Perguntas da Biologia do Desenvolvimento - ICB-USP

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
DEPTO. BIOLOGIA CELULAR E DO DESENVOLVIMENTO
“Biologia do Desenvolvimento: mecanismos celulares
e moleculares envolvidos na formação do ser”
TATIANE KANNO
MARAYSA MELO
Alfenas
Setembro- 2011
LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA MOLECULAR DE VERTEBRADOS
(Magritte, 1936)
A Biologia do Desenvolvimento integra de diferentes níveis da
biologia para a formação do ser
Modelos experimentais utilizados no Estudo
em Biologia do Desenvolvimento
“Camundongo”
“Mosca da fruta”
Drosophila melanogaster
“Galinha”
Gallus gallus
“Peixes”
Zebrafish
“Sapo”
Xenopus leavis
Galinha como modelo experimental
•Baixo Custo
•Facilidade de obtenção
•Maior parte do Desenvolvimento é Externo
•Permite microcirurgia e manipulação genética
•Embrião transparente nos estágios iniciais
•Desenvolvimento similar a humanos nos estágios iniciais
Como um organismo multicelular pode ser
formado a partir de um ovo?
Processo de desenvolvimento do animal
Perguntas da Biologia do Desenvolvimento
1. De onde as células vêm?
Para onde vão?
2. O que estas células podem
ser?
3. Quando elas decidem o que
vão ser?
4. Como ocorre esta decisão?
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia
do Desenvolvimento
Descrição
- Embriologia clássica
Visualização do
desenvolvimento
embrionário
- Mapa do destino
-Imunohistoquímica
- Hibridização in situ
Cirurgia
Ablação
Transplante
Cultura
Expressão
Expressão
diferencial de genes
determinam a
diferenciação
celular
Perguntas da Biologia do Desenvolvimento
1. De onde as células vêm?
Para onde vão?
2. O que estas células podem
ser?
3. Quando elas decidem o que
vão ser?
4. Como ocorre esta decisão?
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia
do Desenvolvimento
Descrição
- Embriologia clássica
Visualização do
desenvolvimento
embrionário
- Mapa do destino
-Imunohistoquímica
- Hibridização in situ
Cirurgia
Ablação
Transplante
Cultura
Expressão
Expressão
diferencial de genes
determinam a
diferenciação
celular
Descrição
Visualização do desenvolvimento embrionário
Descrição
Visualização do desenvolvimento embrionário
Gilbert 8th Edition
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia
do Desenvolvimento
Descrição
- Embriologia clássica
Visualização do
desenvolvimento
embrionário
- Mapa do destino
-Imunohistoquímica
- Hibridização in situ
Cirurgia
Ablação
Transplante
Cultura
Expressão
Expressão
diferencial de genes
determinam a
diferenciação
celular
Como seguir uma célula entre várias?
A injeção de corante flourescente permite acompanhar o destino celular
Gilbert 8th Edition
A injeção de corante flourescente permite acompanhar o destino celular
Células da crista neural
Células da crista neural estão adjacentes a placa neural
Neurulação
Crista neural dá origem aos Gânglios de Raiz Dorsal
c
Crista neural
Tubo
Neural
Notocorda
Células migratórias
c
Epiderme
GRD
Crista
neural
Células da crista
neural
Nature Reviews Neuroscience 8, 114-127, 2007
V
Epiderme
Neuroectoderme
D
Os Gânglios da Raiz Dorsal ficam dispostos ao longo da coluna vertebral
Gânglios de Raiz Dorsal (GRD)
Medula
D
GRD
D
V
TN
V
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia
do Desenvolvimento
Descrição
- Embriologia clássica
Visualização do
desenvolvimento
embrionário
- Mapa do destino
-Imunohistoquímica
- Hibridização in situ
Cirurgia
Ablação
Transplante
Cultura
Expressão
Expressão
diferencial de genes
determinam a
diferenciação
celular
Imunohistoquímica: localização da proteína
Fluoróforo
(conjugado ao Ac secundário)
Anticorpo Secundário
(reconhece o Ac primário)
Anticorpo Primário
(reconhece o epítopo)
PROTEÍNA
Epítopo
(Sítio de ligação específico da proteína – reconhecido pelo Anticorpo)
Pergunta:
A proteína Miosina Va é expressa no
desenvolvimento do sistema nervoso?
Expressão de Miosina Va no desenvolvimento do Sistema nervoso
Tubo Neural – Futura Medula
Gânglio da Raiz
Dorsal
Armazena neurônios
sensoriais
Gânglio da Raiz Dorsal
Pergunta:
A proteína Miosina Va é expressa no
desenvolvimento do sistema nervoso?
Miosina Va é expressa no tubo neural e
no gânglio da raiz dorsal
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia
do Desenvolvimento
Descrição
- Embriologia clássica
Visualização do
desenvolvimento
embrionário
- Mapa do destino
-Imunohistoquímica
- Hibridização in situ
Cirurgia
Ablação
Transplante
Cultura
Expressão
Expressão
diferencial de genes
determinam a
diferenciação
celular
Hibridação in situ: localização do RNAm
Hibridação in situ para cScratch2 em embrião de
galinha
D
V
Dados Felipe Vieceli
Perguntas da Biologia do Desenvolvimento
1. De onde as células vêm?
Para onde vão?
2. O que estas células podem
ser?
3. Quando elas decidem o que
vão ser?
4. Como ocorre esta decisão?
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia
do Desenvolvimento
Descrição
- Embriologia clássica
Visualização do
desenvolvimento
embrionário
- Mapa do destino
-Imunohistoquímica
- Hibridização in situ
Cirurgia
Ablação
Transplante
Cultura
Expressão
Expressão
diferencial de genes
determinam a
diferenciação
celular
O transplante de vesícula óptica para o ectoderma do tronco em
anfíbios gera cristalino ectópicos:
O ectoderma do tronco tem potencial de formar cristalino
doador
aceptor
Transplantes de crista neural de codorna para galinha
mostraram quais são os derivados de cada porção da crista
Perguntas da Biologia do Desenvolvimento
1. De onde as células vêm?
Para onde vão?
2. O que estas células podem
ser?
3. Quando elas decidem o que
vão ser?
4. Como ocorre esta decisão?
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia
do Desenvolvimento
Descrição
- Embriologia clássica
Visualização do
desenvolvimento
embrionário
- Mapa do destino
-Imunohistoquímica
- Hibridização in situ
Cirurgia
Ablação
Transplante
Cultura
Expressão
Expressão
diferencial de genes
determinam a
diferenciação
celular
uper Expressão Gênica!!!!
•Microinjeção de RNA
•Eletroporação
•Infecção
•Transgênese
Microinjeção de RNA
uper Expressão Gênica!!!!
•Microinjeção de RNA
•Eletroporação
•Infecção
•Transgênese
Superexpressão de genes através de Eletroporação in ovo
Develop. Growth Differ. 1999 41, 335–344
-
+
DNA
GRD
Embrião 48 h pós-eletroporação expressando GFP na região truncal
HH19
Imunohistoquímica para detecção do GFP em
criocorte retirado da região truncal de
embrião HH25
Em Resumo...
•
Origem embrionária das células
•
Destino final das células durante o
desenvolvimento
•
Potencial de diferenciação celular
•
Período no qual ocorre a
determinação do que as células
irão originar
•
Quais os fatores moleculares que
influenciam a diferenciação destas
células
Vias de sinalização em desenvolvimento
1. De onde as células vêm? PARA
ONDE vão?
2. O que estas células PODEM ser?
3. QUANDO elas decidem o que vão
ser?
4. COMO ocorre esta decisão?
NIH Stem Cell Progress Report 2001
Existem várias modalidades de comunicação intercelular:
Por contato
direto
Por difusão de
proteínas
extracelulares
Por matriz
extracelular
•FGF (Fibroblast Growth Factor)
•Wnt
•BMP (Bone Morphogenic Protein)
•Ácido Retinóico
•Shh (Sonic Hedgehog)
1. SHH se liga ao
receptor
transmembrana
PTCH,
2. inicia-se a sinalização
celular que ativa os
fatores de transcrição
GLI
O Shh é produzido na notocorda, tubo digestório e broto do membro
Na região da medula espinhal, os motoneurônios ficam
próximos da NOTOCORDA.
SERÁ QUE A
NOTOCORDA
DETERMINA ONDE
SERÃO FORMADOS
OS
MOTONEURôNIOS?
Comprovação: Transplante de notocorda
na região lateral induz motoneurônios
TRANSPLANTE DE
NOTOCORDA
Moto
neurônios
NOTOCORDA
NOTOCORDA
51
COMO que a
notocorda determina
onde serão formados
os motoneurônios?
52
COMO que a notocorda determina onde
serão formados os motoneurônios?
a)
b)
c)
d)
Proteína nuclear?
Proteína citoplasmática?
Proteína de membrana?
Proteína secretada?
53
COMO que a notocorda determina onde
serão formados os motoneurônios?
a)
b)
c)
d)
Proteína nuclear?
Proteína citoplasmática?
Proteína de membrana?
Proteína secretada?
54
O Shh é produzido na notocorda, tubo digestório e broto do membro
Camudongos com deleção para o gene Shh carecem de
motoneurônios no tubo neural
Mutante
Detecção de
motoneurônio
Normal
Nature 412, 194198 (12 July 2001)
56
Na região da medula espinhal, a notocorda direciona a
diferenciação de motoneurônios através do Shh
1. O SHH (sonic
hedgehog) precisa da
adição de colesterol
2. Quando SHH se liga
ao receptor
transmembrana
PTCH, inicia-se a
sinalização celular que
ativa os fatores de
transcrição GLI
Efeito teratogênico de inibidores da via metabólica do colesterol
Ciclopia
Camudongos com deleção para o gene Shh carecem de
motoneurônios E TEM DEFEITOS NA CABEÇA
Normal
Mutante
Detecção de
motoneurônio
Isto era
para ser
uma
cabeça!
Nature 412, 194-198 (12 July 2001)
A interação de Shh, secretado pela notocorda, com
receptores das células no tubo neural induz a expressão
de genes relacionados a diferenciação de
motoneurônios no tubo neural.
61
O Shh é produzido na notocorda, tubo digestório e broto do membro
desenvolvimento do membro
O broto do membro é composto de ectoderma e mesoderma
A
B
C
D
Em aves e mamíferos existe um espessamento distal da
ectoderme do broto do membro: a PREGA ECTODÉRMICA
APICAL (AER)
As fases desenvolvimento do broto do membro :
1. Definição do
campo do
membro
2. Crescimento
do broto
3. Definição dos
eixos
As fases desenvolvimento do broto do membro :
1. Definição do
campo do
membro
2. Crescimento
do broto
3. Definição dos
eixos
O membro tem 3 eixos:
1)antero-posterior = dedão- mindinho
2)Dorso-ventral = costas-palma
3)Proximo-distal= ombro-mão
Eixo Antero-posterior
(ordem dos dígitos)
Existe uma região no broto de membro que é responsável pela
definição do eixo Antero-Posterior: a Zona Polarizadora
Duplicação da Zona Polarizadora por transplante resulta em
duplicação especular dos dígitos
Duplicação da Zona Polarizadora por transplante resulta em
duplicação especular dos dígitos
4 3 2
4 3 2 23 4
Concentrações altas de
X induzem a formação de
dígitos mais posteriores
Que tipo de molécula é X?
O Shh (Sonic Hedgehog) é expresso na Zona Polarizadora
Shh: Proteína secretada no meio extracelular
O Shh (Sonic Hedgehog) é expresso na Zona Polarizadora
Shh: Proteína secretada no meio extracelular
O Shh (Sonic Hedgehog) é expresso na Zona Polarizadora de
TODOS os membros
O Shh (Sonic Hedgehog) é expresso na Zona Polarizadora de
TODOS os membros
Shh: Proteína secretada no meio extracelular
SERÁ QUE O SHH É RESPONSÁVEL
PELA ATIVIDADE DA ZONA
POLARIZADORA??
OU SEJA, SERÁ QUE O SHH DETERMINA
A ORDEM DOS DÍGITOS?
A implantação de vírus que
secretam Shh no primórdio do
membro tem o mesmo efeito que o
transplante da região polarizadora
Sonic Hedgehog
Cartiagem
A superexpressão de Shh nos membros causa polidactilia
Maas e Falon, 2005
Dedos adicionais
SERÁ QUE O SHH É RESPONSÁVEL
PELA ATIVIDADE DA ZONA
POLARIZADORA??
OU SEJA, SERÁ QUE O SHH DETERMINA
A ORDEM DOS DÍGITOS?
Sim!
Concentrações altas de
X induzem a formação de
dígitos mais posteriores
Que tipo de molécula é X?
O Shh é transcrito e traduzido pela Zona
Polarizadora e secretado no meio
extracelular
Altas concentração de Shh = posterior= dedo
mindinho
Baixas concentração de Shh= anterior=
polegar
Síndromes = Efeito Eddie Murphy
Eixo Proximo-distal
(braço, antebraço e mão)
Proximo
Distal
Na sequência próximo-distal, o membro é subdivido em:
Estilópodo -> Zeugópodo -> Autópodo
O esqueleto do membro
desenvolve-se no sentido
proximo-distal, i.e. estruturas
mais proximais surgem
primeiro.
A prega ectodérmica apical (AER) define o crescimento do membro
Em aves e mamíferos existe um espessamento distal da
ectoderme do broto do membro: a PREGA ECTODÉRMICA
APICAL (AER)
prega
ectodérmica
apical (AER)
O FGF8 é expresso na prega ectodérmica apical
FGF: Proteína extracelular secretada
•FGF (Fibroblast Growth Factor)
•Wnt
•BMP (Bone Morphogenic Protein)
•Ácido Retinóico
•Shh (Sonic Hedgehog)
Hipótese:
O FGF8 no Prega Ectodérmica Apical é
responsável pelo crescimento do broto do
membro.
A ausência da prega ectodérmica apical (AER) pode ser
compensada por FGF8
Hipótese:
O FGF8 no Prega Ectodérmica Apical é
responsável pelo crescimento do broto do
membro.
ENTÃO….
Se não tiver FGF8 não tem membro??!!
Camudongos mutantes com deleção genômica
para FGF8 são normais !!!!
E AGORA?????
Jogo a hipótese no lixo?
Boulet et al, 2004
Existem outros FGFs
além de FGF 8,
i.e. os ligantes FGF
constituem uma
grande família
R&D systems
Camundogos com deleção genômica para FGF8 E FGF4
não apresentam membros
Normal
Fgf8-/Fgf4-/-
Camundogos com deleção genômica para FGF8 E FGF4
não apresentam membros
Normal
Fgf8-/-
Fgf4-/-
Boulet et al, 2004
OU seja, o FGF 4 pode agir como “estepe” do
FGF8 quando este está ausente
FGF4
FGF8
Isto também quer dizer que normalmente, tanto
FGF8 quanto FGF4 cooperam para que o plano
final se concretize
RESUMINDO…
Uma única via de sinalização está presente em vários
momentos e locais da embriogênese.
A mesma via de sinalização tem vários
membros da família que agem normalmente
em conjunto e podem compensar pela
ausência de um membro.
FGF4
FGF8
Redundância de sinalização é importante!
Cinto e suspensórios
Modificado de S. Gilbert
•FGF (Fibroblast Growth Factor)
•Wnt
•BMP (Bone Morphogenic Protein)
•Ácido Retinóico
•Shh (Sonic Hedgehog)
LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA MOLECULAR DE VERTEBRADOS
Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento – ICB-USP
Edgar Ruiz
Felipe Vieceli
Maraysa Melo
Tatiane Kanno
José Antonio Turri
Orientadora: Profa. Dra. Irene Yan
http://www.biocel.icb.usp.br/~ireneyan/index.html
OBRIGADA!
[email protected]
[email protected]
AULA PRÁTICA
Aula Prática Biologia do Desenvolvimento in silico
Universidade Federal de Alfenas – UNIFAL/MG
Maraysa Melo e Tatiane Kanno
Modelos animais:
•Embrião de galinha (Gallus gallus)
•Embrião de camundongo (Mus musculus)
•Embrião de sapo (Xenopus Laevis)
•Embrião de peixe paulistinha (Danio rerio)
Sites:
http://geisha.arizona.edu/geisha/
http://www.emouseatlas.org/emap/home.html
http://www.xenbase.org/common/
http://zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-ZDB_home.apg
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
Gene: Pax6
Pax6 comanda o desenvolvimento ocular:
A expressão de Pax6 em patas cria olhos ectópicos em moscas
Drosophila melanogaster
Superexpressão de Pax6 forma de olhos extras em anfíbios
Normal
Visão dorsal
Mutante com mais
Pax6
Visão dorsal
Xenopus laevis
Embriões de Cefalópodos expressam Pax6 no olho
Planárias transgênicas demonstram a presença de Pax6 nos olhos
O peixe-cego das cavernas mexicanas
Astyanax fasciatus mexicanus