ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS

ENSAIOS
IMUNOQUÍMICOS
BIOMEDICINA FIEL
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações imunoquímicas
ANTÍGENO + ANTICORPO
Reação química especial
Reconhecimento do antígeno:


Superfície da célula
Disperso em solução
Anticorpos



Especificidade
Afinidade
Diversidade
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
Técnicas (métodos) utilizados
Reagentes não marcados


Precipitação (Floculação) e derivados
Aglutinação
Reagentes marcados

Radioativos 


RIA = Radio-imunoensaio
IRMA – Ensaio Imunoradiométrico
Não radioativos

Enzimáticos: 1970- ELISA e seus “derivados” = EIA, EMIT,

Fluorescentes: FPIA, ELFA , FSF, Imunofluorescência

Quimioluminescentes : convencional, ou
eletroquimioluminescência]

Blotting
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
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Reações de Precipitação
Quantificação do precipitado
(COMPLEXO ANTÍGENO-ANTICORPO)
Fatores interferentes:

Concentrações do antígeno e do anticorpo

Outros fatores físico-químicos (temperatura, pH)
Reação Antígeno x Anticorpo é REVERSÍVEL

O precipitado se dissolve quando há excesso de um dos
componentes: FENÔMENO PR0-ZONA
Precipitação máxima: concentrações
equivalentes de Antigeno (Ag) e
Anticorpo (Ac)
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
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Reações de Precipitação
Direta: Clássica: VDRL – RPS –
SÍFILIS OU LUES
DERIVADAS MANUAIS

Imunodifusão
Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese)
Imunofixação

Eletroimunodifusáo


DERIVADAS AUTOMATIZADAS

NEFALOMETRIA E TURBIDIMETRIA
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
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Nefalometria e Turbidimetria
Possibilidade de Automação total
Nefalômetros
Equipamentos de bioquímica
Dosagem de proteínas em sangue e outros
fluidos (exemplo LCR)





Alfa 1 glicoproteína ácida (mucoproteína)
Fator Reumatóide
Microalbumina
Proteína C Reativa
Apoliproproteína
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
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Reações de Aglutinação
Formação de agregados grandes de
partículas com múltiplos determinantes
antigênicos interligados por pontes moleculares
de anticorpos;
Ligação: sítios antigênicos iguais em diferentes
partículas
Detectam tanto a presença de IgM quanto de
IgG
Visualização: depende do tamanho dos
agregados formados
Pode ser realizadas em placas, tubos ou
lâminas:
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de Aglutinação
Fatores interferentes:
Classe do Anticorpo
envolvido;
Eletrólitos;
Macromoléculas
Hidrofílicas;
Enzimas;
pH (6 a 8);
Tempo;
Temperatura
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Falso Negativas
Quantidade pequena de
anticorpos:

a partícula ficar com o anticorpo preso ‘a
sua superfície (sensibilizada), não
formando pontes e não aglutinando;
Quantidade muito grande de
anticorpos (fenômeno Pró-zona)
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS
1.
Determinantes antigênicos Naturais:
Hemácias – determinação grupo sangüíneo
Bactérias – SLIDEX meningites
Protozoários
2. Particulas inertes revestidas
Látex (mais comum)
Gelatina
Betonita, polipeptídeos
3.
Células antigenicamente não relacionadas
Células revestidas com antígenos solúveis: ou
com antígenos solúveis adsorvidos ou fixados
Hemácias e bactérias
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
Aglutinação: Técnicas mais Utilizadas
Aglutinação direta : ex teste de gravidez
Aglutinação passiva
Hemaglutinação direta: ABO RH
Hemaglutinação indireta: Toxoplasmose
Hemaglutinação Passiva
Inibição de Hemaglutinação
Inibição de Hemaglutinação passiva
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
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Imunofluorescência
Baseia-se na capacidade das moléculas de
anticorpo se ligarem covalentemente a
fluocromos, mantendo a especificidade
contra o antígeno.
Reagentes Utilizados:



Anticorpos Marcados (Fluocromos – Isotiocianato
de Fluoresceína* )
Glicerina Alcalina
Corantes (Azul de Evans)
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
Imunofluoresência direta
A reação Ag-Ac é detectada pela
emissão de fluorescência
Pesquisa de antígeno
• amostra (Ag??) + Ac específico
conjugado a substância fluorescente
(conjugado)*
microscópio de fluorescência
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
IFI – Imunofluorescência
INDIRETA
A- pesquisa de antígeno
• amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac *
• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
• microscópio de fluorescência
• * lavagens
B- pesquisa de anticorpos
• Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac *
• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
• microscópio
• determinação do título e classe do Ac
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
Imunoensaios competitivos
Há competição entre a substância
presente na amostra (ou o padrão) e
outro marcado com alguma substância
geradora de sinal, por uma quantidade
limitada de anticorpos específicos –
variante: Radioimunoensaio (RIA).
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
Imunoensaios NÃO COMPETITIVOS
São utilizados dois anticorpos, um
ligado à fase sólida e outro marcado
com alguma substância geradora de
sinal, que se ligam a SUBSTÂNCIA em
estudo - Mais preciso e reprodutível, e
possui níveis de sensibilidadeanalítica
superiores. Desvantagem, precisam ter
dois epítodos. Variante: Imunométrico
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
TIPOS
Radioimunoensaio (RIE)
Imunorradiométrico (IRMA)
Enzimaimunoensaio (EIA)
Imunofluorimétrico (IFMA, FPIA, ELFA)
Quimioluminescencia (ICMA)
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
Ensaios Enzimáticos, Fluorescentes
ou Quimioluminescentes :
1. Competitivos
2. Não competitivos
1. Sequenciais
2. Sanduíche
3. Fatores Interferentes:
Reação cruzada: Ocorrem devido a, baixa
especificidade dos anticorpos utilizados e o uso de
anticorpos policlonais.
Presença de Anticorpos Heterófilos:
Resultados falso positivos ou altos em pacientes
transplantados ou submetidos a tratamento com
antoicorpos monoclonais
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
Fatores interferentes II
Contagem de fundo elevada
(Background) Leituras mais elevadas do
que as reais por ligação inespecífica de
constituintes do soro ao suporte sólido,
lavagens inadequadas ou conjugados de
pobre afinidade.
Efeito HooK Resultados menores do que
o esperado na quantificação de substâncias
que na realidade encontram- se elevadas,
bloqueando a ligação.
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
ETAPAS ELISA, EIA
sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição
de Ag ou do Ac
bloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite
desnatado) *
adição da amostra (em diluente) *
adição do conjugado: anticorpo purificado marcado
com enzima (ex: peroxidase) *
adição do substrato cromogênico: peroxidase: H2O2
(substrato) + OPD (ortofenilenodiamina)
interrupção da reação: SDS ou ácido
leitura: leitor de ELISA
* lavagens
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PATOLOGISTA-CLÍNICO
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
Pra que serve??? Qual vantagem?
1. UTILIDADES:
 Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3,
CA-19-9, CEA, AFP)
 HORMÔNIOS
 DOENÇAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites,
 VITAMINAS
 DOSAGEM DE IGE TOTAL
 HOMOCISTEÍNA
2. VANTAGENS:
Sensibilidade – 10 x maior na troca de substrato
cromogênico por um luminescente
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
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