caracterização de bactérias associadas á plantas de arroz

CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS ASSOCIADAS Á PLANTAS DE ARROZ
DO GÊNERO GLUCONACETOBACTER.
Geovane Souza Silvano 1,3 ; Cláudia Cristina Garcia Martin Didonet2,3.
1
Voluntário Iniciação Científica PVIC/UEG
2
Pesquisadora - Orientadora
3
Curso de Farmácia, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, UEG.
RESUMO: Além de fixar nitrogênio atmosférico, Gluconacetobacter diazotrophicus produz
hormônios de crescimento como o Ácido Indol Acético (AIA), é tolerante a vários
antibióticos, como estreptomicina, tetraciclina e rifampicina, ampicilina, erytromicina e
roxitromicina. G. diazotrophicus apresenta variação na estrutura da parede celular, e quatro
grupos de classificação com base na presença de açúcares neutros. Assim distinguiram
cápsulas
com
fucose,
cápsulas
ricas
em
manose,
cápsulas
com
alta
relação
hexose/desoxiexose e cápsulas com baixa relação hexose/desoxiexose. A caracterização de
bactérias do gênero Gluconacetobacter produtoras de ácido indolacético (AIA) e promotoras
do crescimento vegetal tem crescido com a demanda por estudos de microrganismos
associadas à planta uma vez que se têm almejado a cada dia novas tecnologias no campo e
manutenção da qualidade do solo além de sustentabilidade do sistema agrícola. Devido à
grande demanda por tecno logias ‘limpas’, ou seja, a viabilização da agricultura sustentável,
pode-se esperar que futuramente uma percentagem maior destas bactérias seja usada na
produção de alimentos. No cerrado há pouco conhecimento do papel ecológico e da interação
destes na cultura de arroz, e quais são as estratégias para estes organismos atuarem como
PGPR. Este trabalho tem como objetivo caracterizar bactérias do gênero Gluconacetobacter
produtoras de ácido indolacético (AIA) e promotoras do crescimento vegetal.
Palavras-chave: fixação biológica de nitrogênio; Gluconacetobacter, microrganismos
endófitos.
Introdução
Bactérias que formam associações simbióticas com hospedeiros específicos e fixam
nitrogênio formando estruturas especializadas nos hospedeiros e/ou nas próprias bactérias são
chamadas diazotróficos simbióticos. Algumas bactérias, a exemplo de Gluconacetobacter,
podem colonizar a superfície das raízes (rizoplano), filosfera (folhas das plantas) e espaços
2
intracelulares de plantas, onde essas bactérias realizam uma fixação de nitrogênio associativa
à planta (SAWADA, 2003).
As bactérias do gênero Gluconacetobacter estão classificadas como a-Proteobacteria,
pertencentes à família Acetobacteriaceae possuindo atualmente 7 (sete) espécies
Gluconacetobacter diazotrophicus, G. azotocaptans, G. johannae, G. liquefaciens , G.
europeas, G. xilinus, G. hansanii, G. sacchari (FRANKE et al., 1999). Dentre as
características benéficas deste organismo estão a capacidade de fixar N2 em presença de O2
(REIS & DÖBEREINER, 1998)e produzir alguns promotores de crescimento vegetal como o
fito- hormônio ácido indolacético (AIA) e o ácido giberélico (GA) (FUENTES-RAMIREZ et
al., 1993). São bactérias tolerantes a vários antibióticos, como estreptomicina, tetraciclina,
rifampicina, ampicilina, eritromicina e roxitromicina (MUTHUKUMARASAMY et al.,
2002).
Com o crescente uso de fertilizantes químicos e uma maior conscientização acerca da
poluição, o uso da fixação biológica de nitrogênio (FBN) em plantas tem sido cada vez mais
requisitado na agricultura, como uma alternativa à utilização de fertilizantes químicos
(MUTHUKUMARASAMY et al., 2002).
O presente trabalho teve como objetivo caracterizar bioquímica e morfologicamente
bactérias do gênero Gluconacetobacter . Devido à grande demanda por tecnologias “limpas”,
ou seja, por viabilização da agricultura sustentável pode-se esperar que futuramente uma
percentagem maior destas bactérias seja usada na produção de alimentos. No cerrado há
pouco conhecimento do papel ecológico e da interação destes na cultura de arroz, e quais são
as estratégias para estes organismos atuarem como promotoras de crescimento vegetal.
Material e Métodos
Material vegetal: Foram utilizadas plantas de arroz (genótipo BRA-02601) fornecidas
Embrapa Arroz e Feijão, Santo Antônio de Goiás, GO.
Preparo dos extratos : As raízes de 3 plantas foram cortadas e submetidas ao processo de
esterilização superficial em metodologia descrita por Döbereiner, Baldani e Baldani
(1995).As raízes esterelizadas foram maceradas e desse estrato fez-se a diluição seriada.
Isolamento dos microrganismos: Foram feitas as diluições subseqüentes de 10-2 à 10-9 . O
plaqueamento foi feito em triplicata em meio sólido semi- seletivo LGI-P (DÖBEREINER, J.;
BALDANI, V.L.D.; BALDANI,J.I., 1995).
Contagem de microrganismos : As contagens de microrganismos em meio sólido e semisólido foram feitas segundo Döbereiner, Baldani e Baldani (1995).
3
Caracterização morfológica: Para esta caracterização dos isolados foram considerados os
critérios a partir da colônia : forma; elevação; bordas; superfície; estrutura; caracteres ópticos;
coloração; crescimento; brilho e consistência (UFBA, 2006). Foi realizado também o teste de
Gram para os isolados selecionados segundo Hungria e Araújo (1994).
Caracterização bioquímica: Os testes bioquímicos foram todos realizados em triplicatas. A
capacidade de crescimento bacteriano foi avaliada em meio de cultura sólida em LGI-P sem
carbono utilizando as seguintes fontes de carbono: ácido nicotínico, frutose, glicose, maltose,
e sacarose com concentração final de 5 mMol.L-1 . Posteriormente foi inoculada 10uL da
amostra de cada isolado e crescido à temperatura ambiente e avaliada no período de 72h. O
teste de presença da enzima catalase foi realizado segundo UFBA (2006). A presença da
enzima urease e a capacidade de crescimento intrínsedo em antibiótico foram realizadas
segundo Hungria & Araújo (1994). Os antibióticos utilizados foram amoxicilina, e
rifampicina nas concentrações de 100ug.mL-1 , 250ug.mL-1 , 400ug.mL-1 e 500ug.mL-1 .O teste
de redução do nitrato foi realizado em meio semi- sólido contendo nitrato de potássio com
concentração final de 5 mMol.L-1 , e avaliado o crescimento com 72horas. Para a capacidade
de fixar nitrogênio 100 uL das culturas dos isolados foram adicionados a meio semi-sólido
sem fonte de nitrogênio e avaliado a formação de película característica em 72 horas
Resultados e Discussão
Pela contagem obteve-se 2,1 x 104 UFC por grama de raiz no meio LGI-P sólido. Das
placas de contagem foram coletados e isolados 171 microorganismos sendo selecionados 20
para os testes de caracterização. Somente os isolados MRA-6, MRA-18 e MRA-123 se
demonstraram positivos (nir+) ao teste de redução do nitrato (Tabela 1). Segundo Rojas e
Mellado (2007) G. diazotrophicus pode ser isolado facilmente em meios de cultivo semisólidos e sem nenhuma fonte de nitrogênio. Em meio semi-sólido LGI-P, com azul de
bromotimol, a bactéria forma uma película densa de cor amarela 1mm abaixo da superfície do
meio e em um período de 7 dias e o meio de cultura adquire a coloração amarelo. Estas
características descritas foram observadas nas estirpes testadas isoladas em meio LGI-P.
Dos 20 isolados testados neste trabalho, todos utilizaram as fontes de carbono
fornecidas, exceto os isolados MRA-100 e MRA-109, os quais não utilizaram a maltos
(Tabela1). Em trabalho realizado por Barbosa e colaboradores (2006) testando fontes de
carbono, observou crescimento desta bactéria em maltose, mas a não utilização de maltose
não exclui estes isolados de serem possíveis Gluconacetobacter spp..
4
Tabela 1. Testes bioquímicos realizados para as estipes isoladas de raiz de plantas de arroz
(genótipo BRA02601) em meio LGI-P.
1
2
3
3
3
3
3
1
2
3
4
9
5
6
7
8
MRA-5
++
Negativo
+
+
+
+
+
MRA-6
++
+++
Negativo
+
+
+
+
+
MRA-10
++
Negativo
+
+
+
+
+
MRA-11
++
Negativo
+
+
++
+
+
MRA-18
++
++
++
Negativo
+
+
++
+
+
MRA-21
+
Nd.
Nd.
Nd.
Nd.*
Nd.
Nd.
+
MRA-22
+
Nd.
+
+
+
+
+
MRA-36
++
Negativo
Nd.
Nd.
Nd.
Nd.
+
MRA-53
+
+
Negativo
+
+
+
+
+
MRA-56
++
+
Negativo
+
+
+
++
+
MRA-72
+
Negativo
+
+
+
+
+
MRA-86
++
Negativo
+
+
++
+++
+
MRA-88
Negativo
+
+
+
+
+
MRA-96
++
Nd.
Negativo
Nd.
Nd.
Nd.
Nd.
+
MRA-100
+++
+++
Negativo
+
+
++
+
MRA-109
+
+
Negativo
+
+
+
+
MRA-123
++
+++
+
Negativo
+
+
+
+
+
MRA-131
++
Negativo
++
+++
+++
+++
+
MRA-139
++
Negativo
+
+
++
++
+
MRA-143
++
Negativo
+
+
+
+
+
1 Fixação de Nitrogênio; 2 Redução de Nitrato; 3 Catalase; 4 Coloração de Gram; 5 Ácido Nicotínico;
1
6 Frutose; 7 Glicose; 8 Maltose; 9 Sacarose Formação de película superficial em meio NFb : grande
2
3
(+++), média (++), pequena (+) e ausente (-). Formação de bolhas: Avaliação do crescimento nas
-1
fontes de carbono (5mmol.L ): muito (+++), médio (++), pouco (+) e ausente (-), após 72h de
incubação. Nd.: Não determinado.
*Nd.: Não determinado.
Nos testes de resistência á antibiótico no meio LGI-P foi possível analisar a
capacidade de resistência de cada isolado. Em todas as concentrações de rifampicina, MRA-5,
MRA-21, MRA-36, MRA-72, MRA-86, MRA-96 e MRA-109 não cresceram. Os demais
apresentaram crescimento variável. Somente o isolado MRA-131 apresentou muito
crescimento em todas as concentrações de rifampicina. Os isolados MRA-11, MRA-18,
MRA-22, MRA-53 e MRA-88 tiveram seu crescimento reduzido com o aumento da
concentração de rifampicina. Nas avaliações com amoxicilina os isolados MRA-36 e MRA86 não tiveram crescimento em nenhuma concentração, sendo que os demais apresentaram
crescimento variável com redução do crescimento em função da concentração.
Os isolados MRA-18, MRA-53, MRA-56, MRA-100, MRA-109 e MRA-123 foram
positivos para o teste da catalase (Tabela 1), sendo os demais negativos. Todos os isolados no
meio LGI-P submetidos á coloração de Gram se revelaram Gram- negativos (Tabela 1).
No teste de fixação de nitrogênio realizado em meio de cultura semi-sólido somente o
isolado MRA-88 não foi considerada fixadoras de nitrogênio, distanciando assim este
microrganismo das bactérias do gênero Gluconacetobacter spp.
As colônias de G. diazotrophicus são planas, de forma irregular e, tomam uma
coloração laranja intenso após 5 dias de incubação, por isso a necessidade de se fazer uma
5
análise morfológica de todos os isolados (ROJAS E MELLADO, 2007). A caracterização
morfológica apesar de ser importante, deve ser utilizada juntamente com testes bioquímicos, o
que promove uma determinação de grupos de bactérias com maior certeza.
Conclusão
Foram isolados 171 microorganismos e caracterizados morfológica e bioquimicamente
20 estirpes das raízes esterilizadas de planta de arroz. Dezenove desses isolados apresentaram
capacidade de fixação de nitrogênio. Considerados todos os testes treze isolados em meio
LGI-P foram considerados do gênero Gluconacetobacter spp. Por suas características
semelhantes ao observado na literatura
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6
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