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JOÃO RICARDO GONÇALVES DE OLIVEIRA
Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas:
Estudo da Viabilidade de Aplicação de Fungos Micorrízicos Arbusculares
(FMA) e/ou Rizobactérias Promotoras do Crescimento de Plantas (RPCP)
Recife
Fevereiro, 2009
Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas:
Estudo da Viabilidade de Aplicação de Fungos Micorrízicos Arbusculares
(FMA) e/ou Rizobactérias Promotoras do Crescimento de Plantas (RPCP)
Dissertação apresentada ao programa de
Pós-Graduação em Biologia de Fungos da
Universidade Federal de Pernambuco, para
obtenção do grau de Mestre em Biologia de
Fungos.
Orientadora: Dra. Adriana Mayumi Yano-Melo
Co-orientador: Dr. Natoniel Franklin de Melo
Recife
Fevereiro, 2009
Oliveira, João Ricardo Gonçalves de Oliveira
Estabelecimento de plantas ornamentais tropicais micropropagadas: estudo
da viabilidade de aplicação de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e/ou
rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCP)/ João Ricardo
Gonçalves de Oliveira. - Recife: O Autor, 2009
85 folhas: tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco.
CCB. Departamento de Micologia, 2009.
Inclui bibliografia
1. Plantas- aclimatização. 2. Microrganismos benéficos. 3.
Bacillus. 4. Glomeromycota I Título.
582.28
579.5
CDU (2.ed.)
CDD (22.ed.)
UFPE
CCB – 2009- 94
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
“A grande arte da vida é acordar depois de um sonho, levantar de um tombo,
sorrir depois de uma decepção... e nunca desanimar”
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
A meu pai, João Bosco de Oliveira (in memorian),
pelo caráter, humildade e luta. Saudade eterna;
A minha mãe, Maria Gonçalves de Oliveira,
exemplo de coragem e amor aos filhos;
As minhas irmães, Adriana Gonçalves Fernandes
de Oliveira e Andréa Gonçalves Fernandes de
Oliveira, pelo carinho de todos os dias.
Dedico.
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e todas as alegrias que ela vem me proporcionando.
Ao meu pai, que mesmo não estando presente em vida, com toda certeza esteve
ao meu lado nesta nova etapa da minha vida.
À minha mãe e irmãs pelo incentivo em enfrentar todos os obstáculos desta
caminhada e mais que tudo me inspiram a vencer.
A Natoniel Franklin de Melo e Adriana Mayumi Yano-Melo, por me proporcionar
conhecimento, pelo incentivo, paciência, dedicação e independência. Agradeço
também por todo o apoio em Petrolina e na Embrapa Semi-Árido como também por
acreditarem no meu empenho para execução desta dissertação.
A Danielle Lopes, pelos conselhos e companheirismo nos momentos bons e
difíceis desta dissertação.
A Geraldo Milanez de Resende, pela ajuda imprescindível nas análises estatísticas.
A Fábio Barbosa da Silva, pela ajuda na preparação do projeto e nos primeiros
meses de adaptação em Petrolina.
Aos meus tios Juraci e Alice, por me acolherem como filho em Petrolina, como
também a todos meus primos e primas pelos momentos de alegria e descontração.
A todos da Embrapa Semi-Árido, em especial do Laboratório de Biotecnologia
(Arlindo, Elenício, Galego, Ângela, Faubyane, Teresa e Eiryane).
Aos amigos (Adriano, Edineide, Paula, Carol, Tati, Socorro, Kyria, Eliene e Ivanice),
pelos saudosos momentos em Petrolina.
A Teresa, pela amizade e pela área cedida para experimentação em campo.
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Aos amigos e professores do Laboratório de Micorrizas principalmente Profa.
Leonor Maia, Profa. Uided Calvalcante, Renata Souza e Marilene, pelos conselhos
e atenção.
Aos meus grandes amigos e irmãos Flávio e Thiago, pela amizade e
companheirismo.
Aos amigos do Mestrado e Doutorado: Larissa, Juliano, Suzana, Nadja, Araeska,
Moacir, Paul, Angelo, Vanessa, Micheline, Stheffania, Indra, Vilma, Dani, Ricardo,
Felipe, Fabíola, Clarissa, Elton, Elder, Wendel, Paula, Patrícia, Suanni... e a todos
que eu não tenha lembrado. Valeu!!!
Emfim à CAPES, pela concessão da bolsa e a todos que fazem a Pós-Graduação
em Biologia de Fungos da UFPE.
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
SUMÁRIO
Páginas
LISTA DE TABELAS
IX
RESUMO GERAL
XI
ABSTRACT
XII
INTRODUÇÃO GERAL
14
CAPÍTULO 1: Fundamentação Teórica
17
1.
Floricultura comercial
18
2.
Micropropagação
20
3. Fungos Micorrízicos arbusculares (FMA) e seus benefícios na
22
micropropagação e aclimatização de plantas
4. Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCP) e seus
25
benefícios a micropropagação e aclimatização
5.
Interação FMA / RPCP e benefícios às plantas
28
6.
Referências bibliográficas
31
CAPÍTULO 2: Fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e rizobactérias
47
promotoras de crescimento de plantas (RPCP) na aclimatização de Zingiber
spectabile Griff. (Zingiberaceae)
Resumo
48
Abstract
49
Introdução
50
Material e Métodos
51
Resultados e Discussão
54
Referências bibliográficas
61
CAPÍTULO 3: Fungos micorrízicos arbusculares (FMA) na aclimatização de
66
plantas micropropagadas de Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum.
(Costaceae)
Resumo
67
Abstract
68
Introdução
69
Material e Métodos
70
Resultados e Discussão
72
Referências bibliográficas
79
CONCLUSÕES GERAIS
85
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
LISTA DE TABELAS
Páginas
CAPÍTULO 2: Fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e rizobactérias
promotoras de crescimento de plantas (RPCP) na aclimatização de
Zingiber spectabile Griff. (Zingiberaceae)
Tabela 1 - Área foliar, colonização micorrízica e número de glomerosporos na
55
rizosfera de plantas de Zingiber spectabile Griff. inoculadas com FMA
[Glomus etunicatum (Ge) e a mistura G. etunicatum com Gigaspora margarita
(Ge/Gm)] e/ou RPCP [Bacillus thuringiensis (HPF14) e B. pumilus (HPS6)],
após 90 dias em casa de vegetação.
Tabela 2 - Biomassas fresca e seca da parte aérea e radicular de
56
Zingiber spectabile Griff. inoculadas com FMA [Glomus etunicatum (Ge) e a
mistura G. etunicatum com Gigaspora margarita (Ge/Gm)] e/ou RPCP
[Bacillus thuringiensis (HPF14) e B. pumilus (HPS6)], após 90 dias em casa de
vegetação.
Tabela 3 - Altura (cm) e número de folhas de Zingiber spectabile Griff.
58
inoculadas com FMA [Glomus etunicatum (Ge) e a mistura G. etunicatum
com Gigaspora margarita (Ge/Gm)] e/ou RPCP [Bacillus thuringiensis (HPF14)
e B. pumilus (HPS6)], aos 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias, em casa de vegetação.
Tabela 4 – Teor e conteúdo dos macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg) e sódio
59
(Na) na parte aérea de Zingiber spectabile Griff. inoculados com FMA
[Glomus etunicatum (Ge) e a mistura G. etunicatum com Gigaspora margarita
(Ge/Gm)] e/ou RPCP [Bacillus thuringiensis (HPF14) e B. pumilus (HPS6)].
CAPÍTULO 3: Fungos micorrízicos arbusculares (FMA) na aclimatização de
plantas micropropagadas de Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum.
(Costaceae)
Tabela 1 - Área foliar, colonização micorrízica e número de glomerosporos
em plantas de Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. micorrizadas ou
não, após 90 dias em casa de vegetação.
IX
74
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Tabela 2 - Biomassas fresca e seca da parte aérea e radicular de plantas de
75
Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. micorrizadas ou não, após 90
dias em casa de vegetação.
Tabela 3 - Altura (cm), número de folhas e número de perfilhos de
76
Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. micorrizadas ou não, aos 15, 30,
45, 60, 75 e 90 dias, em casa de vegetação.
Tabela 4 - Conteúdo dos macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg e S em g planta -1)
77
em mudas de Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. não micorrizadas
ou
micorrizadas
por
Glomus
etunicatum,
Acaulospora
longula
e
Gigaspora albida, 90 dias pós-transplante.
Tabela 5 - Conteúdo dos micronutrientes (B, Cu, Fe, Mn e Zn em mg planta -1)
e
Na (mg planta-1) na parte aérea e radicular de mudas de
Tapeinochilos
micorrizadas
ananassae
por
(Hassk.)
Glomus
K.
Shum.
etunicatum,
Gigaspora albida, 90 dias pós-transplante.
X
não
micorrizadas
Acaulospora
longula
ou
e
78
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Resumo Geral
A aplicação de microrganismos benéficos na micropropagação é uma técnica
viável e de grande benefício para o desenvolvimento das plantas durante o
período de aclimatização. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial
de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e rizobactérias promotoras de
crescimento de plantas (RPCP) na aclimatização de
ornamentais
tropicais
micropropagadas.
Na
duas espécies
aclimatização
de
Zingiber spectabile Griff. foram utilizados dois tratamentos de inoculação com
FMA
(Glomus
etunicatum
e
Gigaspora
margarita)
e
RPCP
(Bacillus thuringiensis [HPF14] e B. pumilus [HPS6]) isolados e/ou combinados
(em dupla inoculação). Para aclimatização de Tapeinochilos ananassae
(Hassk.)
K.
Shum.
três
isolados
de
FMA
(Glomus
etunicatum,
Acaulospora longula e Gigaspora albida) foram aplicados. Após 90 dias foi
observado para Z. spectabile ganho de biomassa seca e colonização
micorrízica em alguns tratamentos co-inoculados e prejuízo significativo ao
desenvolvimento vegetal nas plantas inoculadas com B. thuringiensis. Em
T. ananassae, plantas inoculadas com G. etunicatum apresentaram diferenças
significativamente (P<0,05) superiores para todas as variáveis avaliadas,
alcançando valores de incremento para biomassa e área foliar superiores a 100
%. Conclui-se que o uso combinado e/ou isolado de FMA e RPCP
selecionados pode favorecer o desenvolvimento de Z. spectabile e que embora
a associação FMA não seja específica, a presença de G. etunicatum e
A. longula maximizaram o desenvolvimento vegetal do T. ananassae durante a
fase de aclimatização.
Palavras-chave: flores tropicais, aclimatização, Glomeromycota, Bacillus,
promoção do crescimento.
XI
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Abstract
The application of beneficial microorganisms in micropropagation technique is a
viable and a great benefit to plants development during the acclimatization
period. This work aimed to evaluate the potential of arbuscular mycorrhizal fungi
(AMF) and plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the acclimatization
of two species of tropical ornamental micropropagated plants. In the
acclimatization of Zingiber spectabile Griff. two treatments were used for
inoculation with AMF (Glomus etunicatum and Gigaspora margarita) and PGPR
(Bacillus thuringiensis [HPF 14] and B. pumilus [HPS6]) isolated and/or combined
(in dual inoculation). For acclimatization of Tapeinochilos ananassae (Hassk.)
K. Shum. three isolates of AMF (Glomus etunicatum, Acaulospora longula and
Gigaspora albida) were applied. After 90 days a gain of dry biomass and
mycorrhizal colonization in some co-inoculated treatments of Z. spectabile and
significant damage in development of plants inoculated with B. thuringiensis
were observed. Plants of T. ananassae inoculated with G. etunicatum showed
significantly higher differences (P <0.05) for all variables, reaching values of
increase for biomass and leaf area over 100%. The combined and/or isolated
use of selected AMF and PGPR can promote development of Z. spectabile and
although the AMF is not a specific association, the inoculation with
G. etunicatum and A. longula maximize the development of T. ananassae
plants during the acclimatization stage.
Key words: tropical flowers, acclimatization, Glomeromycota, Bacillus, growth
promoting.
XII
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Introdução geral
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
INTRODUÇÃO GERAL
O interesse pela floricultura comercial no Brasil teve início na década de
setenta e, desde então, vem se tornando atividade em expansão no mundo
todo, destacando-se no agronegócio por gerar renda, fixar o homem no campo
e por ser considerada cultura alternativa para pequenos produtores (LINS &
COELHO, 2004). No Brasil, este mercado adquiriu notável desenvolvimento e
se caracteriza como um dos mais promissores segmentos da horticultura
intensiva no campo do agronegócio nacional (JUNQUEIRA & PEETZ, 2008a).
Movimentou mais de US$ 15 milhões com exportações de flores e plantas
ornamentais entre janeiro e junho de 2006 (IBRAFLOR, 2009) e apresenta
expectativa de US$ 39 milhões para 2008 (SCHMITT, 2008). O Nordeste, em
especial o estado de Pernambuco, vem se destacando na produção de flores
de clima temperado e tropicais, intensificando a exportação e os trabalhos de
pesquisa (FERREIRA et al., 2002; LOGES et al., 2005).
Um dos métodos para produção de plantas é a propagação vegetativa
in vitro, denominada micropropagação, devido às pequenas dimensões do
material vegetal utilizado (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). A técnica é
alternativa viável para a produção de mudas sadias, com alta qualidade e
uniformidade.
No
entanto,
mudas
micropropagadas
são
isentas
de
microrganismos benéficos, tornando-se mais vulneráveis às perturbações
ambientais e ao ataque de fitopatógenos. Esse problema pode ser transposto
pela reintrodução de microrganismos, que podem proteger as plantas contra
doenças e melhorar o crescimento da muda (MELLO et al., 2002).
Dentre os microrganismos, os simbiontes destacam-se por interagir
diretamente com as plantas, atuando nos processos de absorção de nutrientes,
relações hídricas, crescimento e reprodução (PFLEGER et al., 1994). Os
fungos micorrízicos arbusculares (FMA), caracterizados pela formação de
arbúsculos no córtex da raiz do hospedeiro, formam a simbiose mais difundida
e predominante nos ecossistemas terrestres (ALLEN, 1996), sendo de grande
importância em termos ecológicos e econômicos, podendo ainda, influenciar a
diversidade vegetal (VAN DER HEIJDEN et al., 1998). Estima-se que ocorram
em mais de 95% das famílias de plantas, desde briófitas a angiospermas
(SMITH & READ, 1997). Plantas simbioticamente associadas têm a superfície
14
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
de absorção aumentada, melhorando a aquisição de água e íons de baixa
mobilidade como P, Zn e Cu e apresentam maior tolerância a estresses
bióticos (MAIA et al., 2006) e abióticos (AUGÉ, 2001; MAIA & YANO-MELO,
2005). Os FMA contribuem ainda na estruturação do solo, beneficiando a
qualidade edáfica (RILLIG, 2004; CARAVACA et al. 2005).
Evidências dos benefícios promovidos pela simbiose micorrízica foram
relatados para várias culturas de importância econômica, tais como:
maracujazeiro-doce - Passiflora alata (SILVA et al., 2004), aceroleira Malpighia emarginata (COSTA et al., 2001) e mangabeira - Hancornia speciosa
(COSTA et al., 2003; 2005). Na produção de mudas, em especial de plantas
micropropagadas, a exemplo do: morangueiro - Fragaria ananassa Duch.
(BORKOWSKA, 2002), da bananeira - Musa spp. cv. Pacovan, cv. Grand
Naine, cv. Caipira e cv. Prata-Manteiga (YANO-MELO et al., 1999; DECLERCK
et al., 2002; TRINDADE et al., 2003; LEAL et al., 2005), macieira Prunus prunifolia (Wild.) Borkh. (LOCATELLI & LOVATO, 2002) e pimenta
chilena - Capsicum annuum L. (ESTRADA-LUNA & DAVIES Jr., 2003), além de
espécies ornamentais como o antúrio - Anthurium andraeanum (STANCATO &
SILVEIRA, 2006) e a roseira - Rosa hybrida L. cv. New Dawn (PINIOR et al.,
2005) entre outras.
Rizobactérias Promotoras do Crescimento de Plantas (RPCP) colonizam
diferentes órgãos e exercem efeitos benéficos, entre os quais: supressão de
doenças, produção e/ou alteração da concentração de fitohormônios, fixação
do nitrogênio, solubilização de fosfatos minerais ou outros nutrientes do solo,
oxidação do enxofre, aumento da permeabilidade radicular, aumento do
rendimento de plantas micropropagadas em casa de vegetação e em campo
(KLOEPPER, 1991; AMORIM & MELO, 2002; DEY ET AL., 2004).
Várias culturas podem ser beneficiadas pela utilização dessas
rizobactérias, tais como: abóbora - Cucumis sativus L. (CHEN et al., 2000),
alface - Lactuca sativa L. (FREITAS et al., 2003; SOTTERO et al., 2006),
feijão - Phaseolus vulgaris L. (SILVEIRA et al., 1995), trigo - Triticum aestivum
L. (LUZ, 2001), abacaxi cv. Perola - Ananas comosus L. Merril (MELLO et al.,
2002), entre outras. Além disso, o uso combinado de RPCP e FMA pode
maximizar o desenvolvimento de vegetais de importância econômica como o
15
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
feijão - Phaseolus vulgaris L. (SILVEIRA et al., 1995) e plantas ornamentais:
Heliconia psittacorum L. e H. bihai L. (FARIAS, 2006).
Considerando a potencialidade biotecnológica desses microrganismos
na produção de mudas de qualidade (SAGGIN JÚNIOR & LOVATO, 1999;
VESSEY, 2003), em especial no período de aclimatização, o objetivo deste
trabalho foi avaliar a aplicação de FMA e/ou RPCP em duas espécies
ornamentais tropicais micropropagadas. O trabalho, fundamentado em
literatura específica (Capítulo 1), foi dividido em dois experimentos: o primeiro
objetivando determinar a influência da utilização de dois FMA e RPCP
isoladamente e/ou combinados na aclimatização do Zingiber spectabile Griff.
(Capítulo 2) e o segundo visando avaliar o potencial de três isolados de FMA
na aclimatização de Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. (Capítulo 3).
16
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Capítulo 1
Fundamentação Teórica
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
1. Floricultura comercial
Denominado de indústria de flores por movimentar bilhões de dólares, o
mercado de plantas e flores ornamentais envolve todos os segmentos da
cadeia produtiva, dos insumos aos agentes da intermediação e varejo, até o
consumidor final. Países como Noruega, Suíça, Suécia, Dinamarca e Itália são
os maiores consumidores com mais de US$ 100,00 per capita por ano, o que
mostra importante perspectiva comercial da indústria de flores no mundo
(MATSUNAGA, 1997). Em seu sentido amplo, a floricultura abrange o cultivo
de plantas ornamentais, desde flores de corte e plantas envasadas, floríferas
ou não, até a produção de sementes, bulbos e mudas de árvores de grande
porte (CANÇADO JÚNIOR et al., 2005).
Até meados da década de 50, a floricultura nacional era pouco
expressiva tanto econômica como tecnologicamente, caracterizando-se como
atividade alternativa a outros setores agrícolas, e os principais cultivos
localizavam-se nas regiões próximas às capitais do sudeste e sul do Brasil, não
tendo quase expressão no contexto da agricultura nacional (ANEFALOS &
GUILHOTO, 2003; ROCHA, 2006). Contudo, nos últimos anos a floricultura
empresarial brasileira vem adquirindo notável desenvolvimento e se caracteriza
como um dos mais promissores segmentos da horticultura intensiva no campo
do agronegócio nacional. Observa-se, em todo o Brasil, um movimento
marcado por fortes índices de crescimento da base produtiva e inclusão de
novos pólos geográficos regionais na produção de flores e plantas ornamentais
(JUNQUEIRA & PEETZ, 2008a).
Em 2007, as exportações de flores e plantas ornamentais brasileiras
conquistaram a marca de US$ 35,28 milhões, resultando em acréscimo de
9,18 % em relação a 2006, destacando-se a produção de mudas de plantas
ornamentais, que respondeu na média dos últimos cinco anos por 43,74 % do
total vendido no exterior e por 41,99 % no ano de 2007 (JUNQUEIRA &
PEETZ, 2008b). Estima-se que as exportações brasileiras de flores somarão
cerca de US$ 39 milhões em 2008, 10 % superior ao obtido em 2007, além de
representar um crescimento de 81 % em comparação às vendas de 2005,
quando o Brasil exportou US$ 7,5 milhões (SCHMITT, 2008).
18
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
A Holanda se destaca entre os maiores importadores com 44,56 % do
total produzido no país, seguido dos Estados Unidos (24,24 %), Itália (14,7 %),
Japão (4,99 %), Bélgica (4,96 %), Espanha (1,93 %) e Canadá (1,05 %), além
de outros 18 países de destino (JUNQUEIRA & PEETZ, 2008b).
Dentre os novos pólos regionais de produção de flores e plantas
ornamentais, o Nordeste e em especial o estado de Pernambuco vem se
destacando principalmente na área de flores de clima temperado e tropical, não
apenas em produção, mas em pesquisa e exportação (LOGES et al., 2005),
sendo o primeiro produtor nacional de flores tropicais e o quinto de flores
tradicionais. Atualmente, 197 produtores de Pernambuco exploram 125
hectares de terra: 32 produtores de flores tropicais (70 hectares) e 165 de
flores de clima temperado (55 hectares), organizados em quatro associações e
uma cooperativa, movimentando recursos da ordem de R$ 36 milhões/ano,
gerando 800 empregos diretos e milhares de indiretos (PORTAL DO
AGRONEGÓCIO, 2008). A Europa é o principal destino das exportações de
flores tropicais de Pernambuco representando 99,12 % da receita total
exportada em 2005 (FILHO & FAVERO, 2007).
Apesar da grande expansão do cultivo na região, a utilização de plantas
propagadas vegetativamente pode levar à disseminação de doenças e pragas,
que causam declínio na produção, assim como insustentabilidade ambiental e
econômica (LINS & COELHO, 2004). Essa limitação pode ser minimizada pela
oferta de plantas produtivas em curto espaço de tempo e em pequena área
cultivada, com qualidade fitossanitária de alto valor ornamental, provinda do
cultivo in vitro, que no setor de floricultura vem sendo amplamente utilizado
para a propagação de grande número de espécies (BOSA et al., 2003).
19
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
2. Micropropagação
A propagação in vitro é um método empregado em programas de
melhoramento, conservação e aumento da variabilidade das espécies para fins
de seleção de plantas, em especial, as ornamentais (FERREIRA et al., 1998)
com amplo sucesso para produção de mudas em escala comercial (BOSA et
al., 2003).
Os tecidos cultivados in vitro são mantidos pelos nutrientes orgânicos e
minerais do meio de crescimento, enquanto a expressão morfológica das
células ou de órgãos vegetais pode ser controlada por fatores como variações
nas concentrações nutricionais ou reguladores de crescimento nos meios de
cultura, que definem respostas específicas para cada espécie (CALDAS et al.
1998). As plantas micropropagadas são anatomicamente diferentes e
fisiologicamente mais sensíveis, pois possuem cutícula e estômatos pouco
desenvolvidos e em parte não funcionais, devido à baixa incidência luminosa e
elevada umidade das salas de cultura. Além disso, de poucos pêlos
radiculares, assim como reduzida capacidade fotossintética, resultado da alta
disponibilidade de nutrientes no meio de cultura, o que induz ao metabolismo
heterotrófico das plantas (POSPÓŠILOVÁ et al., 1999; LAMEIRA et al., 2000).
Muitas vantagens são relacionadas ao processo de micropropagação,
tais como: obtenção em curto espaço de tempo e em qualquer época do ano
de grande número de indivíduos, boa qualidade fitossanitária, autenticidade
varietal, fácil transporte para outras regiões, recuperação de espécies em vias
de extinção ou ainda, a preservação de germoplasma (MACIEL et al., 2000;
OLIVEIRA, 2000). O método consiste em cinco etapas: a) seleção da planta
matriz e preparação do explante; b) assepsia do material e estabelecimento em
cultura asséptica; c) multiplicação dos explantes; d) indução da parte aérea e
radicular seguido de pré-aclimatização; e) aclimatização em casa de vegetação
(DEBERGH & READ, 1991).
Esta última etapa é considerada crítica à eficiência da micropropagação,
por se tratar de uma etapa de transição da condição heterotrófica para
autotrófica na qual a planta estará suscetível a agressões ambientais, como o
déficit hídrico, além de biológicas através do ataque de microrganismos
20
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
saprófitos e eventuais patógenos presentes no substrato de transplantio
(PREECE & SUTTER, 1991; MELLO et al., 2002).
Por crescerem em condições assépticas, plântulas micropropagadas são
privadas de microrganismos benéficos (LOVATO et al., 1996b) e a reintrodução
de simbiontes naturais como as rizobactérias e os fungos micorrízicos vem se
tornando técnica viável na aclimatização de plantas micropropagadas, trazendo
grandes benefícios aos hospedeiros (KAPOOR et al., 2008), com elevado
desenvolvimento e rendimento vegetal (SILVA, et al., 2006b).
21
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
3.
Fungos
Micorrízicos
Arbusculares
(FMA)
e
benefícios
na
micropropagação e aclimatização de plantas
Durante os processos evolutivos, os microrganismos adquiriram
características e adaptações para coexistirem com outros seres vivos, como na
simbiose. Certos fungos do solo e raízes de plantas formam esta relação
biológica considerada um dos tipos mais importantes de associação, e
conhecida como micorriza. Acredita-se que as micorrizas surgiram há 400
milhões de anos, porém, apenas no século XIX, a associação de raízes com
fungos foi denominada “micorriza” (MOREIRA & SIQUEIRA, 2002).
As micorrizas podem ser divididas de acordo com as características
morfo-anatômicas
do
sistema
radicular
colonizado
em
três
grupos:
ectomicorrizas, endomicorrizas e as ectendomicorrizas (SILVEIRA, 1992;
SMITH & READ, 1997), sendo as primeiras mais estudadas por sua vasta
ocorrência.
A associação micorrízica do tipo arbuscular, caracterizada pela formação
de arbúsculos no córtex da raiz hospedeira é, provavelmente, a simbiose mais
difundida e predominante nos ecossistemas terrestres (ALLEN, 1996), sendo
de grande importância em termos ecológicos e econômicos, podendo ainda,
influenciar a diversidade vegetal (VAN DER HEIJDEN et al., 1998; BEVER,
2003). Estima-se que ocorra em mais de 95 % das famílias de plantas, desde
briófitas a angiospermas (SMITH & READ, 1997). A exceção encontra-se em
alguns membros das famílias Brassicaceae, Amarantaceae, Commelinaceae,
Juncaceae, Proteaceae, Poligonaceae, Cyperaceae e Chenopodiaceae, fato
associado possivelmente à produção de compostos fungistáticos, ausência de
sinais moleculares para o estabelecimento do fungo, deficiência na aderência
e/ou existência de barreiras físicas na parede do hospedeiro (MOREIRA &
SIQUEIRA, 2002).
A simbiose micorrízica arbuscular é bastante antiga e possivelmente
determinante no processo de colonização das plantas no ambiente terrestre,
visto que registros fósseis indicam que esses fungos surgiram durante o
Ordoviciano, fase em que a flora era possivelmente representada por briófitas
(REDECKER et al., 2000). Os FMA são compostos por aproximadamente 200
22
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
espécies (REDECKER et al., 2007) que constituem atualmente o filo
Glomeromycota, classe Glomeromycetes, com doze gêneros: Ambispora
(WALKER et al., 2007), Acaulospora, Paraglomus, Glomus, Entrophospora,
Scutellospora, Gigaspora (SCHÜΒLER et al., 2001), Pacispora (OEHL &
SIEVERDING, 2004), Diversispora (WALKER & SCHÜΒLER, 2004), Intraspora,
Kuklospora (SIEVERDING & OEHL, 2006) e Appendicispora (SPAIN et al.,
2006). Apesar de não ter sido evidenciada reprodução sexuada, os esporos de
FMA, atualmente denominados glomerosporos (GOTO & MAIA, 2006),
apresentam núcleos geneticamente distintos (HIJRI & SANDERS, 2005),
conferindo diversidade genética e funcional a esse grupo de fungos.
No solo, os FMA constituem a maior parte da biomassa microbiana
(KENNEDY, 1998; OEHL et al., 2003) e contribuem para a melhoria da sua
estruturação (RILLIG, 2004), pela produção da glomalina, uma glicoproteína
hidrofóbica produzida pelas hifas externas, que também pode ser encontrada
na parede dos glomerosporos, envolvida nos processos de agregação de
partículas do solo que acabam por gerar benefícios para qualidade edáfica
(CARAVACA et al. 2005; WRIGHT et al. 1996; STEINBERG & RILLIG, 2003).
Os
benefícios
modificações
nas
à
planta,
concentrações
simbioticamente
de
substâncias
associada,
que
incluem:
regulam
o
desenvolvimento das plantas e aumento na taxa de fotossíntese (RAVERKAR
et al., 2005), aumento da superfície de absorção das raízes, melhoria na
aquisição de íons de baixa mobilidade como P, Zn e Cu (SMITH & READ,
1997) que resultam no aumento da tolerância do vegetal a estresse biótico e
abiótico, como patógenos do solo (MAIA et al., 2006; DUPONNOIS, 2006),
seca (AUGÉ, 2001) e salinidade (MAIA & YANO-MELO, 2005).
A propagação in vitro traz grandes benéficos à produção de mudas em
escala comercial, contudo destitui as plantas de microrganismos benéficos,
como os micorrízicos. Essa associação permite maior desenvolvimento e
resistência, com freqüente antecipação e melhor adaptação durante o
transplantio para substratos em casa de vegetação ou ao campo (VARMA &
SCHUEPP, 1995; LOVATO et al., 1996a). Após a fase in vitro e logo no início
da aclimatização, quando as plântulas apresentam apenas dois primórdios
radiculares, vem demonstrando ser a melhor fase para inoculação com os FMA
(RAPPARINI et al., 1994; LOVATO et al., 1996a).
23
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Nesse sentido, os FMA têm sido bastante utilizados na produção e
durante
a
aclimatização
de
mudas
micropropagadas.
As
plantas
micropropagadas se beneficiam da inoculação micorrízica pelo aumento do
desenvolvimento aéreo e radicular, como também pela maior eficiência
fotossintética, captação de água, absorção de nutrientes e proteção contra
patógenos e estresses ambientais (KAPOOR et al., 2008), exercendo durante
esta fase, a ação biorreguladora, biofertilizadora e/ou biocontroladora
(LOVATO et al., 1996a).
Muitos
trabalhos
de
micropropagação
ratificam
os
benefícios
proporcionados pelos FMA durante a fase de aclimatização: na fruticultura:
banana - Musa spp. cv. Pacovan (YANO-MELO et al., 1999), Musa spp. cv.
Nanicão (MATOS et al., 2002), Musa spp. cv. Prata-Manteiga (LEAL et al.,
2005), uva - Vitis vinifera L. (KRISHNA et al., 2006), morango Fragaria ananassa Duch. (BORKOWSKA, 2002); em plantas medicinais:
Scutellaria integrifolia (JOSHEE et al., 2007), gengibre - Zingiber officinale
(SILVA et al., 2008), além das utilizadas na floricultura comercial: gérbera Gerbera sp. (SATO et al., 1999), rosa - Rosa hybrida L. cv. New Dawn (PINIOR
et al., 2005), antúrio - Anthurium andraeanum (STANCATO & SILVEIRA, 2006).
Em alguns casos, inibição ou nenhum benefício à planta associada pôde
ser verificado, como para o porta-enxerto M.9 de macieira Malus pumila (Mill)
(LOCATELLI & LOVATO, 2002), em helicônia - Heliconia sp. (SATO et al.,
1999),
panamá
-
Alpinia
purpurata
(Viell.)
Shum.
e
sorvetão
-
Zingiber spectabile Griff. (SILVA et al., 2006a). A resposta de plantas
micropropagadas aos FMA pode ser influenciada por muitos fatores, como a
espécie vegetal, o isolado micorrízico, a composição química e física do
substrato e o ambiente (LOCATELLI & LOVATO, 2002; LOVATO et al., 1996b).
Dessa forma, a seleção de inóculos micorrízicos que sejam eficientes na
aclimatização e no desenvolvimento vegetal é desejável, resultando em maior
produção com economia de tempo, que é o objetivo visado pela tecnologia de
propagação.
24
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
4. Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCP) e
benefícios à micropropagação e aclimatização.
Denominadas pelos pesquisadores Klopper & Schroth (1981) como Plant
Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) ou Rizobactérias Promotoras do
Crescimento de Plantas (RPCP), essas são residentes epifíticas ou endofíticas,
não patogênicas, que trazem benefícios diversos para as plantas hospedeiras,
atuando diretamente na promoção do crescimento e/ou indiretamente como
agentes de controle biológico de doenças (MARIANO et al., 2004; SIDDIQUI,
2006).
Pesquisas com rizobactérias tiveram seu início em 1885, na Rússia e na
Ucrânia, com a utilização de espécies de Azotobacter chrococcum,
Bacillus megaterium, além de outras espécies do gênero Bacillus, em diversos
cultivos, especialmente de hortaliças. Porém, efeitos práticos positivos na
promoção do crescimento de plantas e na produtividade das culturas puderam
ser observados somente nos anos 50, pela aplicação de inoculantes em mais
de 35 milhões de hectares da Rússia e da Índia (LUZ, 1996). Na China, a
aplicação comercial de RPCP, conhecida como Yield-Increasing Bacteria (YIB),
é prática antiga e utilizada em larga escala que beneficia mais de 48 culturas
atingindo 3,35 milhões de hectares (WENHUA & HETONG, 1997).
As RPCP beneficiam os hospedeiros através da: supressão de doenças,
produção e/ou alteração da concentração de fitohormônios, fixação do
nitrogênio, oxidação do enxofre, além do aumento na taxa de germinação de
sementes, produção de flores, permeabilidade radicular e do rendimento de
plantas micropropagadas em casa de vegetação e em campo (KLOEPPER,
1991; AMORIM & MELO, 2002; DEY et al., 2004). As RPCP também atuam
como biofertilizantes, pois aumentam a disponibilidade e a absorção de
nutrientes pela solubilização e/ou mineralização dos mesmos por modificações
estruturais nas raízes (VESSEY, 2003).
Dentre os principais mecanismos de promoção de crescimento de
plantas, podemos citar: a produção de ácido cianídrico, enzimas, fitohormônios,
mobilização de fosfato, produção de sideróforos e antibióticos, inibição da
25
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
síntese de etileno e indução à resistência sistêmica a patógenos (LUZ, 1996;
SILVEIRA, 2001; ROMEIRO, 2007).
Muitas RPCP são empregadas na agricultura, tais como as dos gêneros:
Burkholderia,
Herbaspirilum,
Streptomyces,
Rhizobium,
Agrobacterium,
Bradyrhizobium,
Enterobacter,
Acetobacter,
Pseudomonas
e
Bacillus
(MARIANO et al., 2004), sendo estes dois últimos os mais relacionados e
utilizados na promoção do crescimento vegetal.
Utilizando isolados de Pseudomonas, Bacillus, além de outras
rizobactérias, Freitas & Aguilar Vildoso (2004) observaram aumento nos
parâmetros de crescimento, em especial na matéria seca de plantas cítricas de
tangerineira - Citrus reshni e limoeiro - Citrus limonia e Citrus volkameriana. Da
mesma maneira, aumento na matéria seca superiores a 40 % foram
observados em mudas de pepino - Cucumis sativus quando inoculadas com
isolados de Bacillus amyloliquefaciens (SILVEIRA et al., 2004). Em mudas de
alface - Lactuca sativa cv. Verônica, Gomes et al. (2003) obtiveram aumento de
50,21 % e 42,7 % na matéria fresca total quando utilizaram os isolados de
Bacillus pumilus e B. thuringiensis subvar. Kenyae, respectivamente. Ainda foi
observada a ação biofertilizante de RPCP na produção de batata doce Ipomoea batatas (YASMIN et al., 2007) e na qualidade de frutos de tomate Lycopersicon esculentum Mill. cv. Rio Fuego (MENA-VIOLANTE & OLALDEPORTUGAL, 2007).
Em plantas ornamentais, a utilização de RPCP também vem
proporcionando benefícios. Testando Bacillus pumilus, B. thuringiensis subvar.
Kenyae e B. cereus, isolados de folhas e sementes de helicônia Heliconia psittacorum L.f., Assis (2002) obteve promoção do crescimento com
aumento do diâmetro, altura, matéria seca e teor de fósforo dessa planta. Göre
&
Altin
(2006)
observaram
grande
influência
do
isolado
de
Pseudomonas fluorescens (51) na promoção do crescimento com antecipação
da floração e elevação no número de flores em 100 %, 19 % e 107 % para
Pelargonium
peltatum,
Chrysanthemum
spp.
e
Dahlia
variabilis,
respectivamente.
O gênero Bacillus, em especial, apresenta vantagens na formulação de
inoculantes comerciais porque, além de sintetizar ou induzir a produção de
reguladores de crescimento pela planta (BARAZANI & FRIEDMAN, 1999), são
26
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
formadores de endosporos, o que facilita o manuseio e aplicação em culturas,
inclusive em misturas com outros defensivos para o controle de doenças e
pragas, uma importante estratégia para o manejo ecológico sustentável
(FREITAS & AGUILAR VILDOSO, 2004; KOKALIS-BURELLE et al., 2006).
No sistema micropropagado, a reintrodução de bactérias (Biotização)
resulta em modificações no desenvolvimento e na fisiologia das plantas,
aumentando a resistência a estresses ambientais e biológicos (NOWAK, 1998),
melhorando o desempenho global das mudas principalmente com aumento na
área foliar, diâmetro do pseudocaule, número de folhas e matéria seca, além
de maior sobrevivência e produtividade após transplante em casa de vegetação
e no campo reduzindo o tempo de aclimatização (MARIANO et al., 2004).
Aumento de biomassa e redução do tempo de aclimatização foram
observados quando isolados de RPCP são imersos no sistema radicular de
mudas micropropagadas de abacaxizeiro - Ananas comosus (L.) Merril cv.
Pérola (MELLO et al., 2002). Nas cultivares Perolera, Primavera e Pérola de
abacaxizeiro, cultivados em diferentes substratos, a eficiência na promoção do
crescimento variou com o inóculo utilizado, mas, de forma geral, ocorreu
aumento de biomassa seca com redução no tempo de aclimatização (WEBER
et al., 2003).
Muitos fatores podem afetar a promoção do crescimento por RPCP no
sistema micropropagado, entre os quais: o genótipo da planta, a temperatura, a
concentração da suspensão bacteriana, a fonte de carbono no meio, além da
compatibilidade dos isolados (MARIANO et al., 2003), sendo desta forma
necessário mais estudos visando elucidar os mecanismos de promoção de
crescimento e interação bactéria e hospedeiro para aumentar a eficiência na
aplicação da técnica.
27
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
5. Interação FMA/RPCP e benefícios às plantas
Na natureza, microrganismos presentes na rizosfera, em especial
rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (RPCP) e fungos
micorrízicos arbusculares (FMA), desempenham papel chave na manutenção
da qualidade do solo (KOHLER et al., 2007) garantindo o crescimento e o
desenvolvimento das mais variadas espécies vegetais (CORDIER et al., 2000).
No entanto, apenas recentemente os efeitos sinérgicos de combinações entre
bactérias e fungos micorrízicos em plantas têm sido estudados. Essas
interações podem ser estratégicas para o estabelecimento de um sistema
sustentável que busque preservar os recursos naturais e conservar o meio
ambiente (ARTURSSON et al., 2006), além de minimizar os impactos no
desenvolvimento, aumentando o rendimento de plantas micropropagadas
durante a aclimatização (VESTBERG et al., 2004).
Os efeitos da co-inoculação estão, em geral, relacionados à promoção
do crescimento e ao controle de patógenos. Contudo, os mecanismos
reguladores da relação fungos/bactérias não estão totalmente esclarecidos
(ARTURSSON et al., 2006), podendo existir interações sinérgicas e/ou
antagonistas que variam por diversos fatores, tais como a compatibilidade entre
os microrganismos.
Trabalhando com a leguminosa - Anthyllis cytisoides, Requena et al.
(1997) demonstraram a importância da adaptação fisiológica e genética na
relação entre hospedeiro, RPCP e FMA, constatando maior benefício para a
planta, quando isolados nativos de ambos os microrganismos foram utilizados.
Efeitos adicionais da co-inoculação de isolados nativos de FMA e
Pseudomonas fluorescens para biomassa seca aérea e radicular de eucalipto Eucalyptus hybrid, também foram verificados (SASTRY et al., 2000).
Algumas RPCP podem favorecer diretamente a funcionalidade dos FMA
tanto em condições normais quanto adversas, trazendo benefícios ao
crescimento vegetal (VIVAS et al., 2003) inclusive na presença de fertilizantes
químicos (VIVAS et al., 2005) e de metais pesados (VIVAS et al., 2006). Em
outras situações, RPCP podem reduzir a colonização micorrízica, podendo ou
não afetar o desenvolvimento da planta. Comparando o efeito de um fertilizante
inorgânico
com
a
co-inoculação
de
28
Pseudomonas
mendocina
e
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Glomus intraradices Schenck & Smith, Kohler et al. (2006) observaram que
apesar da RPCP terem diminuído a colonização micorrízica, a interação foi tão
eficiente quanto a ação do fertilizante.
O uso isolado ou combinado de RPCP e FMA pode induzir não só
impactos sobre as comunidades bacterianas e fúngicas, com produção de
compostos secundários favoráveis a ambos os microrganismos, resultando em
aumento da qualidade nutricional das plantas (ROESTI et al., 2006), além de
modificações na arquitetura radicular (GAMARELO et al., 2004).
A promoção do crescimento com elevação no conteúdo de nutrientes
pode ser observado em diversas culturas. Em plantas de alface Lactuca sativa, Kohler et al. (2007) observaram maior crescimento e conteúdo
de fósforo e potássio em relação ao controle nos tratamentos co-inoculados
com Bacillus subtilis e Glomus intraradices. Em feijão - Phaseolus vulgaris L.,
maior absorção de nutrientes e crescimento foi observado para tratamentos coinoculados com G. etunicatum e Pseudomonas fluorescens (SILVEIRA et al.,
1995). Em plantas de Hibiscus esculentus L., Pisum sativum L. e
Vigna unguiculata, Srivastava et al. (2007) obtiveram maior produtividade
quando utilizaram tanto o inóculo puro de Glomus intraradices como em
combinações com isolados de Pseudomonas fluorecens.
Resultados neutros ou negativos da co-inoculação RPCP/FMA também
foram observados. Tahmatsidou et al. (2006) verificaram que tanto isolado
como combinado, inóculos comerciais de RPCP (FZB24-WG®) e FMA
(Vaminoc-G®) além de não aumentarem a produtividade do morango - Fragaria
x
ananassa
cv.
Selva,
não
controlaram
a
ação
patogênica
de
Verticillium dahliae. Da mesma forma, plantas de mamão - Carica papaya L.
infectadas por nematóides - Meloidogyne incognita, não apresentaram
benefícios adicionais devido à dupla inoculação de FMA (Glomus mosseae e
G. manihotis) com isolados de Pseudomonas fluorescens, quando comparado
às plantas apenas micorrizadas (JAIZME-VEGA et al., 2006).
Em culturas micropropagadas, os efeitos também são variáveis,
dependendo
Glomus
da
utilidade
mosseae
e
e
combinação
Glomus
de
etunicatum
inóculos.
Ao
conjuntamente
utilizar
com
Pseudomonas putida em mudas de morangueiro micropropagados, Vosatka et
al. (1992) observaram que a co-inoculação resultou em resposta adicional ao
29
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
efeito isolado de ambos os microrganismos; entretanto, houve efeito negativo
na produtividade. Por outro lado, buscando combinações de inóculos para uso
na
promoção
do
crescimento
e/ou
controle
de
patógenos
(Phytophthora cactorum e P. fragariae) de morango micropropagado, Vestberg
et
al.
(2004)
verificaram
que
isolados
de
Bacillus
subtilis,
Pseudomonas fluorescens, Trichoderma harzianum e Gliocladium catenulatum,
além de diminuirem a colonização por Glomus mosseae, não promoveram o
crescimento nem controlaram os patógenos. No entanto, Padilla et al. (2006)
apesar de não utilizarem co-inoculação, observaram durante a aclimatização
de
plântulas
de
Pouteria
lucuma
micropropagadas,
que
tanto
para
Glomus intraradices como para as RPCP presentes no inóculo micorrízico,
ocorreu aumento de biomassa e sobrevivência.
Embora exista número substancial de estudos relacionados às
interações entre fungos e bactérias, os
compreendidos e
suas
mecanismos não são bem
propriedades funcionais ainda
necessitam de
confirmações experimentais. As informações sobre estes mecanismos
permitirão a otimização do uso de FMA em combinação com RPCP para o
aumento no rendimento das mais variadas culturas.
30
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
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46
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Capítulo 2
Fungos
micorrizicos
Rizobactérias
plantas
arbusculares
promotoras
(RPCP)
na
de
(FMA)
crescimento
aclimatização
de
e
de
Zingiber
spectabile Griff. (Zingiberaceae)
Artigo elaborado segundo as normas da Acta Botanica Brasilica
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
RESUMO - [Fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e rizobactérias promotoras de
crescimento de plantas (RPCP) na aclimatização de Zingiber spectabile Griff.
(Zingiberaceae)]. Microrganismos benéficos exercem importantes funções para a
sobrevivência e desenvolvimento de plantas micropropagadas. O objetivo deste trabalho foi
avaliar o potencial de FMA e RPCP, isolados e/ou combinados (em dupla inoculação) na
aclimatização de Zingiber spectabile Griff.. O experimento foi realizado em casa de
vegetação utilizando tubetes de 300 mL e pó da casca de coco (Amafibra ®) como substrato.
O delineamento foi do tipo inteiramente casualizado em 2 tratamentos de inoculação com
FMA [Glomus etunicatum (Ge) e a mistura de G. etunicatum com Gigaspora margarita
(Ge/Gm)], 2 tratamentos de inoculação com RPCP [Bacillus thuringiensis (HPF14) e
B. pumilus (HPS6)], 4 tratamentos com a combinação destes microrganismos [Ge+HPS 6,
Ge+HPF14, Ge/Gm+HPS6 e Ge/Gm+HPF14], e o tratamento controle (não inoculado), em 8
repetições, totalizando 72 parcelas experimentais. Após 90 dias foram avaliados: percentual
de sobrevivência, altura, área foliar, biomassa fresca e seca da parte aérea (BFA e BSA) e
radicular (BFR e BSR), colonização micorrízica (CM) e conteúdo de macro e
micronutrientes
na
parte
aérea.
A
co-inoculação
(Ge/Gm+HPS6)
favoreceu
significativamente a CM (P<0,05) em relação aos demais tratamentos, e resultou em maior
BFA em relação às plantas inoculadas com HPF14. Embora a sobrevivência das mudas na
aclimatização tenha sido de 100%, de modo geral o desenvolvimento de Z. spectabile
inoculado com HPF14 isolado e/ou combinado com os FMA é inferior ao observado para as
plantas controle. O resultado sugere que o uso dos microrganismos promotores do
crescimento de plantas deve se feito com cautela, considerando a relação custo/benefício da
aplicação.
Palavras-chave: Glomeromycota, Rizobactérias, Bacillus sp., micropropagação, plantas
ornamentais
48
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
ABSTRACT - [Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and plant growth-promoting
rhizobacteria (PGPR) in the acclimatization of Zingiber spectabile Griff. (Zingiberaceae)].
Beneficial microorganisms have significant roles for survival and development of
micropropagated plants. The objective of this work was to evaluate the potential of AMF
and PGPR, isolated and/or combined (in dual inoculation) on acclimatization of
Zingiber spectabile Griff.. The experiment was conducted in a greenhouse using tubes of
300 mL and dust from coconut shell (Amafibra®) as substrate. The design was a completely
randomized in two treatments with AMF inoculation [Glomus etunicatum (Ge) and the
mixture of G. etunicatum with Gigaspora margarita (Ge/Gm)], two treatments with PGPR
inoculation [Bacillus thuringiensis (HPF14) and B. pumilus (HPS6)], four treatments
combining of these microorganisms [Ge+HPS6, Ge+HPF14, Ge/Gm+HPS6 e Ge/Gm+HPF14]
and a control treatment (not inoculated) with eight replicates, representing 72 experimental
plots. After 90 days survival percentage, height, leaf area, fresh and dry biomass of shoots
(FBS and DBS) and root (FBR and DBR), mycorrhizal colonization (MC) and content of
macro and micronutrients in the shoot were evaluated. Co-inoculation (Ge/Gm+HPS6)
benefited significantly (P<0.05) the MC when compared to other treatments, that resulted in
higher FBS than HPF14 inoculation. Although the survival of seedlings in the acclimatization
has been 100%, in general the development of Z. spectabile inoculated with HPF14 isolated
and/or combined with AMF is lower than the observed for control plants. The results
suggest that the use of plant growth-promoting microorganisms must be done carefully,
considering the cost/benefit of the application.
Keywords: Glomeromycota, Rhizobacteria, Bacillus sp., micropropagation, ornamental
plants
49
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Introdução
A floricultura tropical é uma atividade econômica de grande relevância no
agronegócio nacional e mundial principalmente devido à elevada rentabilidade,
promovendo a criação e fixação de mão-de-obra no campo e também cultura alternativa
para pequenos produtores (Lins & Coelho 2004). Dentre as plantas ornamentais tropicais de
interesse na floricultura, Zingiber spectabile Griff. ainda é uma espécie pouco difundida,
mas com grande potencial de exploração e excelentes perspectivas de crescimento de
cultivo (Luz et al. 2005). Pertencente à família Zingiberaceae e oriunda da Ásia, mais
precisamente da Malásia, é conhecida popularmente no Brasil como sorvetão, gengibre
ornamental, maracá ou xampu. São plantas perenes, herbáceas, robustas, rizomatosas,
caracterizadas por sua inflorescência composta de brácteas amarelo-brilhante quando novas,
tornando-se vermelhas quando maduras, de grande durabilidade pós-colheita e apreciada
beleza, sendo muito utilizada na ornamentação de ambientes (Luz et al. 2005; Terao et al.
2006).
A dispersão desta espécie para fins comerciais é feita vegetativamente, o que
favorece a disseminação de doenças através de gerações sucessivas e propagação clonal.
Deste modo uma das alternativas é a propagação vegetativa in vitro (micropropagação) na
qual é possível obter em curto espaço de tempo e em qualquer época do ano, grande número
de indivíduos de boa qualidade fitossanitária e autenticidade varietal (Maciel et al. 2000).
Contudo, o sucesso da micropropagação depende da eficiência na fase crítica de
aclimatização, uma vez que esta etapa envolve a transição de condições heterotróficas
in vitro para a condição autotrófica, na qual as plântulas necessitam ativar a fotossíntese e a
absorção de água e nutrientes, estando mais suscetíveis ao déficit hídrico. Além disso,
plântulas micropropagadas são privadas de microrganismos benéficos, tornando-se mais
sujeitas a estresses ambientais, como o ataque de microrganismos saprófitos e eventuais
patógenos (Grattapaglia & Machado 1998; Mello et al. 2002).
Um dos mecanismos alternativos para o melhor desenvolvimento de plantas e
conseqüente elevado rendimento é a associação com microrganismos benéficos (Silva et al.
2006b), que isolados ou combinados exercem funções importantes para a sobrevivência do
hospedeiro (Artursson et al. 2006), além de participarem em inúmeros processos chave no
ecossistema, contribuindo para a saúde das plantas e fertilidade do solo (Jeffries et al.
2003).
50
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Os fungos micorrízicos arbusculares (FMA) têm sido utilizados na produção de
mudas e na aclimatização de plantas micropropagadas com respostas promissoras dos
hospedeiros (Lovato et al. 1996). Esta associação simbiótica mutualista expande a zona de
absorção da raiz, aumentando a superfície de contato com o solo, favorecendo maior
absorção de nutrientes como fósforo, zinco, cobre, potássio (Bressan et al. 2001) e
nitrogênio (Gupta et al. 2002), resultando no aumento da tolerância do vegetal a estresses
abióticos e bióticos (Maia et al. 2006). De forma similar, as rizobactérias promotoras do
crescimento de plantas (RPCP) aumentam o rendimento de vegetais micropropagados por
meio da supressão de doenças, produção e/ou alteração da concentração de fitohormônios,
além da maior eficiência na absorção de nutrientes, em especial os de baixa mobilidade
como o ferro e o fósforo (Vessey 2003).
Benefícios proporcionados em várias culturas de importância econômica pela
inoculação com FMA (Stancato & Silveira 2006; Silveira & Lima 1996; Yano-Melo et al.
1999), RPCP (Yasmin et al. 2007; Sottero et al. 2006; Mena-Violante & Olalde-Portugal
2007), além do uso combinado destes microrganismos (Kohler et al. 2007; Kohler et al.
2006; Roesti et al. 2006) tem sido observados. Assim, a produção de mudas
micropropagadas, aliada à inoculação isolada ou combinada de FMA e/ou RPCP pode
constituir ferramenta biotecnológica de interesse para o cultivo de espécies ornamentais.
Nessa contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de fungos
micorrízicos arbusculares e rizobactérias promotoras de crescimento de plantas, isolados
e/ou combinados, na aclimatização do Zingiber spectabile.
Material e métodos
Local de estudo, substrato e plantas utilizadas
O trabalho foi realizado em casa de vegetação do Laboratório de Biotecnologia da
Embrapa Semi-Árido, Petrolina-PE, sob condições ambientais controladas (temperatura:
27±2 ºC; umidade relativa: 75%; luminosidade: 250 a 560 μmol.m-2.s-1). O substrato
utilizado foi pó da casca de coco - Golden-Mix (Amafibra) que apresentava as seguintes
características: pH 5,8 ,
P
8,9 g kg-1, N 6,1 g kg-1, K 5,5 g kg-1, Ca 6,8 g kg-1,
Mg 2,8 g kg-1, S 5,0 g kg-1, B 64,9 mg kg-1, Cu 134,0 mg kg -1, Fe 1164,0 mg kg -1,
Mn 120,0 mg kg-1, Zn 128,0 mg kg-1 além de 100,0 mg kg -1 de Na.
51
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Foram utilizadas plântulas micropropagadas de sorvetão (Zingiber spectabile Griff.),
fornecidas pelo Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Semi-Árido e originadas de
planta matriz, sendo multiplicadas em meio MS (Murashige & Skoog 1962) suplementado
com 4 mg/L de BAP (6-benzilaminopurina).
Microrganismos
Isolados dos FMA Gigaspora margarita Becker & Hall e Glomus etunicatum
Becker & Gerd., fornecidos pela Embrapa Semi-Árido, foram multiplicados na casa de
vegetação em vasos contendo areia:solo (1:1 v/v) previamente desinfestados, tendo como
hospedeiro o sorgo (Sorghum bicolor L. Moench.). Após a multiplicação, o inóculo
produzido foi avaliado quanto ao número de glomerosporos empregando-se as técnicas de
decantação e peneiramento úmido (Gerdemann & Nicolson 1963), seguido por
centrifugação em água e sacarose (40% p/v) (Jenkins 1964), e a contagem realizada em
placas canaletadas, em estereomicroscópio (40 x). Através da contagem dos esporos foi
determinada a alíquota a ser utilizada como inóculo, que continha cerca de 200 esporos
além de pedaços de raiz colonizada e micélio micorrízico.
Duas RPCP provenientes do Setor de Fitopatologia da Embrapa Semi-Árido: HPF14
(Bacillus thuringiensis Berlinev subvar. kurstakii), HPS6 (B. pumilus Meyer & Gottheil)
conservadas em papéis de filtro dessecados, foram reativadas passando por repiques em
meio NYDA contido em placas de Petri para multiplicação e obtenção de colônias isoladas.
Estas colônias foram repicadas para Erlenmeyer (capacidade de 250 mL) contendo 50 mL
de meio NYD, submetido à agitação a 125 rpm por 24 horas. A suspensão bacteriana obtida
foi então diluída de forma a se obter a concentração de inóculo de 108 UFC/mL, confirmada
pela leitura em espectrofotômetro (580 nm) correspondente a 0,52 de absorbância.
Delineamento experimental
O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com
2 tratamentos de inoculação com FMA [Glomus etunicatum (Ge) e a mistura de
G. etunicatum com Gigaspora margarita (Ge/Gm)], 2 tratamentos de inoculação com
RPCP [Bacillus thuringiensis (HPF14) e com B. pumilus (HPS6)], 4 tratamentos com a
combinação destes microrganismos [Ge + HPS6, Ge + HPF14, Ge/Gm + HPS6 e Ge/Gm +
52
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
HPF14], além do controle (não inoculado), em 8 repetições, totalizando 72 parcelas
experimentais.
As plântulas micropropagadas de Z. spectabile foram retiradas dos frascos de
crescimento e lavadas em água corrente até completa remoção do meio de cultura, sendo
selecionadas de forma a se obter uniformidade de tamanho e número de folhas. No
momento do transplantio para tubetes de 300 mL contendo o substrato (pó da casca de
coco), as plântulas foram inoculadas ou não, dependendo do tratamento. Quando inoculadas
com RPCP, o sistema radicular passou por imersão em 10 mL da suspensão bacteriana
correspondente a 108 UFC/mL, por aproximadamente 10 minutos, sendo a suspensão
restante vertida no colo das plântulas de acordo com o tratamento. A aplicação dos FMA foi
realizada com cerca de 200 glomerosporos na região radicular na forma de solo-inóculo
(contendo solo, raízes colonizadas, hifas e glomerosporos). Nos tratamentos controle foram
adicionados 2 mL de filtrado, oriundo do peneiramento (em malha de 45 μm) de todos os
inóculos testados, visando equilibrar a microbiota do solo.
Parâmetros avaliados
Durante os 90 dias de aclimatização foram avaliados a altura e o número de folhas e
ao final do experimento foi determinada a taxa de sobrevivência, área foliar, biomassa
fresca e seca da parte aérea e radicular, colonização micorrízica, densidade de
glomerosporos e conteúdo de nutrientes na parte aérea.
Para determinação da biomassa seca, amostras de folhas e raízes de Z. spectabile
foram colocadas em estufa (65 ºC) até peso constante. Após a pesagem, amostras da parte
aérea foram trituradas em moinho do tipo Willye, onde porções de 0,5 g da amostra foram
mineralizadas por digestão nítrico-perclórica para posterior determinação dos teores de Ca,
Mg, Fe, Zn, Cu e Mn, por espectrofotometria de absorção atômica; P por colorimetria e K,
por fotometria de emissão de chama. Todas as análises foram realizadas conforme
metodologia da Embrapa (1999) e os valores obtidos multiplicados pela biomassa seca para
obtenção do conteúdo de nutrientes.
A colonização micorrízica foi estimada pelo método de McGonigle et al. (1990),
após diafanização das raízes com KOH 10% e H2O2 10%, acidificação em HCl 1% e
posterior coloração com azul de Trypan (0,05%) (Phillips & Hayman 1970). A densidade de
glomerosporos foi avaliada por contagem, empregando-se as técnicas descritas (Gerdemann
& Nicolson 1963; Jenkins 1964). A área foliar foi estimada utilizando-se o aparelho Li 3100
53
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
(LI-Cor Inc. Lincon, Neb., USA) e para determinação do incremento produzido pela
presença dos inóculos de FMA e/ou RPCP foi utilizada a fórmula de Edginton et al. (1971)
adaptada: I (%) = [(Tr - T) T-1] x 100, onde; I (%) = incremento da variável; Tr = valor
médio para o tratamento inoculado; T = valor médio do controle.
Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise de variância, e as variáveis que mostraram
diferenças significativas foram comparadas pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05) utilizando-se o
programa SANEST (Zonta & Machado 2007).
Resultados e discussão
As plântulas de Z. spectabile apresentaram diferentes respostas aos inóculos
utilizados na aclimatização, não sendo constatado efeito sobre a sobrevivência durante esta
fase. A inoculação combinada e/ou isolada do Bacillus thuringiensis (HPF14) trouxe
prejuízo significativo ao desenvolvimento vegetal sendo observados valores, em média,
inferiores ao controle e demais tratamentos em quase todos os parâmetros avaliados.
Utilizando duas cepas de Bacillus thuringiensis var. kurstaki com o objetivo de avaliar o
efeito sobre microrganismos presentes na rizosfera do sorgo, Brasil et al. (2006) observaram
que apesar de estimular a colonização micorrízica os inóculos reduziram o crescimento das
plantas. No presente trabalho, nem a colonização micorrízica foi estimulada pela utilização
do inóculo HPF14, nem a produção de glomerosporos (Tab. 1); entretanto, de forma similar
ao referido por Brasil et al. (2006), tanto a produção de biomassa, como o desenvolvimento
das plantas de Z. spectabile foram reduzidos (Tab. 2 e 3).
Em plantas de Heliconia psittacorum, isolados de B. cereus e B. subtilis também
induziram redução na área foliar e biomassa seca aérea (Santos et al. 2005). Por outro lado,
outros trabalhos com isolados de B. thuringiensis apresentaram efeitos positivos ou neutros
no crescimento vegetal. Utilizando o isolado ENF16 em mudas de abacaxizeiro
micropropagado, Mello et al. (2002) observaram aumentos na altura e na biomassa seca
aérea em relação á testemunha. Similarmente, Gomes et al. (2003) relataram aumento de
42,7% da matéria fresca total trabalhando com mudas de alface, quando o isolado C25 foi
utilizado. Em mudas de pepino o mesmo isolado produziu respostas negativas de
crescimento (Silveira et al. 2004). Relata-se ainda o efeito neutro para o crescimento de
54
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
plantas
de
alface,
apesar
do
estímulo
à
colonização
da
co-inoculação
B. thuringiensis/Glomus intraradices e B. thuringiensis/G. mosseae (Vivas et al. 2003).
O tratamento com Bacillus pumilus (HPS6), isoladamente, foi o único a proporcionar
aumento significativo (P<0,05) nas biomassas fresca e seca radiculares de Z. spectabile
(Tab. 2) com incrementos de 226,5% e 133,3%, respectivamente, em relação ao controle.
Os isolados ENF10 e C116 de B. pumilus proporcionaram benefícios à altura e biomassa
seca aérea em abacaxizeiro micropropagado (Mello et al. 2002), além de incrementos na
ordem de 50,21% para a biomassa fresca total em mudas de alface (Gomes et al. 2003).
Tabela 1. Área foliar, colonização micorrízica e número de glomerosporos na rizosfera de
plantas de Zingiber spectabile Griff. inoculadas com FMA [Glomus etunicatum (Ge) e a
mistura
G.
etunicatum
com
Gigaspora
margarita
(Ge/Gm)]
e/ou
RPCP
[Bacillus thuringiensis (HPF14) e B. pumilus (HPS6)], após 90 dias em casa de vegetação.
Tratamento
Área foliar
(cm²)
Controle
75,96 bc
Ge/Gm
97,95 ab
Ge
Colonização
(%)
0d
106,14 a
N° de Glomerosporos
(20 g-¹ substrato)
0e
17,26 bc
29,2 b
4,52 d
42,4 a
HPS6
90,62 ab
0d
0e
HPF14
52,24 cd
0d
0e
Ge/Gm+HPS6
72,60 bc
60,33 a
23,2 bc
Ge/Gm+HPF14
33,93 d
19,18 b
12,4 d
Ge+HPS6
71,01 bc
11,75 bc
25,2 b
Ge+HPF14
40,60 d
9,55 cd
16,4 cd
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)
O uso do isolado HPS6 combinado à mistura de Glomus etunicatum e
Gigaspora margarita (Ge/Gm) no tratamento Ge/Gm+HPS6, proporcionou elevada
colonização micorrízica. No entanto, benefício adicional ao mix fúngico e às plantas não
foram verificados, visto que o número de glomerosporos tanto no tratamento isolado
(Ge/Gm) como no combinado (Ge/Gm+HPS6) foram estatisticamente similares (Tab. 1) e a
área foliar, biomassa, altura e número de folhas não diferiram do controle (Tab. 1, 2 e 3).
Resultados similares de estímulo à colonização sem benefícios aos hospedeiros foram
55
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
verificados em plantas crescidas em solo contaminado por zinco (Vivas et al. 2006) e em
bananeiras micropropagadas (E.C.T. Anjos, dados não publicados). O inverso foi observado
no tratamento apenas com Glomus etunicatum (Ge) que, apesar de ter apresentado menor
colonização micorrízica, proporcionou maior área foliar, com incremento de 39,73% em
relação ao controle, além de maior número de glomerosporos, diferindo estatisticamente dos
demais tratamentos inoculados (Tab. 1). Ressalta-se ainda que apesar de não significativa, a
inoculação com Ge proporcionou o maior incremento para biomassa fresca aérea (35,79%)
e para biomassa seca aérea (72,4%) em relação ao controle e demais tratamentos (Tab. 2).
Tabela 2. Biomassas fresca e seca da parte aérea e radicular de Zingiber spectabile Griff.
inoculadas com FMA [Glomus etunicatum (Ge) e a mistura G. etunicatum com
Gigaspora margarita (Ge/Gm)] e/ou RPCP [Bacillus thuringiensis (HPF14) e B. pumilus
(HPS6)], após 90 dias em casa de vegetação.
Tratamento
Biomassas (g)
Fresca
Seca
Aérea
Radicular
Aérea
Radicular
Controle
2,71 ab
1,02 b
0,29 abc
0,15 b
Ge/Gm
3,49 a
1,06 b
0,37 ab
0,15 b
Ge
3,68 a
1,28 b
0,50 a
0,21 b
HPS6
3,37 a
3,33 a
0,42 ab
0,35 a
HPF14
2,32 abc
0,77 b
0,32 abc
0,11 b
Ge/Gm+HPS6
2,95 a
1,27 b
0,33 abc
0,13 b
Ge/Gm+HPF14
1,47 bc
0,62 b
0,17 c
0,09 b
Ge+HPS6
2,46 abc
1,53 b
0,26 bc
0,16 b
Ge+HPF14
1,26 c
0,71 b
0,16 c
0,09 b
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)
Testando também a aclimatização de mudas de Z. spectabile com G. etunicatum em
diferentes substratos, Silva et al. (2006a) não observaram interações significativas,
justificadas, entre outros fatores, pelos elevados teores de fósforo, especialmente nos
tratamentos adubados. A baixa concentração de fósforo (8,9 g kg -1) presente no pó da casca
de coco - Golden-Mix (Amafibra) deste experimento pode ter contribuído para o
desempenho positivo do inóculo de Ge testado, uma vez que em elevadas concentrações
56
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
esse macronutriente afeta a funcionalidade da simbiose e consequentemente os benefícios
advindos da micorrização (Siqueira et al. 2004).
A altura das plantas submetidas aos tratamentos Ge/Gm, Ge, HPS 6 e Ge/Gm+HPS6
se destacou apesar de não diferir do controle, apresentando incrementos logo aos 45 dias de
avaliação, fato não observado para o número de folhas, pois somente aos 90 dias os
tratamentos Ge/Gm e HPS6, respectivamente, mostraram ser os mais promissores (Tab. 3).
Os teores e conteúdos de nutrientes, exceto nitrogênio (N), não puderam ser
determinados para as plantas do tratamento controle em função da técnica empregada, assim
como pela baixa produção de matéria seca (Tab. 4). Efeito de diluição para os teores de
fósforo (P), cálcio (Ca) e sódio (Na) foram constatados nos tratamentos Ge/Gm, Ge, HPS 6,
Ge/Gm+HPS6 e Ge+HPS6. Estes resultados eram esperados, devido ao melhor
desenvolvimento aéreo das plantas de Z. spectabile nesses tratamentos. Diminuição nos
teores de certos nutrientes correlacionados ao maior desenvolvimento de gravioleiras
inoculadas com FMA também foram observados (Chu et al. 2001).
Apesar do efeito de diluição, observado inclusive para o inóculo HPF14, os
conteúdos de P e Na não diferiram entre os tratamentos. O baixo desenvolvimento das
plantas inoculadas e/ou co-inoculadas com HPF14 foi observado também no conteúdo de N
(Tab. 3). Mello et al. (2002) observaram que plantas inoculadas com B. thuringiensis
(ENF16) aumentaram seu vigor quando absorveram maior quantidade de N, o que pode ser
observado também nas plantas associadas com Ge (Tab. 1, 2 e 3).
Os teores de P, Ca e Na foram maiores nos tratamentos Ge/Gm+HPF14 e Ge+HPF14,
demonstrando o efeito sinérgico da dupla inoculação para o aumento no aporte nutricional.
Por outro lado, o teor de K foi maior nos tratamentos Ge/Gm, Ge, HPS 6 e HPF14,
observando-se nesse caso um efeito depressivo da dupla inoculação na aquisição desse
nutriente (Tab. 4). Kohler et al. (2007) também obtiveram maior teor de K quando os
isolados de FMA e RPCP foram usados separadamente. No entanto, Roesti et al. (2006)
tiveram diminuição deste macronutriente na presença isolada ou co-inoculada. Dessa forma,
constata-se a necessidade de conhecer a resposta da inoculação isolada ou em conjunto
visando sugerir inoculantes microbianos para produção de mudas, em especial de flores
tropicais.
57
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Tabela 3. Altura (cm) e número de folhas de Zingiber spectabile Griff. inoculadas com
FMA [Glomus etunicatum (Ge) e a mistura G. etunicatum com Gigaspora margarita
(Ge/Gm)] e/ou RPCP [Bacillus thuringiensis (HPF14) e B. pumilus (HPS6)], aos 15, 30, 45,
60, 75 e 90 dias em casa de vegetação.
Tratamentos
Tempo (dias)
15
30
45
60
75
90
Altura (cm)
Controle
5,62 a
6,00 a
9,43 ab
12,25 ab 12,25 ab
12,87 a
Ge/Gm
5,00 a
4,62 a
7,50 ab
11,12 ab 12,62 ab
15,42 a
Ge
5,37 a
7,25 a
10,87 a
14,25 a
14,56 a
15,50 a
HPS6
6,00 a
6,62 a
10,06 a
12,00 ab 13,37 a
14,50 a
HPF14
4,12 a
4,25 a
5,56 c
Ge/Gm+HPS6
4,87 a
5,50 a
Ge/Gm+HPF14
4,62 a
Ge+HPS6
Ge+HPF14
6,87 d
7,75 c
9,37 b
7,93 ab
10,87 ab 13,31 a
14,37 a
4,50 a
6,37 bc
7,71 cd
8,00 c
9,71 b
5,12 a
4,75 a
6,12 bc
8,50 bc
9,12 bc
9,50 b
4,50 a
4,25 a
6,12 bc
7,75 cd
8,87 bc
9,00 b
N° folhas
Controle
5,87 a
6,12 a
8,12 a
7,87 a
6,37 a
7,12 ab
Ge/Gm
4,50 a
5,25 a
7,50 a
5,87 ab
6,50 a
8,85 a
Ge
6,25 a
5,75 a
7,0 a
6,62 ab
6,12 a
6,37 b
HPS6
5,37 a
5,25 a
7,62 a
7,12 ab
6,25 a
7,00 ab
HPF14
3,50 a
3,87 a
5,00 a
4,50 c
4,62 a
5,87 b
Ge/Gm+HPS6
5,75 a
4,37 a
5,87 a
5,75 ab
4,87 a
6,12 b
Ge/Gm+HPF14
4,37 a
3,62 a
5,57 a
5,14 bc
5,14 a
6,28 b
Ge+HPS6
4,50 a
3,75 a
5,25 a
5,00 bc
4,50 a
5,37 b
Ge+HPF14
3,50 a
3,12 a
4,25 a
4,25 c
4,37 a
4,62 b
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna e para cada variável avaliada, não diferem entre si pelo
teste de Tukey (p<0,05)
58
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Tabela 4. Teor e conteúdo dos macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg) e sódio (Na) na parte
aérea de Zingiber spectabile Griff. inoculados com FMA [Glomus etunicatum (Ge) e a
mistura
G.
etunicatum
com
Gigaspora
margarita
(Ge/Gm)]
e/ou
RPCP
[Bacillus thuringiensis (HPF14) e B. pumilus (HPS6)].
Teor
Tratamentos
N
P
K
Ca
Mg
g / kg
Na
mg / kg
Controle
11,77 a
-
-
-
-
-
Ge/Gm
11,42 a
0,92 c
11,07 a
5,88 c
5,01 ab
252,0 e
Ge
11,02 a
1,14 bc
10,25 a
6,59 bc
5,59 a
287,6 de
HPS6
10,96 a
1,07 bc
10,49 a
6,90 bc
4,79 b
324,0 cd
HPF14
11,31 a
0,98 bc
9,70 a
6,30 bc
4,62 bc
332,0 cd
Ge/Gm+HPS6
10,44 a
1,27 b
3,30 b
5,76 c
4,83 ab
390,0 b
Ge/Gm+HPF14
11,07 a
1,70 a
4,42 b
7,01 ab
5,28 ab
532,8 a
Ge+HPS6
10,73 a
1,13 bc
3,14 b
5,96 c
3,96 c
370,0 bc
Ge+HPF14
10,90 a
1,76 a
4,54 b
7,42 a
5,03 ab
484,0 a
Mg
Na
Conteúdo
N
P
K
Ca
g / planta
mg / planta
Controle
3,51 abc
-
-
-
-
Ge/Gm
4,72 ab
0,34 a
4,28 a
2,26 ab
1,94 abc
Ge
5,19 a
0,49 a
4,68 a
2,96 a
2,43 a
133,10 a
HPS6
4,84 ab
0,48 a
4,56 a
2,75 a
2,11 ab
140,44 a
HPF14
2,80 c
0,24 a
2,53 ab
1,57 ab
1,18 bc
81,57 a
Ge/Gm+HPS6
3,38 abc
0,48 a
1,47 b
1,94 ab
1,62 abc
110,21 a
Ge/Gm+HPF14
2,10 c
0,29 a
0,83 b
1,27 b
0,98 bc
91,00 a
Ge+HPS6
2,94 bc
0,35 a
0,92 b
1,68 ab
1,15 bc
100,70 a
Ge+HPF14
1,96 c
0,27 a
0,88 b
1,33 b
0,89 c
86,06 a
95,27 a
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)
A aplicação da mistura de diferentes isolados representa uma importante estratégia
na promoção do crescimento, dependendo da combinação e compatibilidade dos
59
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
microrganismos envolvidos, porque interações entre diferentes grupos RPCP e FMA foram
observadas, mas o mecanismo ainda não é totalmente compreendido (Kohler et al. 2007).
Apesar do número reduzido de isolados testados neste trabalho, alguns se mostram
promissores, em especial os tratamentos com G. etunicatum/Gigaspora margarita (Ge/Gm),
Glomus etunicatum (Ge) e Bacillus pumilus (HPS6) que, de forma geral, beneficiaram o
desenvolvimento e o estado nutricional de mudas de Zingiber spectabile durante a fase de
aclimatização. Novos testes devem ser realizados com estes isolados separadamente ou em
misturas, com o objetivo de esclarecer os mecanismos ativos de promoção do crescimento e
interação FMA e RPCP para melhor eficiência da sua aplicação.
Agradecimentos
À CAPES, pela concessão da Bolsa de estudo (nível mestrado), à FACEPE pelo auxílio à
pesquisa e a todos do Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Semi-Árido pelo apoio na
execução dos experimentos.
60
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
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65
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Capítulo 3
Fungos
micorrízicos
aclimatização
Tapeinochilos
de
arbusculares
plantas
ananassae
(FMA)
na
micropropagadas
de
(Hassk.)
K.
Shum.
(Costaceae)
Artigo a ser submetido para publicação na Acta Botanica Brasilica
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
RESUMO - [Fungos micorrízicos arbusculares (FMA) na aclimatização de plantas
micropropagadas de
Este
trabalho
Tapeinochilos ananassae
representa
o
primeiro
(Hassk.)
estudo
K.
Shum.
(Costaceae)].
para
a
espécie
Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. provenientes do cultivo in vitro e teve como
objetivo avaliar o potencial de três isolados de FMA (Glomus etunicatum Becker & Gerd.,
Acaulospora longula Spain & Schenck e Gigaspora albida Schenck & Smith) sobre o
crescimento de mudas durante a fase de aclimatização. O experimento foi realizado em casa
de vegetação, utilizando-se sacos de 2 kg contendo solo e vermiculita (2:1 v/v) previamente
desinfestados. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com quatro
tratamentos de inoculação com FMA [não inoculado, inoculado com: Glomus etunicatum
(Ge), Acaulospora longula (Al) ou Gigaspora albida (Ga)], em 10 repetições. Após 90 dias
avaliou-se: percentual de sobrevivência, altura, número de folhas e de perfilhos, área foliar,
biomassa fresca, seca e conteúdo de macro e micronutrientes nas partes aérea e radicular,
número de glomerosporos e colonização micorrízica. O percentual de sobrevivência foi de
100%, exceto para as plantas inoculadas com Ga (80%). Embora a associação FMA não
seja específica, é possível verificar combinações mais favoráveis para o desenvolvimento
vegetal, como observado nas plantas micorrizadas por Ge, que apresentaram diferenças
significativamente superiores (P<0,05) para todas as variáveis avaliadas, alcançando valores
de incremento para as biomassas e área foliar superiores a 100%, além de elevado acúmulo
de nutrientes.
Palavras-chave: cultivo in vitro, Glomeromycota, promoção do crescimento, conteúdo
nutricional, flores tropicais
67
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
ABSTRACT
- [Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in the acclimatization of
micropropagated plants of Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. (Costaceae)].
The work is the first study with plants of Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. from
in vitro cultures and aimed to assess the potential of three isolates of arbuscular mycorrhizal
fungi (Glomus etunicatum Becker & Gerd., Acaulospora longula Spain & Schenck and
Gigaspora albida Schenck & Smith) to promote plant growth during the acclimatization.
The experiment was conducted in a greenhouse, using 2 kg bags containing soil and
vermiculite (2:1 v / v) previously disinfested. The experimental design was completely
randomized with four treatments of inoculation with AMF [not inoculated, inoculated with:
Glomus etunicatum (Ge), Acaulospora longula (Al) or Gigaspora albida (Ga)] in 10
replicates. After 90 days survival rate, height, leaf and tiller numbers, leaf area, fresh and
dry matter and contents of macro and micronutrients in the root and shoot, glomerospores
number and mycorrhizal colonization were evaluated. The survival percentage was 100%,
except for plants inoculated with Ga (80%). Although the mycorrhizal association is not
specific, some combinations can be more suitable for crop development as observed in
plants inoculated with Ge that showed significant differences (P<0.05) for all variables,
reaching values of biomass and leaf area higher than 100%, in addition to high
accumulation of nutrients.
Keywords: in vitro cultivation, Glomeromycota, promoting growth, nutritional content,
tropical flowers
68
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Introdução
A grande diversidade e amplitude de climas e solos no Brasil permitem o cultivo de
inúmeras espécies de flores e plantas ornamentais, de diversas origens, com potencial para
competir
no
mercado
internacional
(Cançado
Júnior
et
al.
2005).
Entre
as
plantas ornamentais tropicais de interesse na floricultura, Tapeinochilos ananassae (Hassk.)
K. Shum. ainda é pouco conhecida no Brasil, mas apresenta excelentes perspectivas de
crescimento no cultivo e aceitação do mercado. Caracterizado pela formação de
inflorescências compostas por brácteas vermelho-brilhante de grande beleza e durabilidade
pós-colheita, o gênero Tapeinochilos apresenta dezesseis espécies, 80% delas concentradas
na ilha da Nova Guiné (Specht & Stevenson 2006).
A sistemática na produção de plantas ornamentais evoluiu muito por constituir uma
atividade extremamente competitiva, exigente em tecnologia, conhecimentos avançados e
comercialização eficiente (Pasqual et al. 2008). Neste sentido, a propagação vegetativa
in vitro (micropropagação) é uma técnica bastante aplicada neste meio (Rout et al. 2006),
capaz de obter em curto espaço de tempo e em qualquer época do ano um grande número de
indivíduos de boa qualidade fitossanitária e autenticidade varietal (Maciel et al. 2000).
A eficiência da micropropagação envolve a fase de aclimatização que, por se tratar
de etapa de transição da condição heterotrófica para autotrófica, é considerada crítica para o
sucesso da técnica. O cultivo in vitro elimina da planta os simbiontes naturais, entre eles, os
fungos micorrízicos arbusculares (FMA), que quando utilizados na produção de mudas,
tanto em viveiro como na aclimatização de plantas micropropagadas, trazem grandes
benefícios aos hospedeiros (Kapoor et al. 2008), podendo atuar como biorreguladores,
biofertilizadores e/ou biocontroladores do desenvolvimento vegetal (Lovato et al. 1996). A
micorrização expande a zona de absorção da raiz, aumentando a superfície de contato com o
solo, favorecendo a maior aquisição de nutrientes como fósforo, zinco, cobre, potássio
(Smith & Read 1997; Bressan et al. 2001), além do nitrogênio (Gupta et al. 2002),
resultando no aumento da tolerância do vegetal a estresses abióticos e bióticos (Maia et al,
2006).
Embora a associação fungo-planta não seja específica, a ocorrência natural da
associação micorrízica em representantes da família Costaceae foi documentada (Santos et
al. 2000) e em alguns casos, combinações mais favoráveis entre FMA e genótipos vegetais
no aumento do crescimento de plantas, em especial as ornamentais, podem ser observadas,
como em antúrio - Anthurium andraeanum Lindl. (Stancato & Silveira 2006); crisântemo 69
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Dendranthema grandiflora (Silveira & Lima 1996), Chrysanthemum morifolium Ramat.
(Sohn et al. 2003); gérbera - Gerbera sp. (Sato et al. 1999) e hortênsia - Hydrangea sp.
(Varma & Schüepp 1994). Por outro lado, a ausência de incremento no crescimento vegetal
também é relatada, em associações de FMA com helicônia - Heliconia sp. (Sato et al.
1999); panamá - Alpinia purpurata (Viell.) Shum. e sorvetão - Zingiber spectabile Griff.
(Silva et al. 2006). Dessa forma, a seleção de inóculos micorrízicos que sejam eficientes na
aclimatização e desenvolvimento vegetal são desejáveis, visando à geração de tecnologia de
propagação.
Este
trabalho
constitui
o
primeiro
estudo
envolvendo
a
espécie
Tapeinochilos ananassae provenientes do cultivo in vitro e FMA, tendo como objetivo
avaliar o potencial de três isoladosde FMA (Glomus etunicatum, Acaulospora longula e
Gigaspora albida) na promoção do crescimento de mudas durante a fase de aclimatização.
Material e métodos
Local de estudo, substrato e plantas utilizadas
O trabalho foi realizado em casa de vegetação do Laboratório de Biotecnologia da
Embrapa Semi-Árido, Petrolina-PE, sob condições ambientais controladas (temperatura:
27±2 ºC; umidade relativa: 75%; luminosidade: 250 a 560 μmol.m-2.s-1). O substrato
utilizado foi solo (latossolo) e vermiculita expandida (2:1 v/v), previamente desinfestados
em autoclave por dois períodos de 1h, a 120 °C, apresentando as seguintes características:
M.O. 6,41 g kg-1, pH 5,6 , C.E. 0,54 dS m-1 , CTC 5,69 cmolc dm-3, P
K 0,44 g kg-1, Ca 1,5 g kg-1, Mg
93 g kg-1,
1,3 g kg-1, Cu 0,84 mg kg-1, Fe 68,9 mg kg -1,
Mn 34,8 mg kg-1, Zn 2,10 mg kg-1 além de 0,14 mg kg-1 de Na.
Foram utilizadas plântulas micropropagadas de Tapeinochilos ananassae (Hassk.)
K. Shum., fornecidas pelo Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Semi-Árido originadas
de planta matriz e multiplicadas em meio MS (Murashige & Skoog 1962).
70
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Inóculo de FMA
Isolados dos FMA Glomus etunicatum Becker & Gerd., Acaulospora longula Spain
e Schenck e Gigaspora albida Schenck & Smith, fornecidos pela Embrapa Semi-Árido,
foram multiplicados em casa de vegetação em vasos contendo areia:solo (1:1 v/v)
previamente desinfestados, tendo como hospedeiro o sorgo (Sorghum bicolor L. Moench.).
O inóculo produzido foi avaliado quanto ao número de glomerosporos empregando-se as
técnicas de decantação e peneiramento úmido (Gerdemann & Nicolson 1963), seguido por
centrifugação em água e sacarose (40% p/v) (Jenkins 1964), e a contagem realizada em
placas canaletadas, em estereomicroscópio (40 x). Após a contagem dos glomerosporos foi
determinada a alíquota a ser utilizada como solo-inóculo, contendo cerca de 200
glomerosporos, além de pedaços de raiz colonizada e micélio micorrízico.
Delineamento experimental
O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com
4 tratamentos de inoculação com FMA (não inoculado, inoculado com: Glomus etunicatum,
Acaulospora longula e Gigaspora albida), em 10 repetições, totalizando 40 parcelas
experimentais.
As plântulas micropropagadas de T. ananassae foram retiradas dos frascos de
crescimento e lavadas em água corrente até completa remoção do meio de cultura, sendo
selecionadas de forma a se obter uniformidade de tamanho e número de folhas. No
momento do transplantio para sacos de 2 kg contendo substrato (solo e vermiculita, 2:1 v/v),
as plântulas foram inoculadas ou não, dependendo do tratamento. Nos tratamentos controle
foram adicionados 2 mL de filtrado, oriundo do peneiramento (45 μm) de todos os inóculos
testados, visando equilibrar a microbiota do solo.
Parâmetros avaliados
Durante os 90 dias de aclimatização foram avaliados a altura, o número de folhas e
de perfilhos e ao final do experimento, foram determinados: percentual de sobrevivência,
área foliar, biomassa fresca e seca da parte aérea e radicular, colonização micorrízica,
número de glomerosporos e conteúdo de nutrientes na parte aérea e radicular.
71
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Para determinação da biomassa seca, amostras de folhas e raízes de T. ananassae
foram colocadas em estufa (65 ºC) até peso constante. Após a pesagem, amostras da parte
aérea foram trituradas em moinho do tipo Willye, onde porções de 0,5 g da amostra foram
mineralizadas por digestão nítrico-perclórica para posterior determinação dos teores de Ca,
Mg, Fe, Zn, Cu e Mn, por espectrofotometria de absorção atômica; P por colorimetria e K
por fotometria de emissão de chama. Todas as análises foram realizadas conforme
metodologia da Embrapa (1999) e os valores obtidos multiplicados pela biomassa seca para
obtenção de conteúdo nutricional.
A colonização micorrízica foi estimada pelo método da interseção dos quadrantes de
Giovannetti & Mosse (1980), após diafanização das raízes com KOH 10% e H 2O2 10%,
acidificação em HCl 1% e coloração com azul de Trypan (0,05%) (Phillips & Hayman
1970). O número de glomerosporos foi avaliado pela contagem, empregando-se as técnicas
descritas (Gerdemann & Nicolson 1963; Jenkins 1964). A área foliar foi estimada
utilizando-se o aparelho Li 3100 (LI-Cor Inc. Lincon, Neb., USA) e para determinação do
incremento resultante dos tratamentos foi utilizada a fórmula de Edginton et al. (1971)
adaptada: I (%) = [(Tr - T) T-1] x 100, onde; I (%) = incremento da variável; Tr = valor
médio para o tratamento inoculado; T = valor médio do tratamento não inoculado.
Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise de variância e as variáveis que mostraram
diferenças significativas foram comparadas pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05) utilizando-se o
programa SANEST (Zonta & Machado 2007).
Resultados e discussão
As plantas micorrizadas por G. etunicatum e A. longula apresentaram expressivo
aumento na área foliar (Tab. 1), com valores de incremento de 175,67% e 95,12%,
respectivamente. Além disso, o número de glomerosporos recuperados em ambos os
tratamentos foi estatisticamente superior ao encontrado pela inoculação com G. albida. O
substrato utilizado apresentou uma concentração elevada de fósforo (93 g kg -1), e esta pode
influenciar diretamente a funcionalidade da simbiose (Siqueira et al. 2004), seja na
produção de glomerosporos (Mohammad et al. 2004), seja na germinação e conseqüente
colonização (Lovelock & Ewel 2005). Pelo número de glomerosporos observados nos
72
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
tratamentos
com
G.
etunicatum
e
A.
longula,
apenas
a
simbiose
G. albida x Tapeinochilos ananassae parece ter sido afetada pela concentração deste
macronutriente.
Tabela 1 - Área foliar, colonização micorrízica e número de glomerosporos em plantas de
Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. micorrizadas ou não, após 90 dias em casa de
vegetação.
Tratamento
Área foliar
(cm²)
Controle
186,48 c
0,03 d
0,01 c
514,07 a
93,74 b
23,90 a
363,87 b
81,45 c
16,38 b
189,53 c
99,12 a
1,00 c
Glomus etunicatum
Acaulospora longula
Gigaspora albida
Colonização
(%)
N° de Glomerosporos
(50 g-¹ substrato)
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)
A inoculação com G. etunicatum proporcionou aumento em todas as variáveis de
biomassa de T. ananassae (Tab. 2), na qual o incremento superou os 100%. O tratamento
com A. longula diferiu estatisticamente do controle apenas para biomassa fresca aérea,
proporcionando incremento de 91,63%. Benefícios da inoculação com G. etunicatum e
Acaulospora sp. na aclimatização também foram relatados em trabalhos com mudas de
gérbera (Sato et al. 1999) e antúrio (Stancato & Silveira 2006) micropropagadas, e em
mudas de crisântemo micorrizadas por diferentes espécies de Glomus (Silveira & Lima
1996; Sohn et al. 2003).
73
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Tabela 2 - Biomassas fresca e seca da parte aérea e radicular de plantas de
Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. micorrizadas ou não, após 90 dias em casa de
vegetação.
Tratamento
Biomassa (g)
Fresca
Seca
Aérea
Radicular
Controle
9,68 c
7,37 bc
Glomus etunicatum
26,78 a
Acaulospora longula
Gigaspora albida
Aérea
Radicular
0,97 bc
1,25 bc
21,26 a
2,96 a
3,69 a
18,55 b
11,12 b
1,45 b
1,92 b
9,41 c
5,62 c
0,81 c
0,83 c
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)
Apesar da elevada colonização micorrízica proporcionada pela inoculação com
G. albida (Tab. 1), tal fato não resultou em maiores benefícios ao crescimento (Tab. 2 e 3) e
sobrevivência das mudas de T. ananassae. Além dos valores obtidos serem semelhante
estatisticamente ao controle, a sobrevivência das plantas foi de apenas 80%, enquanto para
os demais tratamentos esse percentual alcançou 100%. Segundo Piotrowski et al. (2004), a
ausência de promoção do crescimento pode estar relacionada ao dreno excessivo de carbono
para a formação de hifas de algumas espécies de FMA altamente colonizadoras, tais como
membros da família Gigasporaceae.
Tanto para altura como para número de folhas, as plantas micorrizadas por
G. etunicatum diferiram dos demais tratamentos (Tab. 3), a partir dos 45 dias de avaliação,
não ocorrendo o mesmo para o número de perfilhos. Embora tenha aumentado, sendo
numericamente superior aos demais tratamentos, não houve diferença significativa durante
as avaliações quinzenais. Estádios mais avançados da relação planta-fungo podem permitir
a visualização de maiores benefícios ao hospedeiro (Van der Heijden & Kuyper 2001).
Contudo, até o último dia de avaliação do experimento, apenas a inoculação com
G. etunicatum e A. longula propiciou aumento, que resultou em diferença estatística em
relação ao controle. Neste último tratamento o aumento foi apenas em relação à altura, aos
90 dias.
74
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Tabela 3. Altura (cm), número de folhas e número de perfilhos de Tapeinochilos ananassae
(Hassk.) K. Shum. micorrizadas ou não, aos 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias em casa de
vegetação.
Tratamentos
Tempo (dias)
15
30
45
60
75
90
Altura (cm)
Controle
3,20 a
3,75 ab
3,60 b
5,18 b
4,95 b
6,06 c
Glomus etunicatum
3,60 a
4,43 a
5,65 a
9,62 a
12,10 a
15,68 a
Gigaspora albida
3,10 a
3,86 ab
3,60 b
4,86 b
5,85 b
5,78 c
Acaulospora longula
3,60 a
3,31 b
4,00 b
4,81 b
4,20 b
9,18 b
No folhas
Controle
3,60 a
6,17 ab
07,10 b
09,94 b
12,30 bc
15,20 b
Glomus etunicatum
4,00 a
6,77 a
11,40 a
18,00 a
22,90 a
27,20 a
Gigaspora albida
4,70 a
4,64 b
08,10 b
07,98 b
14,70 b
15,11 b
Acaulospora longula
3,90 a
5,68 ab
05,20 b
09,76 b
8,60 c
19,71 ab
N° perfilhos
Controle
1,00 a
1,11 a
1,30 b
2,03 a
2,20 b
2,82 b
Glomus etunicatum
1,10 a
1,22 a
2,10 a
3,28 a
3,70 a
4,57 a
Gigaspora albida
1,20 a
1,11 a
1,40 ab
2,04 a
2,50 ab
3,44 ab
Acaulospora longula
1,10 a
1,22 a
1,40 ab
2,06 a
2,00 b
3,86 bc
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna e para cada variável avaliada, não diferem entre si pelo
teste de Tukey (p<0,05)
O conteúdo de macro e micronutrientes (Tab. 4 e 5) na parte aérea e radicular das
plantas inoculadas com G. etunicatum foi significativamente superior ao controle e demais
tratamentos. De forma similar, Sohn et al. (2003) observaram elevação nas concentrações
de P, K, Mg, Ca, Fe, Mn e Cu nas folhas e de K, Ca, Fe, Mn Cu e Zn nas raízes de mudas de
crisântemo associadas a Glomus sp.. Em goiabeiras micropropagadas e inoculadas com
Glomus diaphanum, G. albidum e G. claroides, Estrada-Luna et al. (2000) obtiveram
aumento dos níveis de P, Mg e Cu nas folhas. Utilizando G. clarum, Leal et al. (2005)
observaram acúmulo diferencial de N, P e K em mudas de bananeira micropropagadas. Os
resultados podem estar relacionados à compatibilidade entre o hospedeiro e o ambiente
(Cavagnaro et al. 2005) ou à associação preferencial de algumas combinações genótipo
vegetal x espécie de fungo (Sanders 2004), visto que nem todos os isolados utilizados
75
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
favoreceram igualmente o conteúdo nutricional (Tab. 4). Embora a micorrização por
G. etunicatum tenha favorecido o acúmulo de nutrientes em T. ananassae, esse mesmo
isolado, mesmo favorecendo o desenvolvimento de bananeiras micropropagadas, reduziu a
concentração de alguns macronutrientes (Yano-Melo et al. 1999).
Tabela 4. Conteúdo dos macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg e S em g planta -1) em mudas de
Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. não micorrizadas ou micorrizadas por
Glomus etunicatum, Acaulospora longula e Gigaspora albida, 90 dias pós-transplante.
Tratamento
N
P
K
Ca
Mg
S
g / planta
Parte aérea
Controle
18,77 b
0,77 d
30,24 c
6,29 c
3,43 c
1,58 c
Glomus etunicatum
36,81 a
4,41 a
81,11 a
18,61 a
18,18 a
6,55 a
Acaulospora longula
31,94 a
2,62 b
63,57 b
11,34 b
9,31 b
3,91 b
Gigaspora albida
19,76 b
1,63 c
30,82 c
7,54 c
5,37 c
1,83 c
Parte radicular
Controle
6,40 c
0,20 b
14,49 c
3,05 b
28,11 bc
1,36 c
Glomus etunicatum
15,79 a
1,18 a
71,54 a
11,00 a
85,00 a
5,39 a
9,93 bc
1,00 a
30,48 b
4,41 b
34,50 b
2,85 b
11,71 ab
0,79 b
20,35 bc
3,93 b
21,23 c
1,52 c
Acaulospora longula
Gigaspora albida
Médias seguidas pela mesma letra na coluna, para cada parte (aérea e radicular) avaliada, não diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
A micorrização por A. longula proporcionou na parte aérea de T. ananassae maior
acúmulo de todos os macro e micronutrientes em comparação ao controle. Na parte
radicular, o conteúdo nutricional em plantas micorrizadas apresentou diferença estatística
apenas em relação ao controle para os macronutrientes P, K e S (Tab. 4) e os
micronutrientes B, Fe, Zn e Na (Tab. 5). A utilização do inóculo de G. albida não
proporcionou aumento significativo nos conteúdos de macro e micronutrientes, exceto para
o P da parte aérea e o N da porção radicular quando comparados ao controle (Tab. 4).
De forma similar, Freitas et al. (2006) observaram que na ausência de adubação
fosfatada em menta - Mentha arvensis L., a utilização do inóculo de Gigaspora margarita
foi responsável pelo aumento no conteúdo de N, P e K. No entanto, inóculos de
76
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
G. margarita também foram responsáveis por baixos níveis de Ca e Mg em porta-enxertos
de abacate - Persea sp. (Silveira et al. 2002) como também na concentração de P em
crisântemo (Silveira & Lima 1996).
Tabela 5. Conteúdo dos micronutrientes (B, Cu, Fe, Mn e Zn em mg planta -1) e Na (mg
planta-1) na parte aérea e radicular de mudas de Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum.
não micorrizadas ou micorrizadas por Glomus etunicatum, Acaulospora longula e
Gigaspora albida, 90 dias pós-transplante.
Tratamento
B
Cu
Fe
Mn
Zn
Na
mg / planta
Parte aérea
46,28 c
11,82 b
238,47 c
1191,19 c
60,43 c
652,27 c
Glomus etunicatum 108,05 a
41,42 a
1032,83 a
5009,90 a
252,06 a
1841,59 a
Acaulospora longula
75,70 b
34,46 a
554,48 b
1740,40 b
153,48 b
1321,25 b
Gigaspora albida
66,92 bc
13,92 b
321,18 bc
436,29 d
77,10 c
1074,20 bc
81,85 c
709,05 c
Controle
Parte radicular
Controle
32,77 c
37,34 bc 31027,50 c
536,07 bc
Glomus etunicatum 134,83 a
116,27 a
96232,33 a
1949,04 a
365,12 a
3957,13 a
Acaulospora longula
67,63 b
50,84 b
57454,66 b
675,03 b
159,97 b
1542,38 b
Gigaspora albida
50,01 bc
27,33 c
27244,16 c
372,21 c
109,34 bc
1108,68 bc
Médias seguidas pela mesma letra na coluna, para cada parte (aérea e radicular) avaliada, não diferem entre
si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Os benefícios nutricionais induzidos por FMA dependem da disponibilidade relativa
dos elementos no meio, além das exigências da planta (Siqueira et al. 2002). Dessa forma, a
avaliação de diferentes isolados sob as mesmas condições, pode auxiliar a seleção de FMA
mais eficientes (Avio et al. 2006).
Diante dos resultados, fica evidenciado que plantas micropropagadas de
T. ananassae apresentam diferentes respostas durante a aclimatização dependendo do
inóculo micorrízico utilizado. A inoculação com G. etunicatum foi benéfica ao hospedeiro,
proporcionando tanto melhorias no desenvolvimento vegetativo e conteúdo nutricional das
plantas, como alta colonização e esporulação fúngica. Em menor intensidade, o inóculo de
A. longula elevou a área foliar e as biomassas, além da concentração de macro e
77
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
micronutrientes nas folhas e raízes. Por outro lado, a inoculação com G. albida não trouxe
grandes melhorias nutricionais e ao desenvolvimento do T. ananassae podendo, inclusive,
ter atuado de forma unidirecional, drenando grande parte dos fotossintatos para a formação
de hifas durante a fase de colonização.
Conclui-se que a aplicação de G. etunicatum na fase de aclimatização de
T. ananassae resulta em aumento na sobrevivência, desenvolvimento e vigor de plantas
micropropagadas, contribuindo para a geração de tecnologia e oferta de mudas de alta
qualidade.
Agradecimentos
À CAPES, pela concessão da Bolsa de estudo (nível mestrado), à FACEPE pelo auxílio à
pesquisa e a todos do Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Semi-Árido pelo apoio na
execução dos experimentos.
78
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
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Conclusões Gerais
Oliveira, J.R.G. Estabelecimento de Plantas Ornamentais Tropicais Micropropagadas: Estudo...
Conclusões Gerais

Os inóculos de FMA e RPCP, isolados ou co-inoculados, não influenciam o
desenvolvimento de plantas micropropagadas de Zingiber spectabile Griff.
durante a aclimatização;

A
rizobactéria
Bacillus
pumilus
HPS6,
quando
associada
a
Glomus etunicatum/Gigaspora margarita (Ge/Gm) estimula a colonização
micorrízica de plantas de Z. spectabile;

A inoculação com Bacillus thuringiensis (HPF14) afeta negativamente o
desenvolvimento vegetativo de Z. spectabile durante a aclimatização;

Isolados de Glomus etunicatum/Gigaspora margarita (Ge/Gm), Glomus
etunicatum (Ge) e Bacillus pumilus (HPS6) são promissores para a produção
de mudas de Z. spectabile micropropagadas;

A inoculação com FMA e RPCP afeta positivamente o teor nutricional de P,
K, Ca e Na das plantas micropropagadas de Z. spectabile, dependendo da
combinação utilizada;

A aclimatização de mudas de Tapeinochilos ananassae (Hassk.) K. Shum. é
beneficiada pela inoculação com Glomus etunicatum e Acaulospora longula
proporcionando melhorias ao desenvolvimento vegetativo e conteúdo
nutricional;

A reprodução vegetativa de G. etunicatum é favorecida pela associação com
T. ananassae, acompanhando a alta taxa de colonização radicular (93%);

A inoculação com Gigaspora albida não favorece a aclimatização e
sobrevivência de plantas de T. ananassae na fase de aclimatização.
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