AVALIAÇÃO DE CASPASE 3/7 E TUNEL UTILIZANDO

XI CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA – FCAV/UNESP
AVALIAÇÃO DE CASPASE 3/7 E TUNEL UTILIZANDO
NITENSIDINA B ISOLADA DE Pterogyne nitens
CASPASE
3/7
AND
TUNEL
ASSESSMENT
USING
NITENSIDINE B ISOLATED FROM Pterogyne nitens
Cristiane Randisk Loriano(1)
Felipe de Oliveira Souza(2)
Resumo
O câncer de colo de útero é o terceiro tumor mais frequente na população feminina, e a quarta
causa de morte de mulheres por câncer no Brasil. Estudos epidemiológicos e moleculares
demonstraram que o principal fator etiológico do câncer cervical é o vírus HPV,
Papilomavírus Humano, e pelo menos 13 tipos de HPV são considerados oncogênicos, sendo
a infecção por esses tipos o maior fator de risco para o desenvolvimento de lesões malignas
no colo uterino. Os produtos naturais têm contribuído intensamente para o desenvolvimento
da terapêutica moderna, de modo que, cerca de 70% das drogas disponíveis na quimioterapia
podem ser consideradas inspiradas em produtos naturais. Dessa forma, o presente trabalho
teve como objetivo verificar a atividade citotóxica de nitensidina B, um alcaloide guanidínico
isolado de Pterogyne nitens, uma planta distribuída do sudeste ao sul do Brasil. A
citotoxicidade foi avaliada em experimentos in vitro, utilizando células de carcinoma cervical
(linhagens SiHa e C33A, imortalizada e não imortalizada pelo HPV-16, respectivamente). O
ensaio realizado foi sulforrodamina B, no qual foi possível observar um padrão de morte
concentração-dependente nas duas linhagens celulares analisadas, estatisticamente
significativos em relação ao veículo (DMSO 1%).
Palavras-chave: Câncer cervical. Citotoxicidade. HPV. Nitensidina B. Sulforrodamina B.
Abstract
Cervical cancer is the third most common tumor in the female population, and the fourth
cause of death of women for cancer in Brazil. Molecular and epidemiological studies
demonstrated that the main etiological factor for cervical cancer is the HPV virus, human
papillomavirus and at least 13 types of HPV are considered oncogenes, and infection these
types the greatest risk factor for the development of malignant lesions cervix. Natural
products have contributed extensively to the development of novel therapeutic, so that about
70% of the drugs in chemotherapy can be considered inspired in natural products. Thus, this
study aimed to verify the cytotoxic activity of nitensidine B, a guanidinic alkaloid isolated
Pterogyne nitens, a plant distributed Southeast south of Brazil. Cytotoxicity was assessed by
in vitro experiments using cell cervical carcinoma (SiHa and C33A lines, immortalized and
non-immortalized by HPV-16, respectively). The sulforhodamine B assay was performed in
which we observed a pattern of concentration-dependent death in both cell lines analyzed,
statistically significant versus vehicle (1% DMSO).
Keywords: Cervical cancer. Cytotoxicity. HPV. Nitensidine B. Sulforhodamine B.
(1)
Aluna de graduação do curso Farmácia-Bioquímica pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas - FCFAr/Unesp, Araraquara-SP. Email
contato: [email protected]. (2) Doutorando em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAr/Unesp, Depto de Análises
Clínicas, Araraquara-SP. Email contato: [email protected].
Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 7, 2015. Número especial.
1 Introdução
Câncer refere-se ao termo neoplasia, caracterizada pela proliferação descontrolada de
células transformadas (ALMEIDA et al., 2005). O câncer cervical, ou câncer de colo uterino,
tem como principal fator etiológico o vírus HPV, Papilomavírus Humano (NAKAGAWA et
al., 2010). Pelo menos 13 tipos de HPV são considerados oncogênicos, apresentando maior
risco ou probabilidade de provocar infecções persistentes e estarem associados com alterações
no colo do útero, chamadas lesões precursoras. Dentre os de alto risco oncogênico, os tipos 16
e 18 do HPV estão presentes em 70% dos casos de câncer cervical (INCA, 2015). Em 2012,
segundo a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer, o câncer de colo de útero foi o
quarto tipo de câncer mais comum entre as mulheres, com uma estimativa de 265 mil mortes
para o mesmo ano (IARC, 2015).
A nitensidina B é um alcaloide guanidínico isolado de estruturas da Pterogyne nitens
(Fabaceae), que apresenta atividade citotóxica sobre linhagens mutantes de Saccharomyces
cerevisiae e sugere uma potencial atividade antitumoral (REGASINI et al., 2008).
O presente trabalho teve por objetivo verificar a atividade citotóxica de nitensidina B
in vitro, utilizando linhagem de carcinoma cervical imortalizada pelo HPV-16 (SiHa-ATCC:
HTB-35) e não imortalizada pelo HPV (C-33A-ATCC: HTB-31).
2 Materiais e métodos
O processo de obtenção da nitensidina B foi realizado no Instituto de Química,
UNESP-IQ, Araraquara-SP. Uma exsicata da Pterogyne nitens (SP204319) encontra-se
depositada no Instituto Botânico, São Paulo – SP, Brasil. As linhagens foram cultivadas em
uma mistura 1:1 (v/v) DMEM e Ham’s F10 (Sigma Co., St. Louis, EUA) acrescido de
100U/mL de penicilina, 100µg/mL de estreptomicina, 0,25µg/mL de anfotericina B,
0,1mg/mL de kanamicina (Sigma) e 10 % de soro fetal bovino (Cultlab, Campinas, Brasil).
Para o tratamento das linhagens foram utilizadas diferentes concentrações da
nitensidina B, variando entre 7,5µM a 120,0µM, em tempo de tratamento 24 de horas. O
controle positivo foi realizado com a exposição a 90,0µM de doxorrubicina e para as células
controle de veículo foi utilizado dimetilsulfóxido (DMSO) a 1%. A Sulforrodamina B (SRB)
é um corante que se combina às proteínas, e quando fixado, é medido fotometricamente após
solubilização, correlacionado com a taxa de síntese protéica total e, em seguida, com a
proliferação celular (metodologia conforme o Kit sigma-aldrich S1402).
Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 7, 2015. Número especial.
As análises estatísticas foram realizadas com software GraphPad Prism® Versão 5.01
(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA), utilizando-se o teste oneway ANOVA com
pós-teste de Tukey (Tratados vs CV).
3 Resultados e Discussão
A citotoxicidade da nitensidina B sobre as células cervicais foi avaliada nas
concentrações: 7,5µM, 15µM, 30µM, 60,0µM e 120,0µM. As devidas quantidades do
composto foram solubilizadas em meio de cultura e aplicadas nas duas linhagens celulares
estudadas (SiHa e C-33A), por 24 horas, determinando o CI50 (concentração do composto
capaz de reduzir em 50% a viabilidade celular).
Figura 1 – Ensaio de citotoxicidade (Sulforrodamina B). Nitensidina B em linhagem celular
SiHa nas concentrações de 7,5µM, 15,0µM, 30,0µM, 60,0µM e 120,0µM em 24 horas
de tratamento. Os dados referem-se às médias de três experimentos independentes e
erro padrão (M ± EP). DOXORRUBICINA (controle positivo a 90µM) e DMSO
(controle de veículo a 1%). Oneway ANOVA com pós-teste de Tukey (Tratados vs
CV). %; * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001.
SiHa
% céls vivas
150
100
***
***
50
***
***
12
0,
0
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,0
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,0
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)
(1
%
M
D
D
O
XO
R
R
U
B
SO
IC
IN
A
0
Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 7, 2015. Número especial.
Em relação à linhagem celular SiHa (infectada pelo vírus HPV16) foi possível
observar um aumento da citotoxicidade em uma resposta concentração-dependente, de forma
que, nas concentrações de 30µM, 60,0µM e 120,0µM, a citotoxicidade apresentou-se
significantemente maior em relação ao controle de veículo (DMSO a 1%) e o CI50 foi de
40,98µM.
Figura 1 – Ensaio de citotoxicidade (Sulfarrodamina B). Nitensidina B em linhagem celular
C-33A nas concentrações de 7,5µM, 15,0µM, 30,0µM, 60,0µM e 120,0µM em 24
horas de tratamento. Os dados referem-se às médias de três experimentos
independentes e erro padrão (M ± EP). DOXORRUBICINA (controle positivo a
90µM) e DMSO (controle de veículo a 1%). Oneway ANOVA com pós-teste de
Tukey (Tratados vs CV). %; * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001.
C-33A
% de céls vivas
150
100
**
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%
M
D
D
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XO
R
R
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IC
IN
A
0
No estudo da linhagem C-33A (não infectada pelo vírus HPV16) foi possível observar
uma diminuição da citotoxicidade da nitensidina B, como demonstrado na figura 2. A
comparação com o resultado obtido para as células tratadas com DMSO 1% (controle de
veículo) demonstra que a significância estatística apresentou-se menor, uma vez que apenas
nas maiores concentrações testadas (60,0µM e 120,0µM) com o alcaloide estudado, houve um
número relevante de morte desta linhagem de células cervicais. A concentração inibitória de
50% das células (CI50) encontrada foi de 90,17µM.
Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 7, 2015. Número especial.
4 Conclusão
O alcaloide guanidínico nitensidina B, extraído de Pterogyne nitens, apresentou
citotoxicidade concentração-resposta nas linhagens de carcinoma cervical imortalizada pelo
HPV-16 (SiHa) e não imortalizada (C-33A).
Observou-se que a nitensidina B induziu citotoxicidade proporcionalmente ao
aumento da concentração nas duas linhagens celulares estudadas, sendo esta maior na
linhagem celular SiHa em relação a C-33A. Tal resultado sugere possível seletividade da
nitensidina B para as células infectadas por HPV 16, um dos principais tipos de vírus de alto
risco associados com lesões pré-cancerosas, sendo responsável por 90% dos casos de câncer
cervical no mundo (PSYRRI; DIMAIO, 2008).
Referências
ALMEIDA, V. L.; LEITÃO, A.; REINA, L. C. B.; MONTANARI, C. A.; DONNICI, C. L.;
LOPES, M.T.P. Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-celular específicos e ciclo-celular não
específicos que interagem com o DNA: uma introdução. Química Nova, v.28, n.1, p.118-129,
2005.
IARC, INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER. GLOBOCAN
2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012.
França. Disponível em: <http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx>. Acesso em:
13 Maio 2015.
INCA, INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA
SILVA. HPV e câncer - Perguntas mais frequentes. Rio de Janeiro. Disponível em:
<http://www1.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=2687#topo>. Acesso em: 13 Maio 2015.
NAKAGAWA, J.T.T.; SCHIRMER, J.; BARBIERI, M. Vírus HPV e câncer de colo de útero.
Revista Brasileira de Enfermagem, v.63, n.2, p.307-11, 2010.
PSYRRI, A.; DIMAIO, D. Human papillomavirus in cervical and head-and-neck cancer.
Nature Clinical Practice Oncology, v.1, n.5, p.24-31, 2008.
REGASINI, L.O.; FERNANDES, D.C.; CASTRO-GAMBOA, I.; SILVA, D.H.S.; FURLAN,
M.; BOLZANI, V.S.; BARREIRO, E.J.; CARDOSO-LOPES, E.M.; YOUNG, M.C.M.;
TORRES, L.B.; VELLOSA, J.C.R.; OLIVEIRA, O.M.M. Constituintes químicos das flores
de Pterogyne nitens (caesalpinioideae). Química Nova, v.31, n.4, p.802-806, 2008.
TUKEY, J. Comparing Individual Means in the Analysis of Variance. Biometrics, v.5, n.2,
p.99-114. 1949.
Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 7, 2015. Número especial.