Instrumentação laboratorial clínica
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Instrumentação laboratorial clínica É função do laboratório clínico analisar amostras retiradas de pacientes de modo a obter informação que possa contribuir para o diagnóstico e para a avaliação da eficácia das terapias. As principais secções do laboratório clínico são a química, a hematologia e a microbiologia. A secção de química realiza análises ao sangue, urina, fluído cerebrospinal e outros fluidos para determinar as quantidades presentes para várias substâncias clinicamente importantes. A secção de hematologia realiza a determinação do número e características dos vários elementos do sangue (glóbulos vermelhos e brancos e plaquetas) A secção de microbiologia realiza estudos em vários tecidos e fluidos corporais para determinar se estão presentes microrganismos patológicos 508 Instrumentação laboratorial clínica Exemplo 1 – H.U.C. A Área de Administração I integra os designados Meios Complementares de Diagnóstico e Terapêutica e Serviços de Apoio Clínico e engloba os seguintes serviços: Anatomia Patológica Imunohemoterapia Imagiologia Esterilização Central Patologia Clínica Centro de Responsabilidade de Medicina Física e de Reabilitação Laboratório de Hematologia Centro de Responsabilidade de Medicina Nuclear O LH desenvolve a sua actividade de modo a fornecer resultados de estudos analíticos e propostas de diagnóstico laboratorial, no âmbito da Hematologia Laboratorial, cobrindo as seguintes valências: Citometria, Citologia, Imunidade Celular, Hemostase, Biologia Molecular e Bioquímica. 509 Instrumentação laboratorial clínica Espectrofotometria A espectrofotometria é a base de muitos dos instrumentos utilizados em química clínica. Tal sucede devido à facilidade de medição, à boa precisão e exactidão e à adequação das técnicas espectrofotométricas a procedimentos de medição automáticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção ou emissão selectiva, para diferentes comprimentos de onda, das substâncias de interesse clínico. 510 Instrumentação laboratorial clínica Algumas definições Lc Lei de Beer: I1 I0 10 A absorvância ou densidade óptica é dada por: A L c log10 I1 I0 A percentagem de transmitância é definida por: I %T 100 1 100 10L c I0 onde I0 é a irradiância da luz incidente (W·m-2) I1 é a irradiância após a passagem pela amostra (W·m-2) L é a distância percorrida pela luz na amostra (cm) c é a concentração de espécies absorventes no material (mol·l-1) é o coeficiente de absorção (ou absortividade molar) do absorvente (l mol-1·cm-1) 511 é o comprimento de onda da luz Instrumentação laboratorial clínica Algumas definições Então A log10 I0 100 log10 2 log10 %T I1 %T A concentração de uma substância é determinada a partir de um padrão de concentração conhecida dessa mesma substância Ad Cd Cp A p 512 Instrumentação laboratorial clínica Sistema espectrofotométrico 513 Instrumentação laboratorial clínica Métodos instrumentais de análise - Cromatografia A cromatografia (correctamente devia dizer-se cromatologia) é o método mais generalizado de realizar separações analíticas. O termo engloba um conjunto de métodos que permite a separação de componentes de misturas complexas Em todas as separações cromatográficas a amostra está dissolvida numa fase móvel, que pode ser um gás, um líquido ou um fluído supercrítico*. Esta fase móvel é forçada a atravessar uma fase estacionária imiscível que está fixa numa coluna ou numa superfície sólida. As duas fases são escolhidas de forma a que os componentes da amostra se distribuam de forma diferente entre as fases estacionária e móvel. * Um fluído supercrítico é qualquer substância a uma pressão e temperatura acima do ponto crítico 514 Instrumentação laboratorial clínica Métodos instrumentais de análise - Cromatografia Os componentes que forem fortemente retidos pela fase estacionária movem-se lentamente com o fluxo da fase móvel. Componentes fracamente retidos acompanham rapidamente o movimento da fase móvel Em consequência destas diferenças de mobilidade, os componentes da amostra separam-se em bandas discretas que podem ser analisadas quantitativamente ou qualitativamente * Um fluído supercrítico é qualquer substância a uma pressão e temperatura acima do ponto crítico 515 Instrumentação laboratorial clínica Métodos instrumentais de análise - Cromatografia A classificação dos métodos de cromatografia pode ser feita com base em duas categorizações distintas: A primeira baseia-se nos métodos físicos utilizados para colocar em contacto as fases estacionária e móvel na cromatografia de coluna a fase estacionária é mantida num tubo estreito através do qual a fase móvel é forçada por gravidade ou pressão na cromatografia planar a fase estacionária é suportada numa placa plana ou nos interstícios de um papel. Aqui a fase móvel é forçada por gravidade ou por capilaridade. 516 Instrumentação laboratorial clínica Métodos instrumentais de análise - Cromatografia A segunda classificação é mais fundamental e baseia-se nos tipos de fases móvel e estacionária e nos tipos de equilíbrio envolvidos na transferência de solutos entre fases. Surgem as classificações cromatografia líquida (LC), cromatografia gasosa (GC) e cromatografia supercrítica (SFC) conforme o tipo de fase móvel empregue. A cromatografia líquida é a única que pode ser executada quer em coluna quer em suporte de papel. As cromatografias gasosa e de fluído supercrítico estão limitadas aos procedimentos com coluna. 517 Instrumentação laboratorial clínica Métodos instrumentais de análise - Cromatografia Classificação Geral Cromatografia Líquida Cromatografia Gasosa Cromatografia Supercrítica Método Específico Fase estacionária Tipo de equilíbrio Líquido – líquido, ou partição Líquido adsorvido num sólido Partição entre líquidos imiscíveis Líquido - fase ligada Espécie orgânica ligada a uma superfície sólida Partição entre líquido e superfície ligada Líquido - sólido, ou adsorção * Sólido Adsorção Permuta iónica Resina de permuta iónica Permuta iónica Exclusão molecular Líquido nos interstícios de um polímero sólido Partição Gás – líquido Líquido adsorvido num sólido Partição entre gás e líquido Gás - fase ligada Espécie orgânica ligada a uma superfície sólida Partição entre líquido e superfície ligada Gás - sólido Sólido Adsorção Espécie orgânica ligada a uma superfície sólida Partição entre fluído supercrítico e superfície ligada Fonte: Principles of Instrumental Analysis, D. Skoog e J. Leary. 4ª Edição * fixação de moléculas de gases ou líquidos à superfície de outra substância 518 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas Amostra Fase móvel Eluição: processo de remoção de um material adsorvido (adsorvato) de um adsorvente, com um líquido (eluente) A+B B A A eluição implica o transporte de uma espécie através da coluna pela adição contínua de uma fase móvel. B A No instante t0, uma porção única de amostra, contida na fase móvel, é introduzida no topo de uma coluna. B A t0 t1 Sinal do Detector t2 B t3 A t0 t1 t2 t4 Detector Os componentes da amostra distribuem-se entre as duas fases. B t3 t4 519 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas Amostra Fase móvel A introdução de fase móvel adicional (o eluente) força esta fase a descer a coluna, ocorrendo mais partição da amostra entre a fase móvel e partes “frescas” da fase estacionária (t1) A+B B A B A B A t0 t1 Sinal do Detector t2 B t3 A t0 t1 t2 t4 B t3 t4 Detector A adição contínua de fase móvel arrasta moléculas dos analitos ao longo da coluna, num processo contínuo de transferências entre as fases móvel e estacionária. 520 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas Amostra Fase móvel A+B Contudo, como o movimento das componentes da amostra só pode ocorrer na fase móvel, a taxa média a que uma espécie migra depende da fracção de tempo que a espécie permanece nessa fase. B A B A B A t0 t1 Sinal do Detector t2 B t3 A t0 t1 t2 t4 Detector B t3 t4 521 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas Amostra Fase móvel Esta fracção de tempo é pequena para substâncias que sejam fortemente retidas pela fase estacionária (B) e é elevada quando a retenção na fase móvel é mais provável (A). A+B B A B A B A t0 t1 Sinal do Detector t2 B t3 A t0 t1 t2 t4 Detector Idealmente, as diferenças nas taxas de migração levam a que os componentes da mistura se separem em bandas localizadas ao longo da coluna (t2). B t3 t4 522 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas Amostra Fase móvel A+B O isolamento das espécies separadas é conseguido fazendo passar uma quantidade suficiente de fase móvel pela coluna para que as componentes atinjam a sua extremidade onde podem ser detectadas ou recolhidas (t3 e t4) B A B A B A t0 t1 Sinal do Detector t2 B t3 A t0 t1 t2 t4 Detector B t3 t4 523 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas A figura mostra os perfis de concentração para as espécies A e B em dois fases do processo de eluição (t1 e t2). A espécie B é mais retida pela fase estacionária e, como tal, durante a migração, o seu pico surge atrasado relativamente à espécie A. Concentração O movimento ao longo da coluna aumenta a distância entre os dois picos. Simultaneamente ocorre alargamento das duas bandas o que diminui a eficiência da coluna como dispositivo de separação. O alargamento das bandas é inevitável. Contudo é possível determinar condições em que este alargamento ocorre mais lentamente do que a separação entre bandas. t1 Deste modo, desde que a coluna seja suficientemente longa é possível assegurar uma boa resolução das espécies contidas na amostra. t2 B A B Distância A 524 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas – Coeficientes de partição A eficiência de uma coluna de cromatografia na separação de dois analitos depende das taxas relativas a que as duas espécies são eluídas. Estas taxas são determinadas pelo valor das constantes de equilíbrio das reacções pelas quais as espécies se distribuem entre as fases móvel e estacionária. Muitas vezes o equilíbrio de distribuição envolvido na cromatografia pode ser descrito por equações simples que envolvem a transferência de um analito entre A estacionaria as 2 fases. Para uma espécie A podemos escrever A movel 525 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas – Coeficientes de partição A constante de equilíbrio para este equilíbrio designa-se por coeficiente de partição e é definida por: c K E cM cM e cE são as concentrações molares de analito nas fases móvel e estacionária, respectivamente. Idealmente K é constante para uma gama larga de concentrações. A cromatografia em que esta equação se aplica designa-se por cromatografia linear. Só estudaremos este tipo de cromatografia 526 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas – Tempo de retenção A figura mostra um cromatograma típico para uma amostra com um único analito. O tempo que decorre desde a introdução da amostra até à chegada do pico do analito ao detector é denominado tempo de retenção. Sinal do detector O pico pequeno resulta de uma espécie não retida pela coluna. Muitas vezes a amostra ou a fase móvel contém uma espécie deste tipo. O tempo necessário para que a espécie não retida atinja o detector é designado por tempo morto tR A velocidade média de migração do analito é L v tR com L o comprimento da coluna. tM A velocidade média das moléculas da fase móvel é Tempo u L tM 527 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas – Relação entre tempo de retenção e coeficientes de partição De forma a relacionar o tempo de retenção de uma espécie molecular com o seu coeficiente de partição, expressa-se a sua velocidade de migração em função da velocidade da fase móvel. v = u · (fracção de tempo que o analito passa na fase móvel) 528 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas – Relação entre tempo de retenção e coeficientes de partição Esta fracção corresponde ao quociente entre o número médio de moles de analito na fase móvel e o número total de moles do analito presentes na coluna: moles de analito na fase movel v u moles de analito na coluna cM VM v u c V c V M M E E 1 v u 1 cE VE cM VM cM e cE - concentrações molares de analito nas fases móvel e estacionária, respectivamente VM e VE - volumes das fases móvel e estacionária, respectivamente 529 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas – Relação entre tempo de retenção e coeficientes de partição Usando a definição de coeficiente de partição obtém-se: 1 v u 1 K VE VM Esta equação relaciona a velocidade de migração de um analito com o seu coeficiente de partição e com os volumes das duas fases. Estes volumes podem ser estimados a partir do método de preparação da coluna. O factor de capacidade de uma espécie A define-se por: V k 'A K A E VM Logo 1 v u ' 1 k A 530 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas – Relação entre tempo de retenção e coeficientes de partição O factor de capacidade de uma espécie pode ser obtido a partir da análise do cromatograma: 1 v u ' 1 k A L L tR tM k 'A 1 ' 1 k A tR tM tM Quando o factor de capacidade de uma espécie é muito inferior à unidade a eluição ocorre tão rapidamente que a determinação exacta dos tempos de retenção é difícil. Se o factor de capacidade for superior a 20 os tempos de eluição são muito longos. Idealmente as separações são realizadas em condições para as quais os factores de capacidade de um componente de uma mistura se situam entre 1 e 5. 531 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas – Factor de selectividade O factor de selectividade de uma coluna para duas espécies A e B é definido por KB KA com KB o coeficiente de partição para a espécie mais fortemente retida e KA o coeficiente de partição para a espécie menos retida (ou mais eludida). De acordo com esta definição, é sempre maior que 1. Atendendo à definição de factor de capacidade podemos escrever k B' ' kA ou ainda tR B tM tR A tM 532 Instrumentação laboratorial clínica Cromatografia de eluição em colunas – Resolução de uma coluna R Z WA WB 2 2 2 Z R WA WB R 2 tR B tR A Sinal do detector A resolução de uma coluna mede a sua capacidade para separar dois analitos. Define-se a partir da expressão Z A B WA WB Tempo WA WB Uma resolução de 1.5 garante a separação completa das bandas (0.3 % de sobreposição). Para uma resolução igual a 1 a sobreposição é de cerca de 4%. 533 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese A electroforese é um processo no qual espécies com carga eléctrica (iões ou partículas coloidais) são separadas com base na sua diferente mobilidade sob a acção de um campo eléctrico. Pode ser definida como o movimento de uma fase sólida relativamente a um líquido. Este líquido, designado por solução tampão, é suportado por uma substância sólida denominada meio. A solução tampão desempenha duas funções: transportar a corrente eléctrica e manter constante o pH e a força iónica do meio durante a migração das moléculas. É uma técnica muito utilizada na separação de proteínas e de ácidos nucleicos, uma vez que estas são moléculas ionizáveis (proteínas) ou com carga eléctrica (proteínas, ácidos nucleicos). 534 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese Vamos limitar a nossa discussão à electroforese de zona ou de suporte que é o tipo de electroforese utilizado em química clínica. Nesta técnica a amostra é aplicada no meio. Sob a acção do campo eléctrico, grupos de partículas de dimensões, carga e forma idênticas migram a velocidades idênticas. Isto resulta na separação das partículas em zonas. 535 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese As separações electroforéticas são normalmente realizadas em géis que actuam como filtros, condicionando as velocidades de migração das moléculas: as moléculas mais pequenas deslocam-se mais rapidamente enquanto que as moléculas de maiores dimensões deslocam-se mais lentamente. Utilizam-se normalmente géis de agarose para separar ácidos nucleicos e géis de acrilamida para separar proteínas Aparelho de electroforese de DNA. Coloca-se um gel de agarose na caixa que contém solução tampão. 536 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – Princípios fundamentais A força exercida por um campo eléctrico de intensidade E sobre uma partícula carregada com carga eléctrica q é: Fe q E quando a partícula se desloca num gel fica sujeita a uma força de atrito: Fa v f com v a velocidade da partícula e f o coeficiente de atrito viscoso. Atingida a velocidade limite tem-se: qE v f 537 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – Princípios fundamentais A mobilidade de uma partícula é definida como sendo a distância em centímetros percorrida pela partícula por unidade de tempo e por unidade de intensidade de campo eléctrico. Esta definição normaliza a mobilidade ao campo eléctrico aplicado. Temos então v q E f Esta expressão aplica-se apenas a concentrações de iões muito baixas e a meios não condutores. As moléculas poli-iónicas estão rodeadas por uma nuvem de iões de sinal contrário que altera o campo eléctrico efectivo aplicado aos iões a separar. Isto leva a que a expressão anterior seja uma fraca aproximação do que se passa em electroforese. 538 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – Princípios fundamentais A mobilidade depende quer de propriedades das partículas (densidade de carga superficial, tamanho) e de propriedades do meio (força iónica, permitividade eléctrica, pH, temperatura). Para forças iónicas elevadas a equação de Smoluchowski dá uma expressão aproximada da mobilidade electroforética: ez h em que e é a permitividade do meio, h é a viscosidade do meio e z é o potencial da superfície da partícula. A força iónica de uma meio depende da concentração de todos os iões presentes na meio: I 1 c i qi2 2 i em que ci é a concentração molar do ião i e qi é a carga do ião i. 539 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – Princípios fundamentais Os aminoácidos, os péptidos ou as proteínas apresentam carácter anfotérico (i.e. são capazes de dar ou aceitar protões pelo que tanto podem actuar como ácidos ou como bases). Isto sucede devido à coexistência, em cada molécula, de funções ácidas (-COOH) e básicas (-NH2). As substâncias anfotéricas, em meio ácido, comportam-se como bases fracas, captando iões H+. Em meio alcalino, actuam como ácidos fracos libertando protões. 540 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – Princípios fundamentais É muito raro que os grupos -NH2 e -COOH coexistam em número igual na forma livre. É ainda mais raro que estes grupos funcionais sejam ionizados de igual modo [pK (COOH) = 2,4 e pK (NH2) = 9-12]. Assim, podemos concluir que cada molécula anfotérica possui o seu ponto isoeléctrico característico. Define-se ponto isoeléctrico como o pH para o qual uma substância não se desloca sob a influência do campo eléctrico, ou seja, é electricamente neutra. 541 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – Princípios fundamentais A carga eléctrica das proteínas depende do pH do meio. Se o pH é superior ao ponto isoeléctrico, a proteína fica com carga negativa e migra para o ânodo. Se o pH é inferior ao ponto isoeléctrico, a proteína é carregada positivamente e migra para o cátodo. 542 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – Princípios fundamentais Como vimos, a velocidade de migração das proteínas na electroforese é directamente proporcional à sua carga eléctrica e inversamente proporcional ao seu peso molecular. O deslocamento das partículas é ainda influenciado pela força iónica do meio e pela temperatura. Numa electroforese mantêm-se constantes o pH e a força iónica do meio, através de uma solução tampão. 543 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – Princípios fundamentais O fluxo de corrente eléctrica através do meio gera calor. Este calor tem dois efeitos importantes na electroforese. Por um lado, leva ao aumento da temperatura do meio o que leva à diminuição da sua resistência eléctrica e consequente aumento da velocidade de migração. Por outro lado, o calor produz evaporação da água à superfície do meio. Isto resulta num aumento da concentração de partículas e leva igualmente ao aumento da velocidade de migração. 544 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – Princípios fundamentais Devido a estes efeitos é necessário manter constante a tensão aplicada ou a corrente eléctrica, de forma a assegurar a reprodutibilidade da técnica. Estes problemas são muito significativos quando o meio utilizado é um gel. Com este tipo de meio devem-se utilizar fontes de corrente para minimizar os efeitos das produção de calor. 545 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – aplicações clínicas Todos os fluidos biológicos contêm uma mistura heterogénea de proteínas. A electroforese tem sido aplicada ao estudo de proteínas séricas, proteínas da urina, proteínas do líquido cefalo-raquídeo, lipoproteínas e glicoproteínas séricas. A análise electroforética das proteínas séricas ou proteinograma electroforético, é um exame frequentemente requisitado na prática clínica diária, devido ao seu valor no auxílio do diagnóstico de variadas doenças. Utiliza-se em geral uma electroforese a um pH básico, sendo as moléculas proteicas essencialmente separadas com base na sua carga O aspecto global do perfil electroforético, é por vezes suficiente para referenciar de imediato algumas anomalias proteicas características. A electroforese desempenha um papel importante no diagnóstico de mieloma múltiplo, macroglobulinémia, enteropatia exudativa, sindroma nefrótico, cirrose, sarcoidose e de várias doenças do colagénio. 546 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – aplicações clínicas Na electroforese de zona utilizada em química clínica, a fase aquosa é estabilizada sobre um suporte poroso impregnado de solução tampão condutora. A principal aplicação desta técnica é no fraccionamento das proteínas e lipoproteínas séricas. A electroforese comporta 3 fases: 1ª fase - electroforese propriamente dita, em que há separação das diferentes fracções proteicas. 2ª fase - revelação (coloração e lavagem dos meios de suporte) 3ª fase - leitura (avaliação quantitativa das diversas fracções). Quando colocamos as proteínas do soro num campo eléctrico com meio de pH 8.6, elas comportam-se como aniões, deslocando-se para o pólo positivo (ponto isoeléctrco (pI) da albumina = 4.5; pI g-globulina 7.5). 547 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – aplicações clínicas A revelação da electroforese por ser realizada por diferentes processos, conforme o que se pretende evidenciar. Exemplos cadeias peptídicas - corante específico (azul de Coomassie R): proteinograma fracções glucosídicas das glicoproteínas - corante para glícidos (Mac. Manus reagente de Schiff): glicoproteinograma estruturas lipídicas das lipoproteínas - corante para lípidos (negro de Sudão): lipoproteinograma 548 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – aplicações clínicas Proteinograma Num proteinograma, observam-se 5 zonas de migração (bandas) em que a mais próxima do ânodo corresponde à albumina (menor peso molecular e maior carga eléctrica negativa) e as seguintes às globulinas 1, 2, b e g, respectivamente. Os valores normais destas fracções proteicas no soro (em %) são: Albumina 50-60 % Globulina 1 3-5 % Globulina 2 5-10 % Globulina b 10-15 % Globulina g 15-20 % 549 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – aplicações clínicas Glicoproteinograma (glicidograma) No glicidograma, observam-se normalmente 3 bandas principais, a nível das 1, 2 e b-globulinas, e mais 2 bandas menores, ao nível da seroalbumina e das globulinas. 550 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – aplicações clínicas Lipoproteinograma (Lipidograma) No lipidograma aparecem, em condições normais, três fracções: -lipoproteínas, situadas em geral entre a albumina e as 1-globulinas. Correspondem a lipoproteínas de alta densidade (HDL): 20-25 %. b-lipoproteínas, localizadas a nível das bglobulinas. Correspondem às lipoproteínas de baixa densidade (LDL), caracterizadas pela sua riqueza em colesterol: 45-50%. uma terceira zona menos constante encontrada entre as b-lipoproteínas e a linha de partida e que corresponde às lipoproteínas de densidade inferior à unidade, caracterizadas por um teor muito elevado em triglicerídeos: 84 %. 551 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese – Procedimento e Instrumentação Ilustramos aqui um procedimento de electroforese em que o meio de suporte é um acetato de celulose, meio que continua a ser muito utilizado em laboratórios clínicos. A tira de acetato de celulose é saturada com a solução tampão e é colocada no seu suporte (“ponte”). A ponte é colocada com ambas as extremidades em contacto com a solução tampão. As amostras a testar são colocadas na tira de acetato em locais marcados. Tipicamente cada tira pode ser utilizada para analisar até 8 a 10 amostras 552 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese - Procedimento e Instrumentação Com este tipo de electroforese utilizam-se fontes de tensão. Um valor típico de tensão é 250 V (corrente inicial na gama de 4 a 6 mA). A tensão é aplicada durante 15 a 20 minutos. O passo seguinte consiste na fixação e marcação das bandas de proteínas de forma a poderem ser detectadas e quantificadas. O processo de fixação e marcação pode ser feito em exposições separadas ou combinadas a um fixador e a um corante. No final deste processo a membrana é “limpa” de forma a ficar transparente, processo que não afecta as bandas correspondentes às espécies coradas. A membrana é seca em preparação para o processo de densitometria. 553 Instrumentação laboratorial clínica Electroforese - Procedimento e Instrumentação O densitómetro é um dispositivo que inclui uma fonte de luz, filtros e um detector, tipicamente um fotodíodo. Mede-se a quantidade de luz absorvida. O aparelho varre a trajectória de migração de uma amostra. A saída de baixa tensão do detector é amplificada por um pré-amplificador muito estável e integrada (filtragem de alta frequência e medição da área de baixo de pico). Os dados são registados por um registrador x-y. 554 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Conceitos básicos Vamos discutir apenas aspectos relacionados com a medição dos constituintes do sangue: glóbulos vermelhos (RBCs – Red Blood Cells), glóbulos brancos (WBCs – White Blood Cells) e plaquetas. Normalmente existem 5 tipos de WBCs no sangue periférico. Por ordem decrescente de número no sangue de um adulto: neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. O parâmetro básico que se pretende medir é o número de constituintes de cada tipo por microlitro. o valor normal de RBCs por microlitro num homem adulto é 4.6 a 6.2 x 106. Para uma mulher adulta a gama de valores é de 4.6 a 5.4 x 106. as gamas de WBCs e plaquetas são independentes do género. Para as WBCs temos 4500 a 11000 por microlitro. Quanto às plaquetas, 150000 a 400000 por microlitro. O hematócrito (HCT) é o quociente entre o volume de todos os constituintes do sangue e o volume total da amostra de sangue. É apresentado como percentagem. As gamas normais são 40 a 54% nos homens e 35 a 47% nas 555 mulheres. Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Conceitos básicos As gamas normais de hemoglobina (Hb) são 13.5 a 18 g/dl nos homens e 12 a 16 g/dl nas mulheres. Um segundo conjunto de medidas destina-se a caracterizar o volume das RBCs e a concentração da Hb. Incluem o volume corpuscular médio (MCV - Mean Corpuscular Volume), medido em m3, a hemoglobina corpuscular média (MCH - Mean Corpuscular Hemoglobin), medida em picogramas e a concentração média de hemoglobina corpuscular (MCHC - Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration), medida em percentagem. Estas medidas constituem os chamados índices RBC. Os valores normais são: MCV: 82 – 98 m3 MCH: 27 – 31 pg MCHC: 32 – 36% 556 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Conceitos básicos Algumas das medidas que apresentámos pode ser relacionadas entre si: MCV 10 HCT Contagem de RBCs MCH 10 Hb Contagem de RBCs MCHC 100 Hb HCT 557 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Conceitos básicos 558 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Instrumentação Existem duas classes principais de dispositivos para medir a características do sangue. Uma classe corresponde a instrumentos cujo princípio de medição é a variação na resistência eléctrica de uma solução quando os constituintes do sangue passam por uma abertura. A outra classe utiliza, para fazer as medições, a deflexão de um feixe de luz provocada pela passagem dos constituintes do sangue. A empresa Coulter Corporation fabrica equipamentos que pertencem à primeira destas classes. Como esta empresa é líder na venda de analisadores de sangue vamos estudar aqui um dos seus produtos, bem representativo desta classe de equipamentos: o Coulter STKS 559 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Instrumentação: Coulter STKS 560 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Instrumentação: Coulter STKS 561 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Instrumentação: Coulter STKS A amostra é sangue anticoagulado com EDTA. Este anticoagulante impede a agregação dos constituintes do sangue que, a ocorrer, resultaria em erros na sua contagem. O volume da amostra deve ser cuidadosamente medido antes de ser introduzido no aparelho. No diluidor I, a amostra é diluída para 1:224 com uma solução de osmolaridade semelhante à do plasma. A amostra diluída é separada: parte vai para o diluidor II, parte vai para a câmara de mistura e lise. Diluting fluid Diluter I WBC stabilizing agent Lysing agent Diluter II Lysing and mixing Lysing and mixing Triple transducer WBC bath module Hgb Hemoglobinometer RBC bath C C C C C C Analyzer computer Laboratory computer system Data management system Printer 562 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Instrumentação: Coulter STKS A função da câmara de mistura e lise é preparar a amostra para as medições do seu conteúdo de hemoglobina e da contagem de WBCs. o agente de lise provoca a hemólise fazendo com que os RBCs soltem o seu conteúdo de hemoglobina para a solução. As WBCs não são alteradas pelo agente de lise. Diluting fluid Diluter I WBC stabilizing agent A adição do agente de lise aumenta o volume da amostra para 1:250. Uma segunda substância –solução de Drabkin – converte a hemoglobina em cianometemoglobina, de forma a cumprir a norma padrão de determinação da concentração de hemoglobina. Lysing agent Diluter II Lysing and mixing Lysing and mixing Triple transducer WBC bath module Hgb Hemoglobinometer RBC bath C C C C C C Analyzer computer Laboratory computer system Data management system Printer 563 Instrumentação laboratorial clínica Vacuum (6"Hg) Hematologia – Instrumentação: Coulter STKS De seguida a amostra passa através do banho de WBCs que funciona como uma cuvete para a determinação do conteúdo de hemoglobina por espectrofotometria. O passo final neste processo é a contagem de WBCs. A figura ilustra o método utilizado para esta contagem (e para a contagem de RBCs) Aperture current Internal electrode + External electrode - Blood cell suspension Sample beaker Uma bomba de vácuo retira um volume controlado de fluido do banho de contagem através da abertura. Entre os 2 eléctrodos circula uma corrente constante, que atravessa a abertura. Sempre que cada WBC passa pela abertura desloca um volume de solução igual ao seu próprio volume. Como a resistência eléctrica do WBC é muito superior à resistência eléctrica da solução, a passagem de WBCs pela abertura é assinalada por picos de tensão no circuito que liga os dois eléctrodos (amplitude = volume). Aperture Aperture tube 100 m 75 m Detail of aperture (WBC) 564 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Instrumentação: Coulter STKS Para aumentar a exactidão da medida, o sistema utiliza 3 unidades de contagem em WBC stabilizing paralelo. As unidades partilham agent o eléctrodo do banho de contagem. Os eléctrodos do tubo de abertura são individuais. A saída de cada um destes eléctrodos é ligada a um préamplificador. À saída do préamplificador, os impulsos são discriminados por um discriminador integral cujo nível foi definido na calibração. Os impulsos acima do nível de discriminação são processados por um integrador que produz um sinal DC proporcional à contagem de WBCs, ou directamente por um contador. Diluting fluid Diluter I Lysing agent Diluter II Lysing and mixing Lysing and mixing Triple transducer WBC bath module Hgb Hemoglobinometer RBC bath C C C C C C Analyzer computer Laboratory computer system Data management system Printer 565 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Instrumentação: Coulter STKS As saídas dos 3 contadores ou integradores de impulsos são enviadas para um circuito de WBC stabilizing votação. Se a 3 saídas forem agent concordantes numa gama especificada o processo é validado e o resultado final corresponde à sua média. O passo seguinte consiste na correcção do sinal médio de contagem relativamente a acontecimentos de coincidência: passagem simultânea de 2 ou mais WBCs pela abertura. O aparelho utiliza análise estatística para corrigir o nível médio de coincidências para um dado tamanho de abertura. Diluting fluid Diluter I Lysing agent Diluter II Lysing and mixing Lysing and mixing Triple transducer WBC bath module Hgb Hemoglobinometer RBC bath C C C C C C Analyzer computer Laboratory computer system Data management system Printer 566 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Instrumentação: Coulter STKS Examinemos agora o lado direito do aparelho. O processo inicia-se com uma diluição adicional no diluidor II. Esta segunda diluição resulta da maior concentração de RBCs no sangue. A contagem de RBCs decorre num processo similar ao da contagem de WBCs. O aparelho classifica células Diluting fluid Diluter I WBC stabilizing agent maiores do que 35.9 fl como RBCs e regista um histograma da distribuição dos volumes das RBCs (256 canais). O MCV e o parâmetro RDW (coeficiente de variação do histograma) são calculados a partir deste histograma. Lysing agent Diluter II Lysing and mixing Lysing and mixing Triple transducer WBC bath module Hgb Hemoglobinometer RBC bath C C C C C C Analyzer computer Laboratory computer system Data management system Printer 567 Instrumentação laboratorial clínica Hematologia – Instrumentação: Coulter STKS Células com volumes a gama de 2 a 20 fl são classificadas como plaquetas. Os volumes destas células são registados num histograma de 64 canais. Este histograma é processado para obter o valor MPV (volume médio das plaquetas). Diluting fluid Diluter I WBC stabilizing agent Lysing agent Lysing and mixing Lysing and mixing Triple transducer WBC bath module A contagem de RBCs, e os valores de Hb e MCV são introduzidos num computador que calcula os valores de HCT, MCH e MCHC usando as equações dos slides anteriores Diluter II Hgb Hemoglobinometer RBC bath C C C C C C Analyzer computer Laboratory computer system Data management system Printer 568
