Variabilidade Genética A variabilidade genética mede a tendência

Variabilidade Genética
A variabilidade genética mede a tendência dos diferentes alelos de um mesmo gene
variarem entre si, numa dada população
Locus, Alelos
Locus - região do cromossoma onde estão localizados os alelos
Alelos - genes que ocupam a mesma posição em cromossomas
homólogos
- cada uma das várias formas alternativas do mesmo gene
- forma com que um gene pode se expressar
1 indivíduo - 2 alelos/locus
muitos indivíduos - mais de 2 alelos/locus
Haplótipos
Haplótipos - combinação de alelos em mútiplos loci que são transmitidos
juntos no mesmo cromossoma (pode se referir a dois loci ou a um
cromossoma inteiro
Combinação de todos os alelos (genótipo) + influência do
meio ambiente = fenótipo
A função de uma protéina pode depender de loci múltiplos
Alelos Múltiplos
Alelos Múltiplos - para um único locus
Ex. Sistema gênico ABO - 3 alelos A, B ou O comuns/locus
4 fenótipos = A, B, AB ou O
Homozigoto (AA ou BB)- tipo sanguíneo A ou B
Heterozigoto para A e B - AB
Heterozigoto para A e O (ou B e O) – A ou B
Homozigoto (OO) - O
Polimorfismo
Alelos Múltiplos/múltiplos loci
Ex. Sistema gênico HLA - muitos alelos /locus
Alelos Múltiplos/múltiplos loci
Polimorfismo
Perfil molecular
• único para cada indivíduo (DNA é suficiente para distinguir um indivíduo do outro)
• perfil molecular - baseado nas diferenças = marcadores moleculares
• o exame do DNA revela diferenças entre os genótipos dos indivíduos (nem
sempre são observadas no fenótipo)
• Polimorfismo de DNA – ocorrencia de determinada variação do DNA em
uma certa porcentagem de indivíduos de uma população
• estima-se que um pedaço de DNA escolhido ao acaso dentro do genoma
humano em cada 270pb contenha uma variação detectável. Considerando o
tamanho do genoma humano (3X109 pb) espera-se encontrar mais que 10
milhões de locus polimorficos (pontos de variações no DNA)
• A análise do DNA - determinar o perfil molecular
- extremamente precisa
- quantidades mínimas de material (fio de cabelo, gota de sangue)
- resultado conclusivo - amostras velhas ou misturadas
Marcador genético
Todo e qualquer fenótipo molecular proveniente
de um gene expresso (isoenzimas, proteínas,
RNAm)
ou
de
um
segmento
específico
de
DNA/RNA (regiões expressas ou não do genoma)
Onde moram os marcadores?
Onde moram os marcadores?
Polimorfismos
Grego = muitas formas (poli= muitas, morphos = formas)
• Genes – sistema ABO, HLA
• Sequencias repetitivas – tamanho e número
• SNP – “single nucleotide polymorphism”
DNA contém sequencias repetitivas
Sequencias que atingem 130-300 pb, depende da espécie, pode estar
presente em milhões de cópias por genoma
Minisatélite, microsatélites – regiões onde se encontram as sequencias
repetitivas
VNTR – “variation number tandem repeat” – minissatélites (repetições de 7 a
10 pb)
STR – “short tandem repeat” – microssatélites (repetição de 1, 2, 3 ou 4
bases)
Alu - Minisatélite
Em mamíferos, a família mais abundante de sequencias repetitivas = Alu
AGCT
TCGA
300.000 vezes/genoma
Função de sequencias Alu é desconhecida
A presença de tantas cópias dessa sequencia é um completo mistério
Digestão com enzima de restrição
Polimorfismo de Alu
Microssatélites
FOXP3 - Microsatélite
HEX-
CAACCATTGCCCTCATAGAGG
ACACATCCACACCAGGGCTGTGCTAGCGTGGGCAGGCAAGCCAGGTGCTGGACCTCTGCACGTGGGGC
ATGTGTGGGTATGTACATGTACCTGTGTTCTTGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTAGAGCTGGGGTGCAA
CTATGGGGCCCCTCGGGACATGTCCCAGCCAATGCCTGCTTTGACCAGAGGAGTGTCCACGTGGCTCAGG
TGGTCGAGTATCTCATACCGCC
15 repeats – 261pb
Alelo
pb
GT(11)
656
639
997
998
1014
1056
1060
frequencia
253
-
+
-
+
-
-
-
2/7 (28.5)
GT(12)
255
-
-
-
-
-
-
-
0
GT(13)
257
-
-
+
-
-
-
-
1/7 (14.2)
GT(14)
259
+
-
-
-
+
-
+
3/7 (42.8)
GT(15)
261
-
-
+
-
-
+
+
3/7 (42.8)
GT(16)
263
-
-
-
-
-
-
-
0
Separação de polimorfismos com poucos nucleotídeos de diferença
639
641
647
656
Polimorfismo – análise sequenciamento de DNA
Polimorfismo – análise Genescan
997
257pb
261pb
Polimorfismo – análise Genescan
1014
259pb
Teste de paternidade
31.1% das crianças nascidas em 1988 e registradas tinham
mãe solteira
Nascem no Brasil em cada 12 meses aproximadamente
5 milhões de criancas
Temos cerca de 1,5 milhões de nascimentos ilegítimos por ano
Nos EUA há cerca de 180.000 processos judisciais de paternidade/ano
Estudos genéticos em várias populações do mundo tem cosistentemente
mostrado uma taxa de não paternidade críptica entre 4 e 10%.
Isto quer dizer que 5/10% de todas as crianças de famílias constituídas
tem um pai biológico diferente do pai “social”
Metodologia
Impressoes digitais de DNA - caracteriza diretamente diferenças genéticas
Em centenas de sítios nos nossos genes a mensagem genética é interrompida
por grupos de pequenas sequencias de DNA = Minisatélites
Minisatélites hipervariáveis - número
- tamanho
Sondas específicas de DNA -
padrão de minisatélites de cada indivíduo
IMPRESÕES
DIGITAIS DE DNA
RFLP e PCR
Amostras de DNA
Todas as pessoas envolvidas
Leucócitos
Outro tecido que contenha DNA - pele, bulbos capilares
sêmen, células cultivadas
Técnica do Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Hae III reconhece a seqüência e corta o DNA
A
T C T G G C C G A T T C
T A G A C C G G C T A A G
Mutação substitui G por A (e C por T na outra fita)
Hae III não reconhece a seqüência e não corta o DNA
A T C T G A C C G A T T C
T A G A C T G G C T A A G
Técnica do RFLP
SONDA
DNA
Sítio de restrição
Sítio de restrição Sítio de restrição
polimórfico
Alelo 1: 9 Kb
Alelo 2: 12 Kb
A Indivíduo
B
C
12 Kb
9 Kb
Perfil eletroforético
Figura 1 – No perfil eletroforético, as letras A, B e C
representam indivíduos.
Técnica do RFLP
Perfil esquemático de Impressões digitais do DNA
Perfil de Impressões digitais do DNA
Perfil de Impressões digitais do DNA
Perfil de PCR multiplex de DNA
Determinação pré-natal da paternidade
Biópsia de Vilosidades Coriônicas
Identificação de Indivíduos