biológicas (Gene Ontology). GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos O valor da expressão dos genes no GeneSpring é um valor relativo (ou normalizado) em relação ao controle. Segunda etapa: As amostras do grupo controle foram usadas como valor basal. A intensidade do sinal de cada gene no grupo experimental foi dividida pelo valor do mesmo gene no grupo controle, o que foi realizado separadamente para os dias 3, 7 e 14. Primeira etapa: Média de todos os sinais da expressão gênica. Este valor é dividido por cada um dos sinais individualmente. Objetivo: evitar valores extremos. Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14) GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle Seleção dos genes (Anova p < 0,01) Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14) GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels em pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo (Diagrama de Venn) Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle Seleção dos genes (Anova p < 0,01) Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14) GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos Reclassificação dos genes (PubMed, GeneCard, UniGene, Gene, GeneBank) Seleção dos processos biológicos (Anova p < 0,05) Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels em pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo (Diagrama de Venn) Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle Seleção dos genes (Anova p < 0,01) Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14) Validação dos resultados do GeneChip Reação em cadeia da polimerase em tempo real RT PCR: Quantificação do número de cópias Sinal de fluorescência: SYBR Green Curva de amplificação da RT PCR com várias amostras Curva de amplificação da RT PCR e definição do CT Fluorescência emitida Platô Linha que delimita o nível de detecção do sinal de fluorescência Amostra Threshold Amostra: sem DNA Região da linha de base CT Quantidade de cópias inicial da amostra Número de ciclos Cálculo da expressão gênica Expressão de um gene Quantidade de cópias do gene-alvo Quantidade de cópias do gene padrão Variação da expressão Expressão do gene no grupo experimental Expressão do gene no grupo controle Gene padrão: 18S. Animais do grupo experimental e do controle. Especificidade dos microarrranjos: árvore biliar extra-hepática Expressão da citoqueratina-7 (Krt2-7): Fígado e árvore biliar extra-hepática Validação: RT PCR IV - Resultados Incidência de AVBEH: animais infectados por RRV 63 camundongos AVBEH: 51 camundongos (81%) Outros estudos: 67% a 86% Petersen C et al., 1997; Czech-schmidt G et al., 2001; Shivakumar P et al., 2004 Evolução da infecção pelo RRV Icterícia AVBEH: quadro clínico Colúria Acolia fecal Ausência: Quadro diarréico X Humanos: diarréia importante (O'ryan M. et al., 2005) Animais mais velhos: ausência de icterícia (Feng N. et al., 1994) Camundongos RRV: tropismo pelos colangiócitos Brevidade cronológica Não persiste com o crescimento e o amadurecimento do animal RRV: tropismo único pelas células do epitélio biliar neonatal (Shivakumar et al., 2004) De modo similar em humanos: Atresia é observada apenas em lactentes nos primeiros três meses de vida, não se desenvolvendo em crianças maiores ou em adultos. BALISTRERI, W. F. Neonatal cholestasis. J. Pediatr. 106, 171-184 (1985). BEZERRA, J. A. & BALISTRERI, W. F. Cholestatic syndromes of infancy and childhood. Semin. Gastrointest. Dis. 12, 54-65 (2001). Imaturidade temporária: relacionada à idade precoce Pode desempenhar um papel importante na história natural dessa doença. Aspecto macroscópico das vias biliares extra-hepáticas Vesícula biliar distendida . Vesícula biliar pequena e contraída. Vias biliares de aspecto normal. Vias biliares estreitas e fibrosadas. Avaliação histológica das vias biliares Grupo controle Dia 3 Dia 3 Dia 7 Dia 14 Grupo experimental Dia 7 Dia 14 Barra preta: 100 μm Peso médio dos camundongos SF 0,9% RRV Peso médio dos camundongos relacionado aos dias seguidos à inoculação com SF0,9% ou RRV, com p < 0,01 dos dias 7 a 14. Modelo animal: Idade Sinais clínicos ss Aspectos macroscópicos Histologia Evolução Hipodesenvolvimento: Fenótipo da AVBEH em crianças Redução da ingesta alimentar Esteatorréia Avaliação histológica do fígado Grupo controle Dia 3 Dia 7 Dia 14 Grupo experimental Dia 3 Dia 7 Dia 14 Papel do vírus RRV (vias biliares e tecido hepático): identificado nos animais sacrificados com 7 dias RRV (vias biliares e tecido hepático): Não foi isolado naqueles sacrificados com 14 dias. SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004). MACK, C. L. et al. Armed CD4+ Th1 effector cells and activated macrophages participate in bile duct injury in murine biliary atresia. Clin. Immunol. 115, 200-209 (2005). Efeito citopático direto do vírus Potencial papel dos processos imunes na evolução da doença. Infiltrado linfocitário periductular Predomínio: linfócitos TH1 e CTLs. SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004). Transcriptoma das vias biliares Transcriptoma das vias biliares (45.101 genes transcritos) Anova p < 0.01 Genes ativados ou desativados < 2x ou > 2x Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels 849 genes Seleção dos processos biológicos Anova p < 0,05 3SF 3RRV 7SF 7RRV 14SF 14RRV Alto Árvore genética: GeneSpring E Baixo 359 genes Reclassificação funcional dos genes (PubMed, UniGene, Gene, GeneCard, GeneBank) Dia 3: Imunidade Enzimas Proteínas estruturais Transporte Transcrição e tradução Dia 7: Imunidade Enzimas Proteínas estruturais Apoptose Transdução de sinais 498 genes Dia 3 Dia 7 Dia 14: Imunidade Enzimas Proteínas estruturais Transcrição e tradução Transdução de sinais Ativados: 310 genes (62%) Dia 14 Classificação funcional dos genes ativados nos dias 3, 7 e 14. Transdução de sinal Apoptose Transcrição e tradução Transporte Proteína estrutural Enzima Imunidade Dia 3 ll Dia 7 Genes ativados Imunidade: três etapas da pesquisa. Maior número de genes ativados: processos imunes no dia 7. Dia 14 Imunidade Dia 3 Fase precoce da lesão biliar (dia 3) Imunidade inata Imunidade adquirida Imunidade inata Células fagocitárias (neutrófilos e macrófagos) Frações do complemento Tyki C1R Ativação macrofágica Ativação da cascata de complemento Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+ PSMB8 TAP2, TAPBP Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+ PSMB8 TAP2, TAPBP H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10 Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+ PSMB8 TAP2, TAPBP H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10 Imunidade celular Etapas da imunidade adquirida Ativação dos linfócitos LY6E LY6A Dias após a exposição ao antígeno Receptores dos interferons e ativação da via clássica JAK-STAT IRF9 IFIT1 Imunidade adquirida: dia 3 i) Processamento e apresentação do antígeno ii) Aumento da expressão do MHC da classe I iii) Fatores reguladores dos interferons iv) Estimulação dos linfócitos T Imunidade humoral Imunidade celular BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of proinflammatory immunity in children with biliary atresia. Lancet 360, 1653-1659 (2002). Imunidade Dia 7 Imunidade inata: complemento C1R – Dia 3 C1Qα, C1Qβ C3αR1 Citotoxicidade mediada por anticorpos FcγRIIIA (CD16) FcγRIII (CD16) Célula NK Célula NK ativada Ac liga-se ao antígeno na superfície do patógeno Receptores Fc (NK) reconhecem os Ac Sinalização para célula NK matar a célula-alvo A célula alvo morre por apoptose Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos: linfócito T CD4+ Catepsinas Biossíntese do MHC da classe II IFNG H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 BROOME, U. et al. Different expression of HLA-DR and ICAM-1 in livers from patients with biliary atresia and Byler's disease. J. Hepatol. 26, 857862 (1997). FENG, J. et al. The aberrant expression of HLA-DR in intrahepatic bile ducts in patients with biliary atresia: an immunohistochemistry and immune electron microscopy study. J. Pediatr. Surg. 39, 1658-1662 (2004). Expressão anômala do MHC da classe II nos ductos biliares: lesão progressiva KOBAYASHI, H. et al. Hepatic overexpression of MHC class II antigens and macrophage-associated antigens (CD68) in patients with biliary atresia of poor prognosis. J. Pediatr. Surg. 32, 590-593 (1997). Receptores das células T e seus ligantes Reconhecimento do antígeno Redistribuição dos receptores e seus ligantes Sinapse imunológica H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 TCRB-V13 Receptores das células T e seus ligantes Reconhecimento do antígeno H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 TCRB-V13 LFA1 Redistribuição dos receptores e seus ligantes Moléculas de adesão intercelular Sinapse imunológica Moléculas deal. adesão: DILLON, P. W. et Differential expression of the major na papel significativo histocompatibility antigens and reação inflamatória ICAM-1 on bile duct epithelialna cells in biliary atresia. Tohoku J. atresia biliar, por Exp. Med. 181, 33-40 (1997). ocasionarem atração, DAVENPORT, M. et al. retenção e ativação Immunohistochemistry of the liver anddos biliary leucócitos tree in extrahepatic biliary atresia. J. Pediatr. Surg. circulantes. 36, 1017-1025 (2001). Receptores das células T e seus ligantes H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 TCRB-V13 LFA1 Reconhecimento do antígeno Redistribuição dos receptores e seus ligantes Outro evento de sinalização intracelular é a fosforilação das tirosinas, por tirosinas cinases da família Src. CD45R Determina a atividade de sinalização das cinases da família Src. HCK Sinapse imunológica Receptores das células T e seus ligantes H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 TCRB-V13 Reconhecimento do antígeno Redistribuição dos receptores e seus ligantes LFA1 CD45R Dia 7 Sinapse imunológica Fundamental: ativação dos mecanismos de sinalização intracelular na ativação da célula T Componentes essenciais: sinapse imunológica Regulam a produção de citocinas. Desenvolvimento das subpopulações das células T IL2RG Ativação das células T Principal citocina: célula T naive. Estágio inicial: diferenciação da célula T Proliferação e a expansão clonal das células T naive Crescimento e diferenciação das células T. Polarização: citocina Subpopulações: TH1 e TH2 Etapas do desenvolvimento dos linfócitos. Pergunta: predomínio TH1 ou TH2? A proporção relativa dessas subpopulações é o principal determinante das funções protetoras e das conseqüências patológicas da resposta imune. TH1 e TH2: citocinas e funções efetoras diferentes IFNG Ações biológicas do interferon gama (A) Ativação de macrófagos, que passam a apresentar maior atividade microbicida. (B) Nas células B, promove a troca do isótopo para anticorpos opsonizantes e fixadores de complemento. (C) Promove a diferenciação das células T CD4+ naive para a subpopulação TH1 e inibe a proliferação das células TH2. (D) Aumenta da expressão das moléculas do MHC das classes I e II. TH1 e TH2: citocinas e funções efetoras diferentes IFNG Citocina: estabelece a presença de atividade das células TH1. Receptores dos interferons e ativação da via clássica JAK-STAT IFNG STAT1 CXCL10, TGTP, CXCL9, LY6C, IGTP, IFI1, IIGP1, SAMHD1, AIF1 e genes do MHC das classes I e II Aciona a transcrição dos genes induzidos pelos interferons. Dia 7 Dia 3 Fatores reguladores do interferon Interferon gama (IRF7 e IRF9) Genes induzidos pelo Ifnγ Via molecular com genes correlacionados Ativação temporal dos indutores do interferon em fases precoces da lesão biliar, seguida da expressão de uma rede molecular dirigida pelo interferon gama, que conhecidamente polariza os linfócitos em um perfil pró-inflamatório TH1. Papel do interferon gama na obstrução das vias biliares Modelo animal Crianças SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004). MACK, C. L. et al. Armed CD4+ TH1 effector cells and activated macrophages participate in bile duct injury in murine biliary atresia. Clin. Immunol. 115, 200209 (2005). Camundongos knock out para essa citocina importância do interferon gama no desenvolvimento da obstrução biliar. Aumento da produção do interferon gama pelos linfócitos TH1 e elevação do TNF-α produzido pelos macrófagos. MACK, C. L. et al. Biliary atresia is associated with CD4+ TH1 cell-mediated portal tract inflammation. Pediatr. Res. 56, 79-87 (2004). BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of proinflammatory immunity in children with biliary atresia. Lancet 360, 16531659 (2002). Perfil de citocinas característico da presença de linfócitos TH1, a saber: IL-2, interferon gama, TNFα e IL-12. Aumento do interferon gama e do osteopontin, sinalizando a resposta TH1, bem como a desativação dos genes relacionados às imunoglobulinas. Transcriptoma: dia 7 IFNG TNFRSF1β, TNFαIP2 Mediador da resposta inflamatória Fagócitos mononucleares ativados, células T estimuladas por antígenos, células NK e mastócitos. Enzima Dia 7 Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos: linfócito T CD4+ Catepsinas Biossíntese do MHC da classe II CTSC, CTSS Processamento do antígeno H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 Expressão coordenada de genes co-relacionados Apoptose Dia 7 Mediadores da apoptose: exocitose de grânulos GZMA GZMB Papel: CTLs Lise das células-alvo Mediadores da apoptose: mediada por FasL-Fas CASP8 Expressão do FasL no epitélio dos ductos biliares pode participar da lesão progressiva dos ductos biliares intra-hepáticos após a portoenterostomia. LIU, C. et al. Expression of fas ligand on bile ductule epithelium in biliary atresia--a poor prognostic factor. J. Pediatr. Surg. 35, 1591-1596 (2000). Histologia das VBEH X transcriptoma biliar Imunidade Dia 14 Ativação: Metabolismo do ferro HAMP1 Maior ativação gênica LCN2 Diminuem a disponibilidade de ferro e, por isso, além de agirem como fatores de defesa, também podem ser responsáveis pela anemia da inflamação ou doença. Desativação: Recrutamento de linfócitos CCL21A VAP1 Silenciamento: diminuição dos processos imunes no dia 14 Transdução de sinais Dia 14 Silenciamento de genes Transdução de sinais relacionados à imunidade Fatores de transcrição das células T Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T MAP2K5 RHOB JUN Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T FKBP5 Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T expressão muito genes relacionados à resposta InibiçãoNF-κB químicaregula desse a fator: preveniu de a obstrução biliar secundária ao RRV. inflamatória/imune. FENG, J. et al. Rotavirus-induced murine biliary atresia is mediated by nuclear factor-kappaB. J. Pediatr. Surg. 40,Sinergismo 630-636 (2005).com o STAT1: sinalização da resposta aos interferons. Via molecular coordenada por genes co-relacionados: Desativação das vias responsáveis: Produção do AP-1 Ativação do NFAT Proteínas estruturais Desativados Matriz extracelular Dia 7: FBN2, ADAMTS5, COL4A5, COL14A1, PCOLCE, SPARCL1, FGFR1, GSN, MFAP2, OGN Dia 14: COL4A5, COL16A1, FBLN1, FMOD, FLRT3 Alta expressão: “morfogênese, fibrinogênese e remodelamento da matriz extracelular”. CHEN, L. et al. Altered expression of genes involved in hepatic morphogenesis and fibrogenesis are identified by cDNA microarray analysis in biliary atresia. Hepatology 38, 567-576 (2003). CHOE, B. H. et al. The pattern of differentially expressed genes in biliary atresia. J. Korean Med. Sci. 18, 392-396 (2003). Pequena quantidade de células viáveis nas fases tardias da obstrução biliar. Exclusão de segmentos atrésicos durante a ressecção da árvore biliar extra-hepática. Microscópio de captura a laser de alta resolução. Validação dos resultados dos microarranjos pela RT PCR Curva standard: expressão gênica Curva standard do gene Irf9 RT PCR: curva de dissociação Curva de amplificação do gene Stat1, das 18 amostras Resultados do RT PCR Genes escolhidos para validação dos resultados dos microarranjos: IRF7, IRF9, IFNG, IGTP, STAT1, CXCL9 e CXCL10 Etapa Gene Descrição Variação* Dia 3 IRF7 Interferon regulatory factor 7 45,2 Dia 3 IRF9 Interferon dependent positive acting transcription factor 3 gamma 7,0 Dia 7 IGTP Interferon gamma induced GTPase 35,3 Dia 7 STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1 12,7 Dia 7 CXCL10 Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 63,5 Dia 7 CXCL9 Chemokine (C-X-C motif) ligand 9 57,4 Dia 7 IFNG Interferon gamma 69,1 Quantificação da expressão gênica nos microrarranjos e na RT PCR Variação IRF7 (Dia 3) IRF9 (Dia 3) IFNG (Dia 7) IGTP (Dia 7) STAT1 (Dia 7) CXCL9 (Dia 7) CXCL10 (Dia 7) GeneChip 13 4.1 3.9 12.2 12.5 24.7 36.8 RT PCR 45.2 7.0 69.1 35.3 12.7 57.4 63.5 Diferença no grau de ativação: A RT PCR apresenta maior acurácia e sensibilidade em relação aos microarranjos de oligonucleotídeos, tendo também maior reprodutibilidade. DING, C. & CANTOR, C. R. Quantitative analysis of nucleic acids--the last few years of progress. J. Biochem. Mol. Biol. 37, 1-10 (2004). Resultados da RT PCR Validam os obtidos nos microarranjos (GeneChip®) Confirmam a existência do circuito inflamatório associado ao interferon gama. Polarização para a resposta imune adquirida TH1. Especificidade dos microarrranjos 33,1 1,2 Fígado Vias biliares *Citoqueratina-7 (KRT2-7): filamento presente nos colangiócitos Em resumo... Histologia das VBEH X transcriptoma biliar Papel do sistema imune Interferon gama, TH1 Lesão e na obstrução das vias biliares Alvos de intervenção terapêutica? Fase precoce Aumento da expressão do MHC da classe I Moléculas: processamento de antígeno para MHC da classe I Fase tardia Aumento da expressão do MHC da classe II Moléculas: processamento de antígeno para MHC da classe II Moléculas: sinapse imunológica Novos achados Apoptose Ativação da cascata do complemento Citotoxicidade mediada por anticorpos VI - Conclusões O transcriptoma da árvore biliar demonstrou a presença predominante de um processo pró-inflamatório, neste modelo experimental da atresia de vias biliares extra-hepáticas, com ativação reacional de genes em períodos específicos da progressão do processo obliterativo. Notavelmente, os animais portadores de AVBEH apresentaram ativação do interferon gama e a expressão seqüêncial de uma rede hierárquica de genes relacionados à essa citocina, o que reflete um predomínio da resposta TH1. A ativação de outros processos biológicos relacionados à apoptose, à cascata de complemento, à ADCC e aos fatores epigenéticos demonstra a presença dessas vias metabólicas durante o desenvolvimento da doença. Coletivamente, esses genes formam uma seleção transcricional altamente importante para a direção de estudos futuros, que possam explorar como genes individuais ou grupo de genes relacionados entre si podem regular o início da lesão biliar, bem como a progressão para obliteração das vias biliares. A definição dos papéis de cada componente desse circuito inflamatório deve contribuir para a elucidação dos mecanismos etiopatogênicos da AVBEH e para o advento de novas opções terapêuticas que influenciem na evolução da doença, no prognóstico do paciente e na necessidade do transplante hepático. Autores Elisa de Carvalho Cong Liu Pranavkumar Shivakumar Gregg Sabla Bruce Aronow Jorge A. Bezerra Se consegui enxergar mais longe é porque estava apoiado sobre os ombros de gigantes. Obrigada! Isaac Newton, Matemático Inglês. Processos imunes – Enzimas – Dia 7 USP18: imunidade inata. SLFN4: crescimento e desenvolvimento das células T. OASL2, OAS1G e OAS2: atividade antiviral, induzida pelos interferons. GBP1, GBP2 e GBP3: proteína ligadora de GTP com atividade GTPase, induzida pelo interferon gama durante ativação macrofágica. GZMA: apoptose. PSMB8, PSMB9 e PSMB10: processamento de antígeno para o MHC da classe I. SAMHD1: induzida pelo interferon, proteína de ligação ao GTP. CTSS e CTSC: proteólise, processamento do antígeno e geração de peptídeo para o MHC da classe II. CYBB, CYP1B1, CYBA, NCF1 e NCF2: complexo NADPH oxidase (fagocitose). PLA2G7: ativa os neutrófilos polimorfonucleares e aumenta a permeabilidade vascular. Atua na inflamação e na anafilaxia. Produzido por plaquetas, leucócitos e células endoteliais. HCK: membro da família Src da tirosina cinase, exerce papel na resposta imune inata e na sinalização para ativação do STAT 5. PTPRC (CD45R): pertence à família dos receptores da tirosina fosfatase, que desempenha papel na sinalização dos receptores dos linfócitos B e T. LYZS: tem função bacteriolítica, em tecidos e fluidos corporais. PTPN18: fosforilação de aminoácidos. Desfosforila a autofosforilada tirosina cinase. Papel da colestase: lesão histológica hepática Ácidos biliares hidrofóbicos Apoptose primária de hepatócitos PALMEIRA, C. M. & ROLO, A. P. Mitochondrially-mediated toxicity of bile acids. Toxicology 203, 1-15 (2004). Avaliação do comitê de ética médica Institutional Animal Care and Use Committee of Cincinnati Children’s Hospital Research Foundation. Transporte Dia 3 Ativados Transportadores de membrana (ATP8A1 e LAPTM4A) Transportadores nucleares (XPO7 e NUTF2) Metabolismo (STARD4) Imunidade (TAP2) Transporte de ânions (SLC4A2) Transporte de cátions (ATP6V1B2) Desativados Transporte de colesterol (APOB) Transporte de aminoácidos (SLC1A4) Controle da transcrição e da tradução Dia 14 Desativados Fatores de transcrição: TCF21, MEIS1, PBX1, ZF, CEBPG, ZBTB20, JUN Splicing do RNA: SFRS7 Tradução e síntese protéica: EIF4A2, SERPINH1 Extração: RNA das vias biliares Homogeneização e lise celular (TRIzol) Fase da separação (fenol/clorofórmio) RNA Lipídeos Carboidratos Proteínas Precipitação (isopropanol) RNA RNA TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA Obtenção do cDNA de fita dupla 2,5 μg de RNA Tampão DNase I Água Destruição do DNA Temperatura ambiente (15 min) EDTA 25mM – 65°C (10 min) Desativa a DNase Primers Nucleotídeos Mistura: anelamento RNase OUTTM 70°C (10 min) - 4°C (1 min) Anelamento Desfaz estruturas secundárias: RNA SuperScriptTM (transcriptase reversa) Tampão Agentes redutores 42°C (50 min) - 17°C (15 min) - 4°C (1 min) Formação do cDNA Destruição do RNA SupserScriptTM Reverse Transcriptase (Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA) RT PCR: Curva padrão Amostra padrão (conhecida) Coeficiente de correlação: 1.000 Amostra em estudo (concentração desconhecida) RT PCR: Curva de dissociação Controle da quantidade e da qualidade do RNA Beckman – DU® – 64 – Spectophotometer: Concentração do RNA (A260 x 4): > 2,5 μg Beckman – DU® – 64 – Spectophotometer: Pureza (260/280 nm): razão > 1,6 Agilent 2100 Bioanalyzer Qualidade do RNA Enzima Dia 3 Processos imunes OAS1G e OASL2 Enzima 2’-5’ oligoadenilato sintetase: marcador da atividade dos interferons Degradação do RNA viral Expressão gênica Transcrição: ATF5 HRMT1L2 (transcrição do STAT1) Chaperona: PDIA3 Ciclo da ubiquitina: USP1 e USP7 Metabolismo Carboidratos (glicogênio): PYGB Lipídios: LIP1 Enzima Dia 7 Receptores do interferon I e ativação da via GAS HCK Membro da família Src Ativação do STAT5 Enzima Dia 14 Ativado: GSTA2 Demonstrado previamente em análise de expressão de genes em fígado de camundongos adultos submetidos à obstrução crônica dos ductos biliares extra-hepáticos. CAMPBELL, K. M. et al. Transcriptional reprogramming in murine liver defines the physiologic consequences of biliary obstruction. J. Hepatol. 40, 14-23 (2004). Resposta da colestase crônica ou do estresse oxidativo persistente em estágios avançados da obstrução ao fluxo biliar. Proteínas estruturais Desativados VIL2 (dia 3) SVIL (dia 14) Proteína do citoesqueleto, necessária para a manutenção e a integridade das microvilosidades do bordo estriado das células epiteliais canaliculares, nas quais os transportadores de membrana da secreção biliar estão localizados. Expressão diminuída ou ausente do gene VIL nas crianças portadoras de doenças hepáticas colestáticas progressivas. PHILLIPS, M. J. et al. Abnormalities in villin gene expression and canalicular microvillus structure in progressive cholestatic liver disease of childhood. Lancet 362, 1112-1119 (2003). Transdução de sinais Dia 14 Receptores do interferon I e ativação da via GAS STAT5 Transdução de sinais Dia 7 STAT1: sinalização do interferons ARHGDIB: sinalização mediada pela proteína Rho, crucial para a ativação da LFA1 CSF2Rβ1: estimula a produção de leucócitos CEBPβ: ativa a transcrição de genes da fase aguda e participa nos mecanismos que controlam a transcrição dos genes induzidos pelo interferon Vias moleculares relacionadas à imunidade Controle da transcrição e da tradução Dia 3 Ativados Replicação e no reparo do DNA: RBBP4, MCM3, RAD23B, TDG Controle do ciclo celular: NDN Expressão gênica: Controle transcricional: FUS, ATF4, ATF5, MEF2A, DHX9, TBX2, MTA2, NDN, TCERG1, PFTF1, SMARCE1. Controle pós-transcricional - splicing do RNA: RNPC2; - tradução: PUM2, NOL5, EIF4EBP2, EIF4A1; - ubiquinização de proteínas: TRIM30, MKRN1. Processos imunes: HRMT1L2: controla a transcrição do STAT1 IRF7e IRF-9: fator regulador de interferons BACH2: controla a transcrição da AP-1 em células neurais e linfócitos Desativados: fenômenos epigenéticos Desativação das histonas (HIST1H1E, HIST2H2BE, HIST1H3A) Metilação do DNA (DNMT3A, CTCF). O papel dos fatores epigenéticos na patogênese da atresia: pacientes portadores da forma embrionária. Estrutura da cromatina: SMARCA-1, HDAC3 e RYBP ZHANG, D. Y. et al. Coordinate expression of regulatory genes differentiates embryonic and perinatal forms of biliary atresia. Hepatology 39, 954-962 (2004).
