Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

Eletroforese de Proteínas em Gel de
Poliacrilamida
1-Introdução
2-Determinação da Malha no Gel
3-Eletroforese em condições desnaturantes
SDS-PAGE
4-Visualização das proteínas separadas por
SDS-PAGE
Edmar Vaz de Andrade
1-introduçao
PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
Poros (malha) com dimensões moleculares,
onde a separação no gel ocorre de acordo com
a filtração em gel e com mobilidade
eletroforética das moléculas.
Indicada para separação de:
DNA
Proteínas
2-Determinação da Malha no Gel
Monômeros
Polímero formado pela
reação entre Acri-Bis
acrilamida
Ligação
cruzada AcriBis
N, N’-metilenobisacrilamida
Acri-Bis: acrilamida ligada a N, N’-metilenobisacrilamida
2-Determinação da Malha no Gel
A polimerização entre Acri-Bis é catalisada
por radicais livres
APS: persulfato de amônio. Se decompõe
naturalmente formando radicais livres.
TEMED: estabiliza os radicais livres
formados a partir do APS.
2-Determinação da Malha no Gel
A formação do polímero entre acrilamida ligada a
N, N’-metilenobisacrilamida determina a dimensão
dos poros formados (malha) no gel.
Depende da quantidade de ligações cruzadas:
Varia em função da concentração de acrilamida e
N, N’-metilenobisacrilamida
3-Eletroforese em condições desnaturantes
SDS-PAGE
3-Eletroforese em condições desnaturantes
SDS-PAGE
Desnaturação da proteína:
SDS-PAGE
Aquecimento a 100 °C
β-mercaptoetanol: agente redutor
SDS: dodecil sulfato de sódio. Detergente
aniônico forte.
Interage com a proteína de modo independente
da seqüência primária (proporcional a massa
molecular)
1 molécula de SDS para cada 2 resíduos de
aminoácidos
3-Eletroforese em condições desnaturantes
SDS-PAGE
Efeito do SDS sobre as
proteínas desnaturadas:
Desnaturação da
proteína
Conformação linearizada
Carga líquida negativa
Ligaçao de SDS
com a / proteína
3-Eletroforese em condições desnaturantes
SDS-PAGE
Gel
concentrador
Gel
separador
Aparato para eletroforese em
SDS-PAGE
3-Eletroforese em condições desnaturantes
SDS-PAGE
4-Visualização das proteínas separadas por
SDS-PAGE
Coloração por azul
brilhante de Coomassie
4-Visualização das proteínas separadas por
SDS-PAGE
kDa
75
50
Quitinase de
Crhomobacterium
violaceum expressa em
Escherichia coli
35
30
25
Coloração por azul brilhante de
Coomassie