Estudo do desenvolvimento embrionário e fetal de gatos (Felis catus

Estudo do desenvolvimento embrionário e fetal de gatos (Felis catus) em
diferentes estágios gestacionais e biodistribuição de células-tronco
Fernanda Lye Watari1,2, Marcos Vinícius Mendes Silva2, Graciela Conceição Pignatari2,
Patrícia Cristina Baleeiro Beltrão Braga1,2
1 Universidade de São Paulo / Escola de Artes, Ciências e Humanidades
2 Universidade de São Paulo / Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
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Resumo
A embriologia compreende o conhecimento relativo ao início da vida e as mudanças que ocorrem durante o
desenvolvimento pré-natal. O período gestacional é diferente para de cada espécie animal e a do gato
doméstico (Felis Catus) varia de 58-65 dias apresentando uma média de 62 dias. Este projeto estudou
aspectos morfológicos durante o desenvolvimento embrionário do gato doméstico e também analisou a
biodistribuição de células-tronco em quatro diferentes períodos gestacionais: 18, 24, 27 e 36 dias de
gestação. Em tempo, apesar das idades gestacionais diferentes, as células de membranas fetais
apresentaram fenótipo de células-tronco mesenquimais (MSC), o que torna essas membranas ou fluidoamniótico como sendo potenciais fontes de células-tronco mesenquimais em espécies de felinos.
Palavras chave: embriologia, felinos, morfologia animal, células-tronco
Abstract
Embryology comprises knowledge on the beginning of life and the changes that occur during prenatal
development. The gestational period is different for each animal species and the domestic cat (Felis Catus)
ranges from 58-65 days with a mean of 62 days. This project studied morphology during embryonic
development of the domestic cat and also examined the biodistribution of stem cells in four different
gestational periods, 18, 24, 27 and 36 days of gestation. In time, despite the different gestational ages, the
cells of fetal membranes showed phenotype of mesenchymal stem cells (MSC), which makes these
membranes or amniotic fluid-potential sources of mesenchymal stem cells in feline species.
Key words: embryology, feline, animal morphology, stem cells
SIICUSP 2014 – 22º Simpósio Internacional de Iniciação Científica e Tecnológica da USP
Introdução
Os gatos domésticos (Felis catus) podem manifestar naturalmente aproximadamente 36
anormalidades e defeitos metabólicos homólogos a doenças humanas (Migaki, 1982), o que faz desse
animal um importante modelo experimental. Além disso, estudos acerca do desenvolvimento embrionário do
gato poderiam ajudar a elucidar o mecanismo de algumas dessas patologias. Entretanto, material acerca do
desenvolvimento embrionário normal de gatos ainda é escasso e carente de informação. Desta maneira,
este projeto procurou investigar o desenvolvimento embrionário destes animais, em quatro diferentes
períodos gestacionais fornecendo informações que contribuam para estudos de embriologia comparada. Em
adição, foi também realizada a investigação de células indiferenciadas nos tecidos através de marcadores
de células-tronco mesenquimal(Caplan 2007; da Silva Meirelles et al., 2008), que além de jamais estudada,
pode fornecer informações sobre a qualidade da diferenciação do tecido e ainda fornecer informações sobre
nichos de células-tronco, os quais podem ser informações valiosas envolvendo protocolos de Medicina
Regenerativa.
Objetivo
Este trabalho teve como objetivo analisar o desenvolvimento embrionário do gato doméstico Felis
catus em quatro diferentes idades gestacionais. Além disso, o segundo momento do projeto teve como
objetivo verificar a presença, qualidade e biodistribuição de células-tronco nas diferentes fases gestacionais.
Materiais e métodos
Foram utilizados embriões de Felis catus em 4 tempos gestacionais distintos (18, 24, 27 e 36 dias)
obtidos no Centro de Zoonoses na cidade de Guarulhos/SP, após aprovação em Comitê de Ética da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ-USP).
Após o registro e medição do comprimento cabeça-cauda (Crown-Rump, CR) para verificar a idade
gestacional, os embriões e o feto foram fixados em paraformaldeído a 4% por 24 h, lavados em tampão
salina-fostato (PBS), fotografados e posteriormente seguiram para o processo de desidratação e inclusão na
parafina, onde posteriormente foram submetidos a cortes de 4 a 6μm em micrótomo e colocados na lâmina.
Para a análise histológica foi feita a desparafinização e coloração por Hematoxilina-Eosina e observação em
microscópio óptico de luz (HE) (Luna, LG, 1968; Tolosa, EMC et al, 2003). Para a realização da imunohistoquímica foi utilizado o anticorpo primário Vimentina (Santa Cruz Biotechnology, DA, Estados Unidos)
diluídos 1:200 em PBS 1x com 2% de soro de albumina bovina (BSA) e o anticorpo secundário HRP
(DAKO, CA, Alemanha).
Resultados
Os períodos gestacionais foram estimados baseados na análise macroscópica e do comprimento
CR, usando como base dados da curva de crescimento descrito por Evan & Sacks (1973). Na tabela 1 estão
descritos o tamanho dos embriões e feto mensurados com auxílio de um paquímetro e seus respectivos
períodos gestacionais.
Tabela 1. Embriões e fetos que participaram deste projeto
Embriões e feto
Crown-Rump
Período Gestacional
(cm)
(dias)
E18
0,90
18
E24
1, 78
24
E27
2,36
27
F36
5,0
36
No embrião E18, a coloração translúcida permitiu visualizar a vesícula ótica com início de
pigmentação. Observamos dilatação rostral correspondente ao prosencéfalo e covas olfativas visíveis na
cabeça. Os processos mandibulares encontram-se fusionados no plano mediano e pode-se notar processos
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nasais e laterais. Na cavidade torácica, há proeminência cardíaca; curvatura entre a parte posterior do
cérebro e da flexura cervical (Figura 1A). Na Figura 1B, observa-se a cavidade nasal, olho, cavidade oral e
abertura do quarto ventrículo encefálico. Assim como a presença do esôfago, coração com átrio e
ventrículo, pulmão, fígado, estômago, a coluna vertebral e a medula espinhal em formação. Através da
imunohistoquímica observa-se a marcação da vimentina no estômago (Figura 1C).
No embrião E24 observamos a presença de prosencéfalo e mesencéfalo e apresentação do talo
hipofisário longo e estreito. A vesícula ótica tem pigmentação acentuada da retina. A boca e mandíbula
estão em processo de formação. Membros superiores e inferiores em desenvolvimento sem distinção dos
dígitos nem garras (Figura 1D). Na histologia, observa-se a que a cavidade oral não se encontra ligada ao
trato-gastro-intestinal e observam-se as glândulas salivares em formação. A medula espinhal encontra-se
rodeada pela meninge primitiva, revestida por tecido conjuntivo, nervos espinhais e gânglios diferenciados.
Pulmão pseudoglandular; gônadas, rins e glândulas supra-renais encontram-se diferenciados. O labirinto
encontra-se formado por cartilagem, bem como as vértebras e costelas. (Figura 1E). Na Figura 1F, através
da imunohistoquímica observa-se a expressão da vimentina em estrutura cartilaginosa.
O embrião de 27 dias de gestação (Figura IG) demonstra formação de nariz e boca. O meato
acústico externo está em desenvolvimento. Dentro da cabeça, músculos orbitais, olhos, boca e dentes são
formados. Há também, formação óssea no maxilar e mandíbula, cartilagem na laringe, concha e septo
nasal. Ainda nesta idade embrionária, observar-se folículos pilosos em quase toda a extensão corporal e na
região das vibrissas. Os órgãos em processo de diferenciação, o pulmão ainda encontra-se em estágio
pseudoglandular. Há formação de glândulas gástricas e vilosidades intestinais; o pâncreas está
diferenciado. Há diferenciação dos músculos e nervos; formação de tecido conjuntivo, cartilagens e
articulações. Dígitos e costelas ainda cartilaginosas com início de ossificação. Somitos não mais visíveis
(Figura 1H). Na Figura 1I, através da imunohistoquímica observa-se a expressão da vimentina na língua.No
feto de 36 dias gestacionais (Figura 1J) as pálpebras, pavilhão auricular e o ouvido externo estão totalmente
formados. Encontra-se em diferenciação, o córtex cerebral, a hipófise e tireoide. No olho, há diferenciação
de câmara, formação de íris e ductos lacrimais. As conchas nasais estão em estágio cartilaginoso, há
desenvolvimento da dentição e formação das papilas da língua, que estão em progresso (Figura 1K). Na
Figura 1L, através da imunohistoquímica observa-se a expressão da vimentina nos somitos.
Figura 1. Imagens representativas dos embriões e feto de gatos. A-C, embrião de 18 dias. Em A
macroscopia, B histologia e coloração por HE, C imunohistoquímica para Vimentina. D-F, embrião de 24
dias. Em D macroscopia, E histologia e coloração por HE e F imunohistoquímica para Vimentina. G-I,
embrião de 27 dias. Em G macroscopia, H histologia e coloração por HE e I imunohistoquímica vimentina. JL feto de 36 dias. Em J macroscopia, K histologia e coloração por HE e L imunohistoquímica para
Vimentina.
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Conclusão
O desenvolvimento embrionário e fetal do gato completa-se com aproximadamente 9 semanas
gestacionais. A embriologia do gato é muito semelhante com o dos seres humanos, que leva em média 40
semanas de gestação, portanto, o gato pode ser usado como modelo de embriologia e de embriologia
comparada. Este estudo visou contribuir com informações sobre as idades gestacionais e o
desenvolvimento embrionário do gato Felis catus), acrescentando ainda informações sobre a biodistribuição
de células-tronco, sendo observado que as mesmas estavam presentes nos quatro períodos gestacionais
estudados nesse trabalho. A verificação de nichos de células-tronco pode ser de extrema valia para o
tratamento de doenças importantes na Medicina Veterinária, como é o caso da Doença Renal Crônica onde
estudos utilizando células-tronco mesenquimais se mostraram promissores no tratamento desta doença.
Referências Bibliográficas
CAPLAN, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells for Tissue Engineering Versus Regenerative Medicine. Jounal
os Cellular Physiology, 2007. 213:34-347.
DA SILVA MEIRELLES, L., CAPLAN, A., NARDI, N. B. In Search of the In Vivo Identity of Mesenchymal
Stem Cells. Stem Cells, 2008, 2287-2299.
EVANS, H. E.; SACK, W. O. Prenatal development of domestic and laboratory animals. Anatomia, Histologia,
Embryologia, Berlin, v.2, p. 11-45, 1973.
Luna, L. G., 1968. Manual of Histology Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3°
Edição, McGraw-Hill, New York, NY. 258p.
MIGAKI G. 1982. Compendium of inherited metabolic diseases in animals. Progr. Clin. Biol. Res. 94:473-501
Tolosa E.M.C., Rodrigues C.J., Behmer A.O., Freitas-Neto A.G., 2003. Manual de Técnicas para Histologia
Normal e Patológica. 2° ed. Manole, São Paulo. 241p.
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