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Avaliação da atividade cicatrizante de ácido lipóico
nanoencapsulado ou livre na cicatrização de feridas
cutâneas em ratos, Ciências médicas e da saúde.
Irene Clemes Kulkamp, Marielly Nunes Souza*, Mariana Domingues
Bianchin, Mateus Isoppo**, Anna Paula Piovezan, Sílvia Stanisçuaski
Guterres (*Bolsista PUIC, **Bolsista Art. 170, Curso de Farmácia, Tubarão).
Introdução
Objetivos
Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a atividade antioxidante in vitro e o efeito
cicatrizante do acido lipoico na sua forma livre e na sua forma nanoencapsulada, em feridas
cutâneas de ratos.
Metodologia
Atividade antioxidante in vitro do ácido lipóico
A avaliação da capacidade antioxidante in vitro foi avaliada a
partir da quantificação da inibição da peroxidação lipídica pela determinação de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico TBARS, com adaptação da técnica descrita por Schaffazick e
colaboradores (2005). Como substrato para a peroxidação lipídica foi utilizado gema de ovo.
A peroxidação lipídica foi induzida pela adição de cloreto férrico e ascorbato, na presença de
nanocápsulas de ácido lipóico ou do mesmo livre. O controle negativo foi feito sem adição de
agentes antioxidantes. As amostras foram incubadas durante 30 minutos a 37 ºC e
posteriormente feita a determinação espectrofotométrica a 532. As amostras testadas foram
denominadas AL (solução de ácido lipóico 1mg/mL), NCAL (suspensão de nanocápsulas de
ácido lipóico 1 mg/mL) e NCB (suspensão de nanocápsulas sem ácido lipóico). Fez-se os
ensaios com alíquotas de 50 ou 100 µL destas amostras. As nanocápsulas foram preparadas
conforme descrito por Kulkamp e colaboradores (2009).
Experimento de cicatrização
O trabalho foi aprovado pelo comitê de ética e pesquisa da
Unisul, sob o protocolo n. 08.365.4.03.V. Foi realizado estudo experimental, com 55 ratos
machos da linhagem Wistar, com cerca de 2 meses. O grupo I recebeu uma emulsão
semisólida contendo alantoína, que foi utilizada como controle positivo, por ser uma
substância com atividade cicatrizante. O grupo II recebeu uma emulsão sem nenhum ativo
cicatrizante e sem nanocápsulas, sendo utilizada como controle negativo. O grupo III recebeu
uma emulsão semisólida contendo nanocápsulas contendo apenas um núcleo oleoso, sem
ácido lipóico. O grupo IV recebeu uma emulsão contendo nanocápsulas de ácido lipóico a 2,5
mg/mL. O grupo V recebeu uma emulsão contendo ácido lipóico livre a 2,5 mg/mL, ou seja,
não encapsulado. A emulsão base utilizada em todos os grupos (acrescida de alantoína,
nanocápsulas sem ativo, ácido lipóico ou nanocápsulas de ácido lipóico) continha como
agente espessante Poliacrilato de sódio (e) Dimeticone (e) Ciclopentasiloxano (e) Tridecete-6
(e) PEG/PPG- 18/18 Dimeticone a 4%.
No dia 0, os animais foram anestesiados com uma solução de
cetamina e xilasina, e foi confeccionada uma ferida cirúrgica com auíílio de bisturi, no dorso
de cada animal , de área 2 x 2 cm, delimitada com um carimbo. As formulações semi-sólidas
foram aplicadas diariamente sobre as feridas, na quantidade de 0,5g/mm2, durante o período
de 11 dias, tendo inicio imediatamente após o processo cirúrgico. O processo de cicatrização
foi acompanhado a partir de fotos com câmera digital, e avaliação dos aspectos
macroscópicos das lesões nos dias 0, 4, 7 e 11 após a confecção das feridas. A área da lesão
foi calculada pelo programa Image J. Os resultados foram avaliados por análise de
variância e teste de Tukey, considerando nível de significância de 0,05%, utilizando o
software Statgraphics 5.1.
Avaliação da atividade antioxidante in vitro
Observou-se na avaliação da atividade antioxidante in vitro
que a diferença na quantidade de malondialdeído formada entre os grupos foi significativa
(p < 0,001). A quantidade de malondialdeído formada indica a atividade antioxidante, por se
tratar de produto da peroxidação lipíca. Quanto menor a quantidade de malondialdeído
formada, maior a atividade antioxidante (Lima et al, 2001).
0.0000025
Concentração Molar de Malondialdeído
Devido a complexidade do processo de cicatrização e do
envolvimento dos radicais livres neste processo, surge o interesse em utilizar antioxidantes.
Algumas substâncias antioxidantes tem sido testadas e demonstrado efeito neste sentido. O
ácido lipóico, um antioxidante presente em pequenas quantidades nos organismos vivos
participa em diversos processos metabólicos, tendo as propriedades de: quelar metais,
capacidade de reter espécies reativas ao oxigênio, capacidade de regenerar antioxidantes
endógenos (como vitamina C e glutationa) e participação no reparo de sistemas. Embora
existam relatos da promoção da cicatrização pelo seu uso via oral, não foram encontrados
estudos controlados relacionados com o seu uso tópico no processo de reparação de feridas.
Em virtude de o ácido lipóico ser um composto altamente instável, devem ser buscadas
alternativas tecnológicas para permitir a sua veiculação em formulações de uso tópico, tendo
em vista a manutenção das suas propriedades. Demonstrou-se que a nanoencapsulação do
ácido lipóico aumenta a estabilidade do mesmo, permitindo a sua veiculação em um veiculos
para aplicação tópica.
Adicionalmente, as nanopartículas poliméricas podem ser
usadas como reservatórios de fármacos lipofílicos e são capazes de prolongar e controlar a
liberação percutânea de fármacos, podendo aumentar a adesividade e o tempo de
permanência de fármacos na pele. A nanoencapsulação de substâncias antioxidantes pode
ainda potencializar a sua ação, a exemplo da nanoencapsulação da melatonina, um fármaco
antioxidante que teve seu potencial substancialmente aumentado através da encapsulação
em nanocarreadores. No entanto, com as pesquisas realizadas até o momento, não se sabe
qual o efeito que a nanoencapsulação exerce sobre a atividade antioxidante do ácido lipóico.
Assim, o estudo da atividade antioxidante de nanocápsulas de ácido lipóico complementa
estudos anteriormente realizados podendo demonstrar a potencialidade da
nanoencapsulação no aumento do efeito antioxidante do mesmo.
Resultados
Sem antioxidante
0.000002
Al 50uL
0.0000015
AL 100uL
NCAL 50uL
0.000001
NCAL 100uL
NCB 50uL
0.0000005
NCB 100uL
Observou-se que o ácido lipóico livre exerceu
atividade pró-oxidante, aumentando a quantidade
de malondialdeído formada, em comparação com
o controle que não utilizou antioxidante (Figura 1).
Embora
diversos
trabalhos
na
literatura
demonstrem efeito antioxidante do ácido lipóico,
tem-se demonstrado que o mesmo pode também
exercer atividade pró-oxidante (Çakatai, 2006).
0
1
Por outro lado, observa-se que as nanocápsulas além de diminuírem o efeito pró-oxidante
do ácido lipóico livre, também exerceram, atividade antioxidante. Isto pode ser explicado,
primeiramente pela propriedade da nanoencapsulação em potencializar a atividade
antioxidante de substânciasou ainda pela presença de BHT nas nanocápsulas, que pode
estar exercendo efeito sinérgico com ácido lipóico.
Avaliação da cicatrização em feridas cutâneas em ratos
Nos dias 0, 4 e 11 não foi observada diferença estatística nas
áreas das lesões dos animais.
Observou-se maior diferença na
área das lesões no 7º dia de análise, conforme apresentado na figura 2 (p = 0,0348).
Observou-se diferença estatística entre o grupo controle positivo (I) e controle
negativo (II), o que valida o método utilizado. Observou-se que o ácido lipóico livre
(V) foi mais efetivo na cicatrização, diferindo significativamente do controle negativo
(II) e mostrando atividade semelhante ao controle positivo (I). Por outro lado, a
atividade cicatrizante das nanocápsulas de ácido lipóico (IV) foi significativamente
inferior ao do ácido lipóico livre (V).
É possível que o maior efeito cicatrizante verificado no
ácido lipóico livre seja devido à sua atividade próoxidante verificada in vitro, já que tem-se mostrado que
agentes oxidantes, podem atuar como sinalizadores
celulares. Relata-se que radicais livres e o estado redox
são importantes no controle da coagulação sangüínea e
trombose, fases envolvidas na cicatrização de feridas. A
produção de colágeno também é associada com a
produção de peróxido de hidrogênio. Evidencia
adicional demonstra a capacidade pró-angiogênica de
oxidantes (Sem e Roy, 2008).
Para explicar explorar melhor os resultados, estudos complementares de atividade
antioxidante, avaliação das características histológicas e determinação do conteúdo
de hidroxiprolina são considerados como perspectivas do presente trabalho.
Conclusões
Verificou-se que o ácido lipóico exerceu atividade pró-oxidante em modelo de peroxidação
lipídica in vitro, e que a nanoencapsulação do ácido lipóico evitou este efeito pró-oxidante e
exerceu atividade antioxidante. Por outro lado, o ácido lipóico livre mostrou efeito superior
ao nanoencapsulado na atividade cicatrizante in vivo, com efeito semelhante ao controle
positivo. Concluiu-se que o efeito superior na cicatrização de feridas demonstrado pelo
ácido lipóico livre em relação ao nanoencapsulado pode estar relacionado com sua
atividade pró-oxidante.
Agradecimentos
Agradecemos aos professores Renê Darela Blazius , João Alex Alves e Luiz Alberto Kanis
bem como ao apoio financeiro recebido pelo programa Unisul de Iniciação científica e bolsa
do artigo 170.
Bibliografia
ÇAKATAI, U. Pro-oxidants action of alfa lipoic acid and dihydrolipoic acid, Medical
Hypotheses 66, 110–117, 2006.; FESSI, H.; PUISIEUX, F.; DEVISSAGUET, J-Ph; Ammoury,
N.; Benita, S.; Int J. Pharm. 55, r1, 1989.; GUTERRES SS, ALVES MP, POHLMANN AR.
Drug Target insights, 2:147-157, 2007.; LIMA, ES E ABDALLA, DSP. Peroxidação lipídica:
mecanismos e avaliação em amostras biológicas. Revista Brasileira de Ciências
Farmacêuticas 37(3), 2001.; SEM, KC, ROY, SASHWATI. Biochimica et Biophysica Acta,
1780:1348-1361, 2008.;SCHAFFAZICK, S.R., POHLMANN, A.R., DE CORDOVA, C.A.S.,
CRECZYNSKI-PASA, T.B., GUTERRES, S.S. International Journal of Pharmaceutics, 2005.
p.210-213