AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE Rubus imperialis Cham. Schl. (Rosaceae) em modelos experimentais in vivo PRISCILA ELIZABET BERTÉ Itajaí, 2013 UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS PRISCILA ELIZABET BERTÉ AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE Rubus imperialis Cham. Schl. (Rosaceae) em modelos experimentais in vivo Dissertação submetida ao Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, da Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade Co-orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero Itajaí, março de 2013 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE Rubus imperialis Cham. Schl. (Rosaceae) em modelos experimentais in vivo PRISCILA ELIZABET BERTÉ ‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’ ____________________________________ Sérgio Faloni de Andrade, Doutor Orientador __________________________________________________________ Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores: ______________________________________ Dr. Sérgio Faloni de Andrade (PMCF - UNIVALI) Presidente ______________________________________ Dr. Rivaldo Niero (PMCF - UNIVALI) Co-orientador ______________________________________ Dra. Márcia Maria de Souza. (PMCF - UNIVALI) Membro Interno ______________________________________ Dra. Angélica Garcia Couto (PMCF - UNIVALI) Membro Interno ____________________________________ Dra. Claudriana Locatelli (UNOESC) Membro Externo Agradecimentos Primeiramente quero agradecer ao Universo, e todas as coisas existentes nele, para que possamos progredir e assim realizar determinados sonhos em nossa vida. Acredito que uma força maior nos rege e nos impulsiona a atingir nossos objetivos. Posteriormente temos dentro de nós essa vontade, força e entusiasmo para ir atrás e realizar. Agradeço a minha família, pelo apoio emocional e financeiro, pela força, pelas palavras de entusiasmo, por demonstrações de amor, carinho. A minha mãe Ilda, sempre estava ali, na alegria, na tristeza, na saudade, me apoiando, me dizendo para nunca desistir, obrigada mãe, foi super essencial essa força e carinho, eu te amo muito. Agradeço ao meu pai Leonir por tudo que eu conquistei até hoje, pois sempre me incentivou a estudar, e me apoiou sempre nas decisões, obrigada Pai, do fundo do meu coração, agradeço por ter pais tão especiais, eu amo vocês. Agradeço ao meu tio Claudio, que sempre foi fonte de inspiração pra mim, como também realizou um mestrado, sempre me proporcionou suas palavras de apoio, e sempre me incentivou a estudar muito. Ao meu professor orientador Sérgio Faloni de Andrade, que me proporcionou a oportunidade de realizar a minha pesquisa com modelo de úlcera gástrica, além de orientador foi um grande amigo nessa caminhada, pois muitas vezes me ouviu com a maior atenção e carinho, obrigada Sérgio. Ao meu co-orientador Rivaldo Niero, pelos ensinamentos, colaboração para que minha pesquisa fosse realizada. Aos Docentes do Programa do Mestrado em Ciências Farmacêuticas pelos ensinamentos e também a Coordenadora professora Tânia Mari Bellé Bresolin, pelas palavras e paciência que teve comigo em determinados momentos. Ao Jhony da Silva Lopes, o qual preparou o extrato e as frações da Rubus imperislis e a purificação dos compostos isolados utilizados no presente trabalho, obrigada Jhony. A minha prima irmã Maira, a qual dividiu apartamento comigo por quatro anos, e em período de mestrado também morou comigo. Sempre me escutou e compartilhou momentos, agradeço pela sua paciência, por me ouvir, por me estender a mão quando eu precisei, muito obrigada Maira. A minha amiga Francielle Zanatta, a qual conheci na prova eliminatória do mestrado, e ali já começou uma grande afinidade, Fran muito obrigada por tudo, pelos momentos, pelas disciplinas que realizamos juntas, pelos experimentos nos quais você me ajudou, pela sua amizade, carinho, risadas, ensinamentos e palavras, te adoro lindona. A meu amigo Antônio Luis Fermino, pelas conversas, pelo apoio, pela amizade. A minha amiga e professora Sandra Soares de Melo, a qual foi minha orientadora em minha caminhada na iniciação científica da graduação de Nutrição, que além de professora e Doutora sempre foi uma grande amiga com suas palavras, ensinamentos e carinho, muito obrigada Prof. Sandra. Agradecer as colegas de laboratório, Marta, Jady e Ana Paula, pela ajuda nos experimentos, sem a ajuda de vocês não teria sido a mesma coisa, obrigada de coração. Agradecer aos funcionários do laboratório de farmacologia “in vivo” que de uma forma ou de outra me auxiliaram, especialmente a Claudia e a Maria Angélica. A todos os amigos que me ajudaram de forma direta ou indireta com a minha caminhada, com muito carinho e companheirismo, muito obrigada! AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE Rubus imperialis Cham. Schl. (Rosaceae) em modelos experimentais in vivo PRISCILA ELIZABET BERTÉ Março/2013 Orientador: Sérgio Faloni de Andrade, Doutor. Co-orientador: Rivaldo Niero, Doutor. Área de concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas. Resumo: A úlcera gástrica (UG) é uma doença heterogênea, com múltiplos fatores envolvidos na sua gênese. O uso abusivo de álcool, de antiinflamatórios não esteroidais (AINEs), o estresse, a hereditariedade, o tabagismo e a infecção por Helicobacter pylori, têm sido considerados os principais fatores de risco, responsáveis por lesões na mucosa gástrica. Algumas classes de compostos de origem natural como terpenos, triterpenos, flavonóides, taninos, alcalóides, glicosídeos e saponinas, são conhecidas por apresentarem atividade gastroprotetora. Rubus imperialis Cham. Schl (amora branca) apresenta em sua composição terpenos e outros compostos com atividade anti-úlcera. O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade gastroprotetora obtidas das partes aéreas do Extrato metanólico bruto de R. imperialis (ExtMB) e das frações: hexano, clorofórmio e acetato de etila, tendo em vista os relevantes resultados fitoquímicos e farmacológicos realizados anteriormente em nossos laboratórios. Para determinação da atividade gastroprotetora foram empregados os ensaios de: úlcera induzida por etanol, por anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), ácido acético, ligadura de piloro (pH, volume e acidez total), dosagem de muco e avaliação da participação do óxido nítrico sintase (L-NAME) e grupamentos sulfidrila (NEM). Para a avaliação do ExtMB foram utilizados ratos wistar (pesando entre 150-200g) e para as frações e substâncias isoladas foram utilizados camundongos swiss (pesando entre 25-30g), provenientes do Biotério Central da UNIVALI. No modelo de etanol utilizando tratamento com ExtMB (100, 250, 500 mg/kg) o índice de cura obtido foi de 55,56%, 63,49%, 78,14% respectivamente, e o fármaco omeprazol (30 mg/kg) foi de 86,62%. Quando utilizado as frações: acetato de etila, hexano e clorofórmio (250 mg/kg) o índice de cura obtido foi de 86,47%, 81,2%, 85,63%, respectivamente, o do omeprazol (30 mg/kg) foi 92,12%. No modelo de AINEs, o índice de cura obtido foi 49,50%, 48,43% e 59,99% utilizando-se ExtMB nas doses de 100, 250 e 500 mg/kg, o índice de cura da cimetidina (100 mg/kg) foi de 55,89%. As frações acetato de etila, hexano e clorofórmio apresentaram índice de cura de 31,67%, 47,68% e 61,44% respectivamente, e a cimetidina 87,75%. No modelo de ácido acético o índice de cura do ExtMB (500mg) foi de 65,75% e do fármaco cimetidina (100 mg/kg) foi 75,55 %. O ExtMB e as frações utilizadas se mostraram efetivas em aumentar pH e diminuir acidez total quando comparado ao controle negativo. De acordo com os resultados obtidos o efeito gastroprotetor não inclui a participação do muco, porém é dependente da participação do óxido nítrico e dos compostos sulfidrílicos. Os estudos fitoquímicos levaram ao isolamento das substâncias Niga-ichigosídeo F1 e Ácido 2β, 3β, 19α-triidróxiursólico (RI5-20), essas substâncias demonstraram resultados estatisticamente significativos para todos os parâmetros analisados em úlceras induzidas por etanol. De acordo com resultados, o extrato bruto de R. imperialis e as frações são capazes de promover gastroproteção, este efeito parece envolver diminuição da acidez gástrica, participação do óxido nítrico e compostos sulfidrílicos. Os resultados em conjunto sugerem que R. imperilalis apresenta potencial terapêutico gastroprotetor. Palavras-chave: Ação gastroprotetora, Úlcera, Rubus imperialis Cham. Schl. ABSTRACT Gastric ulcer (GU) is a heterogeneous disease with multiple factors involved in its genesis. Alcohol abuse, nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), stress, heredity, smoking and Helicobacter pylori infection are considered the major risk factors responsible for gastric mucosa injury. Some classes of natural compounds, such as terpenes, triterpenes, flavonoids, tannins, alkaloids, saponins and glycosides, are known to have gastroprotective activity. Rubus imperialis Cham. Schl (yellow raspberry) has terpenes and other compounds with anti-ulcer activity in its composition. The present study evaluates the gastroprotective activity obtained from the aerial parts of crude methanol extract of R. imperialis (ExtMB) and the fractions: hexane, chloroform and ethyl acetate, in view of the relevant pharmacological and phytochemicals results obtained previously in our laboratories. To determine the gastroprotective activity, the following assays were used: ethanol-induced ulcer, by nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), acetic acid, pylorus ligature (pH, volume and total acidity), determination of mucus, and evaluation of the participation of oxide synthase (L-NAME) and sulfhydryl group (NEM). For the evaluation of ExtMB Wistar rats were used (weighing 150-200g) and for fractions and isolated compounds, Swiss mice were used (weighing between 25-30g) from the Central animal house of UNIVALI. In the model of ethanol using ExtMB treatment (100, 250, 500 mg / kg) the cure rates obtained were 55.56%, 63.49%, 78.14% respectively, while that obtained for the drug omeprazole (30 mg/kg) was 86.62%. When the fractions ethyl acetate, hexane and chloroform (250 mg/kg) were used, the cure rates obtained were 86.47%, 81.2%, 85.63% respectively, while that obtained with omeprazol (30 mg/kg) was 92.12%. In the NSAIDs model, the cure rates obtained were 49.50%, 48.43% and 59.99% using ExtMB at doses of 100, 250 and 500 mg/kg, the cure rate obtained with cimetidine (100 mg/kg) was 55.89%. The fractions ethyl acetate, hexane and chloroform showed cure rates of 31.67%, 47.68% and 61.44% respectively, and cimetidine presented a cure rate of 87.75%. In the model of acetic acid the cure rate of ExtMB (500mg) was 65.75% and the drug cimetidine (100 mg/-kg) was 75.55%. The ExtMB and fractions used have proven to be effective in increasing pH and decreasing total acidity when compared to the negative control. According with the results obtained, the gastroprotective effect does not include the contribution of the mucus, but is dependent on the role of nitric oxide and sulfhydryl compounds. Phytochemical studies led to the isolation of substances Niga-ichigoside F1 and Acid 2β, 3β, 19α-triidroxiursolic (RI5-20). These substances showed statistically significant results for all the parameters analyzed in ethanolinduced ulcers. According to the results, the crude extract of R. imperialis and fractions are able to promote gastroprotection. This effect appears to involve reduction of gastric acidity, participation of nitric oxide and sulfhydryl compounds. Together, the results suggest that R. imperilalis has therapeutic gastroprotective potential. Keywords: Gastroprotective activity, Ulcer, Rubus imperialis Cham. Schl. LISTA DE FIGURAS Figura 1 Partes aéreas, flores e frutos de Rubus imperialis......................................24 Figura 2 Fitoconstituintes presentes na Rubus imperialis.........................................24 Figura 3 Representação esquemática do mecanismo de secreção de ácido pelo estômago.............................................................................................27 Figura 4 Fluxograma resumido da preparação e obtenção das frações...................34 Figura 5 Índice de cura do extrato metanólico bruto de R. imperialis e omeprazol em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais..............................................43 Figura 6 Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol em ratos.........43 Figura 7 Índice de cura das frações FAE, FH, FCHCl3 e omeprazol em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais................................................................................................44 Figura 8 Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol em camundongos.............................................................................................................45 Figura 9 Índice cura do extrato metanólico bruto de R. Imperialis e cimetidina em lesões induzidas por indometacina. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais...................................................................47 Figura 10 Imagens de estômagos após indução de úlcera por indometacina em ratos, utilizando tratamento com extrato metanólico bruto de R. imperialis em diferentes concentrações e o fármaco cimetidina.....................................................48 Figura 11- Índice de cura das frações FAE, FH, FCHCl3 e cimetidina em lesões induzidas por indometacina. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais.....................................................................................49 Figura 12. Imagens de estômagos após indução de úlcera por indometacina em camundongos, utilizando tratamento com as diferentes frações e fármaco cimetidina...................................................................................................................49 Figura 13 - Índice de cura do extrato Metanólico Bruto de R. imperialis e cimetidina em lesões induzidas por ácido acético em ratos. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM)..................................................................................52 Figura 14 – Efeito do Extrato Metanólico bruto de R. imperialis (500 mg/kg) e carbenoxolona (200 mg/kg) em lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com L-NAME. Resultados expressos em Média ± EPM de seis ratos. Estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando comparados com o grupo controle, ##p<0.01 quando comparado ao grupo LNAME.........................................................................................................................58 Figura 15 – Efeitos do ExtMB de R. imperialis (500 mg/kg) e carbenoxolona (200 mg/kg) em lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com NEM. Resultados são Média ± EPM de seis ratos. Estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando comparados com o grupo controle, # #p<0.01 quando comparado ao grupo NEM............................................................................59 Figura 16. Índice de cura das substâncias isoladas: Niga-ichigosídeo e RI5-20 (30 mg/kg) e do omeprazol (30 mg/kg) em lesões induzidas por etanol em camundongos. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais................................................................................................................61 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico bruto das partes aéreas de Rubus imperialis Cham. Schl (100, 250 e 500 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em ratos......................................................................................................................42 Tabela 2 Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes frações do extrato metanólico de R. imperialis (hexano, clorofórmio e acetato de etila, na dose de 250 mg/kg) em úlceras gástricas induzidas por etanol/HCl em camundongos.............................................................................................................44 Tabela 3 Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico bruto das partes aéreas de Rubus imperialis (100, 250 e 500 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina em ratos...........................................................................................................................47 Tabela 4 Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes frações: acetato de etila, hexano e clorofórmio, na dose de 250 mg/kg, em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina em camundongos..............................48 Tabela 5 Efeito do extrato metanolico bruto de R. imperialis e cimetidina no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético em ratos...............................................51 Tabela 6 Efeito do extrato metanólico bruto de R. imperialis nas diferentes doses (100, 250 e 500 mg) e cimetidina, administrados intraduodenal, avaliando os parâmetros obtidos no suco gástrico, através de ligadura de piloro em ratos...........53 Tabela 7 Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes frações: acetato de etila, hexano e clorofórmio na dose de 250 mg/kg nos parâmetros bioquímicos obtidos no suco gástrico de camundongos submetidos a ligadura de piloro........................................................................................................54 Tabela 8 Efeitos das diferentes doses do extrato metanólico de R. imperialis e carbenoxolona na dosagem de muco em mucosa gástrica.......................................55 Tabela 9 Efeitos das frações (acetato de etila, hexano e clorofórmio) de R. imperialis e carbenoxolona na dosagem de muco em mucosa gástrica....................................56 Tabela 10 Efeito da administração oral de omeprazol (30mg/kg) e das substâncias isoladas: Niga-ichigosídeo F1 e RI5-20 em úlceras gástricas induzidas por etanol/HCl em camundongos.............................................................................................................61 LISTA DE ABREVIATURAS AIDS - Síndrome da imunodeficiência Adquirida AINEs – Anti-inflamatórios não esteroidais AMPc- AMP cíclico ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária ExtMB – Extrato Metanólico Bruto FAE- Fração Acetato de Etila FH – Fração Hexânica FCHCl3 - Fração Clorofórmio GSH – Glutationa reduzida HCO3 - Bicarbonato de sódio HCl - Ácido clorídrico H2-Ras – Antagonistas de receptores de histamina-2 H. pylori – Helicobacter pylori IBP- Inibidores da bomba de prótons IC – Índice de Cura I.P- Intraperitoneal L-NAME – Ng-Nitro-Arginina-Metil Ester NEM – N-etilmaleimida NIGA- Niga-ichigosídeo NO – Óxido nítrico NOS – Óxido nítrico-sintase OMS – Organização Mundial da Saúde PG- Prostaglandinas RI5-20- Ácido 2 β, 3 β, 19α-triidróxiursólico SUS – Sistema Único de Saúde SH- Compostos sulfidrílicos TGI – Trato Gastrointestinal UG- Úlcera Gástrica ULI – Índice de Lesões Ulcerativas V.O – Via oral 13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 17 2.1 OBJETIVO GERAL:............................................................................................ 17 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:.............................................................................. 17 3 EMBASAMENTO TEÓRICO.................................................................................. 18 3.1 IMPORTÂNCIA DAS PLANTAS MEDICINAIS ................................................... 18 3.2 FAMÍLIA ROSACEAE......................................................................................... 21 3.3 GÊNERO RUBUS ............................................................................................... 21 3.4 DA PLANTA EM ESTUDO: RUBUS IMPERIALIS ............................................. 23 3.5 FISIOPATOLOGIA DA ÚLCERA E TERAPIA ANTIÚLCERA ........................... 26 3.5.1 SECREÇÃO GÁSTRICA ................................................................................. 26 3.5.2 SECREÇÃO DE MUCO ................................................................................... 28 3.5.3 ÚLCERA E AINES ........................................................................................... 28 3.5.4 ÚLCERA E HELICOBACTER PILORY ........................................................... 30 3.5.5 TRATAMENTO DA ÚLCERA GÁSTRICA....................................................... 31 4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 33 4.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL ............................................................ 33 4.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO E DAS FRAÇÕES ............................................ 33 4.2.1 OBTENÇÃO DOS COMPOSTOS: ................................................................... 34 4.3 ANIMAIS E ENSAIOS FARMACOLÓGICOS ..................................................... 35 4.3.1 ANIMAIS .......................................................................................................... 35 4.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIÚLCERA .................................................... 36 4.4.1 MODELO DE ÚLCERA INDUZIDA POR ETANOL ......................................... 36 4.4.2 ÚLCERA AGUDA INDUZIDA POR ANTI-INFLAMATÓRIO NÃO ESTEROIDAL ........................................................................................................... 37 4.4.3 MODELO DE ÚLCERA CRÔNICA INDUZIDA POR ÁCIDO ACÉTICO .......... 38 4.5 MECANISMOS DE AÇÃO ANTIÚLCERA .......................................................... 38 4.5.1 AVALIAÇÕES DA SECREÇÃO GÁSTRICA E MUCO.................................... 38 4.5.2 LIGADURA DE PILORO .................................................................................. 38 4.5.3 DOSEAMENTO DE MUCO EM MUCOSA GÁSTRICA ................................... 39 14 4.6 PARTICIPAÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO ENDÓGENO ENVOLVIDO NA GASTROPROTEÇÃO ............................................................................................... 40 4.6.1 PARTICIPAÇÃO DOS GRUPAMENTOS SULFIDRILA ENDÓGENOS SOBRE O EFEITO GASTROPROTETOR ............................................................................. 40 4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................... 41 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 42 6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 63 7 PERSPECTIVAS DO TRABALHO ........................................................................ 64 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 65 ANEXO A – PARECER DE APROVAÇÃO DO PROJETO DE PESQUISA PELO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA (CEP) DA UNIVALI ........................................ 76 APÊNDICE- ARTIGO CIENTÍFICO SUBMETIDO E ACEITO PARA A REVISTA NAUNYN-SCHMIEDEBERG'S ARCH PHARMACOL .............................................. 79 15 1 INTRODUÇÃO A úlcera gástrica (UG) é uma patologia que acomete considerável número de pessoas no mundo. O uso abusivo de álcool, antiinflamatórios não esteroidais (AINEs), o estresse, a hereditariedade, o tabagismo e a infecção por Helicobacter pylori têm sido considerados os principais fatores de risco responsáveis pela lesão da mucosa gástrica (MALFERTHEINER et al., 2007.; BABU et al., 2010). A úlcera é uma doença heterogênea muito comum em indivíduos adultos. Patologicamente consiste em uma perda de tecido da superfície interna do trato digestivo que pode alcançar em maior profundidade à submucosa (SONNENBERG, 2006.; SOLL; GRAHAM, 2009). Tem sido reportado que a predisposição hereditária está relacionada com aparecimento da UG, em alguns pacientes. O estresse emocional e os fatores psicossociais também são freqüentemente identificadas como importantes contribuintes para a patogênese da úlcera (ROSENSTOCK et al., 2003). Embora a incidência de úlcera em países ocidentais tenha diminuído ao longo dos últimos 100 anos, cerca de 1 a cada 10 indivíduos ainda são afetados. Como a prevalência da úlcera aumenta com o avanço da idade, é esperado que a doença continuará a ter impacto significativo sobre a saúde, economia e qualidade de vida dos pacientes (RAMAKRISHNAN; SALINAS, 2007). Entre as principais classes químicas de componentes bioativos, com atividade gastroprotetora são os alcalóides, saponinas, xantonas, terpenos, triterpenos, taninos, flavonóides, compostos fenólicos, glicosídeos e polissacarídeos. (BAGGIO et al., 2005; MORIKAWA et al., 2006; VASCONCELOS et al., 2010). Os compostos fenólicos apresentam ampla gama de atividades fisiológicas que incluem propriedades antioxidantes, antimicrobianas, antiinflamatórias, dentre muitas outras (MANACH; MAZUR; SCALBERT, 2005.; HALLIWELL, 2007). Rubus imperialis pertencente à família Rosaceae, apresenta em sua composição alguns terpenos e derivados do ácido elágico e o principal componente ativo identificado na planta foi o triterpeno Nigaichigosideo F1 (NIERO et al.,1999). Algumas substâncias de origem vegetal, entre elas flavonóides, taninos e terpenóides, têm apresentado atividade antiúlcera significativa, demonstrando o 16 potencial das plantas medicinais como fontes alternativas para o tratamento de úlceras gástricas (DONANTINI et al., 2009). Dessa forma ressalta-se a importância da busca por novos fármacos mais eficazes e que apresentam menos efeitos indesejáveis para o tratamento dessa patologia. Nesse contexto, as plantas medicinais e os produtos naturais ganham grande importância, já que muitos extratos e/ou compostos isolados das mesmas, têm apresentado resultados terapêuticos para o tratamento/prevenção de úlceras gástricas (SANNOMIYA et al., 2005). Diante do exposto o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade gastroprotetora das partes aéreas do extrato metanólico e das frações: acetato de etila, hexânica e clorofórmio de Rubus imperialis Cham. Schl. (Rosaceae), conhecida como Amora branca, em diferentes modelos animais, tendo em vista os relevantes resultados fitoquímicos e farmacológicos realizados anteriormente em nossos laboratórios. Também duas substâncias isoladas da planta (Niga-ishigosideo-F1 e Ácido 2β, 3β, 19α-triidróxiursólico) foram testadas. 17 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral: Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato metanólico bruto, e das frações acetato de etila, hexânica e clorofórmio, substâncias isoladas obtidos das partes aéreas de R. imperialis Cham. Schl. (Rosaceae) – amora branca em diferentes modelos animais de úlcera. 2.2 Objetivos Específicos: a) Avaliar atividade gastroprotetora do extrato metanólico bruto (ExtMB) e das frações hexânica, clorofórmio e acetato de etila em modelos animais (etanol, AINEs e ácido acético). b) Avaliar as substâncias isoladas Niga-ishigosídeo F1 e Ácido 2β, 3β, 19αtriidróxiursólico em modelo de etanol. c) Avaliar a atividade do extrato e das frações sobre a secreção gástrica e produção de muco. d) Estudar possíveis mecanismos de ação antiúlcera (participação do sistema do óxido nítrico e grupamentos sulfidrila). e) Comparar a atividade gastroprotetora do extrato com fármacos utilizados na terapia antiúlcera (omeprazol, cimetidina e carbenoxolona). 18 3 EMBASAMENTO TEÓRICO 3.1 Importância das Plantas medicinais Conceitualmente, são consideradas plantas medicinais, aquelas que possuem propriedades terapêuticas. Elas são amplamente utilizadas na medicina popular contra várias patologias, e seu uso vem crescendo gradativamente ao longo dos últimos anos devido a vários fatores, dentre os quais se destaca o baixo poder aquisitivo da maioria da população que procura uma alternativa com menores custos. De acordo com a Organização Mundial da saúde (OMS), no início da década de 90, 65% a 80% da população, em países desenvolvidos, já utilizavam plantas medicinais como única fonte de cuidados básicos de saúde (BUTLER, 2008). De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (BRASIL, 2010), são considerados medicamentos fitoterápicos aqueles obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, cuja eficácia e segurança são validadas por documentações meio de levantamentos tecnocientíficas ou etnofarmacológicos, evidências clínicas. Os de utilização, medicamentos fitoterápicos são caracterizados através do conhecimento de sua eficácia e dos riscos de seu uso, como também pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. A droga vegetal define-se como planta medicinal, ou suas partes, que contenham as substâncias, ou classes de substâncias, responsáveis pela ação terapêutica, após processos de coleta, estabilização, quando aplicável, e secagem, podendo estar na forma íntegra, rasurada, triturada ou pulverizada. Com a crescente utilização da fitoterapia por profissionais da saúde, impulsionada pela produção científica nessa área, principalmente nas duas últimas décadas, a cada dia, mais fármacos de origem vegetal são colocados no mercado e introduzidos para uso terapêutico. Além disso, a realização de estudos etnofarmacológicos possibilita o resgate, a preservação e o uso das plantas como subsídio de pesquisa, do conhecimento popular ou tradicional. (GALVANNI; BARRENECHE, 1994.; BOORHEM; LAGE, 2009). Segundo Newmann e Cragg (2007), dos fármacos lançados entre os anos de 1981 e 2006, 6% eram oriundos de produtos naturais. Destes 28% eram derivados, e 5% eram sintéticos, mas com o grupo farmacofórico obtidos de modelos naturais. 19 Houve grande destaque na participação desta fonte de fármacos, no campo do combate ao câncer e às infecções. Cerca de 40% dos medicamentos existentes no mercado são obtidos de forma direta ou indireta de fontes naturais, dos quais 20% são oriundos das plantas. Atualmente os fitoterápicos representam cerca de 15% do capital da indústria farmacêutica mundial, e avança em direção ao tratamento de doenças de maior gravidade como vitiligo, psoríase e Síndrome da imunodeficiência Adquirida (AIDS). No Brasil, o surgimento da medicina popular com uso das plantas, teve seu inicio com os índios, e posteriormente com contribuições dos negros e europeus. Na época em que o Brasil era colônia de Portugal, os médicos restringiam-se às metrópoles. Na zona rural e/ou suburbana, a população recorria ao uso das ervas medicinais para os problemas de saúde. A construção desta terapia alternativa surgiu da articulação dos conhecimentos dos indígenas, jesuítas e fazendeiros. Este processo de miscigenação gerou diversificada bagagem de usos para as plantas e seus aspectos medicinais, que sobreviveram dos nossos antepassados até os dias atuais (ARAUJO,1979.; FIRENZUOLI; GORI; NERI, 2005). De acordo com estimativas da Convenção da Diversidade Biológica, o Brasil contém entre 15 e 20% de toda a biodiversidade mundial, sendo considerado a maior do planeta em número de espécies endêmicas. Dados estatísticos indicam ainda que existam 55 mil espécies de plantas, 517 anfíbios (294 endêmicos), 1.622 aves (192 endêmicas), 524 mamíferos (cerca de 130 endêmicos), 468 répteis (172 endêmicos), 3.000 espécies de peixes de água doce e cerca de 15 milhões de insetos, muitos completamente desconhecidos. Mesmo com toda essa riqueza biológica, o maior produto de exportação comercial do país (40%) refere-se a espécies de plantas exóticas, que foram introduzidas como, por exemplo, a laranja, a soja, a cana-de-açúcar e o eucalipto (LEWINSONHN; PRADO, 2002). Como reportado anteriormente, a biodiversidade do Brasil é considerada uma fonte de substâncias biologicamente ativas e, sua preservação é fundamental tanto pelo valor intrínseco dessa imensa riqueza biológica, como pelo seu enorme potencial como fonte de novos fármacos. Diante desta realidade, várias pesquisas de bioprospecção dos nossos biomas vêm sendo incrementadas objetivando a busca racional de bioprodutos de valor agregado (BARREIRO; FRAGA, 1999.; COSTA, 2002). 20 O desenvolvimento sustentável de um país depende essencialmente de uma política consistente de educação, ciência, tecnologia e inovação, sustentada na preservação da natureza, na biodiversidade e na exploração racional de fontes naturais necessárias para alimentação, avanço social e econômico, num cenário que assegura a manutenção da saúde e a cura de doenças (BRAZ FILHO, 2010). No Brasil, as pesquisas de descoberta de protótipos de fármacos e/ou fitofármacos, além de propiciarem o avanço da pesquisa básica multidisciplinar, podem contribuir também para o desenvolvimento tecnológico nacional, levando em conta que a diversidade micromolecular dos inúmeros biomas brasileiros é ainda muito pouco explorada como uma fonte de substâncias de interesse farmacológico (BARREIRO, 2009). Medicamentos tradicionais são amplamente divulgados e estima-se que 80% da população do mundo dependam deles como uma fonte de saúde primária. No Brasil, as populações das zonas rurais e de florestas dependem da medicina popular e tradicional para o tratamento de muitas doenças infecciosas. Algumas espécies são incluídas nas prescrições para determinados fins terapêuticos, como a cicatrização de feridas, inflamação, infecções microbianas ou parasitárias, lesões de pele e úlceras (ALVES; ROSA, 2007). As plantas têm sido amplamente reconhecidas como importante fonte da maior parte dos componentes ativos em medicamentos terapeuticamente eficazes. Vale ressaltar que através das pesquisas realizadas com os produtos naturais, foi demonstrado que estes, além de serem utilizados como medicamentos, também são ferramentas para revelar importante aspecto de ações e mecanismos fisiológicos, devido a interações com os canais de membrana, receptores e vias metabólicas (LORENZI; MATOS, 2000.; HARVEY, 2008). Como preconizado pela Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (BRASIL, 2006), os fitoterápicos constituem importante fonte de inovação em saúde, sendo objeto de interesses empresariais privados e fator de competitividade do Complexo Produtivo da Saúde. O desenvolvimento do setor de plantas medicinais e fitoterápicos pode se configurar como importante estratégia para o enfrentamento das desigualdades regionais existentes em nosso país, podendo prover a necessária oportunidade de inserção socioeconômica das populações de territórios caracterizados pelo baixo dinamismo econômico e indicadores sociais precários. A ampliação das opções terapêuticas ofertadas aos 21 usuários do Sistema Único de Saúde (SUS), com garantia de acesso a plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade, na perspectiva da integralidade da atenção à saúde, é uma importante estratégia com vistas à melhoria da atenção à saúde da população e à inclusão social. Desta forma, as pesquisas com descoberta de novos produtos derivados dessa ampla biodiversidade encontrada nas diferentes regiões do Brasil é de grande relevância, tanto para avanço da pesquisa, em desenvolvimento tecnológico e conhecimento científico sobre as plantas, inovação e isolamento de compostos terapeuticamente eficazes para tratamento de diferentes patologias. 3.2 Família Rosaceae Rosaceae consiste em uma grande família de plantas, a grande maioria dos representantes é composta por especies frutíferas como ameixeira, cerejeira, amoreira, framboesa, morangos, damasco, pêra, pêssego, dentre outras (JORGE; MARKMAN, 1993). Tais plantas crescem em todas as partes do mundo, especialmente em regiões temperadas. Algumas foram cultivadas há décadas, e são conhecidas por sua variedade de frutas, utilizada para a fabricação de doces e compotas. Na flora brasileira, a família é representada por cinco gêneros, ocorrendo principalmente no sul do país. Muitas espécies são usadas na medicina popular para tratar diferentes patologias (JOLY, 1991.; LIFE; BED, 1993). 3.3 Gênero Rubus Rubus é um dos cem gêneros da família Rosaceae, com diversas classes de compostos com atividades biológicas comprovadas. O Gênero Rubus é constituído de muitas espécies que são empregadas na medicina popular de vários países para o tratamento de diferentes patologias, especialmente diabetes mellitus. Estudos fitoquímicos e farmacológicos têm mostrado que algumas espécies produzem princípios ativos que exercem atividade gastroprotetora, antioxidante, antitumoral e anti-inflamatória (PATEL; ROJAS-VERA; DACKE, 2004). O gênero Rubus têm sido utilizada no uso popular para diversos efeitos benéficos. Folhas de amora apresentam propriedades anti-inflamatória, antiviral e 22 antimicrobiana, bem como atividade anti-proliferativa contra as células cancerosas. Estudos recentes focaram-se na identificação de componentes fenólicos das folhas de Rubus, bem como a determinação da sua atividade antioxidante (PANIZZI et al, 2002.; DALL’ACQUA et al, 2008). Estudos farmacológicos confirmaram várias indicações populares, incluindo atividade antimicrobiana, antifúngica, antidiabética e antinoceptiva. Além disso, há uma grande ocorrência de diferentes classes de compostos, destacando-se os terpenóides, flavonóides e outros compostos fenólicos (NIERO; CECHINEL-FILHO, 2008). A Rubus occidentalis é conhecida como framboesa preta, muito utilizada para preparação de caldas, sorvetes, sucos e vinhos. Tem sido amplamente estudada devido a presença de compostos antioxidantes. Os principais constituentes fitoquímicos presentes nessa especie incluem as antocianinas, flavonóides, taninos (proantocianidina), ácidos fenólicos e lignanas (HAGER et al, 2008). Como reportado anteriormente, esta planta apresenta significativa capacidade antioxidante, a qual é atribuída à alta concentração de antocianinas e compostos fenólicos totais (SEERAM, 2008.; TULIO et al, 2008.; WANG; LIN, 2000). Estudos realizados têm demonstrado propriedade anti-proliferativa para tumores de cólon, mama e próstata (SEERAM et al, 2006). Jung et al (2009) relataram que o vinho de R. occidentalis apresentou atividade antioxidante comparável à vinhos tinto importados, com propriedade antitumoral para câncer de fígado. Rubus aleaefolius é tradicionalmente utilizada no tratamento de problemas hepáticos, bem como estomatite. Vários compostos foram isolados de diferentes partes da planta, como triterpenóides glicosídeos e taninos hidrolisáveis (GAN et al, 1998.; GAN et al, 2000). A decocção das raízes é utilizada por nativos Anxi (que vivem em regiões montanhosas da Província de Fujian) contra hepatite aguda e outros tipos de patologias (SUN et al, 2004). Embora a terapia utilizando R. aleaefolius sugere que esta pode ser realmente eficaz, ainda faltam estudos científicos sobre sua eficácia para desordens hepáticas. Nenhum estudo sistemático da planta foi realizado para se estabelecer qual é o principio ativo químico responsável para a atividade hepatoprotetora. O que se tem observado na literatura é que a decocção, o extrato etanólico e polissacarídeos provenientes da raiz de R. aleaefolius tem a capacidade de melhorar as funções hepáticas em algumas 23 patologias de fígado (HONG et al, 2005.; YE et al, 2005.; CHEN et al, 2006.; ZHOU et al, 2007). O extrato das raízes de Rubus pinfaensis é utilizado na China para o tratamento de queimaduras e, ensaios in vitro demonstraram significativa atividade antibacteriana. A análise fitoquímica desta espécie revelou a presença de alguns terpenóides como o ácido ursólico, euscáfico, 28-glicosil tormêntico e 19αhidroxiasiático (MAATTA-RIIHINEM et al, 2004). Segundo Yoon et al (2010), Rubus coreanus possui propriedade antioxidante. Os principais constituintes encontrados nessa espécie incluem ácido fenólico, ácido linoléico, ácido linolênico, ácido oléico, ácido palmítico, ácidos orgânicos, triterpenos, e flavonóides. Dentre os efeitos biológicos de R. Coreanus, destaca-se atividade antioxidante, anti-fadiga, anti-fertilidade, adstringente, anti-osteoporose, anti- diabética, anti-tumoral e anti-inflamatória (BAE et al, 2007.; KUA; MUN, 2008.; DO et al, 2008). Estudos foram realizados pelo NIQFAR/UNIVALI com a Rubus rosaefolius. A planta é utilizada na medicina popular como anti-espasmódica, analgésica. Desta espécie, foram obtidos das partes aéreas alguns esteróides como o estigmasterol, βsitosterol livre e glicosilado e os triterpenos ácido tormêntico e 28-metoxitormêntico. Este último quando avaliado em camundongos no modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético e modelo de dor induzida por formalina, apresentou-se eficaz em diminuir o processo doloroso, incluindo a dor de origem inflamatória e neurogênica (KANEGUSUKU et al., 2007). Sugere-se que alguns desses compostos com estas propriedades descritas anteriormente estejam presentes também em outros tipos de Rubus, como é o caso da R. imperialis, objeto de pesquisa nesse estudo. 3.4 Da planta em estudo: Rubus imperialis R. imperialis ocorre abundantemente no sul do Brasil, sendo conhecida como amora-do-mato, amora-branca, amora rosa ou amora-brava (NIERO et al., 1999).É uma planta arbustiva, samentosa, perene, de ramos angulosos, armados de acúleos grandes, podendo atingir 4 a 5 m de comprimento. Flores com pétalas brancas, fruto composto de inúmeras drupas verde-amareladas (Figura 01). Os frutos são 24 saborosos, suculentos e adocicados, esta espécie possui grande potencial para a utilização em geléia, doces em calda e outros derivados ou até mesmo para consumo in natura (BIANCHINI, 2010). Figura 01: Partes aéreas, flores e frutos de Rubus imperialis (Fonte: SILVA-LOPES, 2010) Estudos fitoquímicos realizados por pesquisadores do NIQFAR/UNIVALI, demonstraram na planta a presença de alguns terpenos e derivados do ácido elágico (Figura 2), como o niga-ichigosídeo F1 (ácido 23-hidroxitormêntico-28-O-glicosídeo) (1), ácido 23-hidroxitormêntico (2), ácido 4’metil-3-O-metilelágico (3) e ácido 3-Ometil-4’-O-α-ramnose elágico (4) (BELLA CRUZ et al., 2006). Figura 02. Fitoconstituintes presentes na Rubus imperialis. Fonte: BELLA CRUZ et al (2006). 25 Esta planta, além de ser usada pelas comunidades rurais para o tratamento de diabetes, é também utilizada para combater outras enfermidades, algumas relacionadas à dor. Neste contexto, alguns extratos obtidos de diferentes partes da planta (folhas, caule, raíz) foram testados em alguns modelos de dor específicos, os quais mostraram-se ativos. O principal componente ativo foi identificado como o triterpeno Nigaichigosideo F1, o qual foi isolado com alto rendimento das partes aéreas. Este composto foi aproximadamente 30 vezes mais potente do que a aspirina e o paracetamol, no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético em camundongos, além de previnir tanto a dor de origem neurogênica, como a dor de origem inflamatória no teste da formalina (NIERO et al., 1999). ARDENGHI et al (2006), demonstraram que este triterpeno atua por diversas vias de neurotransmissores para exibir seu efeito antinoceptivo, tais como a via dopaminérgica, taquicininérgica, L-arginina-óxido nitrérgica e glutamatérgica. Um ensaio simples de avaliação da citotoxicidade empregando o modelo da Artemia salina foi conduzido com os extratos metanólicos das raízes, galhos e folhas, juntamente com a fração em hexano e em acetato de etila das raízes e com os compostos Niga-ichigosídeo F1, ácido 23-hidroxitormêntico e ácido 3-O-metil-4’O-α-ramnoseelágico. Apenas os extratos metanólicos e a fração em acetato de etila mostraram citotóxicos em concentrações letais (CL50) abaixo de 1000 µg/mL. Já os compostos isolados não evidenciaram nenhuma citotoxicidade, levando a crer que esta atividade se dá em sinergismo por diversos constituintes do extrato (KANEGUSUKU et al., 2002). A substância Niga-ichigosídeo F1 também foi isolada da espécie Rubus coreanus, e esse composto se mostrou efetivo inibindo inflamação em modelo de artrite reumatóide e também atividade de reduzir lesões gástricas em modelo de úlcera induzida por etanol em ratos (NAM et al., 2006). Embora existam inúmeras referências a respeito de outras espécies do gênero Rubus, poucos são os estudos científicos realizados com R. imperialis, tanto fitoquímico quanto farmacologicamente (SILVA-LOPES, 2010). Desta forma, é de grande importância estar investigando os efeitos da planta na atividade gastroprotetora em ensaios farmacológicos in vivo. 26 3.5 Fisiopatologia da úlcera e terapia antiúlcera Úlceras gástricas são lesões na mucosa gastrointestinal que atingem a camada muscular da mucosa, que persistem e são geralmente dependente da atividade ácido-péptica do estômago. As principais causas são a infecção pelo H. pylori e consumo de antiinflamatórios não esteroidais (AINEs), incluindo aspirina (SOLL; GRAHAM, 2009). A patogênese da úlcera gástrica é complexa e multifatorial, e tem sido estudada por várias décadas. Uma das causas está relacionada com desequilíbrio entre o aumento da secreção de ácido gástrico e função defensiva da barreira da mucosa, ou seja, o enfraquecimento da barreira da mucosa. Vários fatores ambientais também contribuem para formação da úlcera. Dentre estes, podemos citar o uso prolongado de antinflamatórios não esteroidais, uso abusivo de álcool, cigarro e estress (MALFERTHEINER; CHAN; MCCOLL, 2007). A UG pode aparecer na parte inferior do esôfago, estômago, primeira porção do duodeno e menos frequentemente na segunda porção do duodeno e jejuno. O lugar preferencial para úlceras gástricas é o ângulo da curvatura menor do estomago, porém pode ocorrer em qualquer local a partir da cárdia até o piloro (YUAN; PADOL; HUNT, 2006). O sintoma predominante da UG não complicada é dor epigástrica, que pode ser acompanhada por outros sintomas dispépticos como plenitude, distensão abdominal, saciedade precoce e náuseas. Em pacientes com úlcera duodenal, a dor epigástrica ocorre normalmente durante o estado de jejum ou durante a noite, e geralmente é aliviada pela ingestão de alimentos ou de agentes neutralizantes de ácido. Cerca de um terço dos pacientes também têm dispepsia, a maioria sem apresentar esofagite erosiva (PRIMROSE, 2004.; SHAH, 2007). 3.5.1 Secreção gástrica O estômago é anatomicamente dividido em quatro regiões: cárdia, fundo, corpo e antro, formado por várias camadas de músculo liso e revestidas por uma mucosa (KUTCHAI, 1996). Esse órgão secreta cerca de 2,5 litros de suco gástrico por dia. As principais secreções exócrinas são pró enzimas; como a pró renina e o 27 pepsinogênio, sintetizadas pelas células principais ou pépticas; ácido clorídrico e fator intrínseco, secretados pelas células parietais ou oxínticas (GUYTON, 2006). A regulação da secreção de ácido pelas células parietais é de suma importância na patologia da úlcera péptica. A secreção das células parietais é constituída por uma solução isotônica de ácido clorídrico (HCl) (150 nmol/L) com pH abaixo de 1, sendo que a concentração de íons hidrogênio é um milhão de vezes mais alta que a do plasma. O HCl é secretado no canalículo da célula parietal por um processo de três etapas (Figura 03): • O processo de transporte ativo começa pelo transporte de íons K+ e Cl- para o canalículo. O íon Cl- é transportado por bomba ou através do canal. O fluxo dos íons Cl- cria um potencial negativo no canalículo, provocando o fluxo passivo de íons K+ para o canalículo. • Em seguida, o íon H+ é trocado pelo K+ pela bomba H+ - K+ - ATPase. • A água entra no canalículo na direção do gradiente osmótico criado pelo movimento de HCl no canalículo. Figura 03. Representação esquemática do mecanismo de secreção de ácido pelo estômago. (Fonte: OLBE, CARLSSON, LINDBERG, 1998) 28 Os principais estímulos que atuam sobre as células parietais são: • Gastrina; • Acetilcolina; • Histamina; • Prostaglandinas E2 e I2. 3.5.2 Secreção de muco A mucosa gástrica preserva sua integridade estrutural e funcional apesar da contínua exposição a fatores nocivos, incluindo o ácido clorídrico e a pepsina, os quais são capazes de digerir o tecido gástrico. No entanto, graças aos mecanismos de defesa, tal digestão não acontece (LAINE et al., 2008). O muco e o bicarbonato protegem a superfície do estômago das ações do HCl e das pepsinas. A secreção do muco é estimulada por alguns dos mesmos estímulos que intensificam a secreção de ácido e pepsinogênio, especialmente pela acetilcolina (HOWARD; KUTCHAI, 2004). O gel de muco protetor, que se forma sobre a superfície luminal do estômago e as secreções alcalinas, constituem uma barreira chamada de barreira de mucosa gástrica que previne os danos à mucosa pelos conteúdos gástricos. O muco permite que as células epiteliais mantenham um pH quase neutro. A proteção do epitélio gástrico depende tanto do muco quanto das secreções de HCO3. A barreira da mucosa gástrica pode proteger o estômago mesmo quando as taxas de secreção do HCl e das pepsinas estão elevadas. Entretanto, se a secreção de HCO3 ou de muco for suprimida, a barreira mucosa gástrica fica comprometida, e as ações do ácido e da pepsina na superfície do estômago podem ocasionar úlceras gástricas (BERNE et al., 2009). Evidências sugerem que em condições fisiológicas normais, a barreira de bicarbonato junto ao muco é suficiente para a proteção da mucosa gástrica contra o ácido e pepsina, apresentando também proteção ao duodeno (ALLEN; FLEMSTROM, 2005). 3.5.3 Úlcera e AINEs A associação entre a UG e o consumo de AINEs é conhecida há muito tempo. Os antinflamatórios não esteroidais (AINEs) correspondem aos agentes 29 farmacológicos mais utilizados na prática clínica, devido ao seu amplo espectro de indicações terapêuticas, tais como analgesia, inflamação, profilaxia contra doenças cardiovasculares, importante analgésico pós-operatório, desempenhando grande eficácia (KUMMER; COELHO, 2002). No entanto, as lesões agudas gastrointestinais são os efeitos colaterais mais graves e frequentes dos AINEs, o que os tornam responsáveis pela causa mais comum do desenvolvimento de úlceras gastroduodenais nos países ocidentais e no mundo (GLAVIN; SZABO, 1992; YUAN et al., 2006). Os AINEs inibem a secreção tanto de muco quanto de HCO3 e podem causar gastrites, hemorragia subepitelial, erosões e úlceras. Aproximadamente 10-40% dos pacientes que fazem uso de AINEs por 3 meses podem ter úlcera gástrica e úlcera duodenal, respectivamente. O consumo a longo prazo de AINEs aumenta cerca de 4 vezes o risco de complicações gastrointestinais (sangramento de UG e perfuração). Freqüentemente UG associada ao consumo de AINEs é assintomática, mesmo antes da ocorrência de alguma complicação (SINGH; TRIADAFILOPOULOS, 1999.; HAWKEY, 2000.; WALLACE, 2001). Tais agravos no tecido da mucosa gastrointestinal ocorrem devido à inibição da enzima ciclooxigenase (COX), a qual se diferencia em pelo menos três isoformas (COX-1, COX-2 e COX-3) e detém diferenças na sua regulação e expressão. Vale ressaltar que a atividade de ambas é inibida por todos os AINEs, porém em níveis variáveis, dependente do fármaco utilizado (MONTEIRO et al., 2008). A COX-1, designada como constitutiva, contribui na integridade da mucosa gastroduodenal, homeostase vascular, agregação plaquetária e modulação do fluxo plasmático renal. A COX-2, corresponde à enzima indutível, com relevância na modulação do fluxo sanguíneo glomerular e balanço hidroeletrolítico. Sua expressão na maioria dos tecidos é indetectável, no entanto, no processo inflamatório esta se encontra aumentada, e ainda, a presença de glicocorticóides inibe a COX-2, o que pode explicar seus efeitos antiinflamatórios (WATTS, 2008). A expressão de uma terceira variante catalítica da COX (COX-3) foi demonstrada em estudos in vitro com linhagens de macrófagos. A singularidade é que a expressão desta variante não originaria prostaglandinas pró-inflamatórias, mas um membro da família das ciclopentanonas, a 15desoxe-D PGJ2, agonista dos receptores ativadores de proliferação do peroxissomo (PPARs), com atividade antiinflamatória. Se a hipótese de uma terceira ciclooxigenase com atividade 30 antiinflamatória estiver correta, a sua expressão pode resultar em períodos típicos de remissão do processo inflamatório, como tem sido constatado em algumas doenças crônicas, como a artrite reumática (COLVILLE-NASH; QURESHI; WILLIS et al., 1988.; GILROY; TOMLINSON; WILLOUGHBY, 1998). A COX-3, possivelmente uma variante da COX-1 (pois é derivada do mesmo gene dessa isorforma), encontra-se distribuída principalmente no córtex cerebral, medula espinhal e coração (CHANDRASEKHARAN; DAI; ROOS et al., 2002). 3.5.4 Úlcera e Helicobacter pilory A infecção por H. pilory é reconhecida como uma das infecções crônicas mais comuns, estimando-se que cerca de metade da população mundial esteja infectada. É conhecido também que a sua prevalência varia consideravelmente com diversos fatores sendo, geralmente, superior em meios socioeconômicos desfavorecidos em que são comuns habitações com grandes aglomerados familiares e deficientes condições higiênico-sanitárias – ambientes reconhecidos como propiciadores da transmissão da bactéria. Dessa forma, a prevalências da infecção por H. pilory é muito amplo variando com o grau de desenvolvimento das regiões. A maioria dos países em desenvolvimento apresenta taxas superiores a 80% em contraste com os 20 a 40% dos países desenvolvidos (CAVE, 1997.; BROWN, 2000; SANTOS et al., 2010). Infecção por H. pilory é considerada a mais comum no homem e em contrapartida é uma das causas da gastrite aguda e crônica. Entre 85-95% dos pacientes com úlcera duodenal e 70-85% dos pacientes com infecção gástrica apresentam a bactéria (GISBERT; PAJARES, 2003). Em um estudo realizado por Aragão (1997), dos 86% dos pacientes que apresentavam úlcera duodenal, 78% dos mesmos apresetaram infecção com H. pilory. Grandes esforços científicos estão sendo realizados para o controle da H. pylori, visto que a sua infecção é de difícil tratamento, por muitas vezes recorrente, utilizando-se antibióticos específicos e inibidores de bomba, como por exemplo amoxicilina e claritromicina, associada a esomeprazol (LEE et al., 1995.; SIQUEIRA et al., 2007.; SOUZA et al., 2009). 31 Embora a incidência de úlceras causadas por H. pilory em países desenvolvidos tenha diminuído, a úlcera péptica continua ser um importante desafio para pacientes, médicos e investigadores (SOLL; GRAHAM, 2009). 3.5.5 Tratamento da Úlcera Gástrica As terapias mais utilizadas para tratamento de úlceras gástricas consistem nos seguintes mecanismos descritos: • Fármacos que inibem ou neutralizam a secreção de ácido gástrico: Antiácidos que neutralizam o ácido gástrico (hidróxido de magnésio, bicarbonato de sódio, trissilicato de magnésio, gel de hidróxido de alumínio). Antagonistas de receptores H2 da histamina (cimetidina, ranitidina, famotidina) Inibidores da bomba de prótons (IBP), inibem irreversivelmente a bomba H+K+- ATPase, a etapa terminal na via secretora de ácido (omeprazol, pantoprazol, lansoprazol, esomeprasol, rabeprazol). • Fármacos que protegem a mucosa (quelato de bismuto, sucralfato, misoprostol). Essas duas classes de medicamentos anti-secretores (inibidores da bomba de prótons e antagonistas de receptores H2 da histamina), podem ser efetivas na cura da doença aguda, porém nem o tratamento de manutenção nem o tratamento intermitente com tais compostos previnem totalmente as recidivas de úlcera gástrica (HUNT, 2005.; SCARPIGNATO, 2007). Fármacos anti-úlcera incluindo os IBP e antagonistas dos receptores H2 estão disponíveis para o tratamento da úlcera peptica, mas a avaliação clínica desses fármacos mostrou incidência de recidivas, efeitos colaterais e interações medicamentosas. Os efeitos indesejados desses fármacos tem sido a justificativa para o desenvolvimento de novos fármacos anti-úlcera e, portanto, a busca de novas moléculas através das plantas medicinais, as quais podem oferecer uma melhor proteção e também diminuir as úlceras recidivas (LAKSHMI et al., 2010). Sanders (1996), demonstrou que a classe de antagonistas dos receptores H2 pode desenvolver taquifilaxia, ou seja, redução da efetividade após o uso, com pequena e fraca resposta do organismo ao medicamento ou até mesmo podem ter pouca absorção por via oral, ocasionando a redução em até 50% de sua eficácia. 32 Já os IBP são, em geral, bem tolerados pelo organismo. Até o momento, estudos sobre a tolerabilidade dos IBP descrevem que as reações adversas mais comuns relatadas são: cefaléia, diarréia e náusea, com incidência de < 10%, valores que são semelhantes quando comparados com placebo e antagonistas do receptor H2 (SCOTT et al., 2002). O tratamento da úlcera gástrica consiste basicamente em modular a secreção ácida. A busca por novos fármacos que atuem por diferentes mecanismos auxiliaria o tratamento como uma forma alternativa aos fármacos atuais ou para atuar em sinergismo com estes e evitar alguns efeitos adversos dos tratamentos. As plantas apresentam um grande potencial de moléculas bio-ativas, e nos dias de hoje temos a tecnologia que nos permite isolar, testar e definir a segurança dos compostos ativos e determinar parâmetros farmacológicos e farmacocinéticos (OSÓRIO, 2011). Desta forma se torna necessário investigar/estudar terapias mais eficazes do que as já existentes de forma que possam contribuir para o tratamento de úlceras gástricas. 33 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Obtenção do Material vegetal Partes aéreas de R. imperialis Cham. Schl foram coletadas na localidade de São Sebastião no município de Treze de Maio (SC) em agosto de 2008. Após a coleta, o material foi limpo e seco em estufa a 40°C. As folhas foram separadas dos galhos, estes foram então triturados em moinho de martelos. O peso total dos galhos secos foi de 1,1 kg. Uma exsicata foi depositada no Herbário Barbosa Rodrigues sob número VC-Filho nº 036. 4.2 Preparação do extrato e das frações A preparação do extrato e das frações, bem como a purificação e purificação dos compostos, foi realizada pelo acadêmico Jhonny da Silva Lopes, como trabalho de conclusão de curso de Farmácia, UNIVALI, sob orientação do professor Doutor Rivaldo Niero. O material vegetal (galhos) foi submetido à maceração por 12 dias em percolador com capacidade total de 5 litros empregando-se o metanol como líquido extrator. Após este período, o extrato metanólico bruto (ExtMB) foi filtrado e concentrado em rota evaporador à 50 °C, resultando numa massa total de 127,5 g (12,7 %). A utilização de metanol como líquido extrator objetivou a obtenção de uma maior quantidade de moléculas presentes no material vegetal (CECHINEL-FILHO; YUNES, 1997). A partir do ExtMB foram realizadas sucessivas partições líquido/líquido com os solventes hexano clorofórmio e acetato de etila. Todas as frações também foram concentradas em rotaevaporador a pressão reduzida para manter a integridade das mesmas, tendo como rendimento (5,32g), (8,39g) e (9,25g), respectivamente (SILVA-LOPES, 2010). Essa etapa visa uma pré-purificação do extrato bruto, separando os compostos químicos por afinidade pelo solvente em questão (CECHINEL-FILHO; YUNES, 1997). Um fluxograma das extrações realizadas encontra-se na figura 4. 34 Figura 4 – Fluxograma resumido da preparação e obtenção das frações. (SILVA-LOPES, 2010). 4.2.1 Obtenção dos compostos: Todas as frações passaram por um processo cromatográfico na tentativa de isolar as substâncias de interesse farmacológico. Neste sentido, a fração hexânica, foi submetida à coluna de sílica gel, a fase móvel empregada foi uma mistura de hexano e acetona, partindo de hexano 100% até a proporção de hexano/acetona 1:1, sendo a coluna finalmente eluída com metanol 100%, obtendo-se 186 frações. Da subfração de maior grau de pureza foi identificado o esteroide estigmasterol. 35 O material precipitado da fração hexano também foi cromatografado em coluna aberta com sistema de solvente composto de clorofórmio e metanol, variando gradativamente a polaridade desde 100% clorofórmio até 100% metanol. Esta coluna originou 94 frações. A subfração que apresentou maior grau de pureza por CCD foi denominada de RI5-20 e identificado como triterpeno denominado de Ácido 2β, 3β, 19α-triidróxiursólico. Da mesma forma, a fração de acetato de etila foi cromatografada conforme mencionado acima, utilizou-se clorofórmio e metanol em diferentes proporções como fase móvel. Esta coluna apresentou rendimento de 146 subfrações, e na subfração de maior grau de pureza foi identificado o triterpeno Niga-ichigosídeo F1, já isolado previamente de Rubus imperialis. 4.3 Animais e ensaios farmacológicos As doses estabelecidas nos experimentos foram baseadas em estudos preliminares realizados no laboratório de experimentação animal. No estudo farmacológico de plantas utilizaram-se doses crescentes correlacionadas para possível observação da relação dose - resposta. Neste trabalho foi avaliado o efeito do extrato metanólico bruto (ExtMB) utilizando-se as doses de 100 mg/kg, 250 mg/kg e 500 mg/kg, e como modelos animais utilizou-se ratos. A dose utilizadas das frações acetato de etila, hexano e clorofórmio foi de 250 mg/kg, e utilizou-se camundongos. Para os compostos isolados a dose utilizada foi de 30 mg/kg, e utilizou-se camundongos. 4.3.1 Animais Para o ensaio farmacológico foram utilizados ratos machos e fêmeas wistar pesando entre 150-200g, e camundongos machos e fêmeas swiss pesando entre 25-30g, provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, acondicionados em sala climatizada (22 ± 3 ºC), com período claro e escuro de 12 horas cada, controlado automaticamente, tendo livre acesso à ração Labina e água. Doze horas antes dos experimentos, os animais foram mantidos em jejum, com água ad libitum. 36 Quanto aos aspectos éticos da experimentação animal, foram respeitadas as normas preconizadas pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal). Os experimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no uso de animais – CEUA - Universidade do Vale do Itajaí (Protocolo 023/11p2) – Anexo A. 4.4 Avaliação da atividade antiúlcera Para avaliação da atividade gastroprotetora do extrato metanólico bruto de R. imperialis Cham. Schl e das suas respectivas frações (hexano, clorofórmio e acetato de etila) foram utilizados diferentes modelos experimentais, todos baseados em fatores etiológicos da doença, como: uso abusivo de álcool, antiinflamatórios não esteroidais e aumento da secreção gástrica. 4.4.1 Modelo de úlcera induzida por etanol O método empregado foi descrito por Morimoto et al. (1991), com algumas modificações. Os animais (ratos) foram divididos em diferentes grupos (n=6) e foram pré-tratados por via oral com omeprazol na dose de 30 mg/kg (Controle positivo), veículo (controle negativo), ExtMB de R. imperialis nas doses de 100, 250 e 500 mg/kg. Utilizou-se camundongos para a utilização das frações e a dose das mesmas (hexano, clorofórmio e acetato de etila) foi de 250 mg/kg. Para a utilização das substâncias isoladas Niga-ichigosídeo F1 e Ácido 2β, 3β, 19α-triidróxiursólico, utilizou-se camundongos para os testes e a dose utilizada estabelecida foi de 30 mg/ kg. Após uma hora e meia dos tratamentos, foi administrado aos animais 1 mL de álcool etílico 96 % (agente lesivo) por via oral, e uma hora e meia após a administração do agente lesivo, os mesmos foram sacrificados por deslocamento cervical. Em seguida, os estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior, sendo esticados em placas de parafina, e através de Scanner, as imagens obtidas foram captadas e analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho destas. Posteriormente foi realizada a determinação da área total de lesão, porcentagem de área lesada e 37 índice de cura (IC) calculado através da severidade das lesões da mucosa gástrica, classificadas como: a) tipo 1 (T1): área da úlcera < 1 mm²; b) tipo 2 (T2): área da úlcera de 1-3 mm²; c) tipo 3 (T3): área da úlcera > 3 mm². O índice de cura foi determinado como: (%) da taxa de cura = (área controle negativo – área tratado X 100 Área do controle negativo Os resultados foram expressos em porcentagem de área (%), quantidade total de área lesada (mm²), índice de cura (IC). 4.4.2 Úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não esteroidal Foi empregada a metodologia descrita por Nwafor, Okwuasaba e Binda (2000), com algumas modificações. Os animais (ratos) foram divididos em diferentes grupos (n=6) e foram pré-tratados por via oral com cimetidina na dose de 100 mg/kg (controle positivo), veiculo (controle negativo), ExtMB de R. imperialis nas doses de 100, 250 e 500 mg/kg. Utilizou-se camundongos para a utilização das frações e a dose das mesmas (hexano, clorofórmio e acetato de etila) foi de 250 mg/kg. Após uma hora e meia, os animais receberam 100 mg/kg de indometacina (v.o). Após doze horas da administração de indometacina os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos retirados e abertos ao longo da curvatura maior, esticados e através de Scanner, as imagens, captadas e analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho destas. Posteriormente foi realizada a determinação da área total de lesão, porcentagem da área lesada e índice de cura (IC), conforme descrito anteriormente no item 4.4.1. 38 4.4.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético A metodologia utilizada é descrita por Takagi, Okabe e Saziki (1969), com algumas modificações. Utilizou-se ratos para esse modelo. Os ratos foram divididos em 3 grupos (n=6). Em seguida foram anestesiados e submetidos a uma incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide. Após a exposição do estômago, foi injetado na camada sub-serosa da parede externa do órgão 20 µL de solução de ácido acético 30%, na face posterior. O local foi pressionado por 30 segundos para evitar o extravasamento do líquido injetado. Cuidadosamente o estômago foi lavado com salina e então realizouse a sutura da parede abdominal. Dois dias após a cirurgia e com os animais já recuperados, foi realizado o tratamento que teve duração de sete dias. Os animais receberam por via oral cimetidina na dose de 100 mg/kg (controle positivo), veículo (água),e o ExtMB de R. imperialis, na dose 500 mg/kg. Após os dias de tratamento os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, e os estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior; esticados e através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar se ocorreu regressão da lesão nos tratamentos quando comparados com o controle positivo e negativo. Foi realizada a determinação da área total de lesão e a porcentagem de área lesada. O índice de cura expresso pela equação: (%) da taxa de cura = (área controle – área tratado) X 100 Área do controle 4.5 Mecanismos de ação antiúlcera 4.5.1 Avaliações da secreção gástrica e muco 4.5.2 Ligadura de piloro 39 Este experimento foi realizado conforme o método descrito por Shay et al. (1945), com algumas modificações. Os animais (ratos) foram divididos em diferentes grupos (n=6). Em seguida foram anestesiados e submetidos a uma incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide, para amarração do piloro e a administração por via intraduodenal dos diferentes tratamentos: cimetidina na dose de 100 mg/kg (controle positivo), veículo (controle negativo), ExtMB de R. imperialis nas doses de 100, 250 e 500 mg/kg. Utilizou-se camundongos para a utilização das frações e a dose das mesmas (hexano, clorofórmio e acetato de etila) foi de 250 mg/kg. Após os tratamentos, as incisões foram suturadas e quatro horas após a cirurgia os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. As incisões foram reabertas e após pinçamento da válvula cárdia (para evitar-se a perda do conteúdo gástrico) o estômago foi retirado. O conteúdo estomacal foi coletado e foram analisados os parâmetros: volume, pH e concentração de íons hidrogênio. Após a determinação do volume e de pH, foi adicionado 10 mL de água destilada à amostra e esta foi centrifugada por 10 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante foi titulado com solução de hidróxido de sódio 0,01 N, utilizando-se fenolftaleína como indicador. Os resultados foram expressos em mL (volume), pH e mEq/L/4h (Concentração de íons hidrogênio). 4.5.3 Doseamento de muco em mucosa gástrica Este ensaio foi realizado de acordo com a metodologia descrita por Sun, Matsumoto e Yamada (1991) com algumas modificações. Os ratos foram separados em grupos (n=6). Após 12 horas de jejum, sob anestesia, foi realizada uma incisão no abdômen e a ligadura do piloro foi feita. Imediatamente, após a ligadura do piloro, o ExtMB de R. imperialis (100, 250 e 500 mg/kg) e das frações hexano, clorofórmio e acetato de etila (250 mg/kg) foi administrado via intraduodenal. Carbenoxolona (250 mg/kg) foi utilizado como controle positivo, e 1 mL de veículo foi administrado como controle negativo. Os animais foram sacrificados 4 horas após os tratamentos. O conteúdo estomacal foi imerso em 10 mL de solução de Alcian Blue (Alcian Blue 0,02%, sacarose 0,16 M, acetato de sódio 0,05 M; pH 5,8 a 20 ºC) por 24 horas, 40 posteriormente foi centrifugado a 3.000 × 10 min. A absorção do sobrenadante foi determinada por espectrofotometria em 615 nm. O muco livre do conteúdo gástrico foi calculado a partir da quantidade de Alcian blue ligado ao tecido (tecido/mg de peso (g)). 4.6 Participação do óxido nítrico endógeno envolvido na gastroproteção O método empregado neste estudo é descrito primeiramente por Arrieta et al. (2003), com algumas modificações. Nessa metodologia utilizaram-se ratos, os mesmos foram separados em seis grupos (n=6), nos quais, três grupos receberam pré-tratamento com L-NAME (N-nitro-L-Arginina metil éster), um inibidor da enzima óxido nítrico sintase, na dose de 70 mg/kg, i.p. e os demais grupos foram prétratados com salina, i.p. Os animais foram separados nos seguintes grupos: veículo (água destilada) + L-NAME, veículo (água destilada) + salina, carbenoxolona (200 mg/kg) + L-NAME, carbenoxolona (200 mg/kg) + salina, ExtMB de R. imperialis (500 mg/kg) + L-NAME, ExtMB de R. imperialis (500 mg/kg) + salina. Após 30 minutos dos pré-tratamentos, foi aplicado o teste de indução de úlcera por etanol. Decorrido o tempo do teste, os animais foram sacrificados e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura, esticados e através de Scanner, as imagens, então captadas e analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se a % de área lesada. 4.6.1 Participação dos grupamentos sulfidrila endógenos sobre o efeito gastroprotetor Para a avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila na gastroproteção, foi adotado o modelo de Matsuda e Yoshikawa (1999). Nessa metodologia utilizaram-se ratos, os mesmos foram separados em seis grupos (n=6), onde três grupos receberam o pré-tratamento com NEM (N-etilmaleimida), um quelante de grupamentos sulfidrila, na dose de 10 mg/kg, i.p. e os grupos restantes foram pré-tratados com salina, i.p. Os animais foram separados nos seguintes grupos: veículo (água destilada) + NEM, veículo (água destilada) + salina, carbenoxolona (200 mg/kg) + NEM, carbenoxolona (200 mg/kg) + salina, ExtMB R. 41 imperialis (500 mg/kg) + NEM, ExtMB de R. imperialis (500 mg/kg) + salina. Após 30 minutos dos pré-tratamentos, foi aplicado o teste de indução de úlcera por etanol. Passado o tempo do teste, os animais foram sacrificados e os estômagos, retirados e abertos ao longo da grande curvatura, esticados e através de Scanner, as imagens então foram captadas e analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se a % de área lesada. 4.7 Análise estatística Para a análise estatística dos resultados obtidos foi utilizada a análise de variância (ANOVA) e para comparação das médias dos grupos testados utilizou-se o teste de Dunnet e/ou Tukey, sendo os valores com p<0,05 considerados estatisticamente significativos (SOKAL; ROHLF, 1995). 42 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO As plantas medicinais estão entre as mais atrativas fontes de novos medicamentos, particularmente o uso popular mostra que algumas plantas já vêm sendo amplamente utilizadas para o tratamento de úlceras gástricas. Diversos estudos comprovam os efeitos gastroprotetores de extratos e outros derivados vegetais (BORELLI; IZZO, 2000.; VYAWAHARE, 2009). A atividade gastroprotetora de uma substância não conhecida pode ser determinada em animais de experimentação. Os modelos de triagem (etanol, AINE) são os mais utilizados porque representam os agentes etiológicos mais comuns envolvidos na patologia de úlcera gástrica humana. Sendo assim, para avaliação inicial da atividade gastroprotetora do ExtMB de R. imperialis, foi realizado modelo de úlcera induzida por etanol. No presente trabalho, no modelo de etanol observou-se que os tratamentos com o ExtMB (100, 250 e 500 mg/kg) e com o omeprazol (30 mg/kg) foram eficazes em reduzir significativamente a área total da lesão (mm²) e porcentagem de área lesada (Tabela 1). O ExtMB apresentou um Índice de cura de 55,56% para dose de 100mg/kg, 63,49% para dose de 250mg/kg e 78,14% para 500mg/kg. O fármaco omeprazol apresentou um índice de cura de 86,62%.(Figura 5). Tabela 1. Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes doses do ExtMB das partes aéreas de Rubus imperialis (100, 250 e 500 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em ratos. Tratamento (v.o) Dose (mg/Kg) Área total de lesão % de área Índice de cura (mm ) lesada (%) - 2 Controle (-) - 175,68 ± 33,48 16,88 ± 2,65 Omeprazol 30 43,29 ± 10,48** 0,072 ± 0,015** 86,62 ± 4,78** ExtMB 100 51,66 ± 21,67** 5,38 ± 1,81** 55,56 ± 5.59** ExtMB 250 50,28 ± 17,16** 5,40 ± 1,86** 63,49 ± 10,23** ExtMB 500 24,06 ± 11,40** 2,58 ± 1,82 ** 78,14 ± 6,87** Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis ratos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. **p<0,01, quando comparado ao grupo controle. 43 Figura 5 – Índice de cura do extrato metanólico bruto de R. imperialis (100mg/kg, 250mg/kg, 500mg/kg) e omeprazol (30mg/kg) em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais. ** denotam diferenças estatísticas quando comparados com controle. **p<0,01. Na figura 6 estão representados os cortes de estômagos e suas características macroscópicas. Figura 6 - Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol em ratos, utilizando tratamento com extrato metanólico bruto de R. imperialis em diferentes concentrações e o fármaco omeprazol. 44 As frações de acetato de etila, hexânica e clorofórmica foram avaliadas neste mesmo modelo de úlcera induzida por etanol na dose de 250 mg/kg, afim de determinar-se qual ou quais delas seriam mais ativas. Observou-se que todas as frações testadas e o omeprazol (30 mg/kg) mostraram-se eficazes para redução da área total de lesão (mm²), % de área lesada (Tabela 2). Além disso, o índice de cura obtido foi de 86,47% para FAE, 81,2% para FH, 85,63% para FCHCl3 e 92,12% para o omeprazol. Tabela 2. Efeito da administração oral de omeprazol (30mg/kg) e das diferentes frações (acetato de etila, hexano e clorofórmio, na dose de 250 mg/kg) em úlceras gástricas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Tratamento (v.o) Dose Área total de 2 % de área Índice de cura (mg/Kg) lesão (mm ) lesada (%) Controle (-) - 36,87 ± 3,88 9,94 ± 1,28 - Omeprazol 30 4,81 ± 1,50** 1,57 ± 0,59** 92,12 ± 3,15** FAE 250 4,98 ± 1,77** 1,50 ± 0,48** 86,47 ± 4,79** FH 250 4,99 ± 2,40** 1,71 ± 0,75** 81,2 ± 5,89** FCHCl3 250 4,49 ± 0,70** 1,56 ± 0,27 ** 85,63 ± 1,17** Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. **p<0,01, quando comparado ao grupo controle. Figura 7- Índice de cura das frações FAE, FH, FCHCl3 (250mg/kg) e omeprazol (30 mg/kg) em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais.** denotam diferenças estatísticas quando comparados com controle. **p<0,01. 45 Na figura 8, estão representados os cortes de estômagos e suas características macroscópicas. Figura 8- Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol em camundongos, utilizando tratamento com as diferentes frações e fármaco omeprazol. O modelo de indução de úlcera por etanol apresenta dois papéis bastante importantes: primeiro, ele indica a ação gastroprotetora dos extratos frente a um agente extremamente lesivo, e, segundo, serve de triagem para verificação da dose mais eficiente dos extratos (ARRUDA, 2008). O etanol é uma substância tóxica e comumente utilizada com a finalidade de produzir dano na mucosa gástrica em modelos experimentais. O etanol possui efeito ulcerogênico e necrotizante, por sua capacidade lipossolúvel. Ele atravessa facilmente a mucosa resultando dano na mesma (MATSUHASHI, et al., 2007). O etanol é capaz de alcançar o epitélio da mucosa através do rompimento da barreira muco-bicarbonato e suas ações celulares refletem em ruptura da parede dos vasos sanguíneos. Assim, provocam lesões hemorrágicas, resultantes de danos oxidativos das células do epitélio gástrico. Estes danos levam a constrição de veias e artérias da mucosa gástrica, produzindo congestão, inflamação e lesão tecidual. Provavelmente esses efeitos ocorrem devido a ações de lipoperoxidação, formação de radicais livres, estresse oxidativo intracelular, alterações na permeabilidade e 46 despolarização da membrana mitocondrial que culminam na morte celular das células do epitélio gástrico (REPETTO; LIESUY, 2002.; HIRUMA-LIMA , 2009). Sabe-se que as lesões da mucosa gástrica provocadas pelo etanol não são inibidas por agentes anti-secretores do tipo antagonista do receptor H2, como a cimetidina, mas sim por indutores dos fatores defensivos da mucosa (MORIMOTO et al., 1991). Dentre eles, destacam-se os inibidores de bomba de prótons (H+/K+ ATPase), os quais inibem a secreção ácida por se ligarem aos resíduos do aminoácido cisteína (fator determinante para desencadear o processo) em uma subunidade da bomba de prótons (PADILLA; NORIEGA, 2001). Diante disso, justifica-se a utilização do fármaco omeprazol como controle positivo, o qual é classificado como IBP. De acordo com os resultados obtidos no presente estudo, no experimento de indução de úlcera por etanol/HCl, os tratamentos com ExtMB (100, 250 e 500mg/kg) e as frações FAE, FH e FCHCl3 (250mg/kg) demostraram efeito gastroprotetor relevante, evidenciando uma capacidade importante do extrato e das frações em impedir a formação de lesões que seriam geradas pelo etanol (Figura 6 e 8). Outro modelo de triagem utilizada para avaliação do potencial gastroprotetor é o de indução de úlceras gástricas por AINEs. É descrito na literatura, que os AINEs que podem ser utilizados experimentalmente para indução de úlceras em animais de laboratório. No presente estudo utilizou-se a indometacina como agente lesivo. Os resultados apresentados na tabela 3, demonstram que no modelo de úlcera induzida por indometacina, houve redução significativa de área total de lesão e porcentagem de área lesada utilizando os tratamentos com cimetidina (100 mg/kg) e com ExtMB R. imperialis (100, 250 e 500 mg/Kg), quando comparado ao grupo controle negativo. Em adição, o ExtMB apresentou índice de cura de 49,50% para dose de 100 mg/kg, 48,43% para a dose de 250 mg/kg, 59,99% para a dose de 500 mg/kg e 55,89% para o fármaco cimetidina (100 mg/kg) (Figura 9). 47 Tabela 3. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato ExtMB das partes aéreas de R. imperialis (100, 250 e 500 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina em ratos. Tratamento Dose Área total de lesão % de área Índice de cura (v.o) (mg/Kg) (mm2) lesada (%) Controle (-) - 5,39 ± 0,77 0,56 ± 0,09 - Cimetidina 100 2,60 ± 0,41* 0,34 ± 0,06* 55,89 ± 4,35** ExtMB 100 3,16 ± 0,51* 0,2 ± 0,05* 49,50 ± 9,43** ExtMB 250 2,97 ± 0,24* 0,28 ± 0,08* 48,43 ± 11,51** ExtMB 500 1,58 ± 0,29** 0,13 ± 0,09** 59,99 ± 9,63** Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis ratos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, **p<0,01,quando comparado ao grupo controle. Figura 9- Índice de cura do extrato metanólico bruto de R. Imperialis e cimetidina (100mg/kg) em lesões induzidas por indometacina. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais. ** denotam diferenças estatísticas quando comparados com controle. **p<0,01 48 Figura 10. Imagens de estômagos após indução de úlcera por indometacina em ratos, utilizando tratamento com extrato metanólico bruto de R. imperialis em diferentes concentrações e o fármaco cimetidina Também foi observado nesse mesmo modelo que todas as frações utilizadas na dose de 250 mg/kg, foram efetivas em diminuir de forma estatisticamente significativa à área total de lesão (mm²) e % de área lesada. O fármaco cimetidina, na dose utilizada (100mg/kg), se mostrou eficaz em todos os parâmetros analisados, apresentando diferenças estatísticas significativas (Tabela 4). O índice de cura obtido das frações (250 mg/kg) foi de 31,67% para FAE, 47,98% para FH, 61,44% para FCHCl3 e 87,75% para o fármaco cimetidina (100mg/kg). De acordo com o índice de cura, de todas as frações testadas, a fração clorofórmica apresentou-se mais ativa, seguida pela fração hexano. (Figura 11). Tabela 4. Efeito da administração oral de cimetidina (100mg/kg) e das diferentes frações: acetato de etila, hexano e clorofórmio, na dose de 250 mg/kg, em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina em camundongos. Tratamento (v.o) Dose (mg/Kg) Área total de lesão 2 (mm ) % de área Índice de cura lesada (%) Controle (-) - 2,85 ± 0,19 0,75 ± 0,02 - Cimetidina 100 0,35 ± 0,15** 0,14 ± 0,06** 87,75 ± 5,32** FAE 250 1,78 ± 0,18** 0,53 ± 0,05* 31,67 ± 3,43** FH 250 1,53 ± 0,34** 0,45 ± 0,09** 47,98 ± 7,54** FCHCl3 250 1,22 ± 0,24** 0,42 ± 0,03** 61,44 ± 6,64** 49 Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, **p<0,01, quando comparado ao grupo controle. Figura 11- Índice de cura das frações FAE, FH, FCHCl3 (250mg/kg) e cimetidina (100mg/kg) em lesões induzidas por indometacina. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais. ** denotam diferenças estatísticas quando comparados com controle. **p<0,01. Na figura 12 estão representados os cortes de estômagos e suas características macroscópicas. Figura 12. Imagens de estômagos após indução de úlcera por indometacina em camundongos, utilizando tratamento com as diferentes frações e fármaco cimetidina. 50 Com relação à indometacina, experimentalmente se tornou um fármaco de primeira escolha para indução de lesão gástrica, devido ao seu maior potencial ulcerogênico, em comparação com outros fármacos da classe. A administração deste AINE, representa um modelo muito simples e eficaz para o estudo de gastropatia ulcerativa induzida em animais, pois este AINE atua inibindo a síntese de prostaglandinas e, consequentemente, diminuindo os mecanismos de citoproteção da mucosa gástrica mediadas por estas substâncias (SULEYMAN el al., 2010). A prostaglandina produzida pela mucosa gástrica, aumenta na presença de agentes irritantes, e apresenta um papel citoprotetor importante, inibindo a secreção ácida por reduzir a produção celular do monofosfato de adenosina (AMP) (BEEJAY; WOLFE, 2000). A enzima ciclooxigenase (COX-1) converte o ácido araquidônico em prostaglandina G2 reduzindo este intermediário a prostaglandina H2 (PGH2). Sabe-se que a ação antiinflamatória dos AINEs ocorre principalmente através da inibição da enzima COX (cicloxigenase) e, conseqüente, redução da produção de prostaglandinas. Os AINEs não seletivos como a aspirina, a indometacina, dentre outros provocam danos na mucosa gástrica por mais de uma via, como por exemplo, ao inibirem COX-1 reduzem o fluxo sanguíneo, ao inibirem COX-2 aumentam a aderência de leucócitos no endotélio vascular e por uma ação tópica direta causam irritação da mucosa (WALLACE, 2006). Como descrito anteriormente úlceras causadas por AINES envolvem mecanismos de inibição das cicloxigenases I e II, de maneira a promover redução da produção de prostaglandinas E2. As prostaglandinas possuem efeitos na síntese de muco e bicarbonato, na regulação da secreção ácida e do fluxo sanguíneo da mucosa gástrica (CURTIS et al., 1995; HALTER et al., 2001). Segundo Suzuki et al (2000), outros fatores como a hipermotilidade gástrica e infiltração ou ativação de neutrófilos estariam envolvidos com os processos iniciais de formação das lesões causadas por AINEs. A redução dos níveis de prostaglandina compromete a barreira mucosa, que é composta de muco e bicarbonato e facilita a formação de lesões causadas pelas secreções gástricas (ácida e enzimática). No modelo experimental de úlcera por AINE, o ExtMB em todas as doses utilizadas, e as frações hexano e clorofórmio, foram capazes de promover a diminuição das lesões de forma significativa, desta forma isto indica que o extrato e 51 as frações são capazes de promover um efeito protetor sobre a mucosa (Figura 10 e 12), podendo estar relacionado com o aumento de síntese de prostaglandinas. Dando continuidade ao trabalho, como foi observado que o extrato e as frações exercem efeito gastroprotetor nos modelos de triagem (úlcera induzida por etanol e indometacina), os quais são modelos agudos, foi então testado o modelo de úlcera induzida por ácido acético, o qual permite avaliar atividade curativa e cicatrizante do extrato em úlceras gástricas crônicas. O ácido acético, é ainda o único modelo de úlcera gástrica que permite avaliar o processo de cicatrização e foi introduzido pela primeira vez por Takagi et al (1969). A atividade curativa do ExtMB de R. imperialis (500mg/kg) sobre úlceras gástricas crônicas, foi avaliada após 7 dias de indução de lesão por ácido acético. O índice de cura do extrato foi de 65,75%, ou seja, o extrato foi capaz de diminuir o tamanho da úlcera em comparação ao grupo tratado com salina. O tratamento com cimetidina também se mostrou efetivo, sendo que o índice de cura foi de 75,55% (Tabela 5) Tabela 5. Efeito do extrato metanolico bruto de R. imperialis e cimetidina no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético em ratos. Tratamento (v.o) Dose (mg/Kg) Área total de lesão 2 (mm ) % de área Índice de cura lesionada (%) Controle (-) - 25,74 ± 3,28 2,50 ± 0,18 - Cimetidina 100 10,58 ± 3,14** 1,28 ± 0,36* 75,55 ± 6,95 500 11,72 ± 3,25** 1,22 ± 0,33* 65,75 ± 5,54 ExtMB Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, **p<0,01, quando comparado ao grupo controle. 52 Figura 13 - Índice de cura do extrato Metanólico Bruto de R. imperialis e cimetidina em lesões induzidas por ácido acético em ratos. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM). ** denotam diferenças estatísticas quando comparados com controle. **p<0,01. O modelo de úlcera induzida por ácido acético é o que mais se aproxima da doença ulcerosa humana. Tem sido demonstrado que a aplicação de ácido acético na superfície da serosa de estômagos de ratos resulta em úlceras muito semelhantes às observadas em humanos em termos de localização, severidade e cronicidade, bem como no que diz respeito ao processo de cicatrização. O dano causado pelo ácido não se restringe a camada de muco e a submucosa, mas se estende até a camada muscular (BONAMIN et al., 2011). A lesão induzida por ácido acético ocorre por alterações de múltiplos fatores, incluindo alterações nos níveis de prostaglandinas, de fatores de crescimento, óxido nítrico e citocinas, além de mudanças no padrão de aderência do muco e alterações na microcirculação (TARNAWSKI, 2005). A cicatrização da úlcera gástrica é um processo complexo, que inclui a reconstrução da mucosa através da formação do tecido de granulação na base da úlcera, angiogênese e o reestabelecimento da arquitetura glandular. Nesse processo, é especialmente importante a participação da PG gerada pela COX-2, já que essa estimula a proliferação celular, promove angiogênese e restaura a integridade da mucosa (KONTUREK et al., 2005). Diante do exposto, como a cicatrização da úlcera envolve diversos mecanismos, como descrito anteriormente, uma das possibilidades na qual o extrato mostrou-se efetivo para promover a cicatrização, devido a sua ação antioxidante, uma vez que a planta apresenta em sua composição compostos com ação antioxidante e anti-inflamatória. Sugere-se que esses compostos atuem na cicatrização das lesões geradas pelo ácido acético. 53 Antioxidantes são compostos que podem retardar ou inibir a oxidação de lipídios ou outras moléculas, evitando o início ou propagação das reações de oxidação em cadeia. De forma geral, denominam-se antioxidantes as substâncias que presentes em concentrações baixas, comparadas ao substrato oxidável, retardam significativamente ou inibem a oxidação do substrato. Os radicais formados a partir de antioxidantes não são reativos para propagar a reação em cadeia, sendo neutralizados por reação com outro radical, formando produtos estáveis ou podem ser reciclados por outro antioxidante (ATOUI et al., 2005.; BARREIROS et al, 2006). Devido aos resultados obtidos nos modelos utilizados anteriormente, que mostraram potencial gastroprotetor e cicatrizante de lesões ulcerativas, passou-se então a investigar possíveis mecanismos envolvidos neste efeito. Dessa forma, foi realizado avaliação da secreção gástrica, através do modelo de ligadura de piloro. A tabela 6 apresenta os valores de média e desvio padrão de volume, pH e concentração de íons hidrogênio na secreção gástrica em animais, sob tratamento com as diferentes doses (100, 250 e 500mg/kg) do ExtMB e o fármaco cimetidina (100mg/kg). Na avaliação de pH, todos os grupos tratados com o extrato e cimetidina (tabela 6) tiveram diminuição significativa da acidez estomacal, caracterizada pelo aumento de pH quando comparado ao grupo controle. Também foi observado que todos os tratamentos foram eficazes em diminuir significativamente a concentração de íons hidrogênio ([H+] mEq/l/4h) na secreção gástrica, quando comparados ao grupo controle. No presente ensaio não se observou diferença estatística significativa de volume de suco gástrico. Tabela 6. Efeito do extrato metanólico bruto de R. imperialis nas diferentes doses (100, 250 e 500 mg) e cimetidina, administrados intraduodenal, avaliando os parâmetros obtidos no suco gástrico, através de ligadura de piloro em ratos. Tratamento Volume (mg/kg) (mL) - 0,13 ± 0,02 4,53 ± 0,14 69,40 ± 5,94 Cimetidina 100 0,11 ± 0,01 4,74 ± 0,24 13,67 ± 3,43** FAE 250 0,24 ± 0,07 5,36 ± 0,18* 15,89 ± 3,64** FH 250 0,16 ± 0,04 4,79 ± 0,17 31,67 ± 7,91 ** FCHCl3 250 0,30 ± 0,06 4,94 ± 0,18 34,75 ± 1,06** (intraduodenal) Controle pH [H+] Dose mEq/l/4h 54 Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis ratos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. **p<0,01, quando comparado ao grupo controle. Neste mesmo ensaio (tabela 7), utilizando as diferentes frações, não se constatou diferença estatística do volume de suco gástrico dos animais quando comparado ao grupo controle negativo. Apesar de todos os tratamentos se mostrarem eficazes em diminuir significativamente a concentração de íons hidrogênio ([H+] mEq/l/4h) na secreção gástrica, somente a fração acetato de etila apresentou diferença estatística significativa (5,36 ± 0,44) para aumento de pH quando comparado ao grupo controle negativo, sugerindo que as mesma pode ser efetiva e capaz de agir de modo parecido com o fármaco cimetidina. Tabela 7. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes frações: acetato de etila, hexano e clorofórmio na dose de 250 mg/kg nos parâmetros bioquímicos obtidos no suco gástrico de camundongos submetidos a ligadura de piloro. Tratamento Volume (mg/kg) (mL) Controle - 0,9 ± 0,20 2,46 ± 0,14 94,76 ± 2,02 Cimetidina 100 1,2 ± 0,20 6,38 ± 0,34** 10,35 ± 1,32** ExtMB 100 1,5 ± 0,22 3,31 ± 0,44** 29,11 ± 2,49** ExtMB 250 1,1 ± 0,24 3,96 ± 0,16** 28,73 ± 5,52** ExtMB 500 1,3 ± 0,23 4,10 ± 0,17** 26,65 ± 3,16** (intraduodenal) pH [ H+] Dose mEq/l/4h Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, **p<0,01, quando comparado ao grupo controle. No modelo de ligadura de piloro é possível avaliar alterações nos parâmetros bioquímicos do conteúdo gástrico, como pH, acidez total e volume gástrico. Podendo ser considerada com atividade anti-secretória as substâncias que afetam a acidez gástrica (TOMA et al., 2004). A via de administração utilizada no modelo de ligadura de piloro é via intraduodenal, que permite investigar as ações do extrato por via sistêmica, não tendo interações do contato direto com a mucosa gástrica. O tratamento dos animais com ExtMB se mostrou efetivo em reduzir o pH e a acidez total da secreção ácida gástrica, sugerindo que o extrato inibe especificamente a secreção de ácido, o que 55 leva a uma diminuição da acidez de forma gradual que não é acompanhada pela diminuição do volume secretado. Essa diminuição da acidez estomacal contribui na terapêutica da úlcera gástrica, pois a exposição da mucosa a altas concentrações de ácido favorece a lesão epitelial (LAINE et al., 2008). A secreção ácida gástrica é finamente regulada por vias interdependentes que incluem o sistema nervoso central, o sistema nervoso entérico e uma rede de células neuroendócrinas e imunes, que atuam na modulação parácrina e hormonal (SCHUBERT, 2004). Acredita-se que a secreção ácida seja liberada por reflexo vagal em decorrência da distensão gástrica. Este procedimento estimula a secreção do hormônio gastrina, cuja função no trato gástrico é estimular as células parietais a secretar HCl (BAGGIO et al.,2005). A interação da histamina, gastrina e acetilcolina com seus receptores nas células parietais são os principais responsáveis pela ativação da bomba de prótons, proteína secretadora de íon H+ que confere o pH ácido ao suco gástrico. Realizado modelo de ligadura de piloro, foi então, analisado a quantidade de muco na mucosa gástrica dos animais. Essa metodologia visa verificar participação do muco na gastroproteção. Com relação aos resultados obtidos (tabela 08), observa-se que o ExtMB (100, 250 e 500 mg/kg) e a cimetidina (100mg/kg), não foram capazes de promover aumento de muco na mucosa gástrica, quando comparado ao grupo controle negativo. A carbenoxolona (250 mg/kg) mostrou-se efetiva, pois promoveu o aumento de muco. Tabela 8. Efeitos das diferentes doses do extrato metanólico de R. imperialis e carbenoxolona na dosagem de muco em mucosa gástrica em ratos. Tratamento Dose (mg/kg) Itraduodenal Controle Alcian Blue ligado (mg/g tecido) - 1,59 ± 0,09 Carbenoxolona 250 1,73 ± 0.02* Cimetidina 100 0,87 ± 0,03 ExtMB 100 0,99 ± 0,08 ExtMB 250 1,00 ± 0,04 ExtMB 500 0,98 ± 0,07 56 Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis ratos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, quando comparado ao grupo controle. As frações acetato de etila, hexânica e clorofórmica na dose utilizada (250 mg/kg) também não foram capazes de aumentar a quantidade de muco presente na mucosa gástrica quando comparado ao controle negativo. A cimetidina também não promoveu aumento de muco presente na mucosa gástrica. A carbenoxolona (250 mg/kg) se mostrou efetiva, pois promoveu aumento de muco em mucosa gástrica quando comparado ao grupo controle negativo. Os resultados são descritos na tabela 9. Tabela 9. Efeitos das frações (acetato de etila, hexano e clorofórmio) de R. imperialis e carbenoxolona na dosagem de muco em mucosa gástrica em camundongos. Tratamento Dose (mg/kg) Itraduodenal Controle Alcian Blue ligado (mg/g tecido) - 7,92 ± 0,44 Carbenoxolona 250 9,46 ± 0,47* Cimetidina 100 7,04 ± 0,53 FAE 250 7,07 ± 0,47 FH 250 7,67 ± 0,30 FCHCl3 250 7,29 ± 0,41 Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, quando comparado ao grupo controle. O muco gástrico é um componente protetor importante,consiste em um gel viscoso, elástico e transparente, formado por água (95%) e glicoproteínas (5%), que abrange toda mucosa gástrica, sendo a primeira linha de defesa contra o ácido, o muco aderido juntamente com o bicarbonato secretado pelo epitélio, serve como uma barreira contra a autodigestão (ALLEN; FLEMSTROM, 2005). O muco também tem um importante papel na prevenção da agressão mecânica ao epitélio e fornece um microambiente sobre a área lesionada que é rapidamente restituída. As propriedades protetoras da barreira de muco dependem não somente da estrutura do gel, como também da quantidade ou espessura da parede que recobre a superfície da mucosa (WALLACE et al.,2006). 57 Como foi descrito anteriormente, os resultados obtidos nesse modelo experimental, que teve como intuito a determinação do muco gástrico aderido a mucosa, após o tratamento com ExtMB e as frações, indicaram que esses tratamentos não foram capazes de aumentar de modo significativo a produção de muco. Já a carbenoxolona se mostrou efetiva, mas esse resultado já era esperado, sendo que este fármaco atua estimulando a produção de muco gástrico (FRANCO et al., 1993). Avaliado a participação do muco no efeito gastroprotetor, a próxima etapa do presente trabalho foi verificar a participação do óxido nítrico endógeno e dos grupamentos sulfidrila na gastroproteção. Em modelos de avaliação da atividade gastroprotetora, verificou-se a participação do óxido nítrico através da pré-administração de L-NAME (Nω-nitro-Larginina metil-éster), uma substância capaz de inibir a enzima óxido nítrico sintase. uma substância capaz de inibir a enzima óxido nítrico sintase. Quando os animais foram pré-tratados com L-NAME, e tratados com o ExtMB (500 mg/kg), observa-se que houve diminuição da gastroproteção em relação aos animais pré-tratados com salina e tratados com o ExtMB (Figura 14). Ou seja, quando administrado L-NAME aos animais, o tratamento com ExtMB (500 mg/kg) perde sua atividade gastroprotetora, evidenciando, desta forma que o NO está envolvido na resposta protetora do extrato. Os resultados obtidos para o ExtMB (500 mg/kg) no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em ratos pré-tratados com L-NAME (70 mg/kg, i.p.) são apresentados na figura 14. 58 Figura 14 – Efeito do Extrato Metanólico bruto de R. imperialis (500mg/kg) e carbenoxolona (200mg/kg) em lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com L-NAME. Resultados expressos em Média ± EPM de seis ratos. Estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós ** ## teste de Tukey. p<0.01 quando comparados com o grupo controle, p<0.01 quando comparado ao grupo L-NAME, ♦ ♦ p<0.01 quando comparado ao grupo ExtMB. 40 % lesão 30 20 ♦♦ ** ## 10 ♦♦ ** ## 0 controle L-name ExtMB ** ## L-name + ExtMB Carbex ** ## L-name + Carbex Tratamentos Estudos demonstram que o pré-tratamento com L-NAME, acentua as lesões gástricas induzidas por etanol (MATSUDA et al., 1999), pois a inibição pode resultar em distúrbios de motilidade gastrintestinal, no fluxo de sangue, na secreção gástrica, entre outros fatores (WALLACE; MA, 2001). De acordo com os resultados obtidos, o efeito gastroprotetor do extrato parece estar envolvido na via do óxido nítrico. A importância do NO na defesa da mucosa do TGI é bem estabelecida. O principal papel do NO sobre manutenção do fluxo sanguíneo, a partir de sua liberação do endotélio, e da integridade do epitélio gástrico, estimulando a secreção e síntese de muco e bicarbonato bem como prostaglandinas. O óxido nítrico contribui na manutenção da integridade da mucosa por estar envolvido na regulação do fluxo sanguíneo, da secreção gástrica, e por contribuir na síntese de prostaglandinas (BRZOZOWSKI et al., 2005; FREITAS et al., 2011; WALLACE, 2008). O óxido nítrico também contribui para a defesa da mucosa através de sua propriedade citotóxica, uma defesa primaria contra as bactérias e parasitas que são ingeridos (MARCINKIEWICZ et al., 2000, TULASSAY; HERSZENYI, 2010). 59 No modelo de indução de úlcera por etanol, o dano provocado à mucosa está associado com um significativo decréscimo nos níveis de compostos sulfidrílicos (SH) da mucosa, como por exemplo, o da glutationa reduzida (GSH), e o prétratamento com bloqueadores de SH reverte a gastroproteção dos compostos sulfidrílicos (SBAZO et al., 2001). Quando pré-administrado NEM, e utilizado tratamento com ExtMB (500 mg/kg), o extrato perde sua atividade gastroprotetora quando comparado com os animais tratados somente com ExtMB (500 mg/kg), ou seja o efeito gastroprotetor é dependente dos compostos sulfidrílicos. Os resultados obtidos para o ExtMB (500 mg/kg) no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em ratos pré-tratados com NEM (10 mg/kg, i.p.) são apresentados na figura 15. Figura 15- Efeitos do ExtMB de R. imperialis (500 mg/kg) e carbenoxolona (200 mg/kg) em lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com NEM. Resultados são Média ± EPM de seis ratos. ** Estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. p<0.01 quando ## comparados com o grupo controle, p<0.01 quando comparado ao grupo NEM, ♦♦ p<0.01 quando comparado ao grupo ExtMB. 40 % of lesion area 30 ♦♦ ## 20 ♦♦ ** ## 10 ♦♦ ** ## 0 Controle Nem ExtMB ** ## Nem + ExtMB Carbexonolona Nem + Carbex Tratamentos 60 Os grupamentos sulfidrílicos participam da proteção da mucosa pela ligação a radicais-livres (antioxidante) e por formar pontes dissulfeto entre as subunidades do muco de maneira a impedir a sua dissociação (AVILLA et al, 1996). Sendo assim, os grupamentos sulfidrilas são responsáveis pela manutenção da integridade gástrica por estimular a produção de muco e mantê-lo, assim como desempenham papel antioxidante por evitar que espécies reativas de oxigênio causem dano à mucosa (NATALE et al., 2004; HIRUMA-LIMA et al., 2009). Os grupamentos estão presentes na glutationa, uma substancia endógena que, em sua forma reduzida, tem importância na redução do estresse oxidativo, por eliminar radicais livres, reduzir peróxidos e por se complexar com compostos eletrofilícos de maneira a proteger estruturas celulares proteicas, DNA e lipídeos, além de proteger a célula de outros produtos tóxicos (HAYES; MCLELLAN, 1999.; KIMURA et al., 2001). O composto químico NEM apresenta a propriedade de quelar as pontes dissulfeto, as quais são responsáveis pela manutenção da conformação da barreira mucosa gástrica. Sendo assim, a pré-administração de NEM provocou um significativo aumento das lesões gástricas em todos os grupos experimentais, quando comparados aos grupos pré-tratados com salina (Figura 15). O grupo tratado com a carbenoxolona, utilizada como controle positivo, apresentou diferenças estatísticas. A carbenoxolona atua promovendo aumento da síntese de muco gástrico e assim auxilia na proteção da mucosa, auxiliando desta forma na proteção das lesões gástricas (NAGAYAMA et al., 2001). O ExtMB demonstrou exercer gastroproteção tanto através do envolvimento de NO quanto de SH, indicando que seus efeitos sobre a mucosa gástrica estão dependentes destes compostos para exercer seu mecanismo de ação. Considerando os resultados obtidos nos modelos anteriores, e que os estudos fitoquímicos levaram ao isolamento das substancias Niga-ichigosídeo F1 e RI5-20, essas duas substâncias foram testadas em modelo de úlcera induzida por etanol em camundongos (Tabela 10). Observou-se que as duas substâncias mostraram-se efetivas para todos os parâmetros avaliados, vale ressaltar que elas foram mais efetivas do que o fármaco omeprazol. O índice de cura obtido foi de 98,43% para substancia Niga-ichigosideo (30 mg/kg), 99,22% para RI5-20 (30mg/kg), e 92,12% para o omeprazol (30 mg/kg). 61 Tabela 10. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das substâncias isoladas: Niga-ichigosídeo F1 e RI5-20 em úlceras gástricas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Tratamento Dose Área total de % de área (mg/Kg) lesão (mm2) lesada Controle (-) - 36,87 ± 9,5 9,94 ± 3,14 - Omeprazol 30 4,81 ± 3,36** 1,57 ± 1,33** 92,12 ± 7,06** 30 0,57 ± 1,72** 0,12 ± 0,22** 98,43 ± 1,29** 30 0,25 ± 0,33** 0,05 ± 0,06** 99,22 ± 0,37** (vo) Niga-ichigosideo F1 RI5-20 Índice de cura (%) Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p 0,05, **p<0,01, quando comparado ao grupo controle. Figura 16. Índice de cura das substâncias isoladas: Niga-ichigosídeo F1 e RI5-20 (30mg/kg) e do omeprazol (30 mg/kg) em lesões induzidas por etanol em camundongos. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais. ** ** ** Em um estudo realizado por Nam et al. (2006), no qual se avaliou o Nigaichigosideo F1, isolada da R. coreanus, sobre o efeito de lesões gástricas induzidas por etanol em animais de laboratório, observou-se que na dose de 10 mg/kg não houve diminuição significativa na lesão da úlcera quando comparado ao grupo controle, porém quando utilizada dose de 30 mg/kg houve significativa diminuição. Esse estudo corrobora com o presente trabalho, onde a dose utilizada da mesma 62 substância (Niga) foi de 30 mg/kg, e mostrou-se efetiva em diminuir significativamente a área total de lesão e % de área lesada. No presente estudo ressalta-se também a ação da substância RI5-20, isolada pela primeira vez da Rubus imperialis, demonstrando atividade gastroprotetora em úlcera induzida por etanol. Como revisado na literatura, gênero Rubus, apresenta em sua composição terpenos, flavonoides e outros compostos fenólicos. Sabe-se que esses compostos estão envolvidos na gastroproteção. Essa gastroproteção pode estar relacionada com a manutenção da integridade da mucosa gástrica, que depende da manutenção da microcirculação, e atividade de enzimas antioxidantes (KWIECIÉN et al, 2004). Os resultados obtidos no modelo de úlcera induzida por etanol sugerem indiretamente que o ExtMB, as frações e as substâncias isoladas apresentem efeitos gastroprotetores por aumentar a citoproteção favorecendo os processos antioxidantes. Estudos demonstram que os compostos fenólicos têm um grande papel como seqüestradores de radicais livres e por isso, se tornam importantes para a prevenção e terapia da úlcera gástrica. Também é descrito na literatura que os compostos polifenólicos, como o ácido gálico, elágico e seus derivados são capazes de inibir a bomba protônica, presente na célula parietal, participando assim na proteção estomacal contra agentes danosos (TAEKO et al, 2001.; RAO et al, 2008). Sendo a substância Niga-ichigosideo F1 um triterpeno, uma das possibilidades sobre a atividade gastroprotetora da planta, seria devido à ação deste triterpeno. Deste modo, sugere-se que o extrato bruto de R. imperialis, frações, e substancias isoladas avaliados neste trabalho apresentam atividade gastroprotetora na prevenção e cicatrização de úlceras gástricas, provavelmente relacionada as propriedades farmacológicas descritas dos compostos antioxidantes (fenólicos) encontrados no extrato, uma vez que reduziu os níveis de lesão no modelo de etanol, AINEs e mostrou-se efetiva em reduzir acidez estomacal no modelo de ligadura de piloro e eficaz na atividade cicatrizante no modelo de úlcera crônica por ácido acético. 63 6 Conclusão Por meio dos resultados obtidos nos modelos realizados no presente estudo, conclui-se que o Extrato Metanólico Bruto e as frações utilizadas de Rubus imperialis: - Apresentaram atividade gastroprotetora para úlceras induzidas por etanol e anti-inflamatório não esteroidal (AINEs); - O extrato metanólico bruto na dose utilizada apresentou atividade curativa em modelo de lesão gástrica crônica induzida por ácido acético; - A atividade gastroprotetora do extrato metanólico bruto e das frações acetato de etila, hexânica e clorofórmica está provavelmente relacionada com a diminuição da secreção gástrica ácida, não estando relacionada com o aumento da produção de muco; - A ação gastroprotetora é dependente da ação do óxido nítrico e dos compostos sulfidrílicos; - As substâncias isoladas (Niga-ishigosideo F1 e Ácido 2β, 3β, 19αtriidróxiursólico) apresentaram efeito gastroprotetor em modelo de indução de úlcera por etanol quando comparado ao controle negativo e se mostraram tão efetivas quanto o fármaco omeprazol. A substância RI5-20 (Ácido 2β, 3β, 19α-triidróxiursólico) foi isolada pela primeira vez da R. imperialis, e apresentou atividade gastroprotetora em modelo de úlcera induzida por etanol. 64 7 PERSPECTIVAS DO TRABALHO - Quantificar óxido nítrico; - Testar o extrato e as frações em modelo de bomba de prótons; - Dosar enzimas presentes no estômago e mucosa com finalidade antisecretória; -Testar as substâncias isoladas em diferentes modelos de úlcera gástrica; - Dosar perfil antioxidante do extrato metanólico e das frações de R. imperilis in vitro; 65 REFERÊNCIAS ALLEN, A., FLEMSTROM, G. Gastroduodenal mucus bicarbonate barrier: protection against acid and pepsin. American Journal of Physiology Cell Physiology, v. 288, p.119, 2005. ALVES, R. R. N.; ROSA, I. M. L.; Journal Ethnobiological Ethnomedic, v.3, n.14, 2007. ARAÚJO, A. A. Medicina rústica. 3ª ed. São Paulo: Brasiliense, 1979. ARDENGHI, J. V.; KANEGUSUKU, M.; NIERO, R.; CECHINEL-FILHO, V.; DELLE MONACHE, F.; YUNES, R. A.; SOUZA, M. 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