Caracterização de fatores de virulência e do perfil de resistência
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CENTRO UNIVERSITÁRIO DO MARANHÃO- UNICEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO PESQUISA E EXTENSÃO MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA Caracterização de fatores de virulência e do perfil de resistência antimicrobiana de Escherichia coli uropatogênica (UPEC) oriunda da comunidade de São Luís-MA Orientanda: Adriana de Mendonça Marques Orientadora: Prof. Drª. Patrícia de Maria Silva Figueiredo São Luís-MA 2011 Adriana de Mendonça Marques Caracterização de fatores de virulência e do perfil de resistência antimicrobiana de Escherichia coli uropatogênica (UPEC) oriunda da comunidade de São Luís-MA Dissertação apresentada ao Mestrado em Biologia Parasitária do Centro Universitário do Maranhão (Uniceuma) para obtenção de Título de Mestre em Biologia Parasitária. Orientação:Profª Drª Patrícia de Maria Silva Figueiredo São Luís-MA 2011 Adriana de Mendonça Marques Caracterização de fatores de virulência e do perfil de resistência antimicrobiana de Escherichia coli uropatogênica (UPEC) oriunda da comunidade de São Luís-MA Dissertação apresentada ao Mestrado em Biologia Parasitária do Centro Universitário do Maranhão (Uniceuma) para obtenção de Título de Mestre em Biologia Parasitária. Data da Defesa: 13 de dezembro de 2011. Resultado:_________________________ BANCA EXAMINADORA Profª.Drª.Patrícia de Maria Silva Figueiredo (orientadora) Profª.Drª.Cristina de Andrade Monteiro Profª.Drª.Priscila Soares Sabadini Profª.Drª Rosimary de Jesus Gomes Turri Prof.Dr. Silvio Gomes Monteiro (Suplente) São Luís-MA 2011 Dedico este trabalho à minha família, especialmente ao meu marido, Marcelo, que esteve presente em todos os momentos. Agradecimentos Ao meu marido Marcelo, pela compreensão, carinho e por todo o incentivo, por ser meu porto seguro, a minha alegria em tempos difíceis; À minha família, minha mãe Audelita, pelo direcionamento e ensino, um exemplo de mulher, sempre minha “Pãe”, (in memorian) ao meu pai Afonso, pois acredito que ele sempre sonhou acompanhar toda a nossa jornada, à minha irmã Andreia Fernanda e meu irmão Wesllem por toda força ao longo desses alguns anos; À minha orientadora, prof. Dr. Patrícia Figueiredo pela orientação, assim como a amizade pela e por ter acreditado no meu trabalho; A todos os amigos do laboratório: Monique, que ajudou neste trabalho arduamente, muito obrigado pelo auxílio, além de sua amizade que quero manter (ADMO), as minhas amigas Alicia, Francyelle, Márcia Boor, aprendi muito do lado de vocês, as admiro muito e a todos do laboratório que contribuíram para a realização deste trabalho: Andrea, Jacqueline, Carliane, Joana, Thiago Brito, Thiago Ferro, Débora, Reutone (in memorian), Jorge, às meninas fungos: Patricia Valéria, Dália, Fernanda, Iven. Ao Diogo por todas as soluções disponibilizadas e por está sempre disposto a ajudar; Agradeço ao Uniceuma ; Aos professores do Mestrado; Aos meus amigos da segunda turma do Mestrado: Roxana, Ione, Suzane, Inácio, Viviane e Kênia; aos de outras turmas: Francisca, Ronny, Brighity. À Fapema pelo auxílio financeiro nesses anos de Mestrado. “A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original.” Albert Einstein Resumo A infecção sintomática do trato urinário situa-se entre as mais frequentes infecções bacterianas, onde Escherichia coli é a causa mais frequente deste tipo infecção. A severidade da infecção depende da virulência da bactéria. A utilização da terapia empírica inapropriada é encontrada como sendo a causa de problemas mais graves em pacientes com bacteremia oriunda do trato urinário, sendo que a avaliação dos fatores de virulência e resistência, assim como testes de sensibilidade a antimicrobianos são importantes para iniciar tratamentos. Objetivou-se neste trabalho avaliar a presença de diferentes fatores de virulência em 160 isolados de E. coli uropatogênicas e analisar o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos. As amostras foram avaliadas quanto sua capacidade de adesão com testes para análise da produção de fímbrias curli e do tipo 1, tipo P e S, hidrofobiciade, formação de biofilme e a capacidade de adesão das cepas a materiais inertes, análise da adesão em células Vero e Hep-2. Quanto à atividade tóxica com análise da atividade hemolítica e produção de enzimas, assim como realização de testes de citotoxicidade em células Vero. Caracterizou-se a resistência a antimicrobianos e a existência de amostras produtoras de beta-lactamases. Em relação às fimbrias 80,62% dos isolados apresentaram fímbrias curli e 31,35% fimbrias tipo 1. Através de PCR encontrou-se 43,75% das amostras positivas para fimbrias tipo P e S. A grande parte das amostras, 90,62% ,apresentaram hidrofobicidade. Para detecção do biofilme obteve-se 53,75% positivas em vermelho congo e em espectrofotômetro a positividade foi de 86%. Quanto à atividade hemolítica, 38,75% apresentaram-se positivas para o sangue humano do tipo A, 28% para o tipo B, 37,72% para o tipo O, 38,75% para sangue de carneiro e 30,37% sangue de cavalo. Observou-se maior atividade no sangue humano do tipo A, O e carneiro. Nos testes para detecção de atividade enzimática, observou-se 75 (46,83%) das amostras apresentaram atividade proteolítica, 67 (41,87%) produziram fosfolipases e 3(1,87%) gelatinases. Os antibióticos mais eficazes contra a E. coli uropatogênicas durante a análise foram gentamicina com 96,25% e nitrofurantoína 88,75%. Entre as 160 amostras analisadas quanto à produção da enzima ESBL, 26 (16,25%) amostras foram positivas para esta enzima através do teste fenotípico aplicado, enquanto que pela técnica de PCR encontrou-se 104 (65%) do isolados produtores de β-lactamases de amplo espectro. Dentre estes, os mais predominantes foram bla TEM, sendo encontrado em 48,87% dos isolados e bla CTX com 13,75%. Todas as amostras apresentaram ao menos um fator de virulência analisado, assim o conjunto dos dados obtidos traz uma contribuição para o esclarecimento dos aspectos biológicos destes uropatógenos circulantes na comunidade, o que é relevante, considerando a limitação destas informações em nosso meio. Palavras-chave: Escherichia coli;virulência; resistência. Abstract A symptomatic urinary tract infection (UTI) is among the most frequent bacterial infections of humans. The severity of infection depends on the virulence of the infecting bacteria. The use of inappropriate therapy is found to be the cause of most serious problems in patients with the evaluation of virulence factors and resistance as well as antimicrobial susceptibility testing to guide a new therapeutic approach. Thus, this study aimed to evaluate the presence of virulence factors in strains in 160 isolates of uropathogenic and analyze the profile of antimicrobial resistance. The samples were evaluated for their ability to adhere with analysis of production of curli, type 1, type P and S fimbriae , tests to evaluate hydrophobicity and and adhesion ability of the strains to inert materials, analysis of membership in Vero and Hep2 cells. As for the toxic activity with analysis of hemolytic activity and production of enzymes, as well as cytotoxicity testing of Vero cell. We evaluated the antimicrobial resistance and performed the PCR with the genes of extended-spectrum beta-lactamases (ESBL). In relation to the fimbriae, 80.62% of the isolates showed curli and 31.35% type 1. Through PCR we have found that 43.75% of the samples were positive for fimbriae type P and S. A large part of the samples, 90.62%, showed hydrophobicity. To detect biofilm, 53.75% were positive in congo red agar (CRA), while in the spectrophotometer positivity was 86%. About the hemolytic activity, 38.75% were positive for human blood type A, 28% blood type B, 37.72% type O, 38.75% for sheep blood and 30.37% for horse blood. In tests for detecting enzymatic activity: protease, gelatinase and phospholipase, 46.83% of the samples showed proteolytic activity, 41.87% produced phospholipase and 1.87% gelatinase. The antibiotics most effective against uropathogenic E. coli during analysis were gentamicin (96.25%) and nitrofurantoin (88.75%). Among the 160 samples analyzed for enzyme production ESBL, 26 (16.25%) samples were positive for this enzyme by testing phenotypic applied, whereas the PCR was found 104 (65%) of the isolated producing β broad-spectrumlactamases. Among these, the most prevalent were blaTEM being found in 48.87% of isolates with blaCTX and 13.75%. All the data obtained gives a contribution to the elucidation of the biological aspects of these uropathogens circulating in the community, which is relevant, considering the limitations of this information in our midst. Keywords: Escherichia coli, virulence, resistance. i Lista de Ilustrações Figura 1: Identificação de fímbria curli, amostras em Meio Luria Bertani (LB), identificação de fímbria curli ............................................................................... 40 Figura 2: Padrão de amplificação para a PCR multiplex para os genes papC,sfa,afa e hly.Eletroforese em gel de agarose a 2%.LinhaM:marcador de DNA ladder de 100pb.Linhas 1,3,5,7,10,12,13,14:Produtos de amplificação dos genes papC (328pb) e sfa(410 pb).Linhas :2,4,6,8,9,11 e 15:Foram 41 negativas .......................................................................................................... Figura 3: Teste CRA, as colônias negras ou enegrecidas são produtoras de biofilme e a colônia vermelha é não produtora ................................................. Figura 4: Padrão de adesão agregativa (AA) sobre células da linhagem Vero ............................................................................................................................ 42 44 Figura 5: Gráfico da atividade hemolítica de isolados de E. coli por tipo de sangue. Q=14.74, p=0.005. ¹²³ Números diferentes significam p<0.05 ................................................................................................................... .......... 45 Figura 6. Gráfico da atividade hemolítica de isolados de E. coli em sangue puro e com quelantes e cloreto de cálcio. Q=13.27, p=0.004. ¹²³ - Números diferentes significam p<0.05 ............................................................................... 46 Figura 7: Estirpe com fenótipo positivo para produção de β-lactamases de amplo espectro. AH- Ampliação do halo; AMC-amoxicilina+ácido clavulânico;CRO- ceftriaxona;CTX-cefotaxima;FEP-cefepime;ATM-aztreonam .............................................................................................................................. 48 Figura 8: Detecção dos genes blaCTX, blaTEM e blaSHV por PCR multiplex. Visualização em gel de agarose a 2,5%.Canaletas M=marcador de peso molecular (ladder de 50pb); 1=K. pneumoniae ATCC 700603 (controle positivo); 2=cepa nº2 ; 3= cepa nº8; 4= cepa nº 19; 5= cepa nº22; 6= cepa nº22; 6= cepa nº33;7=cepa nº36 ....................................................................................................................... ....... 49 ii Lista de Tabelas Tabela 1: Sequência de base, tamanhos previstos dos produtos amplificados dos primes utilizados na PCR) ................................................ Tabela 2: Antibióticos usados e o respectivo halo de inibição (CLSI,2011) ......................................................................................................................... 33 37 Tabela 3: Sequência de base,tamanhos previstos dos produtos amplificados e a localização dos oligonucletídeos dos primers na PCR 39 ...................................................................................................................... Tabela 4: Resultado do teste LB para fímbria curli das amostras de E.coli uropatogênicas ............................................................................................. Tabela 5: Aderência bacteriana em testes espectrofotométrico ..................... Tabela 6: Distrubuição dos testes de fatores de virulência para adesão testados, em comparação a formação do biofilme .......................................... Tabela 7 : Atividade enzimática das amostras de E.coli uropatogênicas ....................................................................................................................... Tabela 8: Perfil de resistência das cepas de E.coli isoladas de infecção urinária ............................................................................................................ 40 43 43 46 47 iii Lista de abreviaturas afa gene que codifica para a adesina Afa BHI Infusão de cérebro e coração CLSI Instituto de Padrão Clínico e Laboratorial. CRA Ágar Vermelho Congo dNTP desoxinucleotídeo trifosfato EDDA Etileno-di (o-hidroxifenol) ácido acético EDTA Etilenodiamina-tetra ácido acético ESBL beta-lactamase espectro estendido Hep-2 Células de carcinoma de laringe humana hly gene que codifica para a proteína hemolisina ITU infecção do trato urinário MEM Meio mínimo essencial de Eagle MHC Complexo Principal de Histocompatibildade pap pilus associado a pielonefrite PB pares de base PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase) sfa gene que codifica para a adesina fimbrial S TBE tampão tris/ borato/ EDTA Tris Tris (hidroximetil) aminometano UPEC Escherichia coli uropatogênica Vero célula de rim de macaco verde africano Sumário LISTA DE ILUSTRAÇÕES........................................................................................................................ i LISTA DE TABELAS................................................................................................................................. ii LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................................................... iii 1.INTRODUÇÃO ...................................................................................................................................... 14 2. REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................................................... 16 2.1 Escherichia coli .................................................................................................................................. 16 2.2 E. coli uropatogênicas ........................................................................................................................ 17 2.3 Fatores de virulência .......................................................................................................................... 18 2.3.1 Adesinas associadas a ITU ............................................................................................................. 19 2.3.2 Fimbria curli .................................................................................................................................... 20 2.3.3 Fímbria tipo 1 ................................................................................................................................. 20 2.3.4 Fímbria tipo P ................................................................................................................................. 21 2.3.5 Fimbria tipo S ................................................................................................................................. 22 2.3.6 Adesina afimbrial ............................................................................................................................. 22 2.3.7 Hidrofobicidade ................................................................................................................................ 22 2.3.8 Biofilme ............................................................................................................................................ 23 2.4 Toxinas ............................................................................................................................................... 24 2.4.1 Hemolisinas ..................................................................................................................................... 24 2.5 Enzimas .............................................................................................................................................. 26 2.5.1 Gelatinase ....................................................................................................................................... 26 2.5.2 Fosfolipase ...................................................................................................................................... 26 2.6 Resistência a antimicrobianos ............................................................................................................ 27 2.7 Beta-lactamases de espectro estendido ............................................................................................ 28 3. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 30 3.1- Objetivo Geral .................................................................................................................................. 30 3.2- Objetivos Específicos ........................................................................................................................ 30 4- MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................................... 31 4.1 Local de Realização do Trabalho ....................................................................................................... 31 4.2 Aspectos Éticos .................................................................................................................................. 31 4.3- Testes Utilizados para Pesquisa de Fatores de Virulência em E.coli. .............................................. 31 4.3.1- Detecção de fímbrias tipo curli e tipo 1........................................................................................... 31 4.3.2 Extração do DNA dos isolados ........................................................................................................ 32 4.3.3 Detecção de sequencias de pap,sfa e afa por PCR multiplex ........................................................ 32 4.3.4- Determinação da hidrofobicidade celular ....................................................................................... 33 4.3.5- Detecção de Biofilme...................................................................................................................... 33 4.3.6- Adesão em Células ........................................................................................................................ 34 4.3.7- Detecção da atividade citotóxica .................................................................................................... 35 4.3.8- Produção de Hemolisina em Meio Sólido ...................................................................................... 35 4.3.9- Produção de Hemolisina na presença de agentes quelantes e soluções de íons ....................... 35 4.3.10- Detecção de sequencia de hlyA por PCR .................................................................................... 35 4.3.11- Teste da Atividade Enzimática ..................................................................................................... 36 Proteases ................................................................................................................................................. 36 Fosfolipase ............................................................................................................................................... 36 Gelatinase ................................................................................................................................................ 36 4.4 - Teste de Sensibilidade ..................................................................................................................... 37 4.5- Detecção fenotípica das cepas produtoras de ESBLs por disco aproximação. ................................ 38 4.6- Detecção molecular das cepas produtoras de ESBLs pela técnica de PCR..................................... 38 4.7-Análises Estatísticas .......................................................................................................................... 39 5. RESULTADOS ..................................................................................................................................... 40 6. DISCUSSÃO ...................................................................................................................................... 50 7- CONCLUSÃO ....................................................................................................................................... 56 REFERÊNCIAS ........................................................................................................................................ 58 ANEXOS ................................................................................................................................................... 70 APÊNDICES ............................................................................................................................................. 77 14 1 INTRODUÇÃO Infecção do trato urinário (ITU) é uma das principais causas de consulta médica, ficando atrás somente das infecções respiratórias (ANDREU et al., 2005), sendo definida como a invasão microbiana de qualquer órgão do trato urinário, desde a uretra até os rins (MARANGONI; MOREIRA, 1994). É classificada em quatro grandes grupos: uretrites, cistites, síndrome uretral aguda e pielonefrites. O trato urinário pode ser invadido por uma grande diversidade de organismos como bactérias, vírus e fungos (CORREA; CANALANI; MATHEUS, 2003) sendo a maioria das ITUs causadas por bactérias gram-negativas, onde a Escherichia coli é o invasor mais comum isolado em cerca de 70 a 90% das infecções urinárias agudas de origem bacteriana (SATO et al., 2005), sendo a causa mais frequente deste tipo infecção. A severidade da infecção depende da virulência da bactéria infectante e da suscetibilidade do hospedeiro. E.coli causadora de ITUs (UPEC) diferenciam-se das comensais devido aos fatores de virulência, que incluem adesinas, toxinas, cápsula, resistência sérica e sistema de captação de ferro (JANKE et al., 2001; OELSCHLAEGER et al., 2002). Os fatores de virulência podem permitir a colonização das superfícies da mucosa, a lesão e invasão dos tecidos, superação dos mecanismos de defesa e incitação da resposta inflamatória, podendo ser utilizado pelo micro-organismo em diferentes combinações, com diferentes caminhos moleculares, sendo que em alguns casos e possível fazer a diferenciação destes organismos através dos sintomas da doença (KAPER et al., 2004). A habilidade da E.coli em ser patogênica é devido a expressão de seus fatores de virulência e seus genes estão localizados em cromossomo e/ou plasmídeos, alguns estão mais envolvidos com a colonização, como as adesinas e outros com as lesões ao hospedeiro como as toxinas (BABAI et al., 1997). Linhagens de E.coli produzem adesinas, chamadas de pili ou fímbria, estruturas presentes no envelope celular, que permitem essas bactérias iniciar com sucesso as infecções. Os receptores para adesinas são produzidos por células epiteliais, eritrócitos e pelo glicocálix urinário. Especificamente estas adesinas 15 podem se ligar à componentes da matriz extracelular como fibronectina, laminina ou colágeno (GARCIA ; LÊ BOUGUÉNEC, 1996). E.coli pode ser encontrada em diferentes nichos ecológicos e em diversas situações de estresse devido ao uso de antibióticos, o que lhe proporciona a aquisição e disseminação de genes que lhes conferem a resistência a esses agentes (SÁENZ, 2004). Dentre os mais variados mecanismos de resistência aos antibióticos, destaca-se a produção de β-lactamases de espectro estendido (ESBLs), designadas como enzimas que apresentam a capacidade de hidrolisar e inativar uma grande variedade de antibióticos do grupo β-lactâmicos, incluindo cefalosporinas de terceira geração, penicilinas e aztreonam (NATHISUWAN; BURGESS; LEWIS, 2001). Vale ressaltar que, os antibióticos β-lactâmicos constituem o tipo de tratamento mais comum para infecções bacterianas (KOTRA; SAMAMA; MOBASHERY, 2002) como no caso da ITU em que a maioria das cepas produtoras de ESBL são E.coli, Klebsiella pneumoniae e Klebsiella oxytoca (NATHISUWAN; BURGESS ; LEWIS, 2001). As enzimas β-lactamases de espectro estendido são resultantes da mutação das enzimas temoniera, TEM-1, TEM-2 e sulfidril variável 1(SHV-1) que conferem aos micro-organismos alto nível de resistência para penicilinas e baixa resistência às cefalosporinas, no entanto com a vasta utilização destes medicamentos, assim como a do utilização de aztreonam têm causado mutações destas enzimas, contribuindo para surgimento de novas ESBLs (NATHISUWAN; BURGESS; LEWIS, 2001) As ESBLs medeiam resistência à cefotaxima, ceftazidima e outras cefalosporinas de amplo espectro e aos monobactâmicos (tais como o aztreonam), contudo, não apresentam nenhuma atividade detectável contra cefamicinas e imipenem. Devido à sua ação sobre uma grande gama de substratos, essas enzimas receberam a denominação de espectro estendido (SIROT, 1995). O modelo de resistência dos patógenos causadores de infecções urinárias, frente aos agentes antimicrobianos comuns está em constante mudança e isso deve ser levado em consideração na escolha da estratégia para o tratamento (KHAN; AHMED, 2001). Muitos casos de ITU em hospitais são inicialmente tratados empiricamente baseados somente na frequência de patógenos, na taxa de 16 resistência antimicrobiana local e na severidade da doença, sem levar em consideração fatores de virulência do patógeno. A utilização da terapia empírica inapropriada foi encontrada como sendo a causa de mortalidade em pacientes com bacteremia originada no trato urinário (BISHARA et al., 1997). A compreensão dos diversos fatores de virulência que influenciam as ITUs, bem como o comportamento diante de antimicrobianos são de suma importância para a escolha da estratégia terapêutica e acompanhamento clínico. A utilização indiscriminada de antimicrobianos para o controle de doenças de trato urinário tem auxiliado a seleção de bactérias com mecanismos de resistência e possivelmente no crescimento de cepas mais virulentas, sendo que a avaliação de fatores de virulência e resistência, assim como o monitoramento da ocorrência de cepas de UPEC produtoras de ESBLs contribuirá para delinear a amplitude do problema, para definir opções de tratamento e elencar medidas adequadas para uma nova conduta terapêutica. 2 REFERÊNCIAL TEÓRICO 2.1 Escherichia coli A bactéria gram-negativa E. coli foi assim denominada em homenagem a Theodor Von Escheich, que a descreveu em 1885. Originalmente era denominada Bacillus coli commune, sendo que ao longo do tempo recebeu vários outros nomes até chegar ao atual (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997). Era conhecida apenas como um bacilo gram-negativo residente do trato intestinal de pessoas sadias. No entanto, foi reconhecida como causadora de doença após um surto de diarréia em recémnascidos em 1940 (BRAY, 1945). É uma bactéria anaeróbia facultativa da família Enterobacteriaceae que habita o cólon intestinal desempenhando um papel fundamental na fisiologia e manutenção da microbiota deste local (DRASAR; HILL, 1974), protegendo o intestino contra infecções, simultaneamente com outras bactérias comensais, devido a sua competição com outras bactérias patogênicas intestinais. Apesar de ser predominantemente comensal, E.coli está comumente envolvida em uma grande quantidade de toxinfecções alimentares, infecções extra- 17 intestinais,tais como infecções abdominais e do trato urinário, meningite e, no caso de atingir a corrente sanguínea pode provocar sepse (GUERRA et al., 2003; COSTA, 2006). As estirpes patogênicas de E.coli apresentam comumente uma série de fatores de virulência que, usualmente, não são encontrados em bactérias comensais (SÁENZ, 2004). 2.2 E. coli uropatogênicas Em virtude de suas habilidades de colonizar, persistir e induzir inflamação do trato urinário cepas de E.coli são selecionadas da flora fecal tornado-se uropatogênicas. A infecção do trato urinário (ITU) é a forma mais comum de infecção extra-intestinal causada por E.coli, que é o principal agente desta infecção, sendo também uma das fontes mais comuns de bacteremia em indivíduos hospitalizados (PIRES et al, 2007). UPEC é o agente causador de 70 a 95% das ITUs comunitárias e de 50% dos casos de ITUs nosocomiais, sendo que a maior parte destas infecções se desenvolvem em uma rota ascendente (MULVEY, 2002). As infecções do trato urinário representam um problema significativo na área da saúde mundial, ocorrendo em pacientes com o trato urinário anatomicamente e funcionalmente normal envolvendo a ascensão da bactéria da uretra até a bexiga e em alguns pacientes pode subir até o rim (FOWLER JR; STAMEY, 1977). As ITUs ocorrem em homens e mulheres das mais variadas idades, porém os grupos mais acometidos são os recém-nascidos do sexo masculino, homens com obstrução prostática, idosos de ambos os sexos e, especialmente mulheres jovens sexualmente ativas (BARROS et al., 1999). Na ausência de anormalidades funcionais no trato urinário, a incidência desta infecção é maior nas mulheres do que em homens, devido diferenças anatômicas e fisiológicas. Aproximadamente entre 10 e 20% das mulheres adquirem a infecção sintomática, enquanto que este percentual não ultrapassa os 12% nos homens (JOHNSON, 1991). Os sítios mais comuns para a infecção bacteriana do trato urinário são os ureteres, uretra, bexiga e rins, sendo que a pielonefrite é infecção que ocorre nos rins e é a categoria de infecção mais severa (JOHNSON, 1991; MULVEY et al, 2000; MULVEY, 2002), consistindo de uma infecção do parênquima renal e sistema coletor , 18 incluem sintomas como febre, calafrios e dor no flanco renal. Aproximadamente 30% dos casos de pielonefrites há complicação de bacteremia acompanhado por sepse (JONHSON,1991; GARCIA ; LÊ BOUGUÉNEC, 1996;MULVEY,2002). A cistite é uma infecção que ocorre nos rins e é moderadamente severa, caracterizada por disúria, ardor e dor no inicio, durante e após micção, urgência urinária e dor supra-pubiana devido sensibilidade da inflamação da bexiga (JOHNSON, 1991) 2.3 FATORES DE VIRULÊNCIA As características que tornam certas bactérias patogênicas são conhecidas como fatores de virulência conferindo uma vantagem seletiva às estirpes que as possuem em comparação com as estirpes comensais que não as manifestam (MUNDY et al, 2000) . Para que possa colonizar e causar doença no hospedeiro, muitos agentes bacterianos desenvolveram mecanismos necessários para colonizar, invadir e persistir no hospedeiro, uma vez que, após a entrada o micro-organismo fica exposto ao sistema de defesa do hospedeiro (GARCIA; LÊ BOUGUÉNEC, 1996; MULVEY, 2002). Uma das maiores defesas do trato urinário é ação da lavagem com a urina, uma bactéria que não adere poderá ser expulsa facilmente do organismo, sendo que, a aderência de E.coli nas células uroepiteliais protege a bactéria da lavagem urinária e aumenta sua habilidade de multiplicar e invadir o tecido renal (KORHONEN et al, 1988), sendo a adesão o passo inicial relacionado à patogênese da infecção e um pré-requisito para a colonização e infecção. A aderência é um fenômeno específico de reconhecimento entre o microrganismo e as células do hospedeiro humano infectado e ocorre entre as adesinas fimbriais e não fimbriais e seus receptores correspondentes na superfície celular (SMYTH; MARRON; SMITH, 1994). A adesão específica é mediada por proteínas bacterianas denominadas adesinas, que podem ser chamadas de fimbrias ou pili, que permitem o sucesso no 19 início das infecções. Essas adesinas são muito importantes na virulência da bactéria e em particular podem ser também um passo fundamental para o desenvolvimento da sepse. Além disso, adesinas representam um passo essencial no inicio da formação do biofilme. E.coli uropatogênica tem sido encontrada formando biofilme bacteriano, fator que confere importantes vantagens a estes microrganismos como resistência à desidratação e oxidação e maior tolerância a detergentes e antibióticos (CASTONGUAY et al, 2006; HANCOCK et al , 2007). E.coli possui fímbrias que podem ser categorizadas como manose sensíveis e manose resistentes, baseando-se na sua capacidade de aglutinar eritrócitos na presença ou ausência de manose. Fímbrias tipo P, que são manose resistente e estão fortemente associadas à pielonefrites e em menor grau a cistite, devido à manose ser o principal componente glicolipídico da membrana celular renal, que também é o principal receptor para a fímbria P (JOHNSON, 1991). Segundo Schembri et al (2003), os fatores universalmente envolvidos no início da formação do biofilme em E.coli são: fímbria tipo 1 e do tipo P, que estão envolvidas na adesão inicial da bactéria , ao substrato, ao antígeno 43, na agregação inter-bacteriana e na presença de fimbria curli que medeia a interação inter-bactéria e também bactéria-superfície. Outros fatores podem contribuir para a uropatogenicidade bacteriana, como a produção de toxinas (hemolisinas, fatores necrosantes citotóxicos), enzimas extracelulares, resistência à atividade bactericida do soro. A multiplicidade e associação de fatores de virulência têm sido importantes no desenvolvimento de ITU podendo aumentar a patogenicidade de um isolado de UPEC (YAMAMOTO et al, 1995; BLANCO et al, 1997; MORIN;HOPNKS,2002). 2.3.1 ADESINAS ASSOCIADAS A ITU Adesinas são componentes protéicos localizados na superfície bacteriana e promovem a ligação específica para os receptores de células eucarióticas. Estão associadas a apêndices filamentosos chamados fímbrias, que saem a partir da superfície bacteriana. De um modo geral, fímbrias são organelas heteropoliméricas compostas de subunidades principais e outros menores, onde as características adesivas são conferidas às subunidades menores presentes no topo da fímbria ou 20 intercaladas em pontos ao longo deste filamento (KUEN et al, 1994; MOL; OUDEGA, 1996). Em UPEC foram descritas adesinas fimbriais do tipo curli, tipo 1, P , S e adesinas afimbriais. 2.3.2 FÍMBRIA CURLI É uma fímbria amilóide capaz de promover tanto ligação bactéria-bactéria, agregação, quanto a ligação da bactéria-superfície, sendo expressas por muitos isolados patogênicos de E. coli (GOPHNA et al., 2001).Ligam-se a algumas moléculas presentes em tecidos vivos, tais como: fibronectina (OLSEN; JONSSON; NORMARK, 1989), laminina (OLSEN et al., 1993), plasminogênio (SJOBRING; POHL; OLSEN, 1994), proteínas de contato de fase (BEM NASR et al., 1996) e ao MHC de classe I (OLSEN et al., 1998). De acordo com Gophna et al (2001) a adesão e invasão de células se devem principalmente pela ligação da fímbria curli à fibronectina. No entanto ao estudarem esta fimbria encontraram-na em amostras não virulentas de laboratório, tais como E. coli K12. Sendo assim, esses autores propuseram que mesmo possuindo os mesmos grupos gênicos as amostras não virulentas não expressariam o gene nas condições ambientais daquelas oferecidas pelo hospedeiro. 2.3.3 FÍMBRIA DO TIPO 1 A fímbria do tipo1 é muito bem distribuída dentro da família Enterobacteriaceae, tanto em membros patogênicos como em membros não patogênicos. Em muitos casos, por exemplo, em UPEC, parece ser essencial na adesão bacteriana ao epitélio da bexiga e então estabelecimento da infecção, como no caso da cistite (KAU; HUSTAND; HULTGRAN, 2005), favorecendo a internalização bacteriana ao epitélio da bexiga, um fato que então pode levar a fase crônica da cistite. A expressão da fímbria do tipo 1 tem sido reportada por ser uma importante estrutura para formação do biofilme, devido sua adesão celular inicial, sendo importante durante os estágios iniciais de colonização (WOOD et al., 2006). 21 De acordo Teng et al (2005) a fímbria tipo 1 promove a adesão inicial de E. coli em casos de meningite, significando um passo essencial para a translocação pela barreira hematoencefálica e estabelecimento da doença. Em muitos casos esta fímbria está relacionada à adesão inicial de E.coli ao substrato, sendo ele inerte (SCHEMBRI, et al., 2003) ou celular (TENG et al., 2005), estando dessa forma diretamente relacionada a formação do biofilme. Trata-se de uma proteína possuidora de um sítio de ligação a D-manose e assim se liga a esse carboidrato presente na membrana plasmática de células eucarióticas (KAU; HUSTAND; HULTGRAN, 2005). 2.3.4 FÍMBRIA TIPO P A denominação da fímbria P teve origem em seu receptor, que faz parte do antígeno do grupo sanguíneo P. Também conhecida como uma adesina manose resistente em testes de hemaglutinação esta fímbria representa um fator de virulência característico de cepas causadoras de pielonefrite e são frequentemente associadas a alguns sorogrupos de E.coli (JOHNSON, 1991; BLANCO et al.,1992). Esta fímbria, estruturalmente, é composta por um extenso polímero constituído por quatro subunidades protéicas, uma subunidade principal estrutural, duas menores também estruturais presentes na região apical do filamento e uma subunidade G contendo o sítio de ligação com o receptor, localizado na extremidade da fímbria (JOHNSON, 1991). Segundo Kallenius et al (1981) a fímbria tipo P estava presente em 91% das cepas urinárias causadoras de pielonefrite em crianças e em apenas 7% das E.coli fecais de controles sadios. A expressão de fímbrias P em E.coli isoladas de ITU vai declinando progressivamente de 70% entre os isolados em pielonefrite, para 36% nas bactérias causadoras de cistite, 24% nas bactérias encontradas em amostras de urina de portadores de bacteriúria assintomática e 19% em E.coli da microbiota intestinal (JOHNSON, 1991). 22 Os receptores para fímbria P podem ser encontrados em células epiteliais e não epiteliais do rim e de todo o aparelho urinário. Também são encontrados em células do intestino grosso, o que pode explicar o achado freqüente da E.coli causadoras de pielonefrite em nível intestinal (LATHAM; STAMM, 1984). 2.3.5 FIMBRIA TIPO S Fimbrias do tipo S são adesinas relatadas em muitos isolados de infecção do trato urinário, sendo expressas principalmente por estirpes causadoras de sepse e meningite (KORHONEN et al, 1985) . Essas adesinas são chamadas de tipo S devido sua ligação específica com receptor contendo sialyl-galactose. As adesinas S hemaglutinam sangue humano na presença de manose, sendo assim manose resistente (HMR) assim como a fimbria tipo P (JONHSON, 1991). 2.3.6 ADESINA AFIMBRIAL As adesinas afimbriais pertencem à família Dr, sendo também manose resistente com atividade em eritrócitos humanos, mas não de carneiro e coelho. Estão diretamente associadas à superfície da célula bacteriana, nas quais estimulam a ligação de bactérias em diversos tipos de células hospedeiras (SERVIN, 2005; COTA et al, 2006). Sendo geralmente relacionadas com isolados de E.coli com adesão em células do tipo difusa e são associadas epidemiologicamente com estirpes patogênicas causadoras de ITU crônicas e recorrentes, cistite em crianças e pielonefrite em gestantes (NOWICKI et al, 2001) 2.3.7 HIDROFOBICIDADE A aderência de micro-organismos é aceito como o primeiro passo no processo de colonização de superfícies inertes e nas células epiteliais do hospedeiro (BUSSCHER et al., 1990) e as propriedades fisico-químicas da superfície podem exercer 23 uma forte influência sobre a adesão dos micro-organismos, que aderem com maior facilidade em superfícies hidrofóbicas do que nas hidrofílicas. Hidrofobicidade é uma força atrativa que ocorre entre as moléculas hidrofóbicas da superfície das células bacterianas e superfícies inertes ou bióticas formando uma interação atrativa reversível (JONES et al., 1996) Estudo demonstram que hidrofobicidade da superfície celular microbiana, apesar de ser uma interação inespecífica, é um dos fatores determinantes da adesão bacteriana em superfícies (VAN LOOSDRECHT et al., 1987). Uma vez que a hidrofobicidade contribui para a agregação celular, ela também têm um papel importante na formação do biofilme , associada aos outros fatores de adesão. 2.3.8 BIOFILME Em ambientes naturais, as bactérias geralmente são encontradas em comunidades sésseis, que usualmente nos referimos como biofilme, definido como comunidades complexas de bactérias aderidas a superfícies (WHITTAKER; KLIER; KOLENBRANDER, 1996). Com a formação do biofilme, as bactérias podem colonizar praticamente todos os tipos de materiais e se desenvolver em quase todos os tipos de superfícies sem a necessidade de um local com água em abundancia (CASTONGUAY et al., 2006). São formados pela associação de diferentes espécies de micro-organismos (CONSTERTON et al., 1995; DUNNE JR, 2002). Está relacionada normalmente a infecções persistentes, como nos casos de prostatites, cistite causada pelo uso de cateteres devido a maior resistência de UPEC a antimicrobianos, e outras infecções causadas por cateteres e implantes cirúrgicos, sendo uma causa comum de infecções hospitalares (DONLAN; COSTERTON, 2002). Uma característica marcante de muitos biofilmes é a produção extensiva de uma matriz extracelular de natureza polissacarídica ou protéica, conhecida como glicocálice, que se expõe exteriormente à membrana externa das células gramnegativas e ao peptideoglicano das células gram-positivas. Esta matriz é sintetizada 24 por polimerases, constituindo-se em uma estrutura composta de diversas fibras de polissacarídeo ou proteínas globulares, e em seu estado hidratado contém cerca de 98% de água, protegendo as células da desidratação, já que podem reter água em quantidades muito maiores que sua massa e se desidratam lentamente. Este tipo de organização é extremamente vantajoso a todas as espécies de micro-organismos, por fornecer proteção contra adversidades como além da desidratação, colonização por bacteriófagos, estresse oxidativo e resistência a antimicrobianos (GILBERT; MCBAIN; RICKARD, 2003) A capacidade de formar biofilme também está presente em espécies não patogênicas, onde as fímbrias e os flagelos são responsáveis respectivamente pela adesão inicial e a motilidade, importantes para o estabelecimento do biofilme (PRATT; KOLTER, 1998; SCHEMBRI et al., 2003). Além destas estruturas também foi descrita a capacidade de agregação no biofilme bacteriano proporcionada pelo antígeno 43 (Ag43), uma proteína de membrana externa encontrada nesta espécie (DANESE et al., 2000) e fímbria curli, uma organela de membrana , relacionada, dentre outras, a adesão e persistência da bactéria ao substrato. E. coli é capaz de colonizar superfícies através de sua adesão e consequente desenvolvimento de biofilme, que pode resultar em maior persistência no ambiente (CASTONGUAY et al., 2006). 2.4 TOXINAS 2.4.1 HEMOLISINAS As hemolisinas são proteínas extracelulares (exoproteínas) com ação citotóxica com capacidade de lisar eritrócitos, destruindo leucócitos, granulócitos, fibroblastos e células uroepiteliais. Em cepas hemolíticas de E.coli causadoras de ITUs a hemolisina é um importante fator de virulência (CAVALIERI; BOHACH; SNYDER,1985; BLUM et al, 1995; ISLAND et al,1998) A atividade hemolítica extracelular de E.coli ao verificar que algumas culturas deste micro-organismo lisavam eritrócitos e que o seu sobrenadante conseguia reter a atividade hemolítica mesmo após filtração (CAVALIERI; BOHACH; SNYDER, 1985). 25 Estudos identificaram a associação entre a produção de hemolisinas e a virulência de linhagens de E.coli causadoras de infecções extra-intestinais em humanos, particularmente do trato urinário, peritonite, apendicite, septicemia e meningite neonatal (HACKER et al, 1983; CAVALIERI; BOHACH; SNYDER,1985; EBERSPÄCHER; HUGO; BHAKDI, 1989). Aproximadamente 50% das cepas de E.coli que causam infecções extraintestinais em humanos secretam a hemolisina, nas quais se observa zonas de hemólise ao redor da bactéria em placas de ágar sangue (HUGHES et al, 1983). Em humanos, uma baixa porcentagem, aproximadamente 12%, das amostras de E. coli fecal, são hemolíticas comparadas com 35 a 50% das amostras das causadoras de infecções extra-intestinais como: bacteremia, septicemia e ITU (MINSHEW et al, 1978; HUGHES et al, 1983). Entre as causadoras de ITU a produção de hemolisina é freqüentemente associada com outros fatores que contribuem para a virulência (HACKER et al, 1983), acreditando-se que sua virulência seja multifatorial . A hemolisina contribui com o processo da doença de três modos, por ser citotóxica para as células do tecido “in vitro”, logo deve prejudicar as células “in vivo” e contribuir diretamente para a patologia do tecido, afetando os mecanismos de defesa do hospedeiro permitindo a sobrevivência do microrganismo, atuando assim como um mecanismo de evasão e através da lise do eritrócito, mecanismo através do qual o micro-organismo irá obter ferro para permanecer vivo e talvez para continuar a síntese de hemolisina (CAVALIERI; BOHACH; SNYDER, 1985). Em estudos clínicos, a maior incidência de E.coli produtora de hemolisina ocorreu em pacientes com pielonefrite aguda (49%), seguido de 40% nos casos de cistite e 20% dos casos de bacteriúria assintomática, sendo que a produção de hemolisina foi mais prevalente nos casos de ITU renal do que em bexiga (JOHNSON, 1991). 26 2.5 ENZIMAS 2.5.1 GELATINASE A gelatinase é uma protease extracelular membro da família das metaloendopeptidase. É uma enzima extremamente hidrofóbica que degrada diversos componentes da matriz extracelular, capaz de hidrolisar gelatina, colágeno, caseína, hemoglobina e outros peptídeos pequenos biologicamente ativos (VERGIS et al.,2002; KAYAOGLU; ORSTAVIK, 2004) Espécies de bactérias mais virulentas têm apresentado a gelatinase como um fator determinante na infecção, em cepas de Enterococcus fecalis esta enzima tem sido mostrada contribuindo para a virulência de endocardite em um modelo animal (GUTSCHICK;MOLLER;CHRISTENSEN,1979). Gold et al(1975) descobriram que cepas de bactérias que produziam a gelatinase foram cariogênicas em camundongos, enquanto que espécies não produtoras desta enzima apresentaram pouca atividade cariogência. Estudos sobre a gelatinase demonstraram que esta contribuiu para a virulência de E. fecalis em modelos animais, no entanto pouco se sabe sobre a patogenicidade desta enzima em infecções humanas. 2.5.2 FOSFOLIPASE Fosfolipase constitui um diverso grupo de enzimas lipolíticas que tem capacidade de hidrolisar uma ou mais ligações de ésteres presentes em fosfolipídios. A fosfolipase tem um papel que vai desde digestão de nutrientes até a formação de moléculas bioativas. Esta diversidade de funções sugere que as fosfolipases são essenciais à vida de um micro-organismo, assim como para a membrana celular que passa por uma contínua remodelagem devido a ação de uma ou mais fosfolipases (TAGHRID, COLOE;COLOE, 2006). A invasão das células do hospedeiro para a maioria dos patógenos requer penetração e dano da membrana celular, que pode ser mediada por recursos físicos ou enzimáticos, ou pela combinação dos dois. Fosfolipídios e proteínas representam o principal constituinte químico do envelope celular do hospedeiro e, portanto são 27 necessárias fosfolipases para o processo de ruptura da membrana, que ocorre durante a invasão (WAITE, 1996). A atividade da fosfolipase tem sido ligada à patogenicidade em várias espécies de bactérias devido a sua ligação com a atividade citolítica, que é o resultado da destruição dos fosfolipídios presentes na membrana celular, gerando produtos oriundos desta desestabilização. As propriedades citolíticas da fosfolipase dependem diretamente de sua habilidade de hidrolisar fosfolipídios da membrana plasmática. Na maioria dos casos, associa-se a capacidade lítica de uma bactéria somente com sua capacidade de produzir hemolisinas, mas a fosfolipase também é um fator chave da bactéria na indução da hemólise, além da sua importância na aquisição de nutrientes. Os genes da fosfolipase são altamente conservados em bactérias gram-negativas, sugerindo que esta enzima tem um papel fundamental para a sobrevivência destes micro-organismos. No entanto mais estudos têm que ser feitos para identificar o papel da fosfolipases na patogenicidade e sobrevivência de bactérias gram-negativas (TAGHRID, COLOE; COLOE, 2006). 2.6 RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS O mundo está enfrentando uma séria crise no sentido de uma crescente resistência às drogas antibacterianas, de modo que esse fator se apresenta como uma séria ameaça para o manejo das doenças infecciosas (CROFT; D’ANTONI, . TERZULLI, 2007; KOTRA et al., 2002) O aumento nas taxas de resistência entre vários micro-organismos, e, de um modo particular entre as E.coli uropatogênicas (UPECs) têm causado grande preocupação em países desenvolvidos e em desenvolvimento (LINA;RAHMAN;GOMES, 2007). As bactérias vêm sendo avaliadas quanto à sua sensibilidade aos antibióticos e é fato que a resistência pré-existe a estes agentes (resistência natural, inata) adquiridas por mutação ou por transferência de genes de resistência oriundas de outras bactérias. Já foram definidos os mecanismos de ação dos antimicrobianos, seja por meio de atividade bactericida, seja através de atividade bacteriostática, sendo alguns padrões estudados como: ação inibitória na síntese da parede celular, alteração da permeabilidade da membrana citoplasmática, inibição ou alteração da síntese protéica e atuação nos ácidos nucléicos são os mecanismos descritos, para que o antibiótico atue, ele precisa se ligar a um determinado sítio da bactéria para 28 interferir em seu metabolismo. Neste sentido, as bactérias desenvolveram formas de sobrevivência tais como: bomba de efluxo, impenetrabilidade, proteção ribossômica, beta-lactamases e beta-lactamases de espectro estendido, tornado-se mais resistentes aos antibióticos, fator de risco no manejo de doenças infecciosas (LOPES, 2009). Bactérias multi-resistentes relacionadas a infecções hospitalares estão envolvidas à morbi-mortalidade e são de difícil controle, ocasionando maior tempo de internação hospitalar e alto custo com exames e medicamentos (MARTINS, 2006). Com o objetivo de se conter o constante surgimento e rápida disseminação dos mecanismos de resistência aos antimicrobianos, além de se determinar perfis de sensibilidade e monitorar a evolução a da transmissão e expressão da resistência entre várias populações de patógenos, programas de vigilância da resistência têm sido conduzidos em vários países (JONES; MATERSON, 2001). 2.7 BETA-LACTAMASES DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESBL) Dentre os mais variados mecanismos de resistência aos antibióticos, se destaca a produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) que constituem uma classe de beta-lactamases com capacidade de hidrolisar e inativar uma grande variedade de antibióticos do grupo beta-lactâmicos, incluindo cefalosporinas de terceira geração, penicilinas e aztreonam, drogas antimicrobianas mais prescritas em todo o mundo (NATHISUWAN; BURGESS; LEWIS, 2001). As enzimas beta-lactamases hidrolisam os antibióticos beta-lactâmicos, através da hidroxilação irreversível da ligação amida do anel beta-lactâmico, gerando compostos sem atividade antimicrobiana (BUSH, 2001) Entre as bactérias gram-negativas, a produção de beta-lactamases é o principal mecanismo de resistência, tendo aumentado em freqüência e evoluído consideravelmente (MEDEIROS, 1997). Estas enzimas se disseminaram facilmente para outras espécies de bactérias (HAEGGMAN et al., 2004; JACOBY; MUNHOZ-PRICE, 2005) e são identificadas em importantes patógenos da família Enterobacteriaceae (HERITAGE et al., 1999). 29 Micro-organismos produtores de ESBL são a maior causa de falha terapêutica com cefalosporinas, pois isolados clínicos identificados como sensíveis passam a produzir ESBL durante a terapêutica antimicrobiana (BRADFORD, 2001; BUSH, 2001). Além da produção de ESBL está frequentemente associada à resistência a outros antibióticos em patógenos multi-resistentes (BUSH; MEDEIROS, 1995). A maioria das ESBLs é mediada por plasmídeo, oriundas de mutações genéticas (TEM: Termonieira e SHV: sulfidril) (CARTER et al., 2000) que alteram a configuração de aminoácidos (KFOURY;ARAJ, 2003; PATERSON; BONOMO, 2005) e são encontradas, principalmente, em E. coli e Klebsiella sp. (ESMERINO; GONÇALVES; SCHELESKY, 2003). As ESBL tipo TEM e SHV são codificadas por genes bla SHV e bla TEM localizados no cromossomo bacteriano (LIVERMORE, 1995; GUPTA et al., 2007) e evoluíram através de mutações pontuais em bla TEM e bla SHV, respectivamente, o que permitiu a remodelagem de seu sítio ativo e expansão de sua atividade hidrolítica (JACOBY; BUSH, 2005). De forma geral, as cepas produtoras de SHV e TEM apresentam maior nível de resistência a ceftazidima do que à cefotaxima (BONNET, 2004). Mais recentemente, enzimas que pertencem a um tipo diferenciado de ESBL que hidrolisa tipicamente a cefotaxima, CTX-M, vem sendo detectada com freqüência aumentada (BAÑO et al., 2006; TUNER, 2005). Tornaram-se o tipo de ESBL mais prevalente, principalmente na Europa e em determinados países da América do Sul (CANTON; COQUE, 2006) e não apresentam relação próxima com as ESBL do tipo TEM e SHV (BRADFORD, 2001). Estas enzimas eram inicialmente reconhecidas por hidrolisarem preferencialmente a cefotaxima, e apresentam baixa capacidade de hidrólise da ceftazidima. A grande capacidade de disseminação destas enzimas é devida principalmente pela transmissão horizontal de elementos genéticos móveis, além da disseminação de clones resistentes (BOU et al., 2002). Estas enzimas encontram-se disseminadas mundialmente, e apresentam alta prevalência na Europa e América do Sul (BONNET et al., 2000; BONNET et al., 2001; CANTON ;COQUE, 2006) e estudos para a elucidação da diversidade e prevalência das ESBL no Brasil ainda são escassos, devido à grande extensão territorial (CLÍMACO, 2008) 30 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar a presença de fatores de virulência e o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos em cepas E.coli uropatogênicas isoladas de infecção do trato urinário em laboratório particular de São Luís-Maranhão. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Pesquisar a presença de fímbrias curli e tipo 1 através do método fenotípico; Determinar a presença dos genes que codificam para as adesinas fímbria P (pap), fímbria S (sfa) e adesina afimbrial (afa); Avaliar a hidrofobicidade das amostras; Detectar a produção de biofilme; Analisar a adesão em células Vero (Rim de Macaco Verde Africano) e HEp2 (Carcinoma de Laringe Humana) Investigar a atividade hemolítica entre os isolados e determinar a presença do gene que codifica alfa-hemolisina (hlyA) ; Verificar a atividade citotóxica em células Vero; Investigar perfil enzimático através da presença de protease, fosfolipase e gelatinase. Avaliar o perfil de resistência de cepas de UPECs frente a várias classes de antimicrobianos e a produção de β-lactamases de espectro extendido (ESBL) através de técnica fenotípica e molecular. 31 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 LOCAL DE REALIZAÇÃO DO TRABALHO O presente trabalho foi conduzido no Laboratório de Microbiologia Médica do Centro Universitário do Maranhão-Uniceuma com 160 amostras de E.coli uropatogênicas adquiridos de uma colonização do trato urinário oriundas do Laboratório Gaspar localizado na cidade de São Luís-Maranhão, gentilmente cedido por prof. Dr. Luís Henrique Gonçalves previamente identificadas através de testes bioquímicos convencionais. Atualmente fazendo parte da Bacterioteca do Laboratório de Microbiologia Médica do Uniceuma. Cada uma das amostras obtidas foi mantida em tubos criogênicos contendo meio liquido BHI (Brain Hart Infusion) e glicerol. 4.2 ASPECTOS ÉTICOS O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa n˚ 00097/11 do Uniceuma, São Luís, Maranhão (Anexo A) 4.3 TESTES UTILIZADOS PARA PESQUISA DE FATORES DE VIRULÊNCIA 4.3.1 DETECÇÃO DE FÍMBRIAS TIPO CURLI E TIPO 1 Para identificação da fímbria curli a cultura foi crescida a 37ºC no meio Luria Bertani (LB), com ph 8, durante 24 horas. Depois de crescida a cultura foi semeada em placas de LB (sem sal) contendo 0.004% de Vermelho Congo e 0.002% de Azul Brilhante. As placas foram incubadas por 24 a 48 horas em temperatura ambiente. Colônias vermelhas ou rosas são indicativas de bactérias produtoras de curli (DA RE ;GHIGO, 2006) Para identificação da fímbria tipo 1 foi realizado cultivo em BHI por 24 horas a 37ºC. Logo após, uma porção de cada cultivo foi centrifugada três vezes (12000xg por 15 minutos), sempre descartando o sobrenadante e colocando PBS com ph 7,4. Cerca de 100µl dos isolados foram misturados, em lamínulas de vidro, com 100µl de sangue lavado três vezes com PBS, com e sem adição de manose. As amostras que 32 produziram hemaglutinação, somente, na ausência de manose foram consideradas positivas para fímbria tipo 1 (EVANS et al, 1981) 4.3.2 EXTRAÇÃO DO DNA DOS ISOLADOS Para extração do DNA, uma colônia pura foi suspendida em eppendorfs com 0,5 ml de água destilada esterilizada, que posteriormente foram colocados no banho-maria a 100˚C durante 8 minutos, após o qual se agitou vigorosamente no vortex. Seguida de centrifugação a 12.000rpm durante 2 minutos. O sobrenadante foi utilizado na reação em cadeia da polimerase (PCR). (BLANCO et al,1997) 4.3.3 DETECÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE pap, sfa, afa POR PCR multiplex. A reação em cadeia da polimerase multiplex foi realizada utilizando primers específicos para os genes: papC (fímbria P), sfa (fimbria tipo S), afa (adesina afimbrial). A seqüência dos primers e peso molecular dos produtos estão especificados na Tabela 1. Os primers foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA) e todas as reações foram realizadas com um volume total de 25 µl, onde se utilizou 5µl de DNA de cada microorganismo, 2µM de primers, 0,2µL de Taq DNA polimerase, 5µL do tampão da taq, 2mM de MgCl2, 0,2 mM de DNTPs e água pura. As condições para amplificação foram as seguintes: desnaturação inicial a 94˚C por 2 minutos para 1 ciclo, seguidos de 30 ciclos de desnaturação a 65°C por 1 minuto e extensão a 72˚C por 1minutos, seguido de uma extensão final a 72˚C por 10 minutos. As amplificações foram realizadas no termociclador MyCicler (Bio Rad) e o produto amplificado de cada reação foi submetido à eletroforese em gel de agarose 2% durante o período de 1 hora (100 volts), sendo posteriormente corado com brometo de etídio e visualizados em luz ultravioleta com auxílio de Transluminador (BLANCO et al., 1997). postivo. Amostras da E. coli ATTC 25922 foram utilizadas como controle 33 Tabela 1: Sequência de base, tamanhos previstos dos produtos amplificados dos primers utilizados na PCR. Sequencia de oligonucleotídeos (5’-3’) Tamanho REFERÊNCIA papC F:GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG R:ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA 328 pb Daigle et al., 1994 sfa F:CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC R:CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA 410 pb Daigle et al., 1994 afa F:GCTGGGCAGCAAACTGATAACTCTC R:CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG 750 pb Daigle et al., 1994 hlyA F:AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT R:ACCATATAAGCGGTCATTCCCGTCA 1.177 pb Yamamoto et al., 1995 papC: operon da pili associada a pielonefrites , sfa: operon da adesina fimbrial S, afa :operon da adesina afimbrial, hly: α-hemolisina G: guanina, A: adenina, C: citocina, T: timina. 4.3.4 DETERMINAÇÃO DA HIDROFOBICIDADE CELULAR Após crescimento em BHI ágar por 24h a 37°C, as culturas foram suspensas em concentrações crescentes de sulfato de amônio, de 0,5M, 1,0M, 1,5M, 2,0M, 2,5M e 3,0M. A formação de grumos em até dois minutos após a suspensão indicou resultado positivo (SCHMIDT et al,1998). 4.3.5 DETECÇÃO DE BIOFILME Dois métodos foram utilizados para a detecção do biofilme: 1) Teste presuntivo de formação de capsula Ágar Vermelho Congo: O meio de cultura constituído de BHI, sacarose, ágar e corante vermelho Congo, foi preparado como solução aquosa concentrada. Os isolados foram semeados sobre o meio por esgotamento com alça bacteriológica e incubados em aerobiose a 35-37°C por 24 horas e após, deixados em temperatura ambiente por mais de 18 horas. As amostras que apresentaram colônias negras foram produtoras de biofilme (FREEMAN; FALKINER; KEANE, 1989). 34 2) Espectrofotometria: Foram inoculados 100µL de suspensão bacteriana com 100µL de BHI em microplacas com 98 poços com fundo em U e incubadas à 37°C por 24 horas em estufa. Após tempo de incubação, as placas foram lavadas por três vezes como tampão PBS e deixadas em temperatura ambiente. Foi adicionado às microplacas 200μL de Cristal Violeta e incubado por 15 minutos a temperatura ambiente. Cada poço foi lavado com água destilada por três vezes, e deixado secar em temperatura ambiente. As placas coradas com cristal violeta foram submetidas à espectrofotometria com filtro de 492nm para aferir as respectivas absorbâncias (Ab) de cada poço. Baseando-se nas densidades ópticas (D.o.i) produzidas pelos isolados e tomando-se por base o controle negativo (D.o.c) os isolados foram classificados nas seguintes categorias (STEPANOVIC et al.,2004): Não produtor: D.o.i < D.o.c Produtor fraco: D.o.c < D.o.i Produtor moderado: (2x D.o.c) < D.o.i ≤ (4 X D.o.c) Produtor forte: (4 X D.o.c) < D.o.i 4.3.6 ADESÃO EM CÉLULAS A adesão foi realizada em 40 amostras de E.coli uropatogênica em células renais Vero (Macaco Verde Africano) e HEp2 (Carcinoma de Laringe Humana) que foram descongeladas em banho de água a 37ºC e transferidas para uma garrafa de cultura de células contendo Meio Mínimo Essencial de Eagle Modificado (MEM/Cultilab), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB/Cultilab) e 1% de solução de antibióticos contendo penicilina e estreptomicina. Os frascos de cultura foram incubados em atmosfera de 5% de CO2 a 37ºC por 48 horas até a formação da monocamada celular. Após este período o meio foi descartado sendo adicionado à cultura celular uma solução de AVT (Associação Tripsina 30 Versene/Cultilab) para descolamento da monocamada. As células foram ressuspendidas no meio MEM acrescido de 10% de soro fetal bovino. A suspensão de células foi distribuída em microplacas de 24 cavidades, em volume de 100 μL por cavidade. As microplacas foram incubadas a 37ºC, em atmosfera de 5% de CO 2 por 24 horas. 35 Para interpretação dos resultados foram considerados os seguintes padrões de adesão: adesão localizada (AL), adesão pouco localizada (ALA), adesão difusa (AD) e adesão agregativa (AA), segundo descrito por Scaletsky et al 2002. 4.3.7 DETECÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA Amostras de E.coli foram cultivadas em 5mL de BHI a 37°C. Após 24 horas de incubação as culturas foram centrifugadas (6000 x g /15 min). O sobrenadante obtido foi filtrado com membrana de 0.22µm e acrescentando-se 100µL em de microplaca de 98 poços contendo células Vero crescidas em meio Minimal Essential Medium (MEM). As culturas foram incubadas a 37°C em 5% CO 2 atmosférico. Após esse período lavou-se a microplaca três vezes com PBS e depois se acrescentou 200µL por poço da solução de extração deixando agitar por 10 minutos. A microplaca foi lida em Elisa com filtro de 540nm. 4.3.8 PRODUÇÃO DE HEMOLISINA EM MEIO SÓLIDO A capacidade hemolítica foi testada semeando-se as amostras com auxílio de uma alça de semeadura em placas de Petri com ágar Müeller-Hinton contendo 5% de sangue humano do tipo A, B e O, sangue de carneiro e de cavalo, onde após incubação a 37°C por 24 horas a produção de hemolisina foi verificada pela presença de um halo de hemólise ao redor das colônias (WATANABE et al, 1988). 4.3.9 PRODUÇÃO DE HEMOLISINA NA PRESENÇA DE AGENTES QUELANTES E SOLUÇÕES DE ÍONS. Para verificar a influência de agentes quelantes e solução de íons na expressão da atividade hemolítica, as amostras foram cultivadas em BHI e depois semeadas em Müeller-Hinton contendo separadamente os quelantes EDTA (etilenoadiamina-tetra ácido acético) e EDDA (etileno-di-(o-hidrofenol) ácido acético) ; solução de íons CaCl2 (Cloreto de cálcio ) e FeCl3 (Cloreto férrico ) por 48h a 37°C em estufa . 36 4.3.10 DETECÇÃO DE SEQUÊNCIA DE hlyA POR PCR. A reação em cadeia da polimerase foi realizada utilizando primer específico para os genes hlyA (alfa-hemolisina). A seqüência do primer e peso molecular estão especificados na Tabela 1. O primer foi adquirido da Invitrogen (Carlsbad, CA) e todas as reações foram realizadas com um volume total de 25 µl, onde se utilizou 5µl de DNA de cada micro-organismo, 2µM de primer, 0,2µL de Taq DNA polimerase, 5µL do tampão da taq, 2mM de MgCl2, 0,2 mM de DNTPs e água pura. As condições para amplificação serão as seguintes: desnaturação inicial a 94˚C por 2 minutos para 1 ciclo, seguidos de 30 ciclos de desnaturação a 65°C por 1 minuto e extensão a 72˚C por 1minuto, seguido de uma extensão final a 72˚C por 10 minutos (BLANCO et al., 1997). 4.3.11 TESTE DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA PROTEASES O método de análise para a atividade proteolítica foi através do crescimento bacteriano em Müeller-Hinton acrescido de 10% de skim milk, incubando-se a cultura a 37°C por 48 horas. A produção de proteases foi verificada pela presença do halo. FOSFOLIPASE O método para análise da produção de fosfolipase foi através do crescimento bacteriano em Müeller-Hinton acrescido de 3% de egg yolk, incubando-se a cultura a 37°C por 48 horas. A produção de fosfolipase foi verificada pela presença do halo de precipitação. GELATINASE Inicialmente as cepas de E.coli foram inoculadas em BHI e após a incubação a 37°C por 24 horas, os inóculos foram semeados em profundidade em tubos contendo 5mL de uma solução de gelatina a 12%, preparada em tampão fosfato pH 7,4. Após incubação a 37°C por 24 horas , observa-se se ocorre a liquefação da gelatina (WILSON, 1930). 37 4.4 TESTE DE SENSISIBILIDADE O método de difusão de discos foi utilizado para determinar a suscetibilidade antimicrobiana. Os antibióticos testados incluem: ceftiaxona, cefuroxima sódica, amoxicilina ácido clavulânico, gentamicina, nitrofurantoína, ampicilina subactam, norfloxacina, cefotaxima, cefepima, ciprofloxacina, ácido nalidíxico, amoxicilina, que foram utilizados conforme recomendado pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011), os halos de inibição de cada antibiótico estão dispostos na Tabela 2. Cepa de E.coli padrão ATCC 25922 foi utilizada para o controle de qualidade do ensaio. Tabela 2: Antibióticos usados e o respectivo valor dos halos de inibição (CLSI, 2011). Antibiótico** CRO CXM AML CN F SAM NOR CTX FEP CIP AMC NA ** Halo de Inibição(mm) Sensível Intermediário Resistente ≤ 13 ≤ 14 ≤ 13 ≤ 12 ≤ 14 ≤ 13 ≤ 12 ≤ 14 ≤ 14 ≤ 15 ≤ 14 ≤ 13 14-20 15-17 14-17 13-14 15-16 14-16 13-16 15-22 15-17 16-20 15-16 14-18 ≥ 21 ≥ 18 ≥ 18 ≥ 15 ≥ 17 ≥ 17 ≥ 17 ≥ 23 ≥ 18 ≥ 21 ≥ 17 ≥ 19 antibióticos utilizados: CRO= ceftriaxona, CMX= cefuroxima, AML= amoxicilina, CN= gentamicina, F= nitrofurantoína, SAM= ampicilina + sulbactam, NOR= norfloxacina, CTX= cefotaxima, FEP = cefepime, CIP= ciprofloxacina, AMC= amoxicilina + acido clavulânico, NA= acido nalidíxico. 38 4.5 DETECÇÃO FENOTÍPICA DAS CEPAS PRODUTORAS DE ESBLS POR DISCO APROXIMAÇÃO. A detecção fenotípica foi realizada pelo método de aproximação de disco (CLSI, 2011). Para cada cepa foi preparada uma suspensão bacteriana com soro fisiológico e turbidez correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Em seguida, a suspensão foi homogeneizada e semeada em uma placa de ágar Müeller-Hinton (Merck). Discos de aztreonam (30 µg), cefotaxima (30 µg), ceftazidima (30 µg) e cefepime (30 µg) foram colocados a uma distância de 20 mm do disco de amoxicilina/ácido clavulânico (HARADA; ISHII; YAMAGUCHI,2008; SHAH et al, 2004). As amostras foram consideradas produtoras de ESBLs mediante uma das duas situações: 1- quando houve uma ampliação do halo de inibição para as cefalosporinas ou aztreonam; 2 – quando houve o aparecimento de uma terceira zona irregular de inibição (“ghost-zone”) entre o disco composto e o disco de uma das drogas betalactâmicas. 4.6 DETECÇÃO MOLECULAR DAS CEPAS PRODUTORAS DE ESBLS PELA TÉCNICA DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR). A PCR foi realizada utilizando-se primers específicos para os genes de ESBL, TEM- para amplificação do produto gerado na sequência de 445 pares de bases, CTX-M com tamanho de 593 pares de bases e SHV com o tamanho de 747 pares de base (Tabela 3) . Os primers foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA) e todas as reações foram realizadas com 1,0 µl de DNA de cada micro-organismo, 10 pmol de primers específicos, Taq DNA polimerase, tampão MgCl2, DNTPs e água miliQ em um volume total de 25 µl. As condições para amplificação foram as seguintes: desnaturação inicial a 95˚C por 15 minutos, 30 ciclos de desnaturação a 94˚C por 30 segundos, anelamento a 60˚ por 30 segundos, extensão a 72˚C por 2 minutos, seguido de uma extensão final a 72˚C por 10 minutos (MONSTEIN et al, 2007). 39 Tabela 3. Sequência de base, tamanhos previstos dos produtos amplificados e a localização dos oligonucleotídeos dos primers utilizados na PCR. GENE ALVO Pb REFERÊNCIA blaSHV F:CACTCAAGGATGTATTGTG R:TTAGCGTTGCCAGTGCTCG 747 Pitout et al., 1998 blaTEM F:ACGCTCAGTGGAACGAAAAC R:TTCTTGAAGACGAAAGGGC F:GTGACAAAGAGAGTGCAACGG R:ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC 445 Monstein et al., 2007 593 Simarro et al., 2000 blaCTX-M 4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS Para a comparação entre os testes da atividade hemolítica e para avaliar correlação entre presença de fímbrias e hidrofobicidade com a produção de biofilme foi utilizado o teste Coeficiente de Contingência C. A análise estatística foi realizada no Bioestat versão 5.0. Todos os resultados foram considerados como estatisticamente significantes com P < 0.05. 40 5 RESULTADOS Quanto à produção da fímbria curli, obteve-se um total de 129 (80,62%) de amostras produtoras de curli estas amostras apresentaram colônias de coloração vermelha ou rosa (Figura 1), e 31 (19,38%) das amostras não produzem curli, como explica a Tabela 4. Figura 1: Identificação de fímbria curli, amostras em meio Luria Bertani (LB). Tabela 4: Resultado do teste LB para fímbria curli das amostras de E.coli uropatogênicas Classificação para Fímbria Curli Nº de amostras % Produtoras 129 80,62% Não-produtoras 31 19,38% Na detecção da fímbria tipo1, 31,25% das amostras foram positivas (houve formação de uma malha), pois hemaglutinaram na ausência de manose, sendo manose sensível (HMS), e 68,75% das amostras apresentaram hemaglutinação manose resistente (HMR), ou seja, são negativas para fímbria tipo1. 41 Outras adesinas foram analisadas (pap,sfa, afa ) através de técnicas moleculares onde 43,75% (70) possuíram as sequencias relatadas para os fatores de virulência estudados. Foi encontrado que 25 (15,62%) apresentaram positivas para fimbrias tipo P exibindo o genótipo pap, 16 (10%) foram positivas para fímbria do tipo S exibindo o genótipo sfa, 27(16,88%) apresentaram simultaneamente pap e sfa, e apenas 2 (1,25%) apresentaram adesinas afimbriais com o genótipo afa (Figura 2) Figura 2. Padrão de amplificação para a PCR multiplex para os genes papC,sfa. Eletroforese em gel de agarose a 2%. As setas correspondem ao tamanho das bandas dos genes analisados. Linha M: marcador DNA Ladder de 100pb. Linhas1, 3, 5, 7, 10, 12, 13,14: Produtos de amplificação dos genes papC (328pb) e sfa (410 pb). Linhas: 2, 4, 6, 8,9,11 e 15: Foram negativas. Quanto à hidrofobicidade constatou-se que 145 amostras, equivalente a 90,62% foram positivas para o teste de hidrofobicidade e 59,37% foram aglutinantes em concentrações de sulfato de amônio iguais ou superiores a 2M. Os resultados do ensaio qualitativo de biofilme das 160 amostras estudadas demonstraram que 86 (53,75%) formaram biofilme e 74 (46,25%) foram negativas (Figura 3). 42 Figura 3: Teste CRA, as colônias negras ou enegrecidas são produtoras de biofilme e a colônia vermelha é não produtora. Em relação ao teste quantitativo em microplaca obteve-se resultado de 142 das amostras como produtoras de biofilme, sendo que destas, 16 (10%) foram classificadas como fortes, 26 (16,25%) como moderadas, 100 (62,50%) como fraca produtora de biofilme, sendo que 18 (11,25%) não produziram biofilme (Tabela 5). O teste em microplaca diferencia muito bem as cepas efetivas, apresentando-se mais sensível do que o teste fenotípico com Vermelho Congo (HANDKE et al., 2004) , por isso maior porcentagem de produtores de biofilme do que em CRA, apesar de que 11 amostras demonstraram resultado positivo no teste fenotípico com Vermelho Congo e não formaram biofilme com a detecção em microplaca. A análise do biofilme em Vermelho Congo é presuntiva detectando a formação da cápsula, sendo que estas 11 amostras positivas no CRA estejam produzindo a cápsula em uma fase que não pode ser quantificada o biofilme, devido às fases de variação na produção do biofilme (Melo et al, 2008) 43 Tabela 5: Aderência bacteriana em teste espectrofotométrico. D.O.I. (densidade óptica do inóculo). D.O.I Nº % FORTES (≥ 4%) 16 10% MODERADAS (Entre 2 e 4%) 26 16,25% FRACAS (≥ 2%) 100 62,50% NÃO PRODUTORAS (≤ 1) 18 11,25% 160 100% PRODUTORAS DE BIOFILME Σ TOTAL A expressão das fímbrias e hidrofobicidade têm sido reportadas como importantes estruturas para formação do biofilme e identificadas como fatores de virulência com um papel importante na adesão. Realizou-se uma análise dos resultados através do teste de correlação, em que foram comparados os dados do biofilme com produção de fímbrias e hidrofobicidade, porém não foi significativa com a presença destes fatores na formação do biofilme em nossos testes, sugerindo que estejam presentes outros tipos de adesinas (Tabela 6) Tabela 6: Distribuição dos testes de fatores de virulência para adesão em comparação a formação do biofilme. Biofilme (microplaca) Não produtora Fraca Moderada Forte Fímbrias Negativas Fímbria tipo 1 Curli Tipo 1 + Curli 4 1 13 2 12 2 6 0 66 6 9 2 Hidrofobicidade 9 0 Coeficiente de Contigência C Valor de p 0.27 0.31 0.18 0.59 0.29 0.4 0 0 0 1 Não hidrofóbico 1 0 até 1,5M de sulfato de amônio 7 25 5 0 acima de 1.5 de sulfato de amônio 13 59 5 2 Combinação de hidrofobicidade e fímbrias Hidrofobicidade + Fímbria tipo 1 1 5 0 0 Hidrofobicidade + Fímbria curli 12 60 7 0 Hidrofobicidade + Fímbria tipo 1 e curli 2 7 2 1 44 Selecionou-se 40 amostras que apresentaram resultado positivo para todos o tipos de fímbrias, assim como para os testes de biofilme para realizar o teste de adesão em células HEp-2 e Vero. Nenhum padrão de adesão foi encontrado em células HEp-2. Em células Vero 15 amostras foram positivas aderindo às células, demonstrando um padrão agregativo (Figura 4). Figura 4. Padrão de adesão agregativa (AA) sobre células da linhagem Vero. Quanto à atividade hemolítica, no sangue humano dos tipos A, B e O, sangue de carneiro e de cavalo, onde 62 (38,75%) das amostras apresentaram halo de hemólise ao redor das colônias em meio sólido com sangue humano tipo A, 45 (28,12%) com sangue humano tipo B, 60 (37,72%) com sangue humano tipo O 62 (38,75%) com sangue de carneiro e 48 (30,38%) no sangue de cavalo. Sendo observou-se maior atividade no sangue A, O e carneiro (Figura 5). 45 Nº de isolados com atividade hemolítica 60 50 40 30 20 10 0 A¹ B² O¹, ³ Humano Carneiro¹, ³ Cavalo², ³ Não Humano Tipo sanguíneo Figura 5: Gráfico da atividade hemolítica de isolados de E coli por tipo de sangue. Q=14.74, p=0.005. ¹²³ Números diferentes significam p<0.05 Quanto à atividade hemolítica relacionadas aos EDTA, EDDA e CaCl2 presentes no meio de cultivo em hemácias de carneiro não houve atividade hemolítica com o quelante EDTA, o que está de acordo com alguns estudos que avaliam presença do quelante com a diminuição da atividade hemolítica, uma vez que o EDTA é o quelante do cálcio, que é importante para lise das células o que compele o aumento da atividade hemolítica da bactéria, porém ao se observar a atividade hemolítica com o cálcio em nosso trabalho houve uma menor atividade do que a do sangue humano puro (Figura 6). Renie et al (1974) avaliaram a necessidade do cálcio como passo inicial para atividade hemolítica com a ativação hlyA por este elemento. Estes dados foram baseados em observações com préincubações de hlyA com cálcio na fase lag, enquanto que a hemólise pode ser inibida pelo EDTA, porém ao fazer a análise molecular da alfa hemolisina através de PCR apenas 1 amostra (0,63%) apresentou o gene hlyA, este resultado negativo de genes hlyA pode está associado a menor taxa de atividade hemolítica das amostras na presença do cálcio (JORGENSEN et al., 1983) Observou-se uma maior atividade hemolítica das amostras na presença do EDDA (estatisticamente igual ao teste controle com o sangue de carneiro), que tende a aumentar a atividade hemolítica, pois captura ferro do meio, enquanto que não houve nenhuma atividade em comparação ao ferro. 46 Nº de isolados com atividade hemolítica 60 50 40 30 20 10 0 Carneiro¹ Carneiro+EDDA¹ Carneiro+EDTA² Carneiro+Cloreto de cálcio³ Figura 6. Gráfico da atividade hemolítica de isolados de E. coli em sangue e com quelantes e cloreto de cálcio. Q=13.27, p=0.004. ¹²³ - Números diferentes significam p<0.05 Isolados que secretam hemolisinas não somente podem lisar eritrócitos como também outros tipos de células, tornando o micro-organismo mais citotóxico. Neste trabalho analisou-se a atividade citotóxica de UPEC em células Vero, porém apenas 15 (9,37%) do total das amostras apresentaram-se positivas para esta atividade, onde 86,6% das amostras que apresentaram atividade citotóxica em células Vero apresentaram atividade hemolítica em 1 ou mais tipos de sangue analisados. Algumas bactérias apresentam enzimas que são capazes de degradar componentes celulares, destruindo os tecidos e espalhando-se pelos tecidos adjacentes, sendo responsáveis principalmente pela invasão no hospedeiro, desta maneira analisou-se as amostras de E. coli uropatogênicas quanto a presença de enzimas onde 75 (46,83%) das amostras apresentaram atividade proteolítica, 67 (41,87%) produziram fosfolipases e 3 (1,87%) gelatinases (Tabela 7) . Tabela 7: Atividade enzimática das amostras de E.coli uropatogênicas. Enzimas % Σ TOTAL 46,83% Amostras Negativas 85 53,12% 160 67 41,87% 93 58,13% 160 3 1,87% 157 98, 13% 160 Protease Amostras positivas 75 Fosfolipase Gelatinase % 47 O perfil de resistência das amostras de E. coli revelou, que na comunidade estudada, esses micro-organismos apresentaram taxas elevadas de resistência a amoxicilina com 91,25% e mostraram-se mais sensíveis aos aminoglicosídeos (gentamicina com 96,25% e 88, 75% para nitrofurantoína) e às cefalosporinas (ceftriaxona com 86,88% e 86,25% a cefotaxima) sendo que estes antibióticos mostraram-se o mais eficazes contra a E.coli uropatogênicas durante a análise (Tabela 8) Tabela 08Perfil de resistência das cepas de E. coli isoladas de infecção urinária. Antibiótico** Sensível Intermediário Resistente CRO 139 (86,87%) 12 (7,50%) 9 (5,63%) CXM 89 (55,62%) 13 (8,13%) 58 (36,25%) AML 12 (7,50%) 2 (1,25%) 146 (91,25%) CN 154 (96,25%) 1 (0,63%) 16(10%) F 142 (88,75%) 2 (1,25%) 2 (2,38%) SAM 110 (68,75%) 19 (11,88%) 31 (19,38%) NOR 124 (77,50%) 0 (0%) 36 (22,50%) CTX 138 (86,25%) 5 (0%) 17 (10,63%) FEP 124 (77,50%) 13 (8,13%) 23 (14,38%) CIP 124 (77,50%) 1 (0,63%) 35 (21,88%) AMC 75(46,88%) 13 (8,13%) 72 (45%) NA 106 (66,25%) 1 (0,63%) 53 (33,13%) ** antibióticos utilizados: CRO= ceftriaxona, CMX= cefuroxima, AML= amoxicilina, CN= gentamicina, F= nitrofurantoína, SAM= ampicilina + sulbactam, NOR= norfloxacina, CTX= cefotaxima, FEP = cefepime, CIP= ciprofloxacina, AMC=amoxicilina+ acido clavulânico NA= acido nalidixico. O padrão de multi-resistência observado em nossos resultados foi à quinolonas (norfloxacina, ciprofloxacina e ácido nalidíxico) e amoxicilina, onde são relatadas em muitos hospitais taxas de resistência elevada à quinolonas, betalactâmicos e aminoglicosídeos, em geral, por produção de beta-lactamases (ANVISA, 2007). 48 As cefalosporinas de terceira geração são reconhecidas por sua boa atividade contra microorganismos gram-negativos, porém a produção de enzimas extendedspectrum beta-lactamase (ESBL) entre cepas de UPECs as torna capazes de resistir à ação destes medicamentos, constituindo um considerável problema para o tratamento, entre as 160 amostras analisadas quanto à produção da enzima ESBL, 26 (16,25%) amostras foram positivas para esta enzima através do teste fenotípico aplicado (Figura 7). Apesar de ser uma porcentagem relativamente baixa o aparecimento de bactérias produtoras de ESBL é de suma importância, já que o aumento de sua prevalência reduz as opções de tratamento disponíveis (PATERSON, 2006). Sendo assim, sua correta identificação é necessária não somente para gerenciar a conduta terapêutica, mas também para aplicação imediata de medidas de controle que visem impedir sua propagação (WIEGAND et al., 2007). Figura 7: Estirpe com fenótipo positivo para produção de β-lactamases de amplo espectro. AH- Ampliação do halo; AMC- amoxicilina+ácido clavulânico; CRO-ceftriaxona; CTX- cefotaxima; FEP- Cefepime; ATM- aztreonam. 49 Estudou-se a presença dos genes blaSHV, blaTEM e blaCTX nas 160 amostras de UPECs pela técnica de PCR, onde encontrou-se 104 (65%) do isolados produtores de β-lactamases predominantes foram de amplo espectro. Dentre estes, os bla TEM, sendo encontrado em 48,87% dos isolados e mais bla CTX com 13,75%. Apenas quatro cepas apresentaram estes genes simultaneamente. O gene bla SHV foi detectado em três isolados simultaneamente com o gene bla TEM. Seis isolados não amplificaram para nenhum dos genes em estudo, apesar de terem expressado a enzima no teste do disco aproximação. O tamanho dos genes encontra-se representado na figura 8. Figura 8: Detecção dos genes blaCTX, blaTEM e blaSHV por PCR multiplex. Visualização em gel de agarose a 2,5 %. Canaletas M = marcador de peso molecular (ladder de 50 pb); 1 = K. pneumoniae ATCC 700603 (controle positivo); 2 = cepa n˚2; 3 = cepa n˚8; 4 = cepa n˚19; 5 = cepa n˚ 22; 6 = cepa n˚33; 7 = cepa n˚36. 50 6 DISCUSSÃO E. coli tem se destacado como um importante agente de infecção urinária. A patogenicidade das linhagens uropatogênicas está possivelmente associada a diversos fatores de virulência, por exemplo, produção de biofilme, expressão de fímbrias, produção de hemolisinas, resistência antimicrobiana. A aderência microbiana é o primeiro passo para a patogênese (SHERMAN,1988) e um único patógeno pode fazer uso de várias adesinas conferindo vantagem de adaptação do patógeno a diferentes tecidos do hospedeiro no início da infecção (ANTÃO et al, 2009). A fímbria curli está envolvida na formação do biofilme e suas interações promovem a ligação da bactéria a células tanto de animais quanto de vegetais,assim como em superfícies inertes , permitindo a sobrevivência da bactéria em qualquer ambiente, sendo assim expressa por muitos isolados patogênicos de E. coli, pois garante uma vantagem in vivo para o micro-organismo (GOPHNA et al., 2001). A fimbria tipo 1 é essencial para a formação de biofilme e na adesão bacteriana ao epitélio da bexiga e então estabelecimento da infecção, como no caso da cistite (KAU;HUSTAND; HULTGRAN, 2005), favorecendo a internalização bacteriana ao epitélio da bexiga, um fato que então pode levar a fase crônica da cistite. Neste trabalho 68,75% das amostras foram manose resistentes, ou seja, negativas para fímbrias tipo 1, significando que este resultado está ligado a outros tipos de fímbrias como a tipo P e do tipo S. A fímbria tipo P representa um fator de virulência característico de cepas causadoras de pielonefrite e são frequentemente associadas a alguns sorogrupos de E.coli (JOHNSON, 1991; BLANCO et al. 1997). A fimbria tipo S pode ser detectada em isolados de E.coli de diferentes origens, porém podem ser mais associadas a cepas relacionadas à meningite e a sepse (KORHONEN et al. 1988 ). A fímbria tipo P, tipo 1, tipo S tem sido como os fatores de virulência mais específicos de E.coli uropatogênicas (MIYAZAKI et al., 2002), neste sentido analisou-se as amostras quanto a produção de uma ou mais fimbrias e constatou-se que 151 (94,37%) das amostras possuem uma ou mais das adesinas citadas acima demonstrando a capacidade patogênica das amostras circulantes na comunidade 51 uma vez que estas bactérias possuem fatores para promoção de ITU mais complicada como cistites e pielonefrites. Em relação aos genes pap, sfa e afa os dados encontrados no presente estudo corroboram com outros trabalhos sobre UPECs onde fimbrias do tipo P (pap)são as mais prevalentes em E. coli uropatogênicas em 77% dos casos (HULL,1998) seguido de fimbria S (sfa) , sendo que Blanco (1997) detectou com maior freqüência pap e sfa em cepas de E.coli oriundas de pacientes com pielonefrite aguda, indicando que os genes associados na produção das adesinas P e S podem ter o papel mais importante no desenvolvimento e severidade de ITU. O gene afa tem sido reportado com baixa freqüência entre E.coli uropatogênicas (BLANCO et al. 1997; SANTO et al. 2006; TAKAHASHI, 2007; ABE et al., 2008). A capacidade da E.coli uropatogênica de produzir biofilme auxilia sua sobrevivência dentro do hospedeiro, sendo um fator responsável por infecções crônicas ou persistentes. A formação do biofilme é a chave da cascata patogênica e está envolvida em casos de ITU mais complicada, de fibrose cística e outras doenças crônicas infecciosas (PARSEK; SINGH, 2003; DONLAN; COSTERTON, 2002; BRANDA et al, 2005). Aproximadamente, 50% das infecções microbianas são associadas com formações de biofilme, o que aumenta significantemente a resistência a antibióticos e aos mecanismos de defesa do sistema imune. Estudos demonstram a importância da formação de biofilme bacteriano em ITUs, principalmente em cistite crônica (HANCOCK; FERRIÉRES; KLEMM , 2007), uma vez que, a presença do biofilme atua na diminuição da susceptibilidade das bactérias aos agentes antimicrobianos quando comparados à cultura com bactérias planctônicas .Estudos sugerem que a resistência do biofilme é explicada pela impenetrabilidade dos agentes antimicrobianos devido à presença de um polímero hidrofílico que reveste o biofilme e a estratégias de liberação dos agentes antimicrobianos (SMITH, 2005). A aderência em mucosas tem sido considerada um importante fator para a manutenção da bactéria e inicio da infecção aumentando a patogenicidade do organismo invasor. A aderência bacteriana pode ser mediada por componentes superficiais como fímbrias (SVANBORG et al., 1983) proteínas presentes na membrana. A adesão de nossas amostras ocorreu em células renais, no caso Vero, assim como 52 uma porcentagem considerável de fimbrias manose resistentes como P e S demonstram um potencial destas amostras em causarem formas de infecção urinária mais grave, como a pielonefrite. Quanto à produção de hemolisina, vários estudos concluíram que isolados que apresentavam a capacidade de produção desta toxina são mais virulentas do que os isolados não-hemolíticos (COOKSON et al., 2007; HUNT et al., 2008). Alguns isolados de E.coli são capazes de produzir simultaneamente vários tipos de hemolisinas (FIGUEIREDO et al.,2003; HUNT et al., 2008). A α-hemolisina está presente em diversas linhagens causadoras de infecções extra-intestinais sendo citotóxica a diversas células humanas. Apesar de outros tipos de hemolisinas terem sido descritas, como a beta-hemolisina, a prevalência e seu significado clínico é pouco conhecido (JOHNSON 1991; 2001). A alfa-hemolisina é uma exotoxina capaz de induzir o influxo de cálcio e a eventual lise de uma variedade de tipos celulares em diferentes hospedeiros (WELCH; BAUER, 1995), por este motivo pressupõe-se que com o aumento da atividade hemolítica na presença do quelante de cálcio nos resultados obtidos neste estudo as UPECs avaliadas seriam produtoras de alfa-hemolisina, apesar de apresentar uma porcentagem baixa do gene para alfa-hemolisina (hlyA) que pode está relacionada à ampla variação deste gene entre as cepas de E.coli e esta prevalência varia de acordo com o grupo filogenético, condição clínica do paciente e localização geográfica (BLANCO et al., 1997; JOHNSON, STELL, 2000; TAKAHASHI et al., 2007, 2009; ABE et al., 2008). Alguns estudos de mecanismos de lise mostraram dependência do cálcio para iniciar suas atividades (LUDWIG et al. , 1988; RENIE et al., 1974; SHORT, KURTZ, 1971). Ludwig et al (1988) reportaram que o cálcio é necessário para a ligação da hlyA aos eritrócitos, apesar de não haver evidências diretas da ligação da toxina às células presentes. Contudo, alguns estudos do mecanismo de ação indicaram que o cálcio não é importante para a atividade hemolítica (BHAKADI et al., 1986; SMITH, 1963;VAN DEN BOSCH et al., 1980) ,sendo que estes dados foram baseados em observações que a hemólise não foi inibida pelo EDTA (JORGENSEN et al., 1983). E.coli uropatogênica elabora um grande número de enzimas incluindo proteolíticas (proteases, elastases) e fosfolipases. Algumas bactérias são capazes 53 de produzir gelatinases, porém estas enzimas não são observadas com frequência em UPEC (TAGHRID; COLOE; COLOE ,2006). Quanto à fosfolipase, ela tem sido mostrada também como importante fator de virulência, uma vez que essas enzimas lipolíticas que tem capacidade hidrolisar ligações de ésteres de fosfolipídios presentes na membrana plasmática, sendo assim importante na invasão do hospedeiro (WAITE, 1996). As amostras apresentaram 41,87% de positividade para esta enzima, um valor considerável ressaltando-se a origem comunitária destas amostras. O conhecimento do padrão de resistência aos antibióticos é de fundamental importância para a escolha no tratamento das ITU. O perfil de resistência das amostras de E.coli revelou, que na comunidade estudada apresentaram taxa elevada de resistência a amoxicilina com 91,25%, este antimicrobiano não é recomendado para tratamento de infecção urinária por causa da sua alta resistência e recorrência, sendo essa resistência justificada pelo mecanismo de produção da enzima beta-lactamase. Na atualidade, para um eficaz tratamento com o uso de amoxicilina, ela deve ser associada ao ácido clavulâmico em caso de ITUs (JANCEL;DUDAS, 2002). Com o aumento da resistência aos beta-lactâmicos a alternativa terapêutica recomendada seria as fluoroquinolonas, como norfloxacina e ciprofloxacina. No entanto, ressalta-se que esses antimicrobianos são mais indicados para ITU complicada e, se a utilização não for criteriosa, esses agentes podem exercer forte pressão para a seleção de cepas resistentes (WARREN, 1999). Em nosso estudo encontramos prevalência de resistência de 22,5% para norfloxacina e 21,88% para ciprofloxacina, o que torna as UPEC analisadas propensas a aquisição de uma maior resistência se esses antibióticos forem utilizados empiricamente. Nitrofurantoína seria outra opção terapêutica, tendo como desvantagem um maior período de tratamento. Diante de grandes incidências de falha terapêutica e visto que o tratamento inicia é empírico, é de fundamental importância à realização de estudos que analisem o perfil de resistência desses uropatógenos aos antimicrobianos. Estudos bem desenvolvidos são de importância para o auxílio na escolha de terapias mais 54 eficazes e seguras na utilização da prática médica, visando uma redução de novas resistências, tendo em vista que, os padrões de resistência aos antimicrobianos estão evoluindo e sofrendo modificações ao longo do tempo. Obteve-se uma porcentagem fenotipicamente baixa de ESBL enquanto que detecção de genes para essas enzimas apresentou-se alta entre os isolados, indicando que apesar de apresentar os genes eles ainda não estão sendo expressas, essas diferenças podem depender dos plasmídeos no qual o gene se encontra ou da região promotora que controla a síntese da beta-lactamase. Como a degradação do anel beta–lactâmico geralmente ocorre de forma lenta, a resistência a esses agentes geralmente não é detectada quando são realizados testes in vitro (BRADFORD, 2001; REIS, 1999) , As ESBL do tipo TEM são frequentemente encontradas em bactérias gramnegativas, principalmente em E. coli e K. pneumoniae (LIVERMORE,1995) corroborando assim com os dados obtidos neste trabalho. Embora o gene bla CTX-M tenha sido identificado com menor freqüência, as beta-lactamases codificadas por ele estão em rápida expansão (TZOUVELEKIS, 2000). ). Alguns isolados apresentaram os genes bla TEM e bla CTX-M simultaneamente. Resultados similares foram descritos com isolados de E.coli e outras enterobactérias (MONSTEIN et al, 2007). Segundo Jacoby (1997) a resistência ESBL tipo SHV pode ser encontrada mais freqüentemente em isolados nosocomiais do que os de origem comunitária, essa pode ser a explicação do resultado do baixo percentual de blaSHV encontrado nas amostras deste presente trabalho, uma vez que elas são comunitárias. Seis isolados não amplificaram para nenhum dos genes em estudo, apesar de terem expressado a enzima no teste fenotípico. Dados semelhantes foram obtidos com isolados de outros tipos de E.coli, sugerindo que esses micro-organismos carregam genes diferentes de ESBL (MONSTEIN et al. 2007). Apesar de até pouco tempo se considerar que os micro-organismos produtores de ESBL eram um problema quase restritamente nosocomial, um estudo realizado em hospitais espanhóis mostrou que mais da metade das cepas de E.coli produtoras dessas enzimas foram isoladas de amostras de pacientes ambulatoriais, principalmente de urina (HERNÁNDEZ, 2003). 55 A detecção de um número maior de cepas que abrigam os genes de betalactamases em relação aos testes fenotípicos ressalta a importância do uso de métodos moleculares no esclarecimento dos aspectos epidemiológicos das bactérias resistentes aos antibióticos beta-lactâmicos. Dessa forma, uma identificação precisa de bactérias produtoras de ESBLs é importante não somente para gerenciar a conduta terapêutica, mas também para aplicação imediata de medidas de controle que visem impedir sua propagação (WIEGAND et al, 2007; BERGERON;OULLETTE, 1998; COCKERILL, 1999). Técnicas com maior capacidade discriminatória, como as de PCR e o sequenciamento de DNA, permitem distinguir, entre cepas de um mesmo clone, mutações pontuais responsáveis pela resistência específica a determinadas classes de agentes antimicrobianos, como a resistência aos β–lactâmicos (TOSIN;SILBERT; SADER, 2003). Além do uso de técnicas que garantam uma maior confiabilidade na detecção dos mecanismos de resistência, como a produção de ESBLs, é de suma importância que se faça um rígido controle do uso de antimicrobianos, contribuindo assim para a redução da pressão seletiva e para amenizar a incidência de cepas produtoras dessas enzimas. A partir dos resultados obtidos nesse trabalho, que demonstraram uma considerável incidência de UPECs oriundas de pacientes da comunidade produtoras de ESBL, chama-se atenção para a necessidade de mais estudos visando a caracterização molecular para melhor elucidar a disseminação desse mecanismo de resistência na comunidade. Fatores específicos de virulência têm sido relacionados com fenótipos de resistência cujos padrões parecem variar de acordo com a região em estudo. Desta maneira padrões de fatores de virulência assim como o amplo padrão de resistência encontrado em nosso estudo demonstra a importância de se realizarem estudos regionais com o objetivo de conhecer melhor E.coli como agente de infecção urinária circulante na comunidade de São Luís e, mais ainda, conhecer o perfil de resistência e sua evolução. Essas informações são determinantes na orientação terapêutica empírica, podendo orientar a terapêutica antimicrobiana em nossa região. 56 7 CONCLUSÃO De acordo com os resultados obtidos neste trabalho chega-se as seguintes conclusões: Todas as amostras de UPEC apresentaram ao menos um dos fatores de virulência pesquisados. Das amostras analisadas 94,37% possuem uma ou mais das adesinas entre elas: fimbria curli, tipo 1, P, S e adesina afimbrial, demonstrando a capacidade patogênica das amostras circulantes na comunidade; As amostras apresentaram 90,62% de positividade para o teste de hidrofobicidade, em que 59,37% aglutinaram em concentração igual ou superior a 2M; Grande parte amostras mostrou-se capaz de formar biofilme, os resultados do ensaio qualitativo demonstraram que 86 foram positivas, enquanto no teste quantitativo obteve-se resultado 142 das amostras como produtoras de biofilme apresentando-se mais sensível do que o teste fenotípico com Vermelho Congo; Quando comparados à expressão da fímbria curli, tipo 1 e hidrofobicidade com a produção de biofilme a presença destes fatores não foi significativa na formação do biofilme em nossos testes, sugerindo que estejam presentes outros tipos de adesinas; As amostras de UPEC aderiram melhor em células renais (Vero) do que em células de laringe (Hep2); Para detecção da atividade hemolítica, as hemácias de sangue humano A e O carneiro foram mais sensíveis, que as de cavalo e do tipo B; Na presença de EDDA houve um aumento da expressão de hemolisina testadas em hemácias de carneiro indicando presença de alfa hemolisinas; 57 Das 15 amostras analisadas positivas para atividade citotóxica em células Vero, 86,6% apresentaram-se positivas na hemólise em 1 ou mais tipos de sangue. Obteve-se quanto à presença de enzimas 46,83% das amostras com atividade proteolítica, 41,87% produziram fosfolipases e apenas 1,87% gelatinases; Das amostras de UPEC 152 (95%) apresentaram resistência a pelo menos um dos antimicrobianos testados, sendo que apresentaram maior índice de resistência a amoxicilina ; O uso indiscriminado de antibióticos proporciona aquisição e disseminação de genes que conferem resistência às bactérias, sendo necessário fazer uma abordagem do comportamento destes micro-organismos diante de antimicrobianos para a escolha da estratégia terapêutica em São Luís-MA. Vinte e seis amostras foram positivas para ESBL através do teste fenotípico aplicado enquanto 104 foram produtores de β-lactamases de amplo espectro pela técnica de PCR; A observação de uma porcentagem alta de fatores de virulência demonstra um padrão preocupante de E. coli circulantes e o aumento do risco aquisição de ITU nas formas mais graves; de 58 REFERÊNCIAS ABE, C.M. et al. 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Monique Santos do Carmo,Adriana de Mendonça Marques,Luis Henrique Bastos Gonçalves ,Thiago Azevedo Feitosa Ferro,Silvio Gomes Monteiro ,Cristina de Andrade Monteiro,Valério Monteiro Neto.Patrícia de Maria Silva Figueiredo > Thank you for your above-mentioned manuscript which you kindly submitted > for publication in the Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. > > The manuscript will be sent to the Editorial Board for review. We will > contact you again as soon as we receive the reviewer´s comments. > > With the online journal management system that we are using, you will be > able to track its progress through the editorial process by logging in to > the journal web site: > > Manuscript URL: > http://submission.scielo.br/index.php/mioc/author/submission/66577 > Username: moniquebio88 > > Thank you for considering this journal as a venue for your work. > > Sincerely Yours, > > Ricardo Lourenco de Oliveira > Editor > _________________________________ > Memorias do Instituto Oswaldo Cruz > http://memorias.ioc.fiocruz.br 75 Anexo C: Certificado de Participação de Evento com apresentação de trabalho 76 77 APÊNDICES 78 Characterization of virulence factors and analysis of antimicrobial resistance of uropathogenic Escherichia coli from São Luís, Maranhão, Brazil. Adriana de Mendonça Marques , Monique Santos Carmo, Alicia Valéria dos Santos Zaranza de Carvalho, Francyelle Costa Moraes, Andreia Menezes Silva , Thiago Azevedo Feitosa Ferro, Diogo Marcelo Lima Ribeiro, Luís Henrique Bastos Gonçalves, Cristina de Andrade Monteiro, Patrícia de Maria Silva Figueiredo Department of Post-graduate and Extension Studies, Laboratory of Medical Microbiology Uniceuma, São Luís, Maranhão. Josué Montello, nº 1, Renascença II, São Luís-MA, Brasil. CEP 65.075-120 e-mail:[email protected] Summary: The urinary tract infection (UTI) is one of the main causes of medical consultation and Escherichia coli is the most common invader isolated from bacterial acute urinary infections. The severity of the infection depends on the virulence of the bacterium. Thus, this study aimed to evaluate the presence of virulence factors in strains in 160 isolates of uropathogenic E. coli from urinary tract infection, as well as analyze the profile of antimicrobial susceptibility. Samples of uropathogenic E. coli were evaluated for fimbriae production and they went through tests to evaluate hydrophobicity and biofilm production, hemolysin and enzyme production. We evaluated the antimicrobial resistance and performed the PCR with the genes of virulence factors ESBL. To detect biofilm, 53.75% were positive in congo red agar (CRA), while in the spectrophotometer positivity was 86%. In relation to the fimbriae, 80.62% of the isolates showed curli and 31.35% type 1. Through PCR we have found that 43.75% of the samples were positive for fimbriae type P and S, which are mannose-resistant. About the hemolytic activity, 38.75% were positive for type A, 28% B, 37.72% O, 38.75% for sheep blood and 30.37% for horse blood. In tests for detecting enzymatic activity: protease, gelatinase and phospholipase, 46.83% of the samples showed proteolytic activity, 41.87% produced phospholipase and 1.87% gelatinase. All the data obtained gives a contribution to the elucidation of the biological aspects of these uropathogens circulating in the community, which is relevant, considering the limitations of this information in our midst. Keywords: Escherichia coli; virulence factors; antimicrobial resistance, UTI, uropathogens Introduction Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the main agent that causes urinary tract infections (UTI), responsible for 70 to 90% of acute bacterial urinary infections (Sato et al. 2005), where 95% of these infections develop in an ascent way, causing cystitis and pyelonephritis (Mulveey 2002). The presence of virulence factors in UPECs make them different from commensal and include adhesins, which promote colonization and biofilm formation (Ong et al. 2008), as well as the presence of enzymes and toxins (Janke et al. 2001; Oelschlaeger et al. 2002). Bacterial adherence to cells of the urinary tract is an essential step for the beginning of the infection, and UPEC produces many types of adhesins necessary for the initial colonization, including fimbria curli, type 1, type P, type S and non-fimbrial adhesins (Blanco et al. 1997; Johnson and Stell 2000; Kaper 2004). The production of hemolysins is also an important virulence factor, because the presence of this toxin causes the lysis of uroepithelial cells and consequent invasion and dissemination of bacteria in cells (Wiles et al. 2008). In the last decade, enzymes have been intensively studied as virulence factors in the infection process and the identification of several enzymes has confirmed their involvement in the molecular 79 mechanism of infection. The function of these bacterial enzymes may be nutritional only, although it is possible that there is degradation of tissue structures which allow the bacterial invasion and multiplication in tissues and inhibit the action of the host’s immune system (Dow 2000). Multiplicity and association of virulence factors have been important in UTI development, and it can increase the pathogenicity of an UPEC isolate (Yamamoto et al. 1995; Blanco et al. 1997; Morin and Hopnks 2002). The comprehension of the several virulence facts that influence UTIs, as well as the way they behave facing na antimicrobial are extremely important for choosing the therapeutic strategy and clinical follow-up, and the evaluation of virulence and resistance factors contributes to the delineation of the problem and to define treatment options, as well as list appropriate measures for a new therapeutic conduct. The objective of this study was to evaluate virulence mechanisms related invasion and adhesion to the host, as well as to demonstrate resistance mechanisms to antimicrobials in 160 samples of uropathogenic E. coli from São Luís, Maranhão, Brazil. Material and Method The 160 samples of uropathogenic E. coli obtained from colonization in the urinary tract came from Gaspar Laboratory in São Luís-Maranhão, previously identified and currently part of the Bacteria Collection of Laboratory of Medical Microbiology of Uniceuma. This study has been approved by the Research Ethics Comitee n˚ 00097/11 of Uniceuma, São Luís, Maranhão. Detection of fimbriae type curli and type 1 To identify curli fimbria, the culture was grown at 37ºC in Luria Bertani medium for 24 hours. Then it was inoculated in LB agar plates containing Congo Red and Coomassie Brilliant Blue. The plates were incubated for 24 to 48 hours at room temperature (Da Re and Ghigo 2006). To identify type 1 fimbria, we made cultures in BHI for 24 hours at 37ºC. Right after, a portion of each culture was centrifuged three times (12000xg for 15 minutes), always eliminating the supernatant and adding PBS. About 100µl of the isolates were mixed, on glass coverslips, with 100µl of blood washed three times with PBS, with and without mannose. The samples which produced hemagglutination only in presence of mannose were considered positive for type 1 fimbria. Determination of cellular hydrophobicity After growth in BHI agar for 24h at 37°C, the cultures were suspended in rising concentrations of ammonium sulfate with 0.5M, 1.0M, 1.5M, 2.0M, 2.5M and 3.0M. Clumps formation within two minutes after suspension indicated positive result (Schmidt et al. 1998). Biofilm formation Congo red Agar: the test performed with congo red agar has been previously described (Freeman et al. 1989). Briefly, we made culture of the isolates in BHI agar with saccharose and Congo Red. After 24h at 37°C, the plates were analyzed. The biofilm producers showed black colonies, while the non-producers were red. Spectrophotometry: we inoculated 100µL of bacterial suspension with 100µL of BHI in microplates with 98 wells and incubated at 37°C for 24 hours in an incubator. After the incubation period, the plates were washed three times with PBS. Crystal Violet was added to the plates and then incubated for 15 minutes at room temperature. Each well was washed with distilled water three times. The plates were submitted to spectrophotometry with a 492nm filter to measure the absorbance of each well. Based on the optical density (O.d.i) produced by the isolates and considering the negative control (O.d.c), the isolates were classified in the categories: non-producer, weak producer, moderate producer and strong producer (Stepanovic et al. 2004). Bacterial adhesion to cell cultures The adhesion of uropathogenic E. coli was performed in Vero renal cells (Green African Monkey) and Hep2 cells (Human Larynx Carcinoma) which were thawed in a water bath at 37ºC and transferred to a bottle with cell culture containing modified Eagle’s Minimum Essential Medium (MEM/Cultilab), with 10% of fetal bovine serum (FBS/Cultilab) and 1% of antibiotics solution, containing penicillin and streptomycin. The culture bottles were incubated in an atmosphere with 5% of CO2 at 37ºC for 48 hours until formation of the cellular monolayer. After this period, the medium was removed and a solution of TVA (Trypsin Versene Association) was added to the cell culture to detach the monolayer. The cells were resuspended in MEM plus 10%. The suspension of cells has been distributed in microplates with 24 wells, 100 μL per well. The microplates were incubated at 37ºC, in 80 an atmosphere with 5% of CO2 for 24 hours. Adherence was analyzed according to the patterns: local, diffuse and aggregative. Hemolysin production Bacterial cultures were inoculated in plates containing 5% of human blood types A, B and O, sheep and horse blood and then incubated at 37°C for 24 hours. The presence of circular zones of hemolysis or degradation around colonies indicated positive result for hemolytic activity (Watanabe et al. 1988). Hemolysin production in presence of chelating agents and ions solution To verify the influence of chelating agents and solution of calcium chloride in the expression of hemolytic activity, the samples were cultivated in BHI and then planted in Müeller-Hinton, containing separately the chelate EDTA (ethylenediamineacetic acid) and EDDA (ethylene-di-(o-hydro phenol) acetic acid) and ion solution of CaCl 2 (calcium chloride) for 48h at 37°C in an incubator. Detection of cytotoxic activity Samples of Escherichia coli were cultivated in 5 mL of BHI at 37°C. After 24 hours of incubation, the cultures were centrifuged (6000 x g /15 min). The supernatant culture obtained was filtered with a 0.22µm membrane. We added 100µL of the supernatant in a microplate of 98 wells containing Vero cells grown in Minimal Essential Medium (MEM). The cultures were incubated at 37°C in 5% atmospheric CO2. After this period, the microplate was washed three times with PBS and then we added 200µL per well of the extraction solution and shook for 10 minutes. The microplate was read with Elisa with a 540nm filter. Detection of sequences of pap, sfa, afa and hlyA by PCR Amplified DNA was obtained through heating the pure colony in eppendorfs with 0.5 ml of distilled sterilized water and centrifuged at 10.000rpm for 2 minutes. The polymerase chain reation was performed using specifica primers for the genes: papC (fimbria type P), sfa (fimbria type S), afa (fimbrial adhesin) and hlyA (alpha-hemolysin). The primers sequence and molecular weight of the products is specified in (Table 1). PCR products were applied in agarose gel 2% and identified by incubation in ethidium bromide solution and viewed in a UV light transluminator. Detection of Protease and Phospholipase Bacterial cultures were inoculated in Müeller-Hinton plates with 10% of skim milk and 3% of egg yolk and incubated at 37°C for 24 hours. The presence of degradation zones around the colonies and precipitation zones indicated positive result for proteolytic activity and phospholipase production, respectively. Gelatinase E.coli strains were inoculated in BHI and after incubation at 37°C for 24 hours, the inocula were deeply planted in tubes containing 5mL of a gelatin solution 12%, prepared in phosphate buffer pH 7.4. After incubation at 37°C for 24 hours, we observed if there was gelatin liquefaction (Wilson 1930). Antimicrobial susceptibility testing The disk diffusion method was used to determine antimicrobial susceptibility. The antimicrobial tested include: ceftriaxone, cefuroxime sodium, amoxicillin/clavulanic acid, gentamicin, nitrofurantoin, ampicillin/sulbactam, norfloxacin, cefotaxime, cefepime, ciprofloxacin, nalidixic acid, amoxicillin. E.coli standard strain ATCC 25922 was used as control. Phenotypical detection of ESBL producing strains by disk approximation The bacterial suspension was prepared with saline solution and turbidity corresponding to 0.5 in the McFarland scale. Disks of aztreonam (30 µg), cefotaxime (30 µg), ceftazidime (30 µg) and cefepime (30 µg), were placed at 20 mm distant from the amoxicillin/clavulanic acid disk (Harada; Ishii and Yamaguchi 2008; Shah et al. 2004). The samples were considered ESBL producers when there was amplification of the inhibition zone for cephalosporins or aztreonam or when a third irregular zone of inhibition (“ghost-zone”) appeared between the composed disk and the disk of one of the beta-lactams drugs. Molecular detection of strains producing ESBL by PCR 81 In this study, we used the primers TEM-164.SE and TEM-165.AS to amplify a sequence of 445 pairs of bases of the family TEM; for the family CTX-M, the primers pair CTX-M-U1 and CTX-MU2 to amplify 593 pairs of bases and for the family SHX the pair of primers with 747 pairs of bases SHV.SE and SHV.AS. The primers sequence and molecular weight of the products is specified in Table 1. Statistical methods The significance of the results was established using Contingency Coefficient C. Statistical analyses were performed with Bioestat (version 5.0). All results were considered as statistically signifcant at P < 0.05. Results From the 160 samples evaluated, it was observed that 129 (80.62%) were producers of curli fimbria and 50 (31.25%) were positive for type 1fimbria. It was found that 145 samples, equivalent to 90.62% showed positivity for the hydrophobicity test, where 59.37% of the samples were agglutinative within the concentrations from 3M to 2M. The results from the qualitative biofilm assay of the 160 samples studied demonstrated that 86 (53.75%) produced biofilm and 75 (45.35%) were negative. In relation to the quantitative test in microplates, 87.86% of the samples produced biofilm, and they were classified as strong, moderate and weak. From these, 16 (10%) were classified as strong, 26 (16.25%) as moderate, and 100 (62.50%) as weak biofilm producers; 18 (11.25%) did not produce biofilm. The test in microplates differs the efective strains very well, being more sensitive than the phenotypical test with Congo Red (Mariusz et al. 2008), therefore the percentage of biofilm producers is higher than in CRA, despite 11 samples have showed positive results in the phenotypical test with Congo Red and dis not produce biofilm with detection in microplate. The expression of curli fimbria, type 1 and hydrophobicity have been reported as important structures for biofilm formation and identified as virulence factors of uropathogenic E. coli (UPECs) with and important role in adhesion. We performed an analysis of the results by the correlation test, in which we compared biofilm data evaluated to fimbriae production and hydrophobicity, however, the presence of these factors was not significant for biofilm formation in our tests, suggesting other kinds of adhesins present (Table 2). Other adhesins (pap,sfa, afa ) were analyzed through molecular techniques where 43.75% (70) showed the sequences reported for the virulence factors studied. It was found that 25 (15.62%) were positive for type P fimbriae, showing the genotype pap, 16 (10%) were positive for type S fimbria showing genotype sfa, 27 (16.88%) showed simultaneously pap and sfa, and only 2 (1.25%) showed fimbrial adhesins with genotype afa (Figure 1). We analyzed 40 samples to adhesion, and it was not found any adhesion pattern in Hep2 cells, but 15 (37.5%) samples showed aggregative pattern in Vero cells (Figure 2). In relation to hemolytic activity, in A, B and O blood, sheep and horse blood, where 62 (38.75%) of the samples showed total hemolysis zone around the colonies in solid medium with human blood type A, 45 (28.12%) with human blood type B, 60 (37.72%) with human blood type O, 62 (38.75%) with sheep blood and 48 (30.38%) in horse blood. A higher activity was observed in human blood type A, type O and sheep blood (Graphic 1a). In relation to the hemolytic activity related to EDTA, EDDA and CaCl2 present in the cultivation medium in sheep erythrocytes, there was no hemolytic activity with EDTA. It was observed a higher hemolytic activity in samples with EDDA (statistically equal to the control test with pure sheep blood) in comparison to CaCl2, indicating presence of alpha-hemolysins, because EDDA is a a calcium chelate and strains which showed this kind of hemolysin depend on calcium to lyse cells, what increases the bacterial hemolytic activity (Graphic 1b). However, in the molecular analysis of the alpha-hemolysin by PCR only 1 sample (0.63%) showed the gene hly. Isolates that secrete hemolysins not only can lyse erythrocytes but also other types of cells, making the organism more cytotoxic. In this study, we analyzed the cytotoxic activity of UPEC in Vero cells, but only 15 (9.37%) samples were positive for this activity, where 86.6% of the samples showed cytotoxic activity in Vero cells also showed hemolytic activity in 1 or more types of blood analyzed. Some bacteria showed enzymes that are able to degrade cellular components, destroying tissues and mirroring the adjacent tissues, being primarily responsible for the invading the host. Thus, we analyzed uropathogenic E. coli samples for presence of enzymes, where 75 (46.83%) of the samples showed proteolytic activity, 67 (41.87%) produced phospholipase and 3 (1.87%) gelatinase. The resistance profile of the E. coli samples showed that in the community studied, these micro-organisms showed high resistance rates to amoxicillin with 91.25% and were more sensitive to 82 aminoglycosides (gentamicin with 96.25% and 88.75% for nitrofurantoin) and to cephalosporins (ceftriaxone with 86.88% and 86.25% to cefotaxime). These antibiotics were effective against uropathogenic Escherichia coli during the analysis (Table 3). The third generation cephalosporins are known for their good activity against gram-negative microorganisms, however the production of enzymes extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) among UPEC strains make them able to resist to the action of these medicines, what is a great problem for the treatment. Among the 160 samples analyzed for production of the ESBL enzyme, 26 (16.25%) samples were positive for the enzyme according to the phenotypical test applied. We studied the presence of the genes blaSHV, blaTEM and blaCTX in 160 UPEC samples by PCR, and we found that 104 (65%) of the isolates were ESBL producers. Among them, the predominant were blaTEM, found in 48.87% of the isolates and blaCTX with 13.75%. Only four strains showed these genes simultaneously. The gene blaSHV was detected in three isolates together with the gene blaTEM. Six isolates did not amplify for any of the studied genes, despite the have expressed the enzyme in the disk approximation test (Figure 3). Discussion Microbial adherence is the first step for pathogenesis (Sherman 1988) and the fimbriae type 1, type P, type S and non-fimbrial adhesins play an important role in adhesion, identified as main specific virulence factor of uropathogenic E. coli (Miyazaki 2002). Curli fimbria is able to promote connection bacterium-bacterium, as well as the connection bacterium-surface, expressed by several pathogenic isolates of E. coli (Gophna et al. 2001). Type 1 fimbria is essential for bacterial adhesion to the bladder epithelium and establishment of infection, as in cystitis (Kau; Hustand and Hultgran 2005), favoring the internalization of the bacterium to the bladder epithelium, a fact that can lead to the chronic phase of cystitis. The type P fimbria represents a virulence factor typical of strains that cause pyelonephritis and are frequently associated to some serogroups of E. coli (Johnson 1991; Blanco et al. 1997). Type S fimbria can be detected in E. coli isolates from different origins, however they are related most to strains associated to meningitis and sepsis (Korhonen et al. 1988). 151 (94.37%) of the samples analyzed have one or more of the adhesins studied, demonstrating the pathogenic capacity of the samples circulating in the community, since these bateria have factors for a more complicated UTI, as cystitis and pyelonephritis. In relation to the genes pap, sfa and afa, data found in the present study corroborate other data about UPEC research, where type P fimbria (pap) is the most prevalent in uropathogenic E. coli in 77% of the cases (Hull, 1998) followed by fimbria S (sfa). Blanco (1997) has detected with a higher frequency pap and sfa in E. coli strains from patients with acute pyelonephritis, indicating that the operons that encode the adhesins P and S may have the most important role in development and severity of UTI. The gene afa has been reported with low frequency among uropathogenic E. coli (Blanco et al. 1997; Santo et al. 2006; Takahashi 2007; Abe et al. 2008). The capacity of uropathogenic E. coli producing biofilm helps it to survive inside the host organism and this factor is responsible for chronic or persistent infections. Approximately 50% of the microbial infections are associated to biofilm formation, what usually increases significantly resistance to antibiotics and the defense mechanisms of the immune system. Studies demonstrate the importance of bacterial biofilm formation in UTI, especially in chronic cystitis (Hancock; Ferriéres and Klemm 2007), since the presence of biofilm acts in reducing bacterial susceptibility to antimicrobial agents when compared to cultures of planktonic bacteria (Smith 2005). In relation to hemolysin production, several studies concluded that isolates that were able to produce this toxin were more virulent than the non-hemolytic isolates (Cookson et al. 2007; Hunt et al. 2008). Some E. coli isolates are able to produce several types of hemolysins at the same time (Figueiredo et al. 2003; Hunt et al. 2008). Alpha-hemolysin is present in several lineages which cause extra-intestinal infections and it is cytotoxic to several human cells. Despite other kinds of hemolysins have been described, as beta-hemolysin, the prevalence and its clinical meaning is barely known (Johnson 1991; 2001). Alpha-hemolysin is an exotoxin able to induce calcium influx and eventual lysis of a variety of cells types in different hosts (Welch and Bauer 1995). That is why we suggested that with an increase of hemolytic activity in presence of calcium chelate in the results of this study the evaluated UPEC may be alpha-hemolysin producers, despite showing a low percentage of the gene alpha-hemolysin (hly) may be related to the great variation of this gene among E. coli strains, where the prevalence varies according to the phylogenetic group, patient’s clinical condition and geographical localization (Blanco et al. 1997; Johnson and Stell 2000; Takahashi et al. 2007, 2009; Abe et al. 2008). 83 Uropathogenic E. coli elaborates a great number of enzymes, including proteolytic ones (protease, elastase) and phospholipase. Some bacteria are able of producing gelatinase, however they are not frequently seen in UPEC (Taghrid; Coloe and Coloe 2006). Phospholipase has been also shown as an important virulence factor, since these lipolytic enzymes which are able to hydrolyze bonds between ester and phospholipids in the cell membrane, thus being important in invading the host (Waite 1996). 41.87% of the samples were positive for this enzyme, a considerable value, highlighting the community origin of these samples. Knowledge about the pattern of resistance to antibiotics is extremely important to choose the appropriate treatment for UTI. The resistance profile of E. coli samples revealed that in the studied community they had a high resistance rate to amoxicillin, with 91.25%, this antimicrobial is not recommended for treating urinary infection because of its high resistance and recurrence. This resistance is justified by the mechanism of beta-lactamase production. Currently, for an effective treatment of UTI with amoxicillin, it must be associated to clavulanic acid (Jancel and Dudas 2002). With the increase in the resistance to beta-lactams, the recommended therapeutic alternative are fluoroquinolones, as norfloxacin and ciprofloxacin. However, we emphasize that these antimicrobials are more appropriate for complicated UTI and with a careless use, these agents may cause selection of resistant strains (Warren 1999). In our study, we have found prevalence of resistance of 22.5% for norfloxacin and 21.88% for ciprofloxacin, what makes the analyzed UPEC likely to acquire higher resistance if these antibiotics are empirically used. Nitrofurantoin is another therapeutic option, with the disadvantage of a longer treatment period. We have got a phenotypically low percentage of ESBL while the detection of genes for these enzymes was high among the isolates, indicating that the genes are not being expressed yet, despite being detected. TEM type ESBL are frequently found in gram-negative bacteria, especially in E. coli and K. pneumoniae (Livermore 1995) corroborating our data. Although the gene blaCTX-M has been identified with a lower frequency, beta-lactamase encoded by it are in a fast expansion (Tzouvelekis 2000). According to Jacoby (1997), ESBL resistance type SHV can be found more frequently in clinical isolates than in other types of ESBL. This may be the explanation for the low percentage of blaSHV found in our samples, once they come from the community. Two isolates did not amplify for any of the studied genes, although they have expressed the enzyme in the phenotypical test. Similar data were obtained from E. coli isolates, suggesting that these strains carry another type of gene ESBL (Monnstein et al. 2007). Specific virulence factors have been related to resistance phenotypes, whose patterns seem to vary according to the region studied. Thus, patterns of virulence factors, as well as the broad resistance pattern found in our study demonstrates the importance of performing regional studies aiming better knowledge about E. coli as an agent that causes urinary infection circulating in the community of São Luís and, even more, knowing the resistance profile and the its evolution. This information is crucial in empirical therapeutical guidance, and may guide antimicrobial therapeutics in our region. Aknowledgments The authors thank for the financial support given by Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) for the scholarship granted to Adriana de Mendonça Marques and to Centro Universitário do Maranhão (Uniceuma). References Abe CM et al (2008) Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strains may carry virulence properties of diarrheagenic E. coli. 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Microbiol 12:85-90 87 Table 1: Base sequence, foreseen sizes of the amplified products of the primers used in PCR. Oligonucleotides sequence (5’-3’) Size REFERENCE papC F:GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG R:ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA 328 pb Daigle et al., 1994 sfa F:CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC R:CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA 410 pb Daigle et al., 1994 afa F:GCTGGGCAGCAAACTGATAACTCTC R:CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG 750 pb Daigle et al., 1994 hlyA F:AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT R:ACCATATAAGCGGTCATTCCCGTCA 1.177 pb Yamamoto et al., 1995 F:CACTCAAGGATGTATTGTG R:TTAGCGTTGCCAGTGCTCG 747 pb Pitout et al., 1998 F:ACGCTCAGTGGAACGAAAAC R:TTCTTGAAGACGAAAGGGC 445pb Monstein et al., 2007 blaSHV blaTEM papC: operon of the pilli associated to pyelonephritis, sfa: operon of the fimbrial adhesin S, afa: operon of the non-fimbrial adhesin, hly: α-hemolysin. blaCTX F:GTGACAAAGAGAGTGCAACGG 593pb Simarro et al., -M G: guanine, A: adenine, C: cytosine, T: thymine. R:ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC 2000 Table 2: Distribution of the tests of virulence for adhesion applied in comparison to biofilm formation Biofilm (microplate) Non producer Weak Moderate Strong Negative 4 12 2 0 Fimbria type 1 1 6 0 0 Curli 13 66 6 0 Type 1 + Curli 2 9 2 1 Contingency Coefficient C Value of p* 0.27 0.31 0.18 0.59 0.29 0.4 Fimbriae Hydrophobicity Non hydrophobic 1 9 0 0 untill 1.5M of ammonium sulfate 7 25 5 0 13 59 5 2 over 1.5M of ammonium sulfate Combination of hydrophobicity and fimbriae Hydrophobicity + Fimbria type 1 1 5 0 0 Hydrophobicity + Fimbria curli Hydrophobicity + Fimbria type 1 and curli 12 60 7 0 2 7 2 1 * Value of p > 0.05: result without statistical difference 88 Graphic1: A: Hemolytic activity of Escherichia coli isolates according to blood type. Q=14.74, p=0.005. B: Hemolytic activity of Escherichia coli isolates in pure blood and with chelates and calcium chloride. Q=13.27, p=0.004. ¹²³ Different numbers mean p < 0.05. Table 03- Resistance profile of Escherichia coli strains isolated from urinary infection. ** Antibiotic** Susceptible Intermediate Resistant CRO 139 (86.87%) 12 (7.50%) 9 (5.63%) CXM 89 (55.62%) 13 (8.13%) 58 (36.25%) AML 12 (7.50%) 2 (1.25%) 146 (91.25%) CN 154 (96.25%) 1 (0.63%) 16(10%) F 142 (88.75%) 2 (1.25%) 2 (2.38%) SAM 110 (68.75%) 19 (11.88%) 31 (19.38%) NOR 124 (77.50%) 0 (0%) 36 (22.50%) CTX 138 (86.25%) 5 (0%) 17 (10.63%) FEP 124 (77.50%) 13 (8.13%) 23 (14.38%) CIP 124 (77.50%) 1 (0.63%) 35 (21.88%) AMC 75(46.88%) 13 (8.13%) 72 (45%) NA 106 (66.25%) 1 (0.63%) 53 (33.13%) antibiotics used: CRO = ceftriaxone, CMX = cefuroxime, AML = amoxicillin, CN = gentamicin, F = nitrofurantoin, SAM = ampicillin + sulbactam, NOR = norfloxacin, CTX = cefotaxime, FEP = cefepime, CIP = ciprofloxacin, AMC = amoxicillin + clavulanic acid, NA = nalidixic aci 89 Figure 1. Multiplex PCR amplification for the genes for papC, sfa, afa, and hly. Electrophoresis in agarose gel 2%. Lane M: molecular weight marker 100bp. Lanes: 1, 3, 5, 7, 10, 12, 13.14: Products of amplification of genes papC(328pb) and sfa (410 bp). Lanes: 2, 4, 6,8,9,11 and 15, were negative. Figure 2. Aggregative adhesion pattern (AA) on cells from the Vero lineage. Figure 3: Detection of the genes blaCTX, blaTEM and blaSHV by multiplex PCR. Visualization in agarose gel 2.5 %. Lanes: M = molecular weight marker (50pb ladder); 1 = K. pneumoniae ATCC 700603 (positive control); 2 = strain number 2; 3 = strain number 8; 4 = strain number 19; 5 = strain number 22; 6 = strain number 33; 7 = strain number 36. 90 DETECTION OF EXTENDED-SPECTRUM β-LACTAMASES (ESBLs) IN UROPATHOGENIC ESCHERICHIA COLI (UPECs) COMMUNITARY STRAINS. 1 Monique Santos do Carmo. 2 Adriana de Mendonça Marques 3 Luís Henrique Bastos Gonçalves 4 Thiago Azevedo de Feitosa Ferro 5 Dra.Cristina Andrade Monteiro 5 Dra.Patrícia de Maria Silva Figueiredo Carmo MS1; Marques AM2; Gonçalves LH3; Ferro TAF4; Andrade-Monteiro C5; Figueiredo PMS5 1 Biology student, Federal University of Maranhão. 2 Student of Masters in Parasite Biology, UniCeuma. 3 Gaspar Laboratory, São Luís, Maranhão. 4 Master in Parasite Biology. 5 Medical Microbiology Laboratory, UniCeuma. Mail to: Dr. Patrícia de Maria Silva Figueiredo Laboratório de Microbiologia Médica- UniCeuma. Rua Josué Montello, n˚01, Renascença II. CEP 65.075-120. São Luís, Maranhão. E-mail: [email protected] 91 ABSTRACT The production of extended-spectrum β-lactamase (ESBL) is na important resistance mechanism to the β-lactam antimicrobials, considered a risk factor to manage infectious diseases. The wide use of antibiotics on the treatment of urinary tract infections (UTI) has aggravated this problem. In addition to some virus, fungi and bacteria, uropathogenic E. coli are presented as the main responsible for this kind of infection. Studies to understand the diversity of ESBL in Brazil are scarce and, besides, many of them are directed to nosocomial strains. The objective of this study was to detect phenotypically and in molecular level the production of ESBLs of the types TEM, CTX-M and SHV in 117 UPEC isolates from patients from the community. For the phenotypic test it was used the disc approximation test and for the molecular test, PCR multiplex. From the total of strains, 12.8% showed a positive phenotype for ESBL, while 65.8% amplified for the genes in study. Among these, the most prevalent were bla TEM and bla CTX, with 42.7% and 18.8%, respectively. Two isolates were positive for the phenotypic test, but negative for the PCR multiplex, suggesting the presence of other genes for ESBL. From the present results, we call attention to the need of more studies implemented by molecular characterization to elucidate the dissemination of this resistance mechanism among bacteria from the community. Key words: ESBL, UPEC, disc approximation, PCR multiplex. 92 Introduction The world is facing a serious crisis about a growing resistance to antibacterial drugs, so that this factor is presented as a serious threat to the management of infectious diseases.1,2 The increase in resistance rates among several microorganisms and, in particular, among uropathogenic Escherichia coli (UPECs) has been causing great concern in developed and developing countries 3. In addition to some virus, fungi and other bacteria4, UPECs present themselves as responsible for urinary tract infections (UTIs), and are detected in about 70% to 90% of the acute bacterial urinary infections 5. The ITUs are a serious health problem, affecting millions of people every year3, considered one of the main causes of morbidity and mortality 6. These infections represent one of the main causes of medical consultations, following only respiratory infections7. In Brazil, totaling 80% of the consultations8. Among several antibiotics resistance mechanisms, the extended-spectrum βlactamases (ESBLs) production is highlighted, which are a class of β- lactamases mediated by plasmids, showing the capability of hydrolyze and inactivate a great variety of antibiotics from the β-lactam group, including third-generation cephalosporins, penicillins and aztreonam9. ESBLs are the result of the mutation of the enzymes Temoniera 1 (TEM-1), Temoniera 2 (TEM-2) and Sulfhidryl variable 1(SHV-1)9, so that currently, more than 93 340 types are known10, and caused, thereby, great concern among microbiologists and infectologists11. Studies to understand the diversity and prevalence of ESBL in Brazil are scarce, due to the large territory and the need for extensive sampling12. Monitoring the occurrence of strains producing ESBLs is to contribute substantially to delineate the extent of the problem, to define treatment options and identify appropriate containment measures13. Moreover, great part of the studies about ESBL have been directed to strains from hospitalized patients, and a few studies have reported the presence of these enzymes in strains isolated from patients in the community. Thus, the objective of this study was to detect phenotypically and in molecular level by the technique of Polymerase Chain Reaction (PCR), the production of the types TEM, CTX-M and SHV of ESBL in UPEC isolates from the community. Methods Bacterial strains The study was conducted from 118 UPEC isolates, previously identified, from patients of the community, kindly provided by a private laboratory in São Luís, Maranhão, Brazil. Characterization of the ESBL phenotype All strains were submitted to the double diffusion method or disc approximation method, according to CLSI criteria14. 94 Extraction of deoxyribonucleic acid (DNA) from the isolates For DNA extraction, one pure colony from each isolate was suspended in eppendorfs with 1mL of sterile distilled water. Then, the strains were submitted to a temperature of 100˚C for 8 minutes in water bath. Subsequently, the DNA of the isolates was maintained at - 20˚C15. Molecular detection of strains producing ESBLs of hte types TEM, CTX-M and SHV through amplification by PCR multiplex In the study, we used the pairs of primers TEM-164.SE and TEM-165.AS, CTX-M-U1/U2 and bla-SHV.SE/AS with origin and size of the fragment amplified in base pairs (bp) according to Table 1. The primers were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA) and all the reactions were performed with 2,5 µl . DNA polymerase, MgCl2 buffer, DNTPs and miliQ water, in a total volume of 25 µl. The conditions for amplification were: initial denaturation at 95˚C for 15 minutes, 30 cycles of denaturation at 94˚C for 30 seconds, annealing at 60˚ for 30 seconds, extension at 72˚C for 2 minutes, followed by a final extension at 72˚C for 10 minutes. The amplifications were perfeormed in a thermocycler MyCicler (BioRad) and the amplified product of each reaction was submitted to electrophoresis on agarose gel 1% for 1 hour (100 volts), and subsequently), stained with ethidium bromide at a concentration of 20μg/100 ml of water and visualized under UV light with a transluminator.16. Quality control For quality control of molecular and phenotypic tests, we used the strains of Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 (blaSHV-1) and E. coli ATCC 35218 (blaTEM-1) as positive controls and the strain E. coli ATCC 25922 as negative control. 95 Results The results are summarized in table 2. From the 117 isolates, 12.8% showed a positive phenotype for ESBL (Figure 1), while 65.8% amplified for the genes in the study. Among these, the most prevalent were and bla bla TEM, found in 42.7% of the isolates CTX, in 18.8%. Only two strains showed these genes together. The gene bla SHV was detected in three isolates, together with the gene bla TEM. Two isolates did not amplify for any of these genes, despite of being positive in the phenotypic test. The result of the amplification of some strains can be seen in Figure 2. In graphic 1, we can observe the correlation between the results of PCR and disc approximation Discussion While some strains have full resistance to β–lactam antibiotics with broad spectrum, many isolates cannot be phenotypically resistant, even with the genes that encode these enzymes19. These differences in the susceptibility patterns displayed by bacteria can depend on the plasmid in which the gene is; or on the promoter gene that controls the β-lactamase production. As the degradation of β–lactam usually occurs slowly, the resistance to this agent cannot be detected when tests are performed in vitro, as it happened with many isolates in this study when submitted to the disc approximation test20,21. We add to this the fact that the standard inoculum for the susceptibility tests may not be sufficient to detect resistance, since the enzyme can be present in low concentrations and clavulanic acid is not able to effectively inhibit it, and it is not possible to see the phenotype for ESBL production ESBL 22. 96 TEM-type ESBLs are frequently found in gram-negative bacteria23, especially in E. coli and K. pneumoniae confirming the data in this study. Although the gene bla CTX-M has been identified less frequently, the β-lactamases encoded by this gene are in a fast expansion24. Some isolates showed bla TEM and bla CTX-M genes as a whole, similarly to the results found in a study for the detection of these genes in E. coli and other enterobacteria by PCR multiplex16. The enzymes from the family SHV are found with a high prevalence in clinical isolates of the other kinds of β-lactamases, justifying the incidence of the gene bla SHV in UPECs isolates, which are from the community. In addition to this, most of the SHV-type enzymes is found in K. pneumoniae strains25,26. One of the isolates did not amplify for any of the genes in the study, although it was phenotypically positive. This suggests this strain carries another type of ESBL gene. Despite that, until recently, it was believed that microorganisms producing ESBL were almost strictly a nosocomial problem, a study in Spanish hospitals showed that more than half of E. coli strains producing these enzymes were isolated from samples from outside the hospitals, mainly in urine27. Thus, a precise identification of the ESBL-producing bacteria is important not only to manage the therapy but also for the immediate implementation of control measures to prevent its spread28. Within this context, the molecular characterization of resistance mechanisms allows to obtain information not accessible by the exclusive use of phenotypic methods, which allows great advances in knowledge about genetics and epidemiology of bacterial resistance29.30. 97 Techniques with greater discriminatory Power, such as PCR and DNA sequencing, distinguish strains of the same clone punctual mutations responsible for specific resistance to certain classes of antimicrobial agents, such as resistance to beta-lactam shown by Enterobacteriaceae31. Besides the use of techniques to ensure a greater reliability in the detection of resistance mechanisms, such as the production of ESBLs, it is extremely important to have tight control of antimicrobial use, thereby helping to reduce the selective pressure and to decrease the incidence of strains producing ESBLs. From the present results, which showed a considerable incidence of extrahospital strains producing extended-spectrum β-lactamases, we call attention to the need of more studies implemented by molecular characterization to elucidate the dissemination of this resistance mechanism among bacteria from the community. References 1 Croft AC, D`Antoni AV, Terzulli SL. Update on the antibacterial resistance crisis. Review Article. Med Sci Monit 2007; 13: 103-118. 2 Kotra LP, Samama J, Mobashery S. Beta-lactamases and resistance to betalactam antibiotics. In:Lewis K, Slayers AA, Taber HW, Wax RG, editors. Bacterial resistance to antimicrobials. NewYork: Marcel Decker; 2002; p.123-160. 3 Lina TT, Rahman SR, Gomes DJ. Multiple-antibiotic resistance mediated by plasmids and integrons in uropathogenic Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Bangladesh J Microbiol 2007; 24: 19-23. 4 Corrêa LA, Canalini AF, Matheus WE. Etiologia das infecções do trato urinário. 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