Diagnóstico biológico e molecular, e análise da - PPGAgro

1
UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO E MOLECULAR, E
ANÁLISE DA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO
GENE DA PROTEÍNA CAPSIDIAL DE UM ISOLADO
DE Apple stem pitting virus DE PEREIRA
PAULA RADAELLI
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-graduação em
Agronomia da Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinária
da Universidade de Passo Fundo,
para obtenção do título de Mestre
em Agronomia – área de
concentração em Fitopatologia.
Passo Fundo, março de 2005
2
UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO E MOLECULAR, E
ANÁLISE DA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO
GENE DA PROTEÍNA CAPSIDIAL DE UM ISOLADO
DE Apple stem pitting virus DE PEREIRA
PAULA RADAELLI
Bióloga
Orientadora: Profª. Drª. Jurema Schons
Co-orientador: Dr. Osmar Nickel
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-graduação em
Agronomia da Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinária
da Universidade de Passo Fundo,
para obtenção do título de Mestre
em Agronomia – área de
concentração em Fitopatologia.
Passo Fundo, março de 2005
3
“Cada pessoa que passa em nossa vida é única, passa sozinha,
mas não vai sozinha, e nem nos deixa só, sempre deixa um pouco
de si e leva um pouco de nós. Há as que levaram muito, mas não
há as que não deixaram nada...”.
“Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,
qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim”.
Dedico este trabalho aos meus
pais Paulo e Helena e a minha
irmã Milena, sem os quais
minhas
conquistas
jamais
seriam especiais.
4
_________________________________________________________________
R124d
Radaelli, Paula
Diagnóstico biológico e molecular, e análise da seqüência de
nucleotídeos do gene da proteína capsidial de um isolado de Aplle
stem pitting virus de parreira / Paula Radaelli. – 2005.
49 f. ; 29 cm.
Dissertação (mestrado) – Universidade de Passo Fundo, 2005.
Orientação: Dra. Jurema Schons
1.
Doença de planta 2. ASPV 3. Árvore frutífera 4. Macieira
5. Pereira I. Título II. Shons, Jurema, orient.
_________________________________________________________________
Catalogação: bibliotecária Ana Paula Benetti Machado - CRB 10/1641
5
AGRADECIMENTOS
Um trabalho só é desenvolvido com a colaboração de
muitas pessoas. À todas elas meu sincero agradecimento.
À Drª. Jurema Schons pela orientação, amizade, carinho e
incentivo perene à pesquisa.
Ao Dr. Osmar Nickel pela co-orientação, ensinamentos,
dedicação e disponibilidade que possibilitou a realização deste
trabalho.
À coordenação do Programa de Pós-graduação em
Agronomia da Universidade de Passo Fundo pela dedicação e
disponibilidade.
A Marcos Fernando Vanni, Daiana Rizzon, Fernanda Dalcin
e Ivana Prá por todo o auxílio prestado no laboratório e amizade.
Aos funcionários e estagiários da Embrapa Uva e Vinho, em
especial aos amigos do laboratório de Biologia Molecular, Phillipe
Irala e Danielle Serafim pelo aprendizado e incentivo quando tudo
parecia dar errado.
6
Aos pesquisadores da Embrapa Uva e Vinho Dr. Thor V.
M. Fajardo e Dr. Luis Fernando Revers pelas idéias e assistências
prestadas.
Ao Dr. Luis Antônio Suita de Castro (Embrapa Clima
Temperado, Pelotas, RS) e ao Dr. Wilhelm Jelkmann (Biologische
Bundesanstalt,
Institut
für
Pflanzenschutz
im
Obstban,
Dossenheim, Alemanha) pela doação dos anti-soros utilizados, ao
pesquisador Dr. João Bernardi (Embrapa Uva e Vinho, Estação
Experimental de Fruticultura Temperada, Vacaria. RS) pela coleta
e envio das amostras analisadas e ao Dr. Francisco Aragão
(Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília. DF), pelo
seqüenciamento dos fragmentos clonados.
Aos amigos da pousada dos estagiários da Embrapa Uva e
Vinho pelo afeto e apoio.
Aos colegas do mestrado pelo auxílio e colaboração para
realização das disciplinas. Em especial as amigas e parceiras
Ariane, Cheila, Jucenara, Kalíbia, Tanaka, Vanessa e minha prima
Daniele,
pelos momentos
descontraídos,
desabafos e
até
conversas intelectuais.
A toda minha família pelo incentivo, compreensão e críticas
construtivas que muito contribuíram para minha formação.
7
À família Gugel Neves pelo carinho com que me acolheram,
pela paciência e momentos alegres que passamos juntos.
À Universidade de Passo Fundo pela concessão da bolsa e
oportunidade de realizar o curso.
À
Embrapa
Uva
e
Vinho
pela
infra-estrutura
e
disponibilidade dos recursos e a concessão temporária de uma
bolsa, que auxiliaram na elaboração deste trabalho. À FINEP pelo
financiamento do projeto e concessão de bolsa.
8
DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO E MOLECULAR, E ANÁLISE DA
SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO GENE DA PROTEÍNA
CAPSIDIAL DE UM ISOLADO DE Apple stem pitting virus DE
PEREIRA
Paula Radaelli1, Jurema Schons2, Osmar Nickel3
RESUMO - Apple stem pitting virus (ASPV), ocorre na maioria das
cultivares comerciais de macieiras, pereiras e marmeleiros, em
todas as regiões pomicultoras do mundo, geralmente em
combinação com outros vírus. Facilmente transmitido por enxertia,
seus danos consistem de redução do vigor das plantas, da
qualidade dos frutos e da produção. Com o objetivo de estabelecer
técnicas de diagnose para o isolado brasileiro de ASPV, conduziuse o presente estudo no Laboratório de Virologia da Embrapa Uva
e Vinho de Bento Gonçalves, RS. Detectou-se o ASPV por RTPCR em amostras de cvs. de pêra européia (Pyrus communis L.)
Starkrimson e Abate Fetel, e das cvs. de pêra asiáticas (Pyrus
pyrifolia var. Culta (Burm)) Kousui e Housui coletadas no outono
de 2003 e de 2004, utilizando-se várias combinações de
oligonucleotídeos. Foram amplificados fragmentos de DNA de 270,
291 e 1554 pb, este último contendo o gene completo (1131 nt) da
1
Bióloga, mestranda do Programa de Pós-graduação em Agronomia da
Universidade de Passo Fundo (UPF).
2
Orientadora, Bióloga, Doutora em Ciências Biológicas, professora da FAMV e
ICB/UPF.
3
Co-orientador, Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia, pesquisador da
Embrapa Uva e Vinho.
9
proteína capsidial de ASPV (número de acesso GenBank
AY572458). A comparação das seqüências de nucleotídeos com
seqüências do banco de dados GenBank, utilizando-se a função
BLAST, revelou homologias de 88% e 89% com seqüências de
dois isolados alemães de pereira e macieira respectivamente e de
85% a 88% com três isolados poloneses, todos de pereiras. A
indicadora herbácea Nicotiana occidentalis (Willd.) cv. 37B
inoculada mecanicamente com extrato foliar da cv. Housui, reagiu
com lesões locais necróticas nas nervuras e necrose das
extremidades apicais e laterais da lâmina foliar. A indicadora
lenhosa Pyronia veitchii (Trabut) Guill, enxertada com gemas da
cv. Abate Fetel infectada, apresentou manchas cloróticas cujos
núcleos tornaram-se necróticos e bandeamento clorótico de
nervuras secundárias e terciárias. Confirmou-se a infecção com
ASPV por dot-ELISA em Pyronia veitchii e nas cvs. Abate Fetel e
Kousui e por Western blot na cv. Starkrimson. Os testes utilizados
no presente trabalho permitem diagnosticar o ASPV em matrizes
de macieiras e pereiras, evitando assim a disseminação da virose
em materiais propagativos.
Palavras-chave: Pyrus communis, Pyrus pyrifolia, Nicotiana
occidentalis, Pyronia veitchii, Flexiviridae, ASPV, dot-ELISA, RTPCR, Western blot.
10
BIOLOGICAL
AND
MOLECULAR
DIAGNOSIS,
AND
NUCLEOTIDE SEQUENCE ANALYSIS OF THE COAT PROTEIN
GENE OF AN ISOLATE OF Apple stem pitting virus
FROM
PEAR
Paula Radaelli1, Jurema Schons2, Osmar Nickel3
SUMMARY - Apple stem pitting virus (ASPV), (family Flexiviridae,
genus Foveavirus) occurs in many apple, pear and quince
commercial cultivars. It can be found worldwide wherever are
grown, frequently in combination with other viruses. Easily
transmitted by grafting. The virus damages consist of reduction of
plant vigor, of the quality of the fruits and of the production. In order
to establish of the diagnostic procedurese for Brazilian isolateds of
ASPV, this work was carried out in the Laboratory of Virology of
Embrapa Grape and Wine in Bento Gonçalves, RS. ASPV was
detected by RT-PCR in samples of the European pear (Pyrus
communis L.) cultivars Starkrimson and Abate Fetel, and the
Asiatic pear (Pyrus pyrifolia var. Culta (Burm)) cvs. Kousui and
Housui collected in the beginning of autumn 2003 and 2004 by RTPCR using different combinations of primers. Fragments of DNA of
270, 291 and 1554 bp, have been amplified, the latter containing
1
Bióloga, mestranda do Programa de Pós-graduação em Agronomia da
Universidade de Passo Fundo.
2
Orientadora, Bióloga, Doutora em Ciências Biológicas, professora da FAMV e
ICB/UPF.
3
Co-orientador, Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia, pesquisador da
Embrapa Uva e Vinho.
11
the complete coat protein gene (1131 nt) of ASPV (GenBank
access number AY572458). Comparison of the nucleotide
sequences of ASPV BR1 with sequences of the data base
GenBank, using the function BLAST, showed 88% and 89%
homology with sequences of two German isolates and 85% to 88%
with three Polish isolates, from pear. The herbacceus indicator
Nicotiana occidentalis Willd. cv.37B mechanically inoculated with
leaf extracts of ASPV infected cv. Housui presented marginal leaf
necrosis and severe vein necrosis. The woody indicator Pyronia
veitchii (Trabut) Guill, inoculated with infected cv. Abate Fetel,
displayed chlorotic spots which turneds necrotic, and chlorotic vein
banding of secondary and tertiary leaf veins. ASPV-infection was
confirmed by dot-ELISA in Pyronia veitchii, in the cvs. Abate Fetel
and Kousui, and by Western blot in the cv. Starkrimson. The used
tests in the present work allow to diagnosis the ASPV in apple and
pear mother stok, thus preventing dissemination of ASPV in
propagative material.
Key
words:
Pyrus
communis,
Pyrus
pyrifolia,
Nicotiana
occidentalis, Pyronia veiitchii, Flexiviridae, ASPV, dot-ELISA, RTPCR, Western blot.
12
1 INTRODUÇÃO
Doenças virais podem provocar danos em todas as partes
das plantas frutíferas, causando perdas econômicas por redução
da produção ou qualidade dos produtos e da rentabilidade e
longevidade do pomar. Alguns vírus ocorrem de forma epidêmica,
outros podem estar presentes sem necessariamente, produzir
danos, causando apenas pequenas perdas, por vezes sem induzir
qualquer sintoma visível, como é o caso dos vírus chamados
latentes (Matthews, 1981).
Cerca de 30 doenças de macieira (Malus domestica L.),
pereira européia (Pyrus communis L.), pereira asiática (Pyrus
pyrifolia var. culta (Burm)) e marmeleiro (Cydonia oblonga Mill.)
são causadas por vírus, viróides e agentes assemelhados.
Segundo o patógeno, a virulência do isolado viral, a suscetibilidade
da cultivar afetada e as condições ambientais, podem manifestarse em folhas, flores, frutos, na casca e na madeira de troncos e
galhos estruturais, ramos e raízes (Nickel, 2004).
Dentre os vírus que infectam macieiras, pereiras e
marmeleiros destaca-se o vírus das caneluras do tronco de
macieiras, Apple stem pitting virus (ASPV), (Família Flexiviridae,
gênero Foveavirus) (Koganezawa & Yanase, 1990; Jelkmann,
1994).
Por ser um vírus latente em macieiras e pereiras, não
produzindo sintomas visualmente perceptíveis em cultivares
13
comerciais, o ASPV pode passar despercebido e ser propagado
indefinidamente, se o material não for submetido a indexação.
Seus danos consistem em redução de vigor das plantas, da
qualidade dos frutos e da produtividade.
Considerando que o ASPV é um vírus importante das
frutíferas em função dos danos que causa, e que não há estudos
desta virose no Brasil são extremamente restritos no que se refere
à variabilidade do patógeno, propôs-se o presente trabalho
objetivando:
a) Caracterizar um isolado de ASPV que ocorre no sul do Brasil,
possibilitando comparar o grau de parentesco com os isolados já
descritos em outros países depositados em bases de dados,
contribuindo assim, para ampliar o conhecimento sobre o vírus,
sua dispersão geográfica e sua diversidade biológica, visando à
utilização dos resultados em programas de produção de cultivares
livres de vírus.
b)
Estabelecer
o
diagnóstico
do
vírus
e
caracterizar
molecularmente a proteína capsidial de um isolado de ASPV
obtido de pereiras;
c) Observar e descrever os sintomas do mesmo isolado do ASPV
em plantas indicadoras herbáceas e lenhosas.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
O Apple stem pitting virus (ASPV), ocorre na maioria das
cultivares comerciais de macieiras, pereiras européias e asiáticas
e também de marmeleiros, em todas as regiões pomicultoras do
mundo, geralmente em combinação com outros vírus.
O ASPV possui partículas alongadas, filamentosas e
flexuosas, de 12 a 15 nm de espessura e 800 nm de comprimento
(Koganezawa & Yanase, 1990; Jelkmann, 1997).
O genoma é composto de RNA de fita simples, senso
positivo, com 9306 nucleotídeos e 5 fases abertas de leitura (ORFs
– open reading frames) (Jelkmann, 1994). As ORFs 1, 2-4 e 5
codificam,
respectivamente,
metiltransferase/helicase/RNA
polimerase, as proteínas do bloco triplo de genes encontrado
tipicamente em Potexvirus e Carlavirus, envolvidas no movimento
célula-a-célula das partículas virais, e as subunidades da capa
protéica (Figura 1) (Koganezawa & Yanase, 1990; Jelkmann,
1994).
Os sintomas produzidos em indicadoras lenhosas são
usados para detecção do ASPV. A síndrome no lenho é
caracterizada pela formação coalescente de caneluras no xilema,
que em cvs. suscetíveis param na união da enxertia com o portaenxerto tolerante (Stouffer, 1989).
15
ORF1
ORF2
247kDa
25kDa
ORF4
7kDa
5’
3’
13
kDa
ORF3
44
kDa
ORF5
Figura 1. Organização genômica do ASPV (Adams et al., 2004).
Os danos causados pelo ASPV incluem, desde falhas na
"pega" da enxertia no viveiro, até reduções consideráveis de
produção e qualidade dos frutos (redução de calibre) (Baumann &
Louis, 1980). Além disso, as plantas infectadas por vírus, são
geralmente mais suscetíveis a infecções fúngicas, como a
podridão do colo, causada por Phytophthora cactorum (Campbell,
1969). Em macieira cv. Lord Lambourne infectada com 5 vírus de
macieira, dentre eles o ASPV, observou-se uma redução do vigor
e morte das plantas quando comparada com uma macieira sem
vírus inoculada com o mesmo fungo Campbell (1969). Em plantas
infectadas ocorre uma redução na capacidade de utilização de
nutrientes, aumentando o custo de produção e o impacto
ambiental da atividade pomicultora (Baumann & Louis, 1980).
16
Considerando
que
o
único
método
conhecido
de
transmissão é a enxertia, o ASPV pode ser controlado usando-se
propagação de materiais livres de vírus. É possível eliminar o
ASPV dos tecidos infectados por termoterapia, na qual as plantas
são submetidas a uma temperatura de 38 °C, durante um período
que de 4 a 5 semanas. Brotações emitidas durante o tratamento,
são na sequência enxertadas sobre porta-enxertos sadios ou
usadas para extração e cultivo in vitro, permitindo, desse modo, o
desenvolvimento de clones livres da doença (Stouffer, 1989;
Lemoine, 1990; Jelkmann, 1997).
Diversas doenças estão associadas ao ASPV. Entre elas
destacam-se as caneluras produzidas em cultivares suscetíveis de
macieiras, como a cv. Virginia Crab, o “amarelecimento das
nervuras” o “empedramento dos frutos”e o “mosqueado vermelho
da pêra”, a “deformação dos frutos” e as “manchas anelares
ferruginosas do marmelo”, a “epinastia e o declínio do Spy 227”, e
o “descascamento”e o “nanismo de platycarpa” (Refatti & Osler,
1975; Stouffer, 1989; Cameron, 1989; Jelkmann, 1997; Paunovic &
Rancovic, 1998; Schwarz & Jelkmann, 1998; Paunovic et al.,
1999).
Entre as indicadoras biológicas do ASPV, destacam-se
cultivares de Malus domestica (L.) e outras espécies desse
gênero, Pyrus communis (L.) e o híbrido Pyronia veiichii (trabut)
Gull.
A enxertia é o único meio pelo qual o ASPV é transmitido
para plantas hospedeiras lenhosas. Transmissão experimental por
17
inoculação mecânica, foi obtida para Nicotiana occidentalis cv. 37B
(Vana der Meer, 1986) e N. occidentalis Wheeler subsp obliqua
Wheeler (Koganezawa & Yanase, 1990). Leone et al. (1995)
demonstraram a retrotransmissão do vírus de N. occidentalis
Wheeler para macieiras e pereiras, e com isto o preenchimento
dos requisitos dos postulados de Kock.
O diagnóstico dos vírus de fruteiras pode ser realizado
através da enxertia de tecidos de plantas a serem testadas em
plantas indicadoras; ou conduzida em laboratório por sorologia,
baseada na detecção da proteína capsidial do vírus; e por meio de
técnicas moleculares como a PCR ou RT-PCR, baseados na
amplificação de um molde de ácido nucléico viral pela enzima
polimerase de Thermus acquaticus (Saiki et al., 1988).
A sorologia é uma ferramenta usada com muito sucesso por
ser prática e rápida no diagnóstico de agentes infecciosos como
vírus, fungos e bactérias. Entretanto, seu uso é limitado, pois,
dependendo do estágio de desenvolvimento das plantas e das
estações do ano, pode haver interferência negativa destes fatores
nos resultados devido flutuações do título viral. Para a utilização
desta técnica, deve-se dispor de anti-soros produzidos contra
antígenos específicos (Zerbini, et al., 2002), também necessários
para o diagnóstico por meio de Western blot (Towbin et al., 1979).
Como outros vírus de macieira e pereiras, ASPV é latente,
tornando-se necessária a utilização de plantas indicadoras para
realizar a indexação biológica (Tabela 1).
18
Tabela 1. Espécies/variedades utilizadas na indexagem biológica
do ASPV e os respectivos sintomas que desenvolvem
(adaptado de Nickel, 2004)
ESPÉCIES/VARIEDADES
Malus domestica ‘Spy 227’
Pyronia veitchii
SINTOMAS
MC, (C), E
MAC, BC, C, MC
M. domestica cv. Virginia Crab
NUE, C, IBE
M. domestica cv. Radiant Crab
E, NN
( ) sintoma ocorre com certos isolados, não sendo uma regra geral.
(MC) manchas necróticas e/ou cloróticas, (C) caneluras na madeira, (E)
epinastia foliar, (MC) manchas cloróticas, (MAC) manchas anelares
cloróticas , (BC) bandeamento clorótico de nervuras, (NUE) necrose na
união da enxertia, (IBE) inchamento da base do enxerto, (NN) necrose
de nervuras, entre outros.
19
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Local de execução e material vegetal
Os experimentos de laboratório foram conduzidos no
Laboratório de Virologia da Embrapa Uva e Vinho de Bento
Gonçalves, RS, utilizando-se as cultivares de pereiras européias
Starkrimson e Abate Fetel, e pereiras asiáticas Kousui e Housui,
coletadas na Estação Experimental da Embrapa Uva e Vinho,
Vacaria, RS, no outono de 2003 e no outono de 2004.
3.2 Extração de ácidos nucléicos totais
A extração de ácidos nucléicos totais de folhas e cascas de
ramos de pereiras cvs. Starkrimson, Abate Fetel, Kousui e Housui,
foi realizada por adsorção de ácidos nucléicos totais em partículas
de dióxido de silício (Boom et al., 1990). O porta enxerto comercial
sadio cv. Pyrodwarf (P. communis: Old Home x Bonne Louise
D’Avranches) produzida por cultura de meristemas in vitro foi
usada como controle negativo.
Às amostras, de 300 mg de tecido vegetal macerado com
nitrogênio líquido, adicionou-se 3 mL de tampão de extração (4 M
tiocianato de guanidina; 0,2 M NaOAc pH 5,2; 25 mM EDTA pH
8,0; 1M KOAc; 2,5 % peso/vol PVP-40) com 30 µL de
20
mercaptoetanol para cada amostra e da mistura foram transferidos
500 µL para tubos Eppendorf e adicionados 100 µL de NLS 10%
(N-Lauroyl- Sarcosine sodium salt). Em seguida as amostras
foram incubadas a 70 ºC por 10 minutos com agitação intermitente
e mantidas em gelo por 5 minutos. Estas então foram
centrifugadas a 12.000 xg por 10 minutos, e a fase aquosa foi
transferida para um novo tubo ao qual adicionou-se 150 L de
etanol absoluto,300
L de 6M de NaI e 25
L de sílica (Boom et
al., 1990). As amostras foram homogenizadas por 10 minutos com
agitação intermitente à temperatura ambiente e centrifugadas a
6.000 xg por 1 minuto. O sobrenadante foi descartado e o
sedimento lavado com 500
L de tampão de lavagem (10mM Tris-
HCl pH 7,5; 0.5 mM EDTA pH 8.0; 50 mM NaCl; 50 % EtOH). Em
seguida as amostras foram centrifugadas a 6.000 xg por 1 minuto.
O sobrenadante foi descartado e o precipitado mantido a
temperatura
ambiente
para
secagem.
O
sedimento
foi
ressuspendido em 150 µL de água autoclavada e incubado a 70 ºC
por 4 minutos. As amostras foram centrifugadas a 12.000 xg por
10 minutos e 120 µL do sobrenadante foram transferidos para um
novo tubo, e armazenados a -20 ºC.
3.3 Síntese de cDNA e amplificação por PCR
A reação de síntese de cDNA constituiu-se, para todas as
amostras, de: 1µL de RNA total, 9,6 µL de água, 0,7 µL de inibidor
21
de RNAse (40 U/µL) e 0,7 µL de oligonucleotídeo oligo (dT) (10
µM). A mistura foi incubada por 10 minutos a 70 °C e 5 minutos no
gelo. Posteriormente, foram acrescentados 4 µL de tampão 5X da
transcriptase reversa, enzima M-MLV (Moloney murine leukemia
virus), 2 µL de DTT (dithiothreitol) (0,1 M), 1 µL de dNTPs (2,5
mM) e 1µL de transcriptase reversa M-MLV (200 U/µL). A mistura
foi incubada a 37 °C por 1 hora e depois a 70 °C por 15 minutos.
Para a PCR foram preparados para cada amostra 50 µL da
seguinte mistura de amplificação: 5µL de tampão da enzima 10 X,
1,5 µL de MgCl2 (1,5 mM), 4 µL de dNTPs (2,5 mM cada, dATP,
dTTP, dCTP e dGTP), 1 µL de Taq DNA polimerase (5 U/µL), 1 µL
de cada oligonucleotídeo (10 µM) e 5 µL da reação de cDNA. O
volume foi completado para 50 µL com água esterilizada. A mistura
foi desnaturada a 95 ºC por 10 minutos, seguidos de 35 ciclos de
amplificação (desnaturação de 1 minuto a 94 ºC, pareamento de 1
minuto a 50 ºC e extensão de 1 minuto a 72 ºC), e uma extensão
final de 10 minutos a 72 ºC. Foram utilizados os oligonucleotídeos
ASPV1, ASPV2 (Malinowski et al., 1998), ASPV3, ASPV4 e
ASPV5 (Jelkmann, 1994). Os fragmentos amplificados foram
obtidos a partir de combinações desses oligonucleotídeos (Tabela
2).
A análise dos produtos das amplificações foi realizada em
gel de agarose 1,2%, preparado em tampão de corrida 1X TBE
(0,09 M Tris HCl + 0,09 M ácido bórico + 2 mM EDTA, pH 8,0).
Para o seqüenciamento do gene da proteína capsidial, a banda de
22
tamanho esperado de 1554 pb, obtida a partir da combinação dos
oligonucleotídeos ASPV3 e ASPV5, foi recortada do gel e o DNA
eluído com o kit de purificação GFX (Amersham Biosciences) de
acordo com as especificações do fabricante.
Tabela 2. Oligonucleotídeos usados na detecção de Apple stem
pitting virus isolado BR1
Posição no Orientação
genoma
ASPV1 AGCGGTTGCCTATTTTTGCTC 3480-3501
senso
C
ASPV2 GTCAGGTCAAAGATGCTGAA 3750-3770 antisenso
A
senso
ASPV3 GTACATGAGTAACTCGAGCC 7709-7728
Nome
Seqüência
ASPV4 CTCTTGAACCAGCTGATGGC
8993-9012
Senso
ASPV5 ATAGCCGCCCCGGTTAGGTT
9243-9262
Antisenso
Combinação: ASPV1 e ASPV2, fragmento de 291 pb; combinação:
ASPV3 e ASPV5, fragmento de 1554 pb; combinação ASPV4 e ASPV5,
Fragmento de 270 pb.
3.4 Clonagem de fragmento de ASPV e transformação de
Escherichia coli
O fragmento de 1554 pb de ASPV foi clonado no vetor
pGEM-T Easy (Promega). A reação de ligação estava composta
de 5 µL do DNA purificado, 10 µL 2X de tampão da ligase, 1µL do
vetor, 1 µL de ligase T4 e 3 µL de água autoclavada, desionizada.
23
A mistura de 20 µL da reação de ligação foi incubada em tubo
Eppendorf por 3 horas a 15 ºC e 200 µL de células competentes
de E. coli DH5α foram adicionados. As células foram incubadas
em gelo por 30 minutos, submetidas a um choque térmico a 42 ºC
por 90 segundos e devolvidas em seguida ao gelo. Foram então
adicionados 800 µL de meio de cultura LB. Após incubação por 1
hora a 37 ºC e centrifugação por 15 segundos, retiraram-se 800 µL
do meio líquido, e as células foram ressuspendidas no volume
restante de 200 µL e plaqueadas em meio de cultura LB sólido
com ampicilina (100 µg/mL), 40 µL de X-Gal (20 mg/mL) e 4 µL de
IPTG (200 mg/mL) por placa. As colônias recombinantes, brancas
ou
transparentes
foram
transferidas
por
meio
de
palitos
esterilizados para tubos de ensaio com 3 mL de meio de cultura LB
com ampicilina (100 µg/mL) e incubadas com agitação de 120 rpm
durante a noite a 37 °C, para possibilitar o crescimento bacteriano.
3.5 Extração e digestão de DNA plasmidial
O DNA plasmidial de clones transformados foi extraído
utilizando-se o kit “FlexiPrep” (Amersham Biosciences) de acordo
com as instruções do fabricante. A confirmação da presença de
fragmento de ASPV nos plasmídeos recombinantes foi realizada
por clivagem com a enzima de restrição EcoRI a 37 °C por 1 h e
visualização dos produtos da digestão em gel de agarose como
mencionado no item 3.3.
24
O clone recombinante foi seqüenciado e a seqüência de
nucleotídeos e de aminoácidos deduzidos foi analisada e
comparada com as seqüências do banco de dados GenBank,
utilizando-se a função BLAST do NCBI.
3.6 Indexação biológica
A indexação biológica foi feita em outubro de 2004,
enxertando-se gemas de cultivares de pêra infectadas, Abate Fetel
e Housui, em indicadoras lenhosas sadias, sendo elas: Spy 227,
Virginia crab, Malus platycarpa, Beurrce Hardy, Pyronia veitchii e
Radiant crab, enxertadas em Pyrus calleryana (Decne). Foram
enxertadas 3 gemas de cada cultivar de pêra infectada em 6
plantas de cada indicadora lenhosa. Após as enxertias, as plantas
permaneceram em casa de vegetação para acompanhamento e
avaliação.
Folhas das pereiras cvs. Starkrimson, Abate Fetel, Kousui e
Housui, infectadas com o ASPV foram maceradas utilizando-se
tampão fosfato de potássio 0,01M e nicotina 2,5% pH 7,5 e
inoculadas mecanicamente em folhas jovens de N. occidentalis, N.
occidentalis obliqua e N. occidentalis 37B, em casa de vegetação.
A RT-PCR de extratos de RNA total das plantas indicadoras
foi executada conforme protocolo mencionado no item 3.5 com os
oligonucleotídeos ASPV1 e ASPV2.
25
3.7 Dot-ELISA
Para o dot-ELISA utilizaram-se como antígeno extratos de
cascas de ramos e folhas de pereiras cvs. Abate Fetel e Kousui, e
Pyronia veitchii, esta enxertada com gemas da cv. Abate Fetel
infectada. Extrato foliar do porta-enxerto comercial sadio cv.
Pyrodwarf, foi utilizado como controle negativo.
As amostras foram maceradas em tampão TBS (Tris-base
0,02 M, NaCl 0,05 M, pH 7,5) com sulfito de sódio a 0,2% (p/v), na
proporção
1:5,
e
aplicados
20
µL
sobre
membrana
de
nitrocelulose. A seguir, a membrana foi mergulhada em solução
bloqueadora (TBS, pH 7,5, acrescido de 2% de Triton X-100 e de
2% de leite em pó desnatado (LPD)), onde permaneceu por 1
hora, sob agitação lenta. A membrana foi tratada com 10 µL de
anti-soro
contra
ASPV
(fornecido
pela
Embrapa
Clima
Temperado), diluído em 1:1000 em TBS com LPD a 2%,
incubando-se durante a noite, sob agitação. A membrana foi
lavada 3 vezes em TBS com Tween 20 a 0,05%, sob agitação (100
rpm) e incubada, por uma hora, com adição de 10 µL de anti-IgG
comercial (Sigma), diluído 1:1000 em TBS com LPD a 2%. Em
seguida, procedeu-se a nova lavagem da membrana, por 4 vezes
com TBS + Tween 20. O complexo antígeno-anticorpo foi
detectado pela adição do tampão de revelação (0,1 M tris-base +
0,1 M NaCl + 5 mM MgCl2, pH 9,5), ao qual foi adicionado, na hora
da revelação, 0,165 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
(BCIP) e 0,33 mg/mL de ‘nitroblue tetrazolium’ (NBT). A reação foi
26
interrompida mergulhando-se a membrana em água destilada
(Fajardo et al., 2000).
3.8 Western blot
O Western blot foi executado de acordo com Towhin et al.
(1979). As amostras constaram de casca de ramo de pereira
cultivar Starkrimson, e amostra foliar do porta-enxerto de pereira
comercial Pyrodwarf, as quais foram maceradas na proporção 1:10
em tampão de extração: 1. Tris HCl 0.05 M, pH 8.3; 2. Tris HCl
0.5 M, pH 6.8, SDS 10%, 5% glicerol, 2,5% 2-ME, (1:1) e água
destilada para completar o volume. As amostras de extratos de
proteínas totais (Hussain et al., 1986) foram fervidas, em banhomaria por 3 minutos e em seguida colocadas em gelo para
resfriamento e centrifugadas a 10.000 xg durante 20 minutos. As
alíquotas foram armazenadas a -20 °C.
O extrato de proteínas contendo a proteína viral foi
analisado por meio de SDS-PAGE, utilizando-se o sistema de gel
descontínuo vertical, com o gel concentrado em poliacrilamida a
4% e o gel separador a 12% (Laemmli, 1970). Retiraram-se do
freezer 30 µL de cada amostra e adicionaram-se 6 µL de tampão
de carga, este contendo azul de bromofenol (0,25%) e glicerol
(30%). As mesmas foram fervidas, em banho-maria, por 3 minutos
e aplicadas no gel, juntamente com 5 µL de marcador molecular
Magic Mark (Invitrogen). Após a corrida de duas horas a 120 V,
com tampão de eletroforese (25 mM Tris + 192 mM glicina + 10%
27
de SDS, pH 8,3) o gel foi mergulhado em tampão de transferência
(25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol) para promover a
remoção de sais e detergentes presentes no tampão de
eletroforese. As frações antigênicas, separadas por eletroforese,
foram transferidas eletroforeticamente, do gel à membrana de
nitrocelulose (Amersham), utilizando-se aparato de transferência
(BioRad) com tampão de transferência por uma hora a 80 V. Após
a transferência, a membrana foi processada e revelada como no
teste de dot-ELISA (Item 3.7), com anti-soro cedido pelo Dr. W.
Jelkmann (Dossenheim, Alemanha).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com os oligonucleotídeos ASPV4 e ASPV5 foi amplificado
um fragmento de 270 pb (Figura 2), a partir de extratos foliares das
quatro cultivares de pereira testadas, representando assim, um
excelente instrumento para detecção do ASPV.
A partir deste resultado, os oligonucleotídeos ASPV4 e
ASPV5 passaram a ser utilizados nas reações do controle positivo
do ASPV.
A combinação dos oligonucleotídeos ASPV3 e ASPV5
resultou na amplificação de um fragmento de 1554pb (Figura 3) da
cv. Abate Fetel, contendo o gene completo da proteína capsidial, o
qual foi clonado e seqüenciado (Figura 5) e depositado no banco
de dados Genbank (número de acesso AY572458).
28
2
pb
2838
1700
1159
805
514
339
270
264
247
M
1
2
3
4
Figura 2. Análise de produtos da RT-PCR (M) Marcador
DNAλ/PstI. (1) cv. Starkrimson; (2) cv. Abate Fetel;
(3) cv. Kousui; (4) cv. Housui.
De extratos foliares de N. occidentalis 37B inoculada
mecanicamente com o vírus, amplificou-se um fragmento de 291
pb (Figura 4) utilizando-se os oligonucleotídeos ASPV1 e ASPV2,
que contém parte do gene da polimerase viral.
29
3
pb
1554
270
M
1
2
Figura 3. Análise de produtos da RT-PCR (M) Marcador
DNAλ/PstI. (1) Controle positivo, cv. Housui; (2) cv.
Abate Fetel.
30
4
270
pb
291
M
1
2
3
Figura 4. Análise de produtos da RT-PCR (M) Marcador
DNAλ/PstI. (1) Controle positivo, cv. Housui; (2) Controle
negativo, Pyrodwarf; (3) N. occidentalis 37B.
1
TGTAGGTTGTGTTTACTCTGAAGCTTTTATAGAGCTAGTTAAAGGCCTTAAGCCTTATTA
61
CCACCCATTAGGTCAGGGTGTAGTTGCTTAATATTATATAAGTTTGAGGGTGTTCTGTTG
121 TGTGTTTAAAGTTAAAGTTTTAATTGCAATCAGTGTGTTCTTCTATGGCTTCCGACGGAT
M A S D G S
31
181 CCCAGCCTCCAGCTTCCACTCCACTCACTTCCGTGGAGGAATCTACAGCTGCAGCTTCAG
Q P P A S T P L T S V E E S T A A A S A
241 CCCCAATTTCTAGTGCAATTAGCTCGGCCCCCGCAAATGCTCCAGCTGCTAGTGAGCCAG
P I S S A I S S A P A N A P A A S E P V
301 TCATCTCCCAGGTTCAATCATTGGCTCCCTTAGTTAGTGGCTTTGACCCAAATCTTCATG
I S Q V Q S L A P L V S G F D P N L H G
361 GGCGACTTACTAATGAGCAAATGCGGCAGGCCCAGAGTGGAGCTACAAGTCAGGATCGTG
R L T N E Q M R Q A Q S G A T S Q D R V
421 TCAGTATGACCTCTAATCCATTTGAAACTGGTACTGCCTATAGTAGGGGGCCACGTGCAA
S M T S N P F E T G T A Y S R G P R A S
481 GCATGGGGCCTTACCTGAACTTTCCTGGAAGTGGAAGTGCTAGTGAGCCTAATTCTCAGA
M G P Y L N F P G S G S A S E P N S Q R
541 GGATTTTTCCTTTACAACATGGGGTGAATCCTTCAGCTCATGCTTCCGATCTTGTGCCAA
I F P L Q H G V N P S A H A S D L V P N
601 ATCAGCCCACTTCAGGTGGAAATGCTGGAACTCCCTTCACTCTTGGCAATAGAATGCCAA
Q P T S G G N A G T P F T L G N R M P R
661 GAAATGTCACGGCCAATACTGGGGGAATGAGGAGACGTCTTGACTCCGTTGGTCTCAAGA
N V T A N T G G M R R R L D S V G L K N
721 ATATTGGGTATGAACCCCAGGCTGGAGTTGTGGCAAGCAATCAAAAGATCAGAGCTGTCG
I G Y E P Q A G V V A S N Q K I R A V G
781 GCGTTGCACTCGTAGGAATGGGAATCCCTGAGCATCAACTCACAGAGGTGGGAGTTTATC
V A L V G M G I P E H Q L T E V G V Y L
841 TGGCTAGGCATTGCGCAGATGTTGGCGCCTCAGACAAGTCTACATTATTGGGAACTTTCC
A R H C A D V G A S D K S T L L G T F P
901 CTGGTTCTGACATCACTCTGGAGGAGGTTGGAACTATGATCAAGCAGACTGAGGGGTGTA
G S D I T L E E V G T M I K Q T E G C T
961 CTTTGAGGCAATATTGTGCCTTCTATGCAAAGCATGTTTGGAACCTCATGCTGCAGACCC
L R Q Y C A F Y A K H V W N L M L Q T Q
1021 AAAGTCCACCAGCCAATTGGGTCGGCAAAGAGTTCAAATTCGAAACAAGGTATGCAGTCT
S P P A N W V G K E F K F E T R Y A V F
1081 TTGACTTCTTCTTTGGAGTTGAAAGTACCGCTTCTCTTGAGCCAGCAGACGGCCTGATAA
D F F F G V E S T A S L E P A D G L I R
1141 GGCTTCCAACCCAAGCTGAGAGAGTGGCCAATGTTACGAGCAAGGAGATACAGATGTACC
L P T Q A E R V A N V T S K E I Q M Y R
32
1201 GCATCCGCTCAATGGAGGGTACTCAGGCCGTTAATTTTGGTGTGGTTACAGGGGGAAAAA
I R S M E G T Q A V N F G V V T G G K I
1261 TTGGACCCAAGCCAGTTCTATCCATTAGGAAGTAACTAATTAATTAATTTTCCTGCATTT
G P K P V L S I R K *
1321 TCAATTTCCAGTACTTATGCTTTTTAGAAAGTTGATCCCAACCTAACCGGG
Figura 5. Fragmento contendo seqüência completa de nucleotídios
(superior) e aminoácidos deduzidos (inferior) do gene da
proteína capsidial do isolado BR1 do ASPV.
A maior identidade de nucleotídeos do isolado de ASPV
(89%) coletado nos Campos de Cima da Serra foi observada com
um isolado alemão (D21829) de macieira e a menor foi de 85%
com isolados poloneses (AF345893 e AF345894). A maior
identidade de aminoácidos deduzidos foi de 84% com dois
isolados poloneses de pereira (AAK30563 e AAK30566) e a menor
identidade foi de 75% com os dois isolados alemães (BAA04852 e
BAA04853), respectivamente de macieira e pereira. Foi possível,
na análise das seqüências de nucleotídeos e aminoácidos
deduzidos associar esse clone a outros isolados do mesmo vírus
(Tabela 3), confirmando a identificação do isolado nos materiais
analisados.
33
Tabela 3. Comparação de identidade (%) das seqüências de nucleotídeos (diagonal superior) e de
aminoácidos deduzidos (diagonal inferior) do gene da proteína capsidial do isolado de Apple stem
pitting virus (ASPV BR1) com as respectivas seqüências de outros isolados
ISOLADO VIRAL
ASPV BR1 (1)
ASPV BR1 (1)
Alemão PA66 Alemão
(2)
89%
Polonês
PSA-H (3) GNKVII/34 (4)
ST132 (5)
ST113(6)
85%
85%
88%
99%
80%
88%
91%
80%
88%
90%
81%
82%
75%
Alemão PSA-H (3)
75%
89%
84%
76%
83%
Polonês ST132 (5)
82%
76%
76%
74%
Polonês ST113 (6)
84%
76%
78%
74%
GNKVII/34 (4)
Polonês
88%
Alemão PA66 (2)
Polonês
Polonês
92%
89%
Acesso GenBank (NCBI): (1) AY572458/AAS78637, (2) D21829/BAA04853 (3) D21828/BAA04852, (4)
AF345893/AAK30563, (5) AF345894/AAK30565, (6) AF345895/AAK30566. Isolados 1, 3, 4, 5 e 6 de pereira,
2 de macieira.
As espécies da família Flexiviridae têm entre seus genes
completos da proteína capsidial e polimerase, identidade de ≥
72% de nucleotídeos e ≥ 80% de aminoácidos. Espécies de
gêneros diferentes têm menos de 40% de identidade de
nucleotídeos e de 40% de identidade de aminoácidos (Adams et
al., 2004). Assim, foi possível confirmar que o isolado ASPV BR1
pertence à mesma espécie do vírus encontrado na Alemanha e na
Polônia, com os quais foi comparado.
Figura 6. Região de deleção (seta) observada a partir do
alinhamento das seqüências de aminoácidos de
ASPV, isolado ASPV BR1 e isolado alemão PA66
(NCBI, 2005).
O alinhamento da seqüência obtida do isolado ASPV BR1
mostrou diferenças substanciais no tamanho do gene da proteína
capsidial (Tabela 4) quando comparado com os isolados alemães,
não diferindo significativamente dos isolados poloneses. Os dois
isolados alemães de ASPV apresentam duas regiões diferentes do
isolado ASPV BR1 no gene de proteína capsidial, uma com
deleção (Figura 6) e outra com inserção (Figura 7) de 113
nucleotídeos. Mesmo assim, o isolado ASPV BR1 apresentou alta
homologia (89%) com o isolado alemão. Malinowski (1998)
comparando um isolado polonês também verificou essa diferença
em relação ao isolado alemão. Não foi possível, entretanto,
elucidar nem a causa, nem o efeito dessas diferenças merecendo,
portanto, estudos adicionais para um melhor entendimento deste
fato.
Figura 7. Região de inserção (seta) observada a partir do
alinhamento das seqüências de aminoácidos de
ASPV, isolado ASPV BR1 e isolado alemão PSAH (NCBI, 2005).
Embora, pela análise das seqüências, os valores de
homologia
sejam
determinação,
suficientemente
com segurança
da
altos
para
identidade
permitir
do
vírus,
a
a
variabilidade apresentada pode ser explicada, pela variabilidade
natural existente entre isolados de uma mesma espécie ou estirpe
viral.
Nas
condições
brasileiras
ainda
é
desconhecida
a
variabilidade do ASPV. Por diferir de outras regiões do mundo
onde este vírus está presente, a pressão de seleção no Brasil
pode estar produzindo variantes distintas daquelas encontradas
em locais com ambientes diferentes, o que justifica a necessidade
e acentua a importância do estudo realizado.
Tabela 4. Relação dos isolados de ASPV de pereiras com gene
da proteína capsidial caracterizados, disponíveis no
banco de dados GenBank
ACESSO
ISOLADO
TAMANHO PC*
Brasileiro ASPV BR1
1.131
D21892
Alemão PA66
1.244
D21828
alemão PSA-H
1.244
AF345895
Polonês ST113
1.124
AF345894
Polonês ST132
1.125
AF345893
polonês GNKVII/34
1.128
AY572458
* Referente à proteína capsidial, em pares de bases.
No teste de transmissão mecânica somente a indicadora
Nicotiana occidentalis 37B inoculada com extrato foliar da cv.
Housui, reagiu com necrose de nervuras (NN) (Figura 8A) e das
extremidades apicais (NE) e laterais da lâmina foliar (Figura 8B).
A
B
NN
NE
Figura 8. Nicotiana occidentalis 37B inoculada com extrato de
ASPV de pereira cv. Housui infectada. (A) necrose de
nervuras (B) necrose das extremidades apicais e
laterais da lâmina foliar.
Estes
resultados
encontrados
no
presente
estudo
confirmam aqueles obtidos por Van der Meer (1975) e Van Dijk et
al. (1987).
Das indicadoras lenhosas, somente
Pyronia veitchii
enxertada com gemas da cv. Abate Fetel infectada, após 6 meses
em casa de vegetação, apresentou manchas cloróticas cujos
núcleos tornaram-se necróticos e bandeamento clorótico de
nervuras secundárias e terciárias nas folhas (Figura 9).
Figura 9. Reação de Pyronia veitchii inoculada com enxertia de
gemas da cv. Abate Fetel infectada com ASPV, com
manchas cloróticas nos espaços entre as nervuras
secundárias e terciárias; anéis e/ou semi-anéis
cloróticos e bandeamento clorótico de nervuras
secundárias e terciárias de pouca extensão.
Segundo Jelkmann (1997), sintomas de ASPV em pereiras
consistem em clorose nas nervuras, principalmente nas nervuras
secundárias e terciárias o que se assemelha com o observado
neste trabalho em P. Veitchii.
1
2
3
4
5
6
7
Figura 10. Análise por dot-ELISA. (1) Controle negativo,
Pyrodwarf (folha); (2) P. veitchii (casca); (3) P.
veitchii (folha); (4) Abate Fetel (casca); (5) A.
Fetel (folha); (6) Kousui (casca); (7) Kousui
(folha).
Neste estudo o ASPV foi detectado por dot-ELISA em todas
as cultivares analisadas e nos dois tipos de tecidos amostrados
(cascas e folhas). Foi possível visualizar de forma inequívoca a
reação sorológica positiva, com evidente contraste entre amostras
infectadas, as quais apresentaram uma coloração arroxeada e a
amostra sadia, que apresentou coloração verde (Figura 10). Tanto
a casca dos ramos quanto as folhas mostraram-se adequados
para o diagnóstico do ASPV, não havendo diferenças entre
ambos.
As amostras 2 e 3 apresentaram uma coloração mais forte
que as demais. Essa diferença de cor pode ser devida a uma
maior concentração de vírus nos respectivos tecidos.
O ASPV também foi detectado por Western blot. Obteve-se
uma banda em torno de 55 kDa (Figura 11). Paunovic et al.
(1999), observaram uma banda de 48 kDa extraído de folhas de
N. occidentalis inoculada com ASPV. Em imunoblots e SDSPAGE, Jelkmann (1994) observou uma banda de 48 kDa, porém o
tamanho previsto segundo cálculo computacional feito com base
no tamanho do gene foi de 44 kDa. Essa diferença entre os
tamanhos pode ser atribuída à alta hidrofilicidade da proteína
capsidial de ASPV. Discrepância similar foi encontrada com a
proteína capsídica de Shallot virus X (ShVX), (família Flexiviridae)
sugerida por Kanyuka et al. (1992). Estes autores sugeriram que a
adsorção de moléculas de água pelas subunidades de proteína da
CP, que determina um aumento aparente do tamanho da molécula
em conseqüência de uma redução da mobilidade eletroforética. É
importante afirmar que ficou demonstrado que a proteína viral do
ASPV reagiu com o anti-soro produzido contra um isolado alemão
de ASPV.
kDa
M
C-
1
120
100
80
60
50
40
30
Figura 11. Análise por western blot. (M) Marcador molecular
Magic Mark (Invitrogen). C- (controle negativo)
Pyrodwarf sadio
(folha), 1: Starkrimson (casca de
ramos).
5 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente trabalho permitem concluir que:
a) As técnicas de PCR, dot-ELISA e Western blot e o diagnóstico
biológico são eficientes para detecção do ASPV;
b) O isolado viral estudado é um isolado de ASPV com alto grau
de homologia com outros isolados depositados em bases de
dados;
c) Caracterizou-se o gene completo da proteína capsidial de
ASPV, isolado pêra BR1;
d) Apesar de somente uma das plantas inoculadas ter sido
infectada, foi possível a transmissão mecânica do vírus para
Nicotiana occidentalis 37B e por enxertia para a indicadora
lenhosa Pyronia veitchii. O diagnóstico biológico mostrou-se
igualmente eficiente para a detecção do ASPV.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A
implementação
de
testes
diagnósticos
biológicos,
sorológicos e/ou moleculares, a exemplo dos utilizados neste
trabalho, embasa decisões de pesquisa que visem a seleção de
matrizes de macieiras e pereiras, e ainda possibilitam a segura
indexação de plantas, de maneira a evitar a disseminação da
virose em materiais propagativos.
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