Aula 7-2012 - Setor de Virologia UFSM

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA
BIOLOGIA MOLECULAR
Aula 7
REPLICAÇÃO DO DNA
DNA polimerases: enzimas que sintetizam DNA
- Replicação do genoma: REPLICASES
- Outras: REPARO e funções auxiliares na replicação
- Procariotas: 3 DNA polimerases (DNA pol I, II, III)
-Eucariotas: 5 polimerases (, ß, , ,  )
- Mas, apenas UMA é a replicase
PROPRIEDADES das DNA pol
- Sintetizam
DNA a partir de moldes DNA
- Necessitam de PRIMER
- Mecanismo de síntese é similar
- Síntese na direção 5’ > 3’
- Alta fidelidade
- Atividade proofreading
Polimerização
Mecanismo de Polimerização
A REPLICAÇÃO É SEMI-CONSERVATIVA
A REPLICAÇÃO É BIDIRECIONAL
A REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUA
A Síntese de uma das cadeias é CONTÍNUA
...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC
5’-UACGAUCGATCGATCG
ATCGATCGATCGATCG
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
TAGCTAGCTAGCTAGC
...5’- TACGATCGATCGATCG
LEADING strand
E A SÍNTESE DA OUTRA CADEIA????????
A direção da síntese é SEMPRE 5’ > 3’
...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC
5’-UACGAUCGATCGATCG
ATCGATCGATCGATCG
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
TAGCTAGCTAGCTAGC
...5’- TACGATCGATCGATCG
A Síntese da outra cadeia é DESCONTÍNUA
...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC
5’-UACGAUCGAUCGATCG
ATCGATCGATCGATCG
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
TAGCTAGCTAGCTAGC
...5’- TACGATCGATCGATCG
LAGGING strand
Síntese da LEADING strand
...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC
UACGAUCGAU
ATCGATCGATCGATCG
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
TAGCTAGCTAGCTAGC
...5’- TACGATCGATCGATCG
UMA ÚNICA INICIAÇÃO- PRIMER + ELONGAÇÃO
Síntese da LAGGING strand
...3’- ATGCTAGCTAGCTAGCATCGATAGATCGATAG
ATCGTTTCGCGTCTATCTGCTGCTGCTCTTAT
ATCGATCGAT
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
TAGCTAGCTA
UAGCUAGC
...5’- TACGATCGATCGATCGTAGCTATCTAGCTATC
-Vários eventos de INICIAÇÃO e ELONGAÇÃO
- Remoção dos PRIMERs
- Ligação das cadeias – Fragmentos de OKAZAKI
REPLICAÇÃO SEMIDESCONTÍNUA
(O filme)
REPLICAÇÃO EM PROCARIOTAS
DNA POLIMERASES em E.coli
- DNA pol I – REPARO (tbém auxiliar na Replicação)
- DNA pol II - REPARO
- DNA pol III – É A REPLICASE!!!!
- Apenas a I e III são ESSENCIAIS
PROPRIEDADES DAS DNA pol de E.coli
I
II
III
-Polimerização 5’>3’
+
+
+
-Atividade exonuclease
-3’>5’
+
+
+
-5’>3’
+
-
-
-Taxa de síntese por seg
600
,
30.000
-Moléculas por célula
400
,
10-20
“PROOFREADING”
(3’ > 5’ EXONUCLEASE)
DNA pol I (E.coli)
 Primeira DNA pol caracterizada
 Polipeptídeo único: 104 kDa
 Clivagem gera dois produtos: 68kDa e 35 kDa
 Klenow fragment (68kDa): polimerase, exo 3’ > 5’
 Fragmento de 35kDa: atividade 5’ > 3’ exonuclease
 Capaz de iniciar a síntese em “NICKs”(única)
Funções – -Reparo (Nick translation)
-Termina a síntese da “lagging strand”
NICK TRANSLATION
DNA pol III (Replicase de E.coli)
 Complexo enzimático (várias subunidades)
 Atividade polimerase e 3’ > 5’ exonuclease
 Síntese da leading e lagging strands
Fidelidade: 10-8 - 10-10 (1 erro/genoma/1000 ciclos)
Proofreading- aumenta fidelidade 10 a 200 vezes
 Síntese: 800 a 1000 nt/s
ETAPAS da REPLICAÇÃO
1. INICIAÇÃO
Primossoma
2. ELONGAÇÃO
Replissoma
3. TERMINAÇÃO/SEGREGAÇÃO
REPLICON: A UNIDADE DE REPLICAÇÃO
 Inicia na ORIGEM - termina no TERminador
 BACTÉRIAS: um ÚNICO REPLICON (4.000 kb)
 REPLICAÇÃO: 46’
 ORI: 245 bp
 Contém 3 (13bp repeats), 4 (9bp repeats)
 Sítios p/ ligação da proteína DnaA
ORIgem em E.coli -245 bp
-Três 13mer repeats
- Quatro 9mer repeats
Pré-INICIAÇÃO em E.coli
-DnaA liga-se nos 9mer
- Multimerização da DnaA
Forma agregados e flexionam
O DNA
Separação das cadeias
Inicia nos 13mers
-DnaB+DnaC juntam-se
Ao complexo e formam o
Complexo de iniciação
-DnaB – helicase
-DnaC- liga-se na DnaB
FUNÇÕES NO REPLICATION FORK
Função
E.coli
Helicase
DnaB
Primase
DnaG
Clamp
subunit 
Catálise
Pol III
Remoção do Primer
E substituição por DNA Pol I
Ligação dos Okazaki
Ligase
Helicase
Primase
DNApol III
SSB
DNApol I
REPLICAÇÃO EM EUCARIOTAS
EUCARIOTAS
 Múltiplos REPLICONS
 YEAST (40kb), mamíferos (100kb)
 ORI? Terminador?
 Iniciam na fase S
 Síntese (2000bp/min x 50.000/min em E.coli)
 Síntese não é simultânea
 Replicação completa em 6 horas
DNA pol de EUCARIOTAS
Pol  - Primase (síntese dos primers RNA) Ld & Lg
Pol  - Reparo
Pol  - Replicase (Ld & Lg)
Pol  - Replicação do DNA mitocondrial
Pol  - Reparo
PROPRIEDADES DAS DNA POL de EUCARIOTAS





-Polimerização 5’>3’
+
+
+
+
+
-Atividade exo 3’>5’
-
-
+
+
+
-Atividade PRIMASE +
-
-
-
-
- Localização
N
M
N
N
N
FUNÇÕES NO REPLICATION FORK
Função
E.coli
Hela cells
Helicase
DnaB
?
Primase
DnaG
Pol alfa/primase
Clamp
subunit 
PCNA
Catálise
Pol III
Pol 
Remoção do Primer
Pol I
MF1
Ligação dos Okazaki
Ligase
Ligase I
As DNA pol PRECISAM de Primer!!!!
PRIMERS utilizados pelas DNA Pol
 Primer de RNA (replicação procariotas/eucariotas)
 O próprio DNA-OH (reparo, alguns vírus)
 Proteína (alguns vírus)
Primer de RNA
(replicação Euc + Proc)
Primer de DNA
Nick + parvovírus
Proteína -0H - Adenovírus
MUTAÇÕES (definição)
Origem:
1. Erros da Polimerase durante a REPLICAÇÃO
2. Erros da Polimerase durante o REPARO
3. Lesões (cross-link) durante a interfase
Mutações em ponto, deleções e inserções
Podem ter efeitos diversos, dep. do tipo, da célula e do local
Em células somáticas: podem levar a neoplasias!
MUTAÇÕES EM PONTO:
1. De acordo com a troca de base:
Transições ou Transversões
2. De acordo com o efeito:
- Silenciosa (mesmo a.a)
- “Missense” (a.a. diferente)
- “Nonsense” (stop codon)
Não altera a fase de leitura
2. Inserção
3. Deleção
Alteram a fase de leitura (frameshift)
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