Eletroforese_PCR_Sequenciamento
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A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Histórico • 1952, Markham and Smith – • 1955, Smithies – • Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda moléculas grandes de DNA 1980, Schwartz and Cantor – • Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano 1967, Loening – • Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante... Vou ali correr um gelzinho e já volto Tenho que ir senão vou perder meu gel Eletroforese • Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme • DNA, carga negativa – Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico • Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS) • Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular Eletroforese, etapas 1.Preparação do gel 2.Aplicação das amostras 3.Eletroforese 4.Coloração 5. Análise dos resultados Preparação do gel Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida Aplicação das amostras Definição do mapa das amostras por canaleta Corrida do gel • Aplicação do campo elétrico • Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão • Terminais positivo e negativo • Tempo adequado, senão o DNA sai do gel Coloração das moléculas • Brometo de etídio – Agente intercalante do DNA • Cancerígeno! – Composto fluorescente à luz UV – Gel de agarose • Prata – Gel SDS-PAGE • PoliAcrilamide Gel Electrophoresis – Melhor resolução • Coomassie blue, etc Eletroforese em campo pulsado Grandes fragmentos de DNA PCR a reação em cadeia da polimerase Prof. Dr. Francisco Prosdocimi http://dotsub.com/view/538a719f -927b-4192-8e95-18a92a9e95a5 Reação em cadeia Amplificação do DNA Síntese de DNA in vitro • Polimerase Chain Reaction – Reação em cadeia da Polimerase • Amplificação in vitro de moléculas de DNA – In vivo X In vitro X In silico • Procedimento análogo à replicação do DNA – Amostra de DNA; 2 primers; DNA polimerase; Tampão; dNTP Etapas da PCR • Ciclos da PCR – Separação das fitas → 96°C – Anelamento dos primers → 60°C – Síntese do DNA → 37°C • Problema inicial da técnica – Durante a etapa de quebra das pontes de H e separação das fitas (DNA melting) a 96°C, a enzima polimerase era desnaturada e precisava ser acrescentada ciclo a ciclo... – Não permitia automação História da PCR • Químico, 1966 – – Doutor em bioquímica, 1972 2 anos de pós-doutorado numa industria farmacêutica • Deixou a academia para escrever ficção científica, foi dono de padaria por dois anos; voltou à indústria • 1983 → Teve a idéia de utilizar um par de primers para amplificação enquanto voltava para a casa à noite ao lado da namorada • Avisou na empresa e deixou-se que ele ficasse trabalhando na PCR, demorou um ano para padronizar a técnica • Perdeu a namorada logo depois, mas ganhou o Nobel de química (1993) • 1986 → utilização da enzima polimerase de Thermus aquaticus – • Permitiu finalmente a automação da técnica Controvérsias: Surfista, já foi divorciado 3 vezes, é um dos que acredita que o HIV não causa a AIDS, e diz ter tomado bastante LSD na década de 60/70 e que isso o ajudou a descobrir a afamada técnica! Taq polimerase Kary Mullis, 1944 PCR Sistema de reação: DNA molde (100 ng) Iniciadores (5 mM) dNTPs Tampão com MgCL2 Taq polimerase Protocolo de amplificação: Desnaturação: 95º C Anelamento: 45-60º C Extensão: 72º C Filmes como técnica didática • http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ • http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm • http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ Interlúdio explicativo Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Bioquímica + Biomol • Enzimas são proteínas, portanto: 1. São formadas por sequências de aminoácidos 2. Derivam de informações dispostas por genes no DNA, que deve ser transcrito e, posteriormente, traduzido 3. Podemos saber a sequência delas, tanto de aminoácidos quanto de nucleotídeos >gi|188497753|ref|NM_000188.2| Homo sapiens hexokinase 1 (HK1), nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1, mRNA GAGGAGGAGCCGCCGAGCAGCCGCCGGAGGACCACGGCTCGCCAGGGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCA CGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCAGCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAG CTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTCTATGCCATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCA TAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCTCCCGGGATTTTAATCCAACAGCCAC AGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTCTGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTG GATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAATCATGAGAAAAACCAGAATGTTCACA TGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCAGTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGT TGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGACAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACG TTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTGATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAG CGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAGCCATCAAAAAGCGAGGGGACTATGA TGCCAACATCGTAGCTGTGGTGAATGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGGCTATGACGACCAGCAC TGTGAAGTCGGCCTGATCATCGGCACTGGCACCAATGCTTGCTACATGGAGGAACTGAGGCACATTGATC TGGTGGAAGGAGACGAGGGGAGGATGTGTATCAATACAGAATGGGGAGCCTTTGGAGACGATGGATCATT AGAAGACATCCGGACAGAGTTTGACAGGGAGATAGACCGGGGATCCCTCAACCCTGGAAAACAGCTGTTT GAGAAGATGGTCAGTGGCATGTACTTGGGAGAGCTGGTTCGACTGATCCTAGTCAAGATGGCCAAGGAGG GCCTCTTATTTGAAGGGCGGATCACCCCGGAGCTGCTCACCCGAGGGAAGTTTAACACCAGTGATGTGTC AGCCATCGAAAAGAATAAGGAAGGCCTCCACAATGCCAAAGAAATCCTGACCCGCCTGGGAGTGGAGCCG TCCGATGATGACTGTGTCTCAGTCCAGCACGTTTGCACCATTGTCTCATTTCGCTCAGCCAACTTGGTGG CTGCCACACTGGGCGCCATCTTGAACCGCCTGCGTGATAACAAGGGCACACCCAGGCTGCGGACCACGGT TGGTGTCGACGGATCTCTTTACAAGACGCACCCACAGTATTCCCGGCGTTTCCACAAGACTCTAAGGCGC TTGGTGCCAGACTCCGATGTGCGCTTCCTCCTCTCGGAGAGTGGCAGCGGCAAGGGGGCTGCCATGGTGA CGGCGGTGGCCTACCGCTTGGCCGAGCAGCACCGGCAGATAGAGGAGACCCTGGCTCATTTCCACCTCAC CAAGGACATGCTGCTGGAGGTGAAGAAGAGGATGCGGGCCGAGATGGAGCTGGGGCTGAGGAAGCAGACG CACAACAATGCCGTGGTTAAGATGCTGCCCTCCTTCGTCCGGAGAACTCCCGACGGGACCGAGAATGGTG ACTTCTTGGCCCTGGATCTTGGAGGAACCAATTTCCGTGTGCTGCTGGTGAAAATCCGTAGTGGGAAAAA GAGAACGGTGGAAATGCACAACAAGATCTACGCCATTCCTATTGAAATCATGCAGGGCACTGGGGAAGAG CTGTTTGATCACATTGTCTCCTGCATCTCTGACTTCTTGGACTACATGGGGATCAAAGGCCCCAGGATGC CTCTGGGCTTCACGTTCTCATTTCCCTGCCAGCAGACGAGTCTGGACGCGGGAATCTTGATCACGTGGAC AAAGGGTTTTAAGGCAACAGACTGCGTGGGCCACGATGTAGTCACCTTACTAAGGGATGCGATAAAAAGG AGAGAGGAATTTGACCTGGACGTGGTGGCTGTGGTCAACGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGCTT ATGAGGAGCCCACCTGTGAGGTTGGACTCATTGTTGGGACCGGCAGCAATGCCTGCTACATGGAGGAGAT GAAGAACGTGGAGATGGTGGAGGGGGACCAGGGGCAGATGTGCATCAACATGGAGTGGGGGGCCTTTGGG GACAACGGGTGTCTGGATGATATCAGGACACACTACGACAGACTGGTGGACGAATATTCCCTAAATGCTG GGAAACAAAGGTATGAGAAGATGATCAGTGGTATGTACCTGGGTGAAATCGTCCGCAACATCTTAATCGA CTTCACCAAGAAGGGATTCCTCTTCCGAGGGCAGATCTCTGAGACGCTGAAGACCCGGGGCATCTTTGAG ACCAAGTTTCTCTCTCAGATCGAGAGTGACCGATTAGCACTGCTCCAGGTCCGGGCTATCCTCCAGCAGC TAGGTCTGAATAGCACCTGCGATGACAGTATCCTCGTCAAGACAGTGTGCGGGGTGGTGTCCAGGAGGGC CGCACAGCTGTGTGGCGCAGGCATGGCTGCGGTTGTGGATAAGATCCGCGAGAACAGAGGACTGGACCGT CTGAATGTGACTGTGGGAGTGGACGGGACACTCTACAAGCTTCATCCACACTTCTCCAGAATCATGCACC AGACGGTGAAGGAACTGTCACCAAAATGTAACGTGTCCTTCCTCCTGTCTGAGGATGGCAGCGGCAAGGG GGCCGCCCTCATCACGGCCGTGGGCGTGCGGTTACGCACAGAGGCAAGCAGCTAAGAGTCCGGGATCCCC AGCCTACTGCCTCTCCAGCACTTCTCTCTTCAAGCGGCGACCCCCTACCCTCCCAGCGAGTTGCGCTGGG AGACGCTGGCGCCAGGGCCTGCCGGCGCGGGGAGGAAAGCAAAATCCAACTAATGGTATATATTGTAGGG TACAGAATAGAGCGTGTGCTGTTGATAATATCTCTCACCCGGATCCCTCCTCACTTGCCCTGCCACTTTG CATGGTTTGATTTTGACCTGGTCCCCCACGTGTGAAGTGTAGTGGCATCCATTTCTAATGTATGCATTCA TCCAACAGAGTTATTTATTGGCTGGAGATGGAAAATCACACCACCTGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAG CCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACCAGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCC CGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCTTCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTG GCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGTCCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTG TGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGTCCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCA TTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAATTTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTC GTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA >gi|188497754|ref|NP_000179.2| hexokinase 1 isoform HKI [Homo sapiens] MIAAQLLAYYFTELKDDQVKKIDKYLYAMRLSDETLIDIMTRFRKEMKNGLSRDFNPTATVKMLPTFVRS IPDGSEKGDFIALDLGGSSFRILRVQVNHEKNQNVHMESEVYDTPENIVHGSGSQLFDHVAECLGDFMEK RKIKDKKLPVGFTFSFPCQQSKIDEAILITWTKRFKASGVEGADVVKLLNKAIKKRGDYDANIVAVVNDT VGTMMTCGYDDQHCEVGLIIGTGTNACYMEELRHIDLVEGDEGRMCINTEWGAFGDDGSLEDIRTEFDRE IDRGSLNPGKQLFEKMVSGMYLGELVRLILVKMAKEGLLFEGRITPELLTRGKFNTSDVSAIEKNKEGLH NAKEILTRLGVEPSDDDCVSVQHVCTIVSFRSANLVAATLGAILNRLRDNKGTPRLRTTVGVDGSLYKTH PQYSRRFHKTLRRLVPDSDVRFLLSESGSGKGAAMVTAVAYRLAEQHRQIEETLAHFHLTKDMLLEVKKR MRAEMELGLRKQTHNNAVVKMLPSFVRRTPDGTENGDFLALDLGGTNFRVLLVKIRSGKKRTVEMHNKIY AIPIEIMQGTGEELFDHIVSCISDFLDYMGIKGPRMPLGFTFSFPCQQTSLDAGILITWTKGFKATDCVG HDVVTLLRDAIKRREEFDLDVVAVVNDTVGTMMTCAYEEPTCEVGLIVGTGSNACYMEEMKNVEMVEGDQ GQMCINMEWGAFGDNGCLDDIRTHYDRLVDEYSLNAGKQRYEKMISGMYLGEIVRNILIDFTKKGFLFRG QISETLKTRGIFETKFLSQIESDRLALLQVRAILQQLGLNSTCDDSILVKTVCGVVSRRAAQLCGAGMAA VVDKIRENRGLDRLNVTVGVDGTLYKLHPHFSRIMHQTVKELSPKCNVSFLLSEDGSGKGAALITAVGVR LRTEASS 917 aminoácidos 917 x 3 = 2751 3617-2751 = 866 3617 bp 3,6 kb Sequenciamento de proteínas • Degradação de Edman – Quebra-se o aminoácido N-terminal – Identifica-se o aminoácido quebrado – Sequenciamento de 50 a 70 aa’s • Espectometria de massa – Quebra-se a proteína em diversos pontos e verifica-se a massa dos fragmentos – Comparações com massas conhecidas dos aa’s identifica a sequência dos mesmos • Técnicas com limite de automação – Não permitem produzir dados em largaescala – Para saber-se a sequência de um proteína, muitas vezes sequencia-se o DNA do organismo de interesse O Sequenciamento de moléculas de DNA Prof. Dr. Francisco Prosdocimi >gi|33869444|gb|BC008730.2| Homo sapiens hexokinase 1, mRNA (cDNA clone MGC:1724 IMAGE:3163058), complete cds GGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCACGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCA GCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAGCTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTGTATGCC ATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCATAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCT CCCGGGATTTTAATCCAACAGCCACAGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTC TGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTGGATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAAT CATGAGAAAAACCAGAATGTTCACATGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCA GTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGTTGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGA CAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACGTTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTG ATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAGCGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAG(...) TGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAGCCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACC AGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCCCGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCT TCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTGGCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGT CCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTGTGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGT CCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCATTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAAT TTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTCGTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA Frederick Sanger • Único vivo dentre os 4 indivíduos que já venceram dois prêmios Nobel • ~1955: publicou a primeira sequência de aminoácidos da insulina – Ganhou o Nobel de química em 1958 • 1964: descobriu que as proteínas de bactéria iniciavam-se com o aminoácido formil-metionina • 1967: desvendou a sequência do RNA ribossomal 5S • 1975: inventou o método dideóxi para o sequenciamento do DNA • 1977: sequencia, pela primeira vez, o genoma inteiro de um organismo, o bacteriófago phi X 174 – 11 genes in 5386 bases sequenciadas “à mão“ – Ganha o segundo Nobel de química em 1980 O método de Sanger, 1975 Polimerização do DNA a ser sequenciado (molde) na presença de: DNA polimerase primer tampão dNTPs (desóxinucleotídeo) ddNTPs (didesóxinucleotídeo) O que faria um nucleotídeo que, ao invés da extremidade 3’OH, tem uma extremidade 3’H? http://www.youtube.com/watch?v=Mz4LSfecM4&feature=related (dideóxi) Como acontece a síntese de moléculas de DNA? Amplificação interrompida com didesoxinucleotídeos Desoxinucleotídeos dNTP O didesóxinucleotídeo não tem a extremidade 3’OH livre (...) e, portanto, não permite a incorporação de novas bases a 3’ quando é adicionado, (...) interrompendo a formação da nova cadeia definitivamente ddNTP Didesoxinucleotídeos T C C T C T G T A G A G T T C A A C AC T T C A G G G T T A G C A C C C A G T 5’ 3’ G A ATGCTTC ||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’ T T C T T G C A C A T A G T A AC T T C A G G G T G T C C AG A C C TC A G 5’ 3’ G A ATGCTTC ||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ C 5’ C T T G A A GA T T C C CA AC T T G G T A G T G C A G A C C C A G T 5’ 3’ G A ATGCTTCTG |||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ T C T C C T AT G C T C T A T TT C A T G CA C G A GC T G G T A C A G T A G A C C A GC 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGATCT ||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’ A T GAA G A T T G T T T GA G C C T A T T C A GT G C C A GC A T C G C AC CC 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’ CC T T A T GAA G A G C T A C T T C AA G G GT G T A G T CA C G C C C AC 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA T 3’ T 5’ A 5’ 3’ T T GAA CC T G A T G T T C A G C T G G T AA T C T C G G T C GC A C CA AC ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’ 5’ ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCT ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 3’ População de moléculas Incorporação aleatória do didesóxi Quantidade precisa entre didesóxi e desóxi 5’ ATGCTTCT ATGCTTCTGGCAGAT ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT • molde • polimerase • dNTPs •ddGTPs G •ddATPs A •ddTTPs T •ddCTPs C ATGCTTCT ATGCTTCTG ATGCTTCTGG ATGCTTCTGGC ATGCTTCTGGCA ATGCTTCTGGCAG ATGCTTCTGGCAGA ATGCTTCTGGCAGAT ATGCTTCTGGCAGATC ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTG ATGCTTCTGGCAGATCTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAA ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT G A T C ATGCTTCT ATGCTTCTG ATGCTTCTGG ATGCTTCTGGC ATGCTTCTGGCA ATGCTTCTGGCAG ATGCTTCTGGCAGA ATGCTTCTGGCAGAT ATGCTTCTGGCAGATC ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTG ATGCTTCTGGCAGATCTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAA ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT Modelo original Etapa 1 Amplificação Tipo-PCr Etapa 2 Marcação do primer 4 reações necessárias, uma para cada base Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos Eletroforese Leitura manual da sequência de baixo pra cima Sanger e o fago Phi 174 De fato, esse tipo de sequenciamento manual continuou acontecendo por décadas... Modelo moderno Applied Byosystems, 1986 Marcação fluorescente do ddNTP Leroy Hood, 1938- 1 reação necessária, todas as bases lidas ao mesmo tempo Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos Leitura da automática sequência, de baixo pra cima, por um laser http://www.youtube.com/watch ?v=ezAefHhvecM Cromatograma As máquinas necessárias para o sequenciamento • Primeira etapa: junta-se os reagentes em poços de placas e coloca-se na máquina de PCR para a reação de amplificação interrompida • Diferenças com relação ao PCR – Utilização de um só primer – Utilização dos ddNTPs • Uma vez prontas, as sequências de diferentes tamanhos contendo os didesóxi amplificados devem ser enviadas ao sequenciador de DNA mais próximo O que faz um sequenciador de DNA? • Segunda etapa: realiza a eletroforese capilar – O sequenciador executa a eletroforese em géis capilares ultra-finos – Um sensor é responsável por emitir um laser e verificar qual o comprimento de onda emitido pelo didesóxi Exercício Dê a sequência de DNA da canaleta apontada azul = Guanina amarelo = Timina vermelha = Adenina verde = Citosina http://www.youtube.com/watch?v=dUjMf2ZezIw&fe ature=related
