título do resumo

Estabilidade e distribuição sistêmica do complexo do Citrus tristeza
virus em plantas de laranja doce da variedade Pêra [Citrus sinensis (L.)
Osbeck] avaliado pela análise dos Padrões SSCP.
Inaiara de Souza (PIBIC/CNPq-UEM), Carlos Alexandre Zanutto, Maria Júlia
Corazza (Orientador), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual de Maringá/Centro de Ciências Biológicas
Palavras-chave: Tristeza dos citros, Análise molecular, doenças dos citros
Resumo:
O Citrus tristeza vírus (CTV), agente causal da tristeza dos citros, é
endêmico no Brasil e pode ser encontrado no floema de muitas espécies e
variedades de citros. O CTV não é um único vírus, mas um complexo de
isolados que diferem nas suas propriedades biológicas e imunológicas. A
evidência da presença de mais de um variante genotípico em um complexo
do vírus tem sido comprovada por diferentes técnicas, imunológica e
molecular. Múltiplas inoculações do vírus pelo afídeo vetor e o movimento de
material infectado com isolados severos entre as regiões citrícolas podem
favorecer a ocorrência de mutações e recombinações gênicas, afetando a
estabilidade e a variabilidade genética do complexo viral dentro do
hospedeiro. De acordo com a literatura todos os haplótipos que constituem
um complexo de CTV podem ser encontrados no floema em qualquer parte
da planta. Considerando essa premissa, o presente estudo teve como
objetivo investigar a estabilidade do padrão SSCP (single strand
conformation polymorphism) do gene da proteína do capsídeo do CTV nos
diferentes quadrantes de plantas selecionadas e ao longo do tempo. O
experimento foi conduzido em três repetições, sendo o material vegetal,
fonte de CTV, constituído de plantas da variedade Pêra, pertencentes a um
pomar comercial do Noroeste do Paraná. Os resultados preliminares obtidos
apontaram diferenças nos padrões de SSCP entre as plantas analisadas.
Entretanto, nas amostras obtidas dos diferentes quadrantes e topo da copa
de cada uma das plantas analisadas, não foram observados alterações nos
perfis eletroforéticos de SSCP, mostrando que o complexo viral estava bem
distribuído por toda a planta, resultando em um único padrão para todos os
pontos da planta onde se coletou tecido para as análises SSCP.
.
Introdução
O Citrus tristeza vírus (CTV), agente causal da tristeza dos citros, é
um dos patógenos economicamente mais importantes da citricultura
mundial. Membro do gênero closterovirus, encontra-se limitado ao floema
das plantas cítricas. De modo geral, o CTV ocorre na planta como um
complexo constituído por uma mistura de dois ou mais haplótipos
geneticamente diferentes e relacionados imunologicamente, podendo ou não
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desenvolver sintomas em função das variedades copa e porta-enxerto
(ZHOU et al., 2007; MORENO et al., 2008).
O CTV é transmitido por meio da movimentação de materiais
propagativos infectados ou de forma semi-persistente por várias espécies de
afídeos vetores com uma eficiência variável. O Pulgão preto dos citros
(Toxoptera citricida Kirk.) é o vetor mais eficiente na transmissão do CTV,
sendo considerado endêmico no Brasil. Estudos demonstraram que, durante
a aquisição e a transmissão do vírus pelo afídeo vetor, haplótipos de CTV
podem ser selecionados aleatoriamente e que a interação vírus-vetorhospedeiro pode ser a causa da distribuição de distintos haplótipos do vírus
(HERRON et al., 2006; MORENO et al., 2008).
No campo, comumente ocorre a co-existência de vários haplótipos do
vírus em um mesmo indivíduo, podendo ocorrer mudança na predominância
de um haplótipo dentro do complexo viral, ocasionando alterações nos
sintomas apresentados pelo hospedeiro (BORDIGNON et al., 2003). O
genoma do CTV apresenta variabilidade genética moldada a partir da
ocorrência de mutações e recombinações gênicas.
A composição e o equílibrio dos isolados pode ser afetada pelas
condições ambientais, por repetidas inoculações de pulgões com outros
haplótipos do CTV e pelo trânsito de plantas infectadas entre as regiões
citrícolas (BORDIGNON et al., 2003; MORENO et al., 2008). Tais alterações
podem ser, de modo simples e rápido, acompanhadas pela utilização da
análise SSCP (single strand conformational polymorphism), através de
alterações observadas nos perfis eletroforéticos do gene da capa protéica
(GCP) do complexo viral presente na planta, avaliados ao longo do tempo
(SOUZA et al., 2001; Sambade et al., 2002).
Com base nas informações apresentadas, o presente estudo teve
como objetivo avaliar a estabilidade do padrão SSCP do gene da proteína do
capsídeo do CTV nos diferentes quadrantes da planta e ao longo do tempo.
Materiais e Métodos
Para a realização desse estudo foram selecionadas três plantas de
laranja Pêra enxertadas sobre limão Cravo (Citrus limonia Osbeck),
pertencentes a um pomar comercial localizado no município de Nova
Esperança, Noroeste do Estado do Paraná. Das plantas selecionadas foram
coletados ramos jovens dos quatro quadrantes e da parte superior (ponteiro)
da planta. Esta coleta foi realizada em duas etapas com um intervalo de 12
meses entre elas.
O material proveniente de cada parte de cada uma das plantas foram
submetidos à extração do RNA viral através do uso do Trizol reagent
(Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. O RNA total obtido, serviu
de molde para a síntese da primeira fita de cDNA através de reações com o
uso da transcriptase reversa (RT) de acordo com o procedimento descrito
por SAMBROOK et al. (1989):
O GCP foi isolado e amplificado por meio da reação da polimerase em
cadeia utilizando como substrato a cDNA obtido e com o uso de dois primers
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específicos: CN119 (5’AGA TCT ACC ATG GAC GAC GAA ACA AAG 3’) e
CN120 (5’GAA TTC GCG GCT CAA CGT GTG TTA AAT TTC C 3’).
A análise SSCP foi realizada de acordo com a metodologia descrita
por CORAZZA-NUNES et al. (2001). Alíquotas do produto do PCR foram
misturadas a igual volume de solução desnaturante (95% de formamida,
2mM de EDTA e 0,05mM de azul de bromofenol), desnaturadas a 95°c e
colocadas imediatamente em gelo. Em seguida, as amostras foram
submetidas à eletroforese em gel não desnaturante de poliacrilamida a 8%.
A corrida ocorreu a 200V por 16 horas a 25°C. O gel foi corado com solução
de nitrato de prata de acordo com o procedimento descrito por BEIDLER et
al. (1982).
Resultados e Discussão
Os resultados obtidos das análises das amostras coletadas na
primeira etapa do trabalho apontaram diferenças nos padrões de SSCP dos
isolados de CTV extraídos das três plantas estudadas. Este fato se deve,
provavelmente, às múltiplas inoculações por afídeos vetores nos pomares.
Como descrito por ALBIACH-MARTÍ et al. (2000), a transmissão de isolados
de CTV por afídeos, freqüentemente, resulta em variações nas populações
de RNA genômico de CTV.
Entretanto, padrões SSCP idênticos foram observados nos isolados
de CTV extraídos das amostras coletadas de uma mesma planta,
comprovando os resultados descritos pela literatura que mostram uma alta
estabilidade genética do CTV em um mesma planta hospedeira, podendo
ocorrer, porém, uma diversidade entre isolados de plantas distintas
(MORENO et al., 2008). Os resultados demonstram também a eficiência e
alta sensibilidade da análise de padrões SSCP.
A segunda etapa deste experimento encontra-se em andamento,
compreendendo a avaliação da estabilidade dos complexos virais dentro de
uma das plantas ao longo do tempo (12 meses de intervalo entre uma coleta
de material e outra), sendo que a obtenção dos resultados desta etapa está
prevista para Agosto de 2009.
Conclusões
A análise dos perfis eletroforéticos dos isolados de CTV obtidos em
cada um dos quadrantes de uma planta permitiu inferir que o complexo de
haplótipos do vírus apresenta-se estável e bem distribuído por todas as
partes da planta, resultando em um único padrão de SSCP.
No entanto, os perfis eletroforéticos de SSCP obtidos das três
plantas estudadas foram diferentes entre si, mostrando que os complexos
virais presentes nestas plantas são constituídos por diferentes haplótipos do
vírus. Esses resultados demonstram que as sucessivas inoculações do vírus
pelo vetor e a passagem entre hospedeiros podem alterar a composição de
haplótipos dos complexos do CTV.
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Agradecimentos
Ao PIBIC/CNPq-UEM pela bolsa de estudos.
Referências
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