BIOLOGIA MOLECULAR DA CLULA

Faculdade de Medicina de Lisboa
Biologia
Molecular
da Célula
1ºAno
2003/2004
FML – Biologia Molecular da Célula
Este documento inclui resumos de uma parte da matéria
leccionada na disciplina de Biologia Molecular da Célula. Os
capítulos correspondem aos do livro aconselhado (The Cell,
Cooper and Hausman) estando ausentes os referentes a
Cancro e Ciclo Celular.
Torna-se
importante
referir
que
os
seguintes
apontamentos não foram revistos, logo, é natural que se
encontrem erros.
Espero que este resumo seja útil para a revisão de
matéria, pois é sempre aconselhável estudar pelo livro.
Rita Luz
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FML – Biologia Molecular da Célula
3. Princípios Fundamentais da Biologia
Hereditariedade, Genes e DNA
1. Genes e Cromossomas
Genes:
− Nucleótidos com determinada sequência de bases no DNA
− Unidade dos cromossomas que transmite características de pais para filhos
− Unidade de diferença que torna distintos os indivíduos de uma população
− Registo histórico das alterações sofridas pelos organismos ao longo do tempo.
→ Os genes podem apresentar formas alternativas responsáveis pelos caracteres
contrastantes. As formas alternativas de um mesmo gene são chamadas genes alelos.
Locus: é a zona de um cromossoma onde se situa um gene e corresponde, portanto, à
localização física do gene.
Loci: é o plural de locus e é onde os dois alelos que controlam um determinado
carácter estão localizados, nos dois cromossomas homólogos.
Genes autossómicos: são os genes que se localizam nos autossomas e o seu modo de
transmissão define a hereditariedade autossómica.
Factor dominante: é o factor que se manifesta quando os dois factores se encontram
em presença um do outro.
Factor recessivo: é o factor que não se manifesta quando em presença do dominante
correspondente.
Genótipo: constituição genética de um indivíduo em relação a uma determinada
característica, isto é, o genótipo diz respeito à porção da molécula de DNA que se
expressa numa determinada característica.
Fenótipo: é o conjunto de caracteres que um indivíduo manifesta resultantes do seu
genótipo, corresponde ao modo como o genótipo se expressa. O fenótipo
compreende as características anatómicas, fisiológicas e até comportamentais que se
observam no indivíduo.
Homozigótico: quando os dois alelos de um par de cromossomas homólogos são
idênticos. Todos os seus gâmetas são idênticos relativamente aos genes considerados.
Pode ser homozigótico dominante, se o par de alelos for o factor dominante e pode
ser homozigótico recessivo, se o par de alelos for o factor recessivo.
Heterozigótico: se os dois alelos de um par de cromosomas homólogos são diferentes,
origina gâmetas que são uns portadores de uma forma alélica e outros da outra forma
alélica.
Cariótipo: conjunto de cromossomas de uma célula, que pelo número, forma e
tamanho caracteriza uma dada espécie.
Cromossomas homólogos: são pares de cromossomas que são semelhantes entre si e
que contêm informação genética para o mesmo fim, embora possam ser diferente.
Células haplóides: células cujos núcleos não apresentam cromossomas homólogos. (n)
Células diplóides: células cujos núcleos apresentam cromossomas homólogos. (2n)
Meiose: processo de divisão nuclear através do qual um núcleo diploide origina quatro
núcleos haplóides, isto é, há redução do número de cromossomas em cada nova
célula (passa a metade). Assim, os organismos que se reproduzem sexualmente
através da fecundação mantêm nas suas células somáticas o mesmo número de
cromossomas, de geração para geração. Durante a meiose, os cromossomas trocam
de material, levando à recombinação entre genes.
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FML – Biologia Molecular da Célula
2. Genes e Enzimas
Cada gene especifica a estrutura de uma única enzima: um gene Æ uma enzima.
3. Identificação do DNA como material Genético
Descoberta que o principio transformador era o DNA através da demonstração que a
actividade deste principio era abolida pela digestão enzimática do DNA e não das
proteínas.
4. Estrutura do DNA
Constituintes dos nucleótidos:
− Ácido fosfórico: molécula com um átomo de fósforo, que confere aos ácidos
nucleicos as suas características ácidas.
− Pentoses: monossacarídeo com cinco átomos de carbono. A pentose do DNA é a
desoxirrobose (com apenas 4 átomos de carbono) e a pentose do RNA é a ribose
(com 5 átomos de carbono).
− Bases azotadas (variável de nucleótido para nucleótido)
• Purinas (anel duplo) - Adenina (A) e Guanina (G)
• Pirimidinas (anel simples) - Timina (T) - apenas no ADN, Uracilo (U) - apenas no
RNA, Citosina (C)
Estrutura do DNA:
− São polímeros constituídos por nucleótidos
− A sua união é realizada por reacções de
condensação
− O grupo hidroxilo do C5 da desoxirribose reage com
o oxigénio do grupo fosfato (que está ligado ao C1)
resultando numa ponte fosfodiéster com libertação
de água.
− Cada novo nucleótido liga-se pelo grupo fosfato que
está ligado ao carbono 5' da base azotada, ao
carbono 3' da pentose do último nucleótido da
cadeia, repetindo-se o processo 5' → 3'.
− Segundo o modelo da dupla hélice de Watson e
Crick, cada molécula de DNA é constituída por duas
cadeias enroladas helicoidalmente à volta de um
mesmo eixo, antiparalelamente.
− A pentose e o ácido fosfórico são hidrofílicos por isso encontram-se no exterior da
estrutura do DNA. As bases azotadas são hidrofóbicas por isso encontram-se na
parte interior da estrutura do DNA.
− As bases que se emparelham são as bases complementares:
• a Adenina liga-se à Timina ( A = T) por duas ligações de hidrogénio;
• a Guanina liga-se à Citosina (G ≡ C) por três ligações de hidrogénio.
Se uma cadeia tiver mais ligações A = T torna-se mais instável.
− As duas cadeias polinucleotidícas da dupla hélice desenvolvem-se em direcções
opostas. Cada uma delas inicia-se por uma extremidade 5' e termina em 3'.
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5. Replicação do DNA
A descoberta da complementaridade de bases entre as cadeias de DNA sugeriu que
elas poderiam separar-se para servir como molde para a síntese de novas cadeias
complementares – hipótese de replicação semiconservativa.
Segundo a hipótese de replicação semiconservativa podem considerar-se várias
etapas:
1. As duas cadeias da dupla hélice na presença de enzimas específicas, DNA
polimerases, separam-se por ruptura das ligações de hidrogénio.
2. Cada uma dessas cadeias serve de molde à formação de uma cadeia
complementar, sendo utilizados nucleótidos que existem livres na célula.
3. Formam-se simultaneamente duas cadeias de desoxirribonucleótidos de
acordo coma regra das bases complementares. Os novos nucleótidos, à
medida que se vão colocando, ligam-se por acção enzimática à desoxirribose
do nucleótido anterior, desenvolvendo-se duas cadeias complementares das
duas cadeias originais, sendo cada cadeia antiparalela em relação à que lhes
serviu de molde.
4. As reacções de condensação ordenada de nucleótido processam-se no
sentido 5'→ 3', crescendo duas cadeias em sentidos opostos.
5. Quando o processo de replicação termina estão formadas duas moléculas de
DNA idênticas entre si e idênticas à molécula original.
Replicação: provém do facto de as novas cadeias formadas serem uma réplica das
cadeias originais, o que leva a uma identidade entre as moléculas recém-formadas e
a molécula original.
Semiconservativa: pelo facto de permanecer, em cada uma das novas moléculas,
uma das cadeias polinucleotídicas da molécula original.
AZT
− Liga-se à extremidade 3’ da sequência de nucleótidos
− Impede a ligação do grupo fosfato do nucleótido seguinte
− É eficaz no tratamento da SIDA, pois o vírus HIV ao entrar na célula tem que se
replicar, se existir AZT na extremidade da sequência é impossível a adição de novos
nucleótidos
− Trava o crescimento do DNA, mas não para, pois existem muitas cadeias de DNA.
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Expressão da Informação Genética
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Os genes actuam na determinação da estrutura das proteínas, responsáveis pelo
metabolismo celular através da actividade das enzimas
As proteínas são polímeros de 20 aminoácidos cuja sequência determina a função
e estrutura.
1. Colinearidade de Genes e Proteínas
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A ordem dos nucleótidos especifica a ordem dos aminoácidos da proteína.
Mutações num gene implica alterações na sequência de DNA, a qual poderia
resultar na substituição de um nucleótido por outro, adição ou delecção.
A posição da mutação no gene reflecte-se na posição do aminoácido da
proteína codificada.
2. A função do RNA mensageiro
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Apesar do DNA especificar a ordem dos aminoácidos nas proteínas não é
necessariamente o responsável directo pela síntese proteica.
O DNA encontra-se no núcleo celular, nas células eucariotas, e a síntese proteica
dá-se no citoplasma, logo existe uma molécula que transporta a informação
genética para os locais de síntese proteica (ribossomas)
O RNA é sintetizado a partir de uma molde de DNA, sendo o intermediário para a
síntese proteica.
RNA ≠ DNA, porque:
• É constituído por uma única cadeia
• O componente glicidico é a ribose e não a desoxirribose
• Tem como base pirimidinica o uracilo em substituição da timina
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Como o RNA se encontra no citoplasma, este aparece como intermediário da
conversão da informação do DNA para os ribossomas, assim:
As moléculas de RNA são sintetizadas a partir do mode de DNA – transcrição
As porteinas são sintetizadas de moldes de RNA - tradução
O RNA mensageiro (por servir de intermediário) é transcrito do DNA pela RNA
polimerase que cataliza a síntese de RNA a partir do molde de DNA.
Existem mais tipos de RNA importantes para a síntese proteica:
• RNA ribossomal (rRNA): é um componente dos ribossomas
• RNA de transferência (tRNA): serve como molécula adaptadora dos aminoácidos
ao longo do mRNA.
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FML – Biologia Molecular da Célula
3. Código Genético
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Não existe complementaridade entre os aminoácidos e o mRNA, logo existem
tRNAs que servem de adaptadores durante a tradução.
Cada aminoácido é ligado, por uma enzima específica, ao tRNA apropriado
O emparelhamento entre as bases de mRNA e tRNA dirige o aminoácido que lhe
está ligado para o local correcto do molde de mRNA.
A partir de sequências das quatro bases nucleotídicas do DNA - adenina (A), timina
(T), citosina (C) e guanina (G) - é possível formar exactamente 64 palavras código
de três letras diferentes, tripletos ou codões.
Estes tripletos representam a mais pequena unidade da mensagem genética que
vão codificar a ordenação de séries de aminoácidos que caracterizam diversas
proteínas.
Três das 64 palavras possíveis são utilizadas como sinais de paragem (codões STOP),
significando que se, chegou ao fim do código de uma proteína.
As outras codificam os 20 aminoácidos.
Mais que uma palavra, aliás entre uma e seis, podem codificar o mesmo
aminoácido.
A introdução ou retirada de 1 ou 2 nucleótidos alteram a leitura do gene inteiro,
enquanto que a introdução ou retirada de 3 nucleótidos leva a que a proteína
tenha mais ou menos um aminoácido; o resto da sequência mantém-se inalterada.
A leitura dos nucleótidos começa num local fixo.
Características do código genético:
− "Universalidade" - há uma linguagem comum a quase todas as células, mas
existem excepções à regra tal como é o caso dos protozoários ou o caso do ADN
das mitocôdrias.
− Redundãncia - neste código vários codões são sinónimos, isto é, podem codificar o
mesmo aminoácido. Este fenómeno também conhecido por degenerescência do
código genético.
− O código não é ambíguo - o mesmo codão em regra não codifica aminoácidos
diferentes.
− O terceiro nucleótido de cada codão não é tão específico como o primeiro
− O tripleto AUG tem uma dupla função - codifica o aminoácido metionina e é uma
codão de iniciação da síntese proteica.
− Os tripletos UAA, UAG e UGA são codões de finalização - estes codões representam
sinais de fim de síntese e não codificam aminoácidos.
4. Vírus RNA e transcrição reversa
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Existem vírus que contém apenas RNA e proteínas.
São capazes de sintetizar RNA através do RNA modelo, usando o mesmo sistema
de complementaridade de bases que na replicação de DNA ou transcrição de
DNA para RNA.
Este processo implica a acção de uma enzima específica.
Os vírus que contém apenas RNA (os retrovirus) replicam, via síntese de DNA
intermédio, o DNA provirus.
Os retrovirus, contém uma enzima especifica (transcriptase reversa) que cataliza a
síntese de DNA a partir de RNA – transcrição reversa.
A transcrição reversa é importante:
1. Para a replicação dos retrovirus
2. Como não é restrita aos retrovirus, também ocorre nas células, é responsável
pela transposição de sequência de DNA de um cromossoma para outro.
3. As transcriptases reversas podem ser utilizadas para gerar copias de DNA a
partir do RNA, permitindo o estudo de mRNA’s de células eucariotas.
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DNA Recombinante
A manipulação genética permite a criação de uma nova molécula de DNA,
geralmente pela recombinação de DNA de diferentes organismos, por meios artificiais,
utilizando-se enzimas conhecidas como enzimas de restrição, e a consequente
produção de muitas cópias de DNA recombinante. Este processo designa-se
clonagem.
Os passos básicos numa experiência de clonagem molecular são os seguintes:
1. Insere-se o fragmento de DNA a ser clonado numa molécula de DNA com
capacidade de auto-replicação, denominada vector, originando uma
molécula de DNA recombinante.
2. O vector funciona com um veículo que introduz o DNA numa célula
hospedeira, geralmente bactéria, embora se possam usar outros tipos de
células.
3. Uma vez no interior da célula hospedeira o vector multiplica-se, produzindo-se
inúmeras cópias idênticas, não só do vector mas também do fragmento de
DNA que ele contém.
4. Quando a célula hospedeira se divide, as cópias das moléculas de DNA
recombinante são transmitidas à descendência e ocorre novo ciclo de
replicação.
5. Após um grande número de divisões celulares, uma colónia ou clone de
células hospedeiras geneticamente idênticas é gerado. Cada célula do clone
contém muitas cópias da molécula de DNA recombinante; o fragmento de
DNA introduzido na molécula de DNA recombinante diz-se agora clonado.
6. Para além da obtenção de múltiplas cópias idênticas de um fragmento de
DNA, a clonagem de um gene num vector adequado (vector de expressão)
permite a obtenção de grandes quantidades de proteína recombinante.
1. Vectores de clonagem
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Moléculas de DNA que têm como função transportar o DNA de interesse para a
célula hospedeira.
Geralmente são vectores plasmídicos que têm como base plasmídeos naturais que
são posteriormente modificados por técnicas de engenharia genética.
Os plasmideos são pequenas moléculas de DNA circular que se replicam
independentemente (sem estarem associados ao cromossosma).
As características mais importantes de um vector de clonagem são:
• Origem de replicação (ORI): permite que o vector e a molécula de DNA
recombinante, se mantenha na célula e seja transmitida à descendência.
• Marca de selecção: a maioria dos vectores plasmídicos possui um gene que
confere resistência a um antibiótico. Assim, apenas as bactérias que possuem o
DNA recombinante sobrevivem quando crescidas em presença desse
antibiótico.
• Local de policlonagem (MCS): pequena
Promotor
sequência de DNA (~100 pb) que contém
locais de corte únicos para várias enzimas de
Local de
restrição. É neste local que é introduzido o Origem de
policlonagem
fragmento de DNA que se pretende clonar.
replicação
• Promotor: presente apenas em vectores de
Vector B
expressão e localizado a montante do local
de
policlonagem.
A
maquinaria
de
transcrição genética identifica a sequência
do promotor e transcreve a partir desse local.
Serve para quando se pretende a síntese de
Resistência a ampicilina
proteínas.
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2. Enzimas de restrição
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São o bisturi que permitem “cortar” o DNA de um modo preciso e reprodutível.
Fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam ligações fosfodiester
entre nucleótidos adjacentes.
Clivam apenas as ligações entre nucleótidos com uma sequência específica.
Existem nas bactérias servindo como o modo de defesa contra a entrada de DNA
estranho (p.ex.: viral) na célula que contenha a sequência especifica identificada
pela enzima em causa.
Reconhecem sequências com 4 a 8 pares de bases.
Existem enzimas que de modo a evitar a autodestruição de cadeia, ao
reconhecerem sequências estranhas introduzem um grupo metilo (metilases).
Mapas de restrição: mostram os locais de quebra de diferentes endonucleases de
restrição de moléculas de DNA.
3. Formação de moléculas de DNA recombinante
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As enzimas de restrição digerem o plasmideo e o DNA deixando livres
extremidades com sequências especificas.
As extremidades do vector e do fragmento de DNA são unidas pela
complementaridade das bases pela acção de DNA ligases não especificas.
Se o vector e o DNA forem tratados com a mesma enzima de restrição, as
extremidades são complementares, facilitando o processo, no entanto existem 4
possíbilidades para a ligação:
1. O vector liga-se a si próprio
2. O fragmento de DNA liga-se correctamente
3. O fragmento de DNA liga-se ao contrário
4. Liga-se mais do que um fragmento de DNA ao mesmo vector.
Se as 2 extremidades forem cortadas com enzimas de restrição diferentes, a
especificidade é maior, logo o fragmento só se pode ligar correctamente.
Os fragmentos de DNA que são clonados não estão limitados aqueles que
terminam em locais de quebra das enzimas de restrição.
Existem DNA “linkers” sintéticos contendo locais das endonucleases de restrição
que podem ser unidos às extremidades cegas de qualquer fragmento de DNA
Estes linkers são pequenos oligonucleótidos que podem ser obtidos por síntese
química, permitindo virtualmente que qualquer fragmento esteja preparado para
a ligação com o vector.
As extremidades protuberantes também podem ser tornadas cegas (“blunt”)
através do uso exonucleases.
O RNA também pode ser clonado utilizando a transcriptase reversa que sintetiza
DNA (cDNA) a partir do RNA.
Como o mRNA contém sequências que não codificam aminoácidos para
determinada proteína, os intrões, a síntese de cDNA a partir do mRNA sem os
intrões, é crucial para o estudo de um gene.
Fosfatases: retiram os grupos fosfato do plasmideo, no entanto a ligação só se
estabelece na 1ª volta da replicação, já na bactéria.
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FML – Biologia Molecular da Célula
9 Após a produção de DNA recombinante, abrem-se poros na bactéria (pela
destabilização dos iões) para a entrada da molécula produzida.
9 De seguida é necessário realizar uma selecção das bactérias que contém o DNA
recombinante, partindo do principio que se o tiverem são resistentes ao antibiótico.
Para este processo as bactérias são colocadas num meio com antibiótico, as
células que não tiverem DNA recombinante não sobrevivem.
9 Depois, é necessário realizar um extracção do DNA, após lise das paredes celulares,
de modo a poder analisá-lo.
9 O cromossoma é separado do DNA recombinante por centrifugação, devido às
suas diferenças de tamanho.
9 O DNA recombinante é novamente sujeito à digestão por acção das enzimas de
restrição, linearizando a molécula.
9 Os fragmentos de DNA são sujeitos a electroforese.
9 Como nem todos os insertos se ligam ao vector, ou podem ligar-se correcta ou
incorrectamente, a electroforese de DNA permite distinguir pelo tamanho e
utilizando enzimas de restrição, pelo estudos dos mapas de restrição, todas estas
sequências.
4. Electroforese de DNA em gel
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É o método utilizado para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA
consoante o seu comportamento num campo eléctrico.
O gel é geralmente a agarose (polímero extraído do agar) ou poliacrilamida.
Os geis preparam-se fundindo a agarose na presença de um tampão apropriado.
A solução obtida é deitada num molde e deixada arrefecer até solidificar.
Ao solidificar forma-se uma matriz cuja densidade é determinada pela
concentração da agarose.
Quando se aplica um campo eléctrico através do gel, o DNA carregado
negativamente (devido aos grupos fosfato) migra em direcção ao ânodo
(eléctrodo positivo).
A velocidade de migração é determinada por um conjunto de parâmetros, entre
os quais o tamanho da molécula e a concentração da agarose.
O gel actua como um filtro, retardando selectivamente as moléculas maiores,
enquanto que as moléculas mais pequenas movem-se mais rapidamente.
A velocidade de migração é inversamente proporcional ao log10 do tamanho do
fragmento (em bp) e, para um mesmo tamanho de fragmento de DNA, a
velocidade de migração é maior num gel com menor concentração de agarose.
Para a separação de moléculas maiores utilizam-se géis pouco concentrados e
vice-versa.
A migração das moléculas de DNA através do gel, depende ainda da voltagem
aplicada; quanto mais alta for a voltagem, mais rápida a migração.
Para visualizar o DNA nos geis de agarose utiliza-se o corante fluorescente brometo
de etídio. Esta substância possui grupos químicos que se intercalam entre as bases
do DNA. Em consequência, o corante ligado ao DNA fluoresce com mais
intensidade do que o corante livre, quando irradiado com luz ultravioleta.
O brometo de etídio permite detectar cadeias simples e duplas de ácidos
nucleicos, tanto DNA como RNA.
Por convenção, os géis de DNA são lidos da esquerda para a direita, com os poços
colocados no topo.
A área do gel perpendicular ao poço designa-se “pista” ou lane.
Ao olhar para uma lane analisam-se os fragmentos de DNA colocados nesse poço.
Fragmentos de DNA com o mesmo tamanho migram a mesma distância no gel
dando origem a bandas.
Por convenção, o tamanho de cada fragmento de DNA é expresso pelo número
de pares de bases que o constituem (bp).
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FML – Biologia Molecular da Célula
5. Sequenciação de DNA
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A clonagem molecular permite o isolamento de fragmentos individuais de DNA em
quantidades adequadas para caracterização adequada, inclusive determinação
da sequencia de nucleótidos.
A sequenciação permite:
• Saber a proteína produto
• Estudar as propriedades de sequencias de DNA que regulam a
expressão do gene.
Processo:
1. Desnatura-se o DNA a sequenciar
2. Incuba-se com um primer, na presença de DNA polimerase e dos quatro
desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dTTP, e dCTP), um dos quais é radioactivo.
3. O produto desta reacção é depois dividido por quatro tubos, a cada um dos quais
se junta um didesoxiribonucleosido-trifosfato (ddATP, ddCTP, ddTTP, e ddCTP).
Didesoxiribonucleosido-trifosfato: nucleótidos modificados são desprovidos de grupo
hidroxilo ligado ao carbono 3, e, portanto, impedem o alongamento das cadeias de
DNA em que são incorporados.
4. Como em cada tubo existem milhões de moléculas de DNA, originam-se fragmentos
de diversos tamanhos consoante a posição de cada nucleótido na sequência original.
5. O DNA de cada tubo (A, C, T, e G) é desnaturado e colocado num gel de
acrilamida com ureia (para evitar a renaturação do DNA durante a electroforese).
6. No final, o gel é seco e autoradiografado.
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Os nucleótidos radioactivos incorporados dão origem a uma série de bandas que
indicam o tamanho dos fragmentos de DNA produzidos em cada tubo de
reacção.
Ao contrário dos géis de agarose, os géis de acrilamida permitem resolver
moléculas de DNA cujo comprimento difere apenas num nucleótido.
Como a síntese de DNA ocorre de 5’ para 3’, os fragmentos menores resultam de
uma incorporação do dNTP mais próxima da extremidade 5’.
Em consequência, a leitura do gel de baixo para cima indica a sequência de
nucleótidos da cadeia 5’-3’.
Para iniciar a reacção de sequenciação é necessário um primer, logo o DNA
desconhecido tem de ser “enquadrado” numa sequência conhecida, para a qual
o primer será complementar.
Primers: oligonucleótidos sintetizados quimicamente de modo a obter sequências com
cerca de 20 bases complementares do início da cadeia de DNA que se pretende
sequenciar.
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A sequenciação automática permite acelerar e mecanizar a maior parte do
processo de análise dos resultados. Os diferentes produtos de reacção (G; A; T; C)
têm incorporados nucleótidos fluorescentes em vez de nucleótidos radioactivos,
cada um deles com uma cor diferente, num total de 4 cores. A leitura do sinal
fluorescente é feita por um scanner apropriado que, estando acoplado ao
aparelho de electroforese, faz a leitura directamente do gel enquanto a
electroforese decorre. A leitura é feita em simultâneo com a migração dos
fragmentos através do gel: sempre que no local do scanner passa uma banda que
fluoresce numa cor é representado um pico no gráfico dos resultados e o software
atribui-lhe a letra correspondente à cor detectada.
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FML – Biologia Molecular da Célula
6. PCR (polymerase chain reaction)
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Permite obter in vitro grandes quantidades de uma sequência definida de DNA
Só é necessário conhecer as sequências que ladeiam o fragmento a amplificar
É uma alternativa à clonagem molecular
Componentes de uma reacção de PCR
• Molde, template
• Primer (ligam-se às extremidades que se pretende ladear, sendo complementares
às regiões que flanqueiam a sequência a amplificar)
• DNA polimerase (taq polimerase, termoestável e assegura a polimerização 5´Æ 3’)
• Nucleótidos dNTP
• Termocycler (assegura ciclos rápidos de aquecimento e arrefecimento)
• Tampão de reacção
Processo:
• Desnaturação da cadeia por aquecimento
• Adição de um excesso de primers e de dNTP
• Ligação dos primers por arrefecimento
• Polimerização pela adição da DNA polimerase
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FML – Biologia Molecular da Célula
Detecção de Ácidos Nucleicos e Proteínas
1. Hibridação de ácidos nucleicos
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A chave para detectar sequências especificas de ácidos nucelicos é o
emparelhamento de bases complementares de cadeias de DNA e RNA
A temperaturas altas, as cadeias complementares de DNA separam-se
(desnaturam-se) originando cadeias simples de DNA
Se as cadeias separadas forem incubadas nas condições ideais, renaturam pela
complementaridade de bases – hibridação de ácidos nucleicos.
Podem-se formar híbridos com 2 cadeias de DNA, 2 de RNA ou uma de cada.
A hibridação de ácidos nucleicos permite detectar sequências de DNA ou RNA
complementares de um ácido nucleico isolado, como um genoma viral ou
sequência de DNA clonado.
O DNA clonado é marcado radioactivamente, sendo sintetizado na presença de
nucleótidos radioactivos.
DNA radioactivo é usado como sonda para hibridação com sequências
complementares de DNA e RNA, detectados devido à radioactividade dos híbridos
resultantes de 2 cadeias.
Southern Blotting
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O Southern blotting permite a análise de fragmentos genómicos de grandes
dimensões e não exige o conhecimento prévio da sequência de nucleótidos da
região de interesse.
A técnica de Southern blotting envolve:
• Separação de DNA genómico por electroforese em gel de agarose
• Transferência das moléculas separadas para um suporte sólido
(membrana ou filtro de nitrocelulose) hibridação com uma sonda
marcada (em geral, radioactivamente)
• Detecção do sinal da sonda (por autoradiografia).
Devido às grandes dimensões do DNA genómico, para que se possa proceder à
sua separação, é necessário tratá-lo com uma enzima de restrição.
Esta enzima vai cortar o DNA de forma previsível, dando origem a milhares de
fragmentos genómicos diferentes que cobrem um leque vasto de tamanhos,
produzindo um aspecto típico de mancha arrastada (smear) após electroforese.
As dimensões dos fragmentos genómicos formados vão ser característicos de cada
indivíduo, já que são consequência da existência de um local de restrição da
enzima usada em determinada posição do genoma e, portanto, reflectem a
sequência do genoma.
Aplicações da Southern blotting:
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Variações polimórficas da sequência do genoma
9 STRs – short tandem repeats
9 VNTRs - variable number of tandem repeats
9 SNPs - single nucleotide polymorphisms)
Mutações podem causar diferenças no tamanho dos fragmentos de
restrição observados numa população (RFLPs - restriction fragment length
polymorfisms)
9 por destruição ou criação de locais de restrição
9 por aumento ou redução do número de nucleótidos situado entre dois
locais de restrição.
São diferenças de dimensão facilmente detectáveis por esta técnica.
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FML – Biologia Molecular da Célula
Northen Blotting
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Permite analisar o RNA, da mesma forma que o Southern para DNA
Como o RNA já é fragmentado o passo da digestão com enzimas não é
necessário.
Dá-nos a informação da expressão de um gene
Hibridação in situ (FISH)
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A hibridação de ácidos nucleicos também pode ser usada para detectar
sequências de DNA ou RNA homólogas em cromossomas ou células intactas
Os resultados são analisados por examinação microscópica
Pode ser usado para detectar
• o locus do gene no cromossoma
• mRNA’s específicos em células do mesmo tecido.
2. Detecção de pequenas quantidades de DNA e RNA por PCR
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É uma técnica muito sensível
Amplifica-se DNA (ou RNA após transcrição reversa) até atingir níveis detectáveis
Usam-se primers de oligonucleótidos que hibridam com a sequência
complementar do molde
Pode detectar-se DNA especifico em pequenas quantidades de material genético
3. Anticorpos como sondas para proteínas
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Os anticorpos reagem selectivamente com proteínas únicas.
Os anticorpos são proteínas produzidas pelo sistema imunitário (linfócitos B) que
reagem contra moléculas (antigénios) presentes em substâncias estranhas,
identificando-as.
O sistema imunitário produz milhões de anticorpos que identificam antigénios
específicos, que podem ser proteínas, carbohidratos, etc.
Um linfócitos apenas produz um tipo de antigénio
Os anticorpos podem ser produzidos pela inoculação de um animal com qualquer
proteína diferente
Os anticorpos podem ser criados contra proteínas purificadas de células, tal como
outros materiais que podem ser utilizados para imunização.
Os anticorpos podem também servir para reconhecer proteínas recombinantes
Existem anticorpos que reconhecem péptidos de 10 a 15 aminoácidos, por isso,
conhecendo apenas o inicio do gene que se pretende clonar, é possível produzir
anticorpos que reagem contra a proteína inteira.
Western Blotting ou Imunoblot
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As proteínas extraídas das células são separadas por electroforese (electroforese
em gel de poliacrilamida-SDS), devido aos diferentes tamanhos e carga eléctrica.
As proteínas são colocadas numa solução de SDS, um detergente carregado
negativamente que se liga às proteínas desnaturando-as.
As proteínas passam a ter uma estrutura linear, estando carregadas
negativamente.
As proteínas passam depois para um filtro que permite a reacção com os
anticorpos contra a proteína de interesse.
14
FML – Biologia Molecular da Célula
Imunoprecipitação
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As células são incubadas com aminoácidos radioactivos que vão marcar as suas
proteínas
Os extractos celulares marcados são incubados com anticorpos que se ligam com
o seu antigénio-alvo
Os complexos anticorpo-antigénio obtidos são isolados e sujeitos a electroforese
permitindo a detecção dos antigénios radioactivos por autoradiografia.
15
FML – Biologia Molecular da Célula
4. Organização do Genoma Celular
Complexidade do Genoma Eucariótico
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O Genoma Eucariótico é muito maior e mais complexo que o procariótico.
Um genoma maior nem sempre está relacionado com a complexidade genética
de alguns eucariotas.
O genoma eucriota contém não só genes funcionais, mas também grande
quantidade de DNA que não codifica proteínas.
Da totalidade do genoma humano (6x109bp) só cerca de 1,5% é que contribuem
para a codificação de proteinas.
1. Intrões e Exões
Gene: segmento de DNA que é expresso num produto funcional (RNA ou proteína)
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Muito do DNA eucariotico consiste em sequências entre genes (space sequences)
Dentro do próprio gene também podem existir:
• Exões: sequências codificantes
• Intrões: sequências não cidificantes
−
O gene é transcrito a RNA que posteriormente sofre splicing, removendo-se os
intrões e permanecendo os exões de modo a formar um mRNA maduro.
A quantidade de DNA em intrões e exões é variável, sendo que o 1º pode ser
superior ao 2º.
Os intrões estão presentes na maioria dos genes eucarióticos, excepto nalguns
seres mais simples e também em alguns procariotas
Pensa-se que os intrões representam sequências que forma importantes no inicio
da evolução, ou que a facilitaram, permitindo a recombinação de exões de
alguns genes.
O desaparecimento de intrões em alguns procariotas deve-se à selecção natural
por rápida replicação Î como a rápida diminuição celular não é vantajosa em
eucariotas superiores, os intrões permanecem no seu genoma.
Podem ter surgido depois da divergência, pela inserção de DNA em genes já
formados como sequências codificantes contínuas, para permitir o exon shuffling
(recombinação entre regiões codificantes de diferentes genes)
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2. Sequências repetitivas de DNA
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Uma porção substancial dos genomas eucarióticos consiste em sequências de
DNA não-codificantes, muito repetidas.
As cadeias desnaturadas de DNA hibridam entre si para formar moléculas de
cadeia dupla
Como a hibridação de DNA é um processo bimolecular, a taxa de reassociação
depende da concentração de cadeias simples de DNA que colidem entre si.
Os fragmentos de DNA de E. coli forma desnaturados e criadas as condições para
hibridarem todo o DNA híbrida à mesma taxa, uma Vaz que cada sequência de
DNA existe num só local por genoma (não se repete)
A reassociação de fragmentos de DNA extraído de células de mamíferos é
diferente:
• 60% híbrida à taxa esperada pois existe apenas uma vez no genoma
• 40% híbrida mais rapidamente, devido à existência de sequências que
existem várias vezes no genoma (maior a probabilidade de se
encontraram e hibridarem)
16
FML – Biologia Molecular da Célula
Tipos de sequências repetitivas
DNA de sequências simples
− Contêm milhares de copias de sequências pequenas.
− Podem ser separadas do resto do genoma por centrifugação de equilíbrio em
gradiente de densidade de CsCl
− As suas densidades são variáveis, sendo que as sequências ricas em A e T são
menos densas que as mais ricas em G e C.
− As sequências que se separam da cadeia de DNA de acordo com a sua
densidade são denominadas de DNA’s satélites.
− Estas sequências:
• não são transcritas
• não contêm informação genética
• podem desempenhar um papel importante na estrutura dos cromossomas
SINEs (elementos curtos dispersos) e LINEs (elementos longos dispersos)
− Sequencias repetitivas de DNA espalhadas pelo genoma
− Podem mover-se por diferentes locais de DNA genómico, podendo regular a
expressão dos genes ou ter desempenhado um papel evolutivo importante,
gerando diversidade genética.
3. Família de genes e pseudogenes
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A grande extensão do genoma eucariótico deve-se também ao facto de que
muitos genes apresentam múltiplas cópias (muito repetidas), pois podem ser
necessários para a produção de grandes quantidades de RNA ou de proteínas.
Podem também encontrar-se “não funcionais”
Por outro lado, a maioria dos genes dos procariotas só existe uma vez no genoma
Às cópias dos genes eucariotas denominam-se famílias de genes, os quais
permitem:
• Produzir RNA e proteínas em grandes quantidades
• Membros distintos da família podem ser transcritos em diferentes tecidos
ou diferentes estádios de desenvolvimento
Estas famílias podem estar próximas numa região de DNA, ou estar dispersas em
diferentes cromossomas.
Origem das famílias de genes
Existe duplicação do gene original ancestral
Os diferentes membros da família divergem como consequência de mutações ao
longo da evolução
− A divergência pode levar à evolução de proteínas envolvidas em diferentes
tecidos e estádios ou pode levar à perda da capacidade de produzir proteínas ou
produtos funcionais do gene.
Pseudogenes: cópias de genes não funcionais que aumentam o genoma eucariótico
sem apresentarem uma contribuição genética funcional.
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17
FML – Biologia Molecular da Célula
4. Número de Genes
−
Um polipéptico médio possui cerca de 400aa, que correspondem a 1200 b de um
mRNA
Genoma bacteriano:
• Maioria do DNA codifica proteínas (90%)
• Aproximadamente 4300 genes
Genoma de leveduras
• Apenas 4% de genes possui intrões
• 70% dos genes codificam proteínas
Genoma de animais superiores e humano
• 1,1% a 1,4% codifica proteínas
• 45% inclui DNA repetitivo
−
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O restante é útil na regulação da expressão, normalmente através de sequências
reconhecidas por ehnancers e repressores.
Para determinar e identificar o gene usa-se mRNA que é passado para DNA por
acção da transcriptase reversa (cDNA) ficando apenas a sequência de exões.
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FML – Biologia Molecular da Célula
Cromossomas e Cromatina
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O genoma de procariotas contém cromossomas únicos, que são normalmente
moléculas de DNA circular.
O genoma de eucariotas é composto por vários cromossomas, contendo cada um
uma molécula de DNA linear.
O DNA de células eucariotas está ligado a pequenas proteínas (histonas) que
compactam o DNA de forma ordenada no núcleo.
1. Cromatina
É o complexo formado pelo DNA e as proteínas
As proteínas mais abundantes são as histonas que contêm uma proporção alta de
aminoácidos básicos que facilitam a ligação à molécula de DNA carregada
negativamente.
− Existem outras proteínas para além das histonas (nonhistone chromossomal
proteins) que participam em vários processos como a replicação de DNA e a
expressão genética.
Nucleossoma: é a unidade estrutural básica da cromatina
Cromatossoma: subunidade da cromatina que consiste numa sequência de 166 pb
enroladas à volta do núcleo das histonas.
− O empacotamento do DNA com as histonas compõem uma fibra de cromatina
composta por cromatossomas separados por segmentos de DNA ligante (DNA
linker)
−
−
A condensação da cromatina varia durante o ciclo celular:
Interfase:
− A maior parte da cromatina está relativamente descondensada (eucromatina) e
distribuída para fora do núcleo.
− Os genes são expressos e o DNA é replicado, em preparação para a divisão
celular.
− Os genes que são mais expressos estão num estado mais descondensado para
facilitar o acesso da maquinaria de transcrição.
− 10% da cromatina em interfase está altamente condensada (heterocromatina) e
está inactiva para transcrição e contém muitas sequências repetitivas.
Mitose: os cromossomas estão muito condensados e não podem servir de molde para
a síntese de RNA, assim a transcrição cessa durante a mitose.
2. Centrómeros
−
É uma região especializada do cromossoma que assegura a distribuição correcta
dos cromossomas duplicados nas células filhas, durante a mitose
1. O DNA é replicado durante a interfase, resultando na formação de 2 cópias de
cada cromossoma
2. Assim que a célula entra em mitose, a condensação da cromatina leva à
formação de cromossoma que consistem em 2 cromtideos idênticos
3. Estes cromatídeos estão ligados na região do centrómero
4. Os microtubulos do fuso acromático ligam-se ao centrómero e as 2
cromatideos separam-se e movem-se para pólos opostos.
5. No fim da mitose, a membrana nuclear é reposta e os cromossomas
descondensam
19
FML – Biologia Molecular da Célula
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−
Os centrómeros servem como locais de associação entre os cromatideos e de
ligação dos microtubulos.
Consistem em sequências especificas de DNA à qual proteínas (centromereassociated proteínas) se ligam, formando uma estrutura especializada:
“kinetochore”.
A ligação dos microtubulos ao kinetochore medeia a junção dos cromossomas ao
fuso acromático
As proteínas associadas aos centrómeros actuam como motores moléculas que
conduzem o movimento dos cromossomas ao longo das fibras
3. Telómeros
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−
São sequências no final dos cromossomas eucarióticos que são importantes para a
replicação e manutenção.
Consistem em sequencias simples de DNA repetidas, contendo resíduos G numa
cadeia.
Estas sequências são repetidas milhares de vezes terminado com uma cadeia
simples de DNA.
As sequências repetidas do telómero formam loops no final dos cromossomas aos
quais se juntam proteínas que protegem a terminação do cromossoma de ser
degradado.
Os telómeros são importantes da replicação do final das moléculas de DNA linear.
DNA polimerase é capaz de estender uma cadeia de DNA em crescimento, mas
não é capaz de iniciar a síntese na terminação de uma cadeia de DNA linear.
Assim, as extremidades dos cromossomas não podem ser replicados pela acção
normal da DNA polimerase.
A manutenção dos telómeros parece determinar a capacidade reprodutiva das
células.
Telomerase
−
−
Proteína capaz de produzir telómeros e dos associar à molécula que está a ser
replicada para continuar a replicação.
É uma transcriptase reversa da classe das DNA polimerases que sintetiza DNA a
partir do RNA. Ela carrega consigo o RNA que lhe serve de molde e que é
complementar às sequências repetidas que sintetiza – os telómeros.
20
FML – Biologia Molecular da Célula
6. Síntese e Processamento de RNA
−
−
A regulação da expressão genética permite à célula adaptar-se a mudanças no
meio ambiente e permite a diferenciação celular das plantas e animais complexos
A expressão de um gene comporta as seguintes fases:
• Transcrição da mensagem genética - segmentos de DNA codificam a produção
de RNA.
• Processamento de RNA (em eucariotas)
• Tradução da mensagem genética - RNA codifica a produção de proteínas.
Estrutura do RNA
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−
−
O ácido ribonucleico, polímero de ribonucleótidos em cadeia simples, constitui
moléculas de dimensões muito inferiores às dimensões das moléculas do DNA.
Em algumas situações a cadeia pode dobrar-se sobre si própria, estabelecendo
ligações com bases complementares da mesma cadeia segundo a
complementaridade dos pares de bases: A = U e C ≡ G.
Apesar da sua simplicidade molecular, funcionalmente as moléculas de ARN são
diferentes existindo sob três formas: RNA mensageiro, RNA ribossómico e RNA de
transferência, variando também a sua estrutura.
O RNA mensageiro é o que faz a ligação entre o DNA que se encontra no núcleo
das células eucariotas e os ribossomas, onde se processa a síntese proteica.
21
FML – Biologia Molecular da Célula
Transcrição em Procariotas
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−
−
A síntese de RNA é similar à de DNA, tal como a DNA polimerase, a RNA
polimerase cataliza o crescimento de cadeias de RNA na direcção 5’Æ 3’.
Ao contrário da DNA polimerase, a RNA polimerase não necessita de um modelo
(primer) para iniciar a síntese de RNA.
A transcrição começa de novo em sítios específicos no início dos genes.
O início da transcrição é a etapa reguladora
1. RNA polimerase
•
•
•
•
•
Cataliza a polimerização de ribonucleósido 5’trifosfatos (NTPs)
É constituída por múltiplas cadeias polipeptidicas
É constituída por 5 subunidades: 2x α, β, β’, ω e σ.
A subunidade σ está fracamente ligada às outras
O núcleo (constituído pelas subunidades α, β, β’ e ω) é totalmente capaz de
catalizar a polimerização (não selectiva), não sendo necessário a presença da
subunidade σ.
• A subunidade σ identifica os sítios correctos para iniciar a transcrição, que
convém ser no início do gene.
2. Promotor
• É a sequência à qual se liga a RNA polimerase para iniciar a transcrição do
gene, mas não é transcrito.
• A comparação de vários genes da E. coli revelou 2 zonas numa região acima
do local de iniciação da transcrição comuns
• Estas 2 zonas são compostas por 6 nucleótidos e estão colocadas a cerca de 10
e 35 pares de bases acima do local de inicio de transcrição – são os elementos
-10 e -35.
• As regiões onde a RNA polimerase se liga podem ser identificadas por
footprinting. Através desta técnica incuba-se o gene de uma proteína com a
RNA polimerase e em seguida trata-se com DNase que digere o gene. As
porções onde a RNA polimerase se ligam ficam protegidas e não são digeridas
e através de electroforese e comparação reconhece-se os locais de ligação.
• Nucleótido +1: é o 1º nucleótido a ser reconhecido e a partir do qual começa a
transcrição.
• O promotor é próprio de cada tipo de organismo. O promotor da bactéria não
serve no DNA humano
• Tem uma direcção de transcrição
• A RNA polimerase identifica a sequência do promotor pela subunidade σ.
• O promotor está sempre ligado à extremidade 5’ do gene, de modo a tornar
possível a transcrição.
• Promotor induzível: pode estar on/off, para a transcrição
• Sequências de consenso: sequências que estão conservadas em vários genes,
ou seja, são mais frequentemente encontradas naquelas posições.
• Promotor fraco: tem menos atracção para a polimerase, ou seja, é menos
consensual, pois a ligação entre o promotor e a polimerase é tanto mais forte e
estável quanto mais consensual for a sequência do promotor.
• Promotor forte: é mais consensual e atrai mais a polimerase. Os genes que têm
promotores fortes são mais frequentemente transcritos.
22
FML – Biologia Molecular da Célula
3. Transcrição
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A RNA polimerase liga-se ao DNA numa região de 60 pb (-40 e +20)
A subunidade σ liga-se especificamente às sequências das regiões -35 e -10.
Sem a subunidade σ, a RNA polimerase liga-se não especificamente e com menor
afinidade.
A RNA polimerase liga-se ao promotor formando um complexo promotor-fechado,
pois o DNA está enrolado.
A polimerase desenrola o DNA numa região de 14 pb formando um complexo
promotor-aberto, em que uma única cadeia de DNA serve de molde para a
transcrição.
A transcrição é iniciada pela junção de 2 NTPs.
Depois da adição de 10 nucleótidos, a subunidade σ é libertada da RNA
polimerase que continua o alongamento da cadeia de RNA.
A RNA polimerase vai desenrolando DNA, mantendo sempre um espaço de 15pb
desenroladas.
A síntese de RNA continua até que a polimerase encontre um sinal de terminação,
após o qual a transcrição pára, o RNA liberta-se da polimerase e esta dissocia-se
do DNA modelo.
Na E. coli, o sinal de paragem consiste numa sequência de RNA rica em C e G,
interrompida por 4 ou mais resíduos A, o que vai conduzir a uma destabilização da
cadeia pela complementaridade de bases Æ disrupção do processo.
4. Repressores e controlo negativo da transcrição
O estudo da expressão de enzimas no metabolismo da lactose na E. coli, permitiu
compreender a regulação da transcrição em procariotas, pois sabia-se que as
enzimas envolvidas neste metabolismo (ex. β-galactosidase, permease e
transacetilase) só são expressas quando existe lactose no meio.
Operão: unidade de expressão das enzimas do metabolismo da lactose
Operador: regula a transcrição do operão, adjacente ao local de iniciação da
transcrição do gene.
Repressor: bloqueia a transcrição ligando-se ao operador.
No metabolismo da lactose, esta liga-se ao repressor que já não se liga ao operador.
Elementos de controlo cis-actuantes: sequencias reguladoras que afectam a
expressão de genes ligados na mesma molécula de DNA, tal como o operador.
Factores trans-actuantes: afectam a transcrição de genes localizados noutros
cromossomas, assim como o repressor.
5. Controlo positivo da transcrição
O estudo do efeito da glucose na expressão de genes que codificam enzimas
envolvidas no metabolismo de outros açúcares é um exemplo de controlo positivo,
pois aquelas enzimas apenas são expressas quando a glucose não está disponível.
• Quando existem baixos níveis de glucose, a adenil ciclase converte ATP em
AMPc.
• O AMPc liga-se a uma proteína reguladora da transcrição (CAP – catabolite
activator protein), que se vai ligar à sequencia de DNA alvo (sequencia do lac
operão)
• CAP interage com a RNA polimerase, facilitando a sua ligação ao promotor e
activando a transcrição.
23
FML – Biologia Molecular da Célula
RNA polimerases Eucarióticas e Factores de Transcrição
A transcrição ocorre do mesmo modo em todas as células, no entanto é mais
um processo mais complexo em eucariotas que nos procariotas, pois:
• Enquanto que os procariotas têm uma RNA polimerase que transcreve todos os
genes, nos eucariotas existem diferentes RNA polimerases que transcrevem
classes de genes distintas.
• A RNA polimerase eucariota necessita de interagir com várias proteínas para
iniciar o processo – factores de transcrição.
1. RNA polimerases eucarioticas
RNA polimerase II: transcreve genes codificantes de proteínas (mRNA’s).
RNA polimerase I: transcreve espécies maiores de rRNA
RNA polimerase III: transcreve espécies pequenas de rRNA’s e tRNA’s; RNAs envolvidos
em splicing e transporte de proteínas (snRNA’s e scRNA’s)
RNA polimerase mitocondrial: transcreve o DNA deste organelo.
RNA polimerases:
• São enzimas complexas (12 a 17 subunidades)
• Reconhecem promotores diferentes
• Transcrevem classes de genes distintas.
2. Factores de transcrição gerais e inicio da transcrição pela RNA polimerase II
−
−
A actividade da RNA polimerase II é diferente da RNA polimerase procariota
A RNA polimerase II apenas inicia a transcrição se forem adicionadas proteínas –
factores de transcrição
Factores de transcrição:
• Factores de transcrição gerais (envolvidos na transcrição de todos os
promotores da polimerase II)
• Factores de transcrição específicos para o gene (ligam-se a sequencias de
DNA que controlam a expressão de genes individuais)
Factores de transcrição necessários para iniciar a transcrição:
• TFIID
• TFIIB
• TFIIF
• TFIIE
• TFIIH
• Complexo proteico mediador (permite a resposta da RNA polimerase II a
factores reguladores)
−
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−
−
Os promotores de vários genes transcritos pela polimerase II contêm uma
sequência semelhante a TATAA com 25 a 30 nucleótidos (TATAA box) acima do
local de iniciação da transcrição
Um factor de transcrição geral (TFIID) liga-se a TATAA box, através da TATA-binding
protein (TBP) e a outros nucleótidos através de TBP-associated factors (TAFs).
Depois liga-se outro factor (TFIIB) que se liga a TBP tal como à sequência de DNA
que está atrás da TATA box.
A TFIIB serve como uma ponte para a RNA polimerase II que se liga ao complexo
TBP-TFIIB em associação ao TFIIF
De seguida ligam-se mais 2 factores de transcrição (TFIIE e TFIIH)
24
FML – Biologia Molecular da Célula
−
−
−
A TFIIH desenrola o DNA na região do inicio da transcrição e fosforila uma parte da
RNA polimerase (CTD) libertando-a do complexo de iniciação.
Para além da TATAA box, muitos promotores transcritos pela RNA polimerase
contêm outro sequência importante (sequência iniciadora ou Inr) que expande a
região iniciadora.
Existem promotores que não têm a TATAA box, mas a sequência iniciadora e uma
outra (DPE – downstream promotor element) que são reconhecidas por TBPassociated factors (TAF’s) pois não existe TATAA box para ser reconhecida pela TBP
que continua a ter um papel fundamental neste processo.
3. Transcrição pela RNA polimerase I
−
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−
−
A TBP (TATAA binding protein) é requerido pelas 3 polimerases, apesar de cada
uma reconhecer promotores distintos.
A RNA polimerase I transcreve genes ribossomais que leva à formação de 48S prérRNA que é processado e forma os rRNAs 28S, 18S e 5,8S.
O promotor dos genes ribossomais é reconhecido por 2 factores de transcrição: UBF
(upstream binding factor) e SL1 (selectivity factor 1; que contem a TBP); que se
juntam à RNA polimerase I formando o complexo de iniciação.
Na ausência da TATAA box no promotor, a TBP não se liga a sequências
específicas, são algumas proteínas do SL1 que se ligam ao promotor.
4. Transcrição pela RNA polimerase III
−
−
A polimerase III transcreve o tRNA, 5S rRNA e algum RNA pequeno envolvido em
splicing (snRNA).
Estes genes são transcritos a partir de diferentes promotores
5S rRNA: ligação de TFIIIA a sequências especificas no promotor e formação de um
complexo iniciador (TFIIIC, TFIIIB e polimerase).
tRNA: o promotor não contém a sequência reconhecida por TFIIIA, logo o TFIIIC liga-se
directamente ao promotor formando o complexo com a ligação do TFIIIB e da
polimerase.
RNAs envolvidos em Splicing: o promotor contém a TATAA box (reconhecida pela TFIIIB
através da TBP) tal como um local de ligação para outro factor (SNAP). A polimerase
ligação posteriormente à TFIIIB.
25
FML – Biologia Molecular da Célula
Regulação da Transcrição em Eucariotas
Tipos de controlo:
• Ao nível da iniciação da transcrição
• Ao nível do elongamento
• Proteínas reguladoras
• Enrolamento do DNA
• Metilação do DNA
1. Sequências reguladoras cis-actuante: promotores e enhancers
−
−
A transcrição na bactéria é regulada pela ligação de proteínas a sequências cisactivadoras que regulam a transcrição dos genes adjacentes.
No eucariotas também existe um género de regulação similar a esse.
Î Para estudar essas sequências em eucariotas:
• Liga-se a sequência reguladora a um gene repórter (codifica uma enzima
facilmente detectável)
• A expressão do gene repórter promove um conhecimento sobre a função da
sequência reguladora clonada.
−
−
Os genes transcritos pela RNA polimerase II têm 2 elementos centrais no promotor:
TATAA box e a sequência Inr, que servem de locais específicos de ligação dos
factores de transcrição gerais.
Outras sequências cis-activadoras servem de local de ligação para uma grande
variedade de factores de regulação que controlam a expressão individual de
genes. Estas sequências estão muito frequentemente acima da TATAA box.
Enhancers:
− São sequências que, embora estejam longe do local de transcrição, podem
estimulá-la.
− Funcionam, tal como os promotores, pela ligação de factores de transcrição que
regulam a RNA polimerase
− Isto é possível pela formação de um DNA looping que permite que os factores
ligados ao enhancer interajam com as proteínas associadas à RNA polimerase e
ao promotor.
− A ligação de factores aos enhancers é reponsável pelo controlo da expressão
genética durante o desenvolvimento e diferenciação, tal como durante a resposta
a hormonas e factores de crescimento.
− Os enhancers geralmente contêm inúmeros elementos sequenciais funcionais que
se ligam a diferentes proteínas reguladoras de transcrição.
− É a expressão específica de cada tecido em proteínas reguladoras que resultam
em diferentes combinados de diferentes elementos no enhancer.
2. Proteínas reguladoras de transcrição
−
−
O isolamento de proteínas reguladoras de transcrição é baseado na sua ligação
específica a um promotor ou a sequências amplificadoras
Estudo desta ligação:
1. Footprinting
26
FML – Biologia Molecular da Célula
2. Electrophoretic-mobility shift assay (ensaio de retardamento em gel)
• Incubação de DNA marcado radioactivamente com proteínas
• Electroforese num gel não desnaturante
Î A ligação às proteínas é detectado pelo retardamento da
mobilidade electroforética do fragmento de DNA.
3. Purificação de proteínas por cromatografia de DNA por afinidade
• Liga-se oligonucleótidos iguais a esferas (composto celular) numa
coluna
• Introduz-se extracto celular
Î As proteínas que se ligaram às esferas envolvidas naquela sequência
ficaram presas enquanto que as outras saem depois da lavagem.
3. Estrutura e função dos activadores de transcrição
Activadores:
− Ligam-se a sequências de DNA reguladoras e estimulam a transcrição.
− Têm 2 regiões:
• Onde a proteína se liga especificamente ao DNA
• Outra que activa a transcrição interagindo com outros componentes
da maquinaria de transcrição.
4. Repressores eucariotas
−
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−
−
Ligam-se a sequências de DNA e inibem a transcrição
Podem apenas interferir com a ligação de outro factor de transcrição de DNA ou
da RNA polimerase.
Outros repressores competem com activadores no local de ligação ao DNA,
possuindo o domínio da ligação mas não o domínio da activação
Os repressores activos inibem a transcrição por interacção entre as proteínas.
27
FML – Biologia Molecular da Célula
5. Relação entre a estrutura da cromatina e a transcrição
−
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−
−
−
−
−
O DNA de todas as células eucariotas está intimamente ligado a histonas,
formando os nucleossomas.
O empacotamento do DNA no núcleo interfere com a transcrição
Os genes transcritos activamente são encontrados numa cromatina
descondensada, mas o DNA continua enrolado nos nucleossomas, constituindo um
obstáculo à maquinaria de transcrição.
A cromatina activa para transcrição atravessa determinadas modificação, tal
como:
• Modificação das histonas
• Rearranjos nos nucleossomas
• Associação a 2 proteinas (nonhistone chromossomal proteins) – proteínas
HMGN
Acetilação das Histonas
As histonas têm 2 porções, uma envolvida no núcleo e enrolamento do DNA e um
domínio amino-terminal.
O domínio amino-terminal é rico em lisina que pode ser modificada por acetilação.
A acetilação:
• Reduz a carga positiva das histonas enfraquecendo a ligação destas ao
DNA.
• Facilita a ligação dos factores de transcrição.
6. Regulação da transcrição por RNA’s não codificantes
−
−
Um forma da actuação de RNA’s não codificantes é inibir a tradução por
interferência de RNA
Reprime a transcrição de alguns loci cromossomais, pela indução da
condensação da cromatina
7. Metilação de DNA
−
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−
−
−
−
−
−
Controla a transcrição em vertebrados
Resíduos de citosina podem ser modificados pela adição de grupos metil ao C5
Esta metilação ocorre em C’s que precedem G’s, na cadeia de DNA
(dinucleótidos CpG)
Esta metilação está relacionada com a redução da transcrição, em genes que
contêm grande frequência de dinucleótidos CpG, através da interferência na
ligação de factores de transcrição e pela ligação de repressores.
Parece que a metilação apenas serve para manter e estabilizar a inactivação de
um gene
Genomic imprinting
Controla a expressão de alguns genes envolvidos no desenvolvimento embrionário
de mamíferos
Na maior parte dos casos os 2 alelos são expressos em células diploides, no entanto
existem alguns genes “imprinted” cuja expressão depende de quem são herdados.
A metilação é importante na distinção entre os alelos maternos ou paternos dos
genes “imprinted”.
28
FML – Biologia Molecular da Célula
Processamento de RNA e Turnover
−
O pré-RNA tem de sofrer modificações para se tornar funcional, excepto o RNA
bacteriano.
Procariotas: os ribossomas têm acesso directo ao mRNA e a tradução começa com o
mRNA nascente, enquanto a transcrição ainda está a ocorrer.
Eucariotas: o mRNA sintetizado no núcleo tem que ser transportado para o citoplasma
antes de ser usado como molde para síntese proteica.
−
No entanto, todo o rRNA e tRNA necessita de processamento, quer em células
eucarioticas quer em procariotas.
1. Processamento de mRNA em eucariotas
Processamento do mRNA:
• Modificação das extremidades (caping e adenilação)
• Remoção de intrões (splicing)
A transcrição e o processamento do mRNA são processos que estão coordenados
devido a uma porção (CTD) da RNA polimerase II que serve como local de ligação
para as enzimas envolvidas no processamento.
Modificação da extremidade 5’ (capping)
− Adição de uma estrutura (7-metilguanosina cap), pelas caping enzimes, que
estabiliza o RNA e alinha-o com o ribossoma, na tradução.
Modificação da extremidadde 3’ (poliadenilação)
− Clivagem desta terminação e adição de uma cauda poli-A – poliadenilação.
− Um sinal de poliadenilação (hexanucleótido AAUAAA, em mamíferos) localiza-se 10
a 30 nucleótidos acima do local de poliadenilação.
− Estas sequências são reconhecidas por um complexo de proteínas:
• uma endonuclease que corta o RNA
• a poli-A polimerase que adiciona a cauda poli-A
− a poliadenilação representa o fim da transcrição, estando o complexo proteico de
poliadenilação associado à RNA polimerase II.
− Regula a transcrição e a estabilidade do mRNA
2. Mecanismos de Splicing
Splicing: remoção de intrões do pré-RNA e produção de mRNA funcional.
Este mecanismo ocorre em 5 passos:
1. O pré-mRNA é clivado na extremidade 5’ do splicing site.
2. A terminação 5’ do intrão é unida a um nucleótido de adenina dentro do
intrão (próximo da extremidade 3’) – resulta numa ponte de ramificação (um
loop) devido à união a extremidade 5’ ao 2’ OH da adenina.
3. Clivagem da extremidade 3’
4. Ligação dos 2 exões.
5. Linearização e degradação do intrão.
O pré-mRNA contém sequências consensuais em cada posição critica,
permitindo que a maquinaria de splinging reconheça o pré-mRNA e desenvolva as
reacções de clivagem e ligação.
29
FML – Biologia Molecular da Célula
Spliceossomas:
− Complexos envolvidos no processo de splicing, compostos por proteínas e RNA’s
(snRNA’s: U1, U2, U4, U5, U6).
− Cada snRNA está complexado com 6 a 10 proteínas formando small nuclear
ribonucleoprotein particles (snRNP’s) que exercem o papel principal no processo:
• U1, U2 e U5 são moléculas isoladas
• U4 e U6 estão num complexo formando um único snRNP.
Associação do spliceossoma:
1. Ligação do snRNP U1 à extremidade 5´ do splicing site (devido à
complementaridade de bases com a extremidade 5´do snRNA U1)
2. snRNP U2 liga-se ao ponto de ramificação (também por complementaridade
de bases)
3. O complexo formado snRNP’s U4/U6 e U5 incorporam-se no spliceossoma,
ligando-se o U5 acima do ponto de ramificação.
Rearranjos antes de começar o splicing:
1. U6 dissocia-se do U4 e retira o U1 da extremidade 5’.
2. U5 liga-se à sequência da extremidade 3’
3. Excisão do intrão e ligação dos exões.
snRNA’s:
• Reconhecem as sequências no ponto de ramificação e na extremidades
• Catalizam as reacções directamente
Î Alguns RNA’s podem fazer auto-splicing
Factores de Splicing: direccionam os spliceossomas para os locais de splicing correctos
através da ligação de sequências de RNA nos exões e depois recrutando os snRNP’s
U1 e U2 para os locais apropriados no pré-mRNA por interecções proteína-proteina.
3. Splicing Alternativo
−
Processo que ocorre em eucariotas e permite a regulação da expressão genética
em diferentes tecidos e durante o desenvolvimento.
• Obtêm-se diferentes combinações de locais de splicing originando vários
RNA’s.
• Combinações dos mesmos exões.
4. Edição de RNA
−
−
Processo que altera as sequências codificantes de proteínas de alguns mRNA’s.
Resulta na mudança de bases como resultado de reacções de modificação de
bases:
• desaminação da citosina a uridina
• desaminação da adenosina a inosina.
30
FML – Biologia Molecular da Célula
5. Degradação de RNA
−
−
−
Os processos acima descritos resultam na formação de RNA maduro, que é
transportado para o citoplasma onde ocorre a síntese proteica
No entanto muitas sequências transcritas para pré-mRNA são degradadas no
núcleo, tal como os intrões.
Esta função é exercida por:
• uma enzima que reconhece a ligação 2’-5’ formada no ponto de ramificação
• outras enzimas que reconhecem as extremidades 3’ e 5’ e catalizam a
degradação de RNA em qualquer direcção.
−
As células possuem um sistema de controlo de qualidade (nonsense-mediated
mRNA decay) que leva à degradação de:
• mRNA’s que não têm a sequência completa prevenindo a síntese de proteínas
anormais
• codão de terminação prematuro encontrado pelo ribossoma (no caso das
bactérias)
−
A degradação no citoplasma é outro modo de controlo da expressão dos genes:
• O rRNA e tRNA são muito estáveis
• O mRNA bacteriano é rapidamente degradado, permitindo respostas rápidas
e variações ambientais.
• mRNA eucariota tem um degradação variada, com vista a facilitar a
regulação dos genes.
Processo de degradação no citoplasma:
• Encurtamento das cadeias poli-A
• Remoção do cap na extremidade 5’
• Degradação por nucleases a partir das extremidades.
mRNA’s instáveis:
• Codificam proteínas reguladoras
• Contêm muitas sequências ricas em AU perto da extremidade 3’.
31
FML – Biologia Molecular da Célula
7. Síntese Proteica
Tradução de mRNA
−
−
−
−
−
A tradução corresponde à transformação da mensagem contida no mRNA na
sequência de aminoácidos que constituem a cadeia polipeptídica.
O mRNA contém a informação para a síntese proteica e é lido de 5’ para 3’.
A cadeia polipeptidica é sintetizada da extremidade amina para a terminação
carbolixo.
Cada aminoácido é especificado por codões do RNA
O mecanismo de tradução é semelhante em todas as células
Intervenientes:
• mRNA: contém a informação genética para a síntese de proteínas
• Aminoácidos: moléculas básicas para a construção das proteínas.
• tRNA: selecciona e transporta o aminoácido apropriado e reconhece o codão
correspondente do ARNm. Funcionam como intérpretes entre a linguagem do
ARNm e a linguagem das proteínas.
• Ribossomas: sistemas de leitura. Promovem a ligação entre aminoácidos. Na sua
constituição entra o RNA ribossómico (rRNA) e proteínas.
• Enzimas: catalisam as reacções que ocorrem em todo o processo
• ATP: Transfere energia para o sistema.
1. RNA de transferência (tRNA)
• Cada um dos 20 aminoácidos tem que ser alinhado com os codões
correspondentes do mRNA
• O tRNA serve como adaptador para este processo, fazendo a ligação entre o
mRNA e o aminoácido correspondente.
• Tem uma estrutura de L, requerida para se encaixar do ribossoma durante a
tradução
• Todos terminam em CCA ao qual se liga o aminoácido, na extremidade 3’
• Contém um anticodão na outra extremidade que se liga ao codão respectivo,
devido à complementaridade das bases.
• A ligação dos aminoácidos no tRNA especifico é catalizada pela aminoacil
tRNA sintetase, que reconhece um aminoácido para o tRNA correcto.
• Esta reacção é ATP-dependente.
2. Ribossoma
• É o local de síntese proteica de todas as células
• Faz a ligação entre o tRNA e o mRNA
• Tem 2 subunidades que normalmente estão separadas no citoplasma e só se
ligam para realizar a síntese proteica, contendo cada uma delas proteínas
características e rRNA.
• O rRNA tem um papel catalítico, pois são essenciais para a junção de
ribossomas funcionais in vitro e um papel estrutural, na qual se reúnem as
proteínas ribossomais.
• O ribossoma mantém os aminoácidos juntos, permitindo a ligação peptidica,
catalisada pela subunidade maior.
• A cadeia vai crescendo à medida que se vai adicionando aminoácidos.
32
FML – Biologia Molecular da Célula
• A cada mRNA correspondem 3 locais de leitura diferentes que correspondem a
aminoácidos diferentes.
• O ribossoma tem que saber o quadro de leitura para a sequência de
aminoácidos que se pretende sintetizar.
3. A organização do mRNA e o inicio da tradução
−
−
−
−
−
−
−
−
A tradução não começa na extremidade 5’ do mRNA, mas em locais específicos
de iniciação.
Vão existir locais entre a extremidade 5’ e o local de iniciação que não vão ser
traduzidas – UTR (untranslated region)
O mRNA eucariótico codifica apenas uma cadeia polipeptidica especifica
(monocistronico), enquanto que o mRNA procariótico pode codificar mais do que
uma, dependendo do local de iniciação (policistronico)
Em ambas as células, a tradução começa no codão AUG que codifica o
aminoácido metionina.
A sequência de iniciação é diferente nos eucariotas e procariotas.
O mRNA bacteriano contém uma sequência (sequência de Shine-Delgarno) que
alinha o mRNA no ribossoma para a tradução pela complementaridade das bases
do rRNA.
Esta sequência impede que a tradução comece na extremidade 5’ e noutros
locais de iniciação internos.
O RNA humano não contem a sequencia de Shine-Delgarmo, logo o ribossoma
não reconhece o sitio a partir do qual começa a síntese. Quando se corta o DNA
plasmidico para se introduzir o Gene é necessário ter em conta este factor.
4. Processo de Tradução
É composta por 3 etapas: iniciação, alongamento e finalização
1. Iniciação:
• Verifica-se a ligação do mRNA e de um tRNA iniciador, que transporta
usualmente o aminoácido metionina à subunidade menor de um ribossoma.
• A subunidade maior do ribossoma liga-se ao conjunto.
• O ribossoma está então funcional.
• É necessário proteínas não ribossomais especificas – factores eucarióticas de
transcrição – que reconhecem a extremidade 5’ e 3’ do mRNA, sendo
responsáveis pela estimulação da poliadenilação durante a tradução.
2. Alongamento:
• É a fase de tradução dos codões sucessivos do mRNA e da ligação dos
aminoácidos.
• Os locais do ribossoma a que se liga o tRNA designam-se sítios P, A e E.
• O tRNA iniciador liga-se ao sítio P
• O próximo tRNA liga-se ao sitio A, pelo emparelhamento com o segundo
codão.
• Há a formação de uma primeira ligação peptídica entre o aminoácido que ele
transporta e a metionina.
• Durante este processo o ribossoma move 3 nucleótidos ao longo do mRNA,
posicionando o codão seguinte no sitio A vazio.
• O alongamento do péptido continua até que um codão STOP seja translocado
no sitio A do ribossoma.
33
FML – Biologia Molecular da Célula
3. Finalização:
• Os codões de finalização não têm nenhum anticodão complementar, mas
existem factores de libertação que reconhecem os sinais e terminam a síntese
proteica.
• Estes factores ligam-se a um codão STOP no sitio A e estimulam a hidrólise do
polipéptido completo do ribossoma.
• O tRNA é libertado, as subunidades do ribossoma e o mRNA dissociam-se
Características da biossíntese de proteínas:
- Complexidade: faz interferir vários agentes
- Rapidez: uma célula eucariótica junta 140 aminoácido de uma cadeia de
hemoglobina em dois a três minutos.
- Amplificação: a mesma zona de DNA pode ser transcrita várias vezes,
formando-se assim várias moléculas de mRNA idênticas. Por outro lado, os
polirribossomas mostram que a tradução da mesma mensagem é
descodificada simultaneamente por vários ribossomas. Originam-se, deste
modo, várias cadeias polipeptídicas idênticas, resultando cada uma delas da
tradução efectuada por cada ribossoma. Desta forma, apesar de o mRNA ter
curta duração, como a sua mensagem podem ser traduzida várias vezes é
amplificada a sua actividade.
5. Regulação da Tradução
−
−
−
Um mecanismo de regulação deste processo é a ligação de proteínas repressoras
a sequências específicas de mRNA, bloqueando a tradução.
A ligação da mesma proteína reguladora a diferentes sítios nas moléculas de
mRNA pode ter efeitos distintos na expressão genética:
• inibir a tradução
• estabilizar o mRNA para aumentar a síntese proteica.
Outro mecanismo regulador envolve a modulação da actividade de factores de
iniciação.
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FML – Biologia Molecular da Célula
8. Núcleo
−
−
A presença de núcleo é a principal diferença entre células eucariotas
eprocariotas.
O núcleo serve como reservatório para a informação genética e como centro de
controlo da célula
Processos que ocorrem no núcleo:
• Replicação de DNA
• Transcrição
• Processamento de RNA
Invólucro Nuclear e o Tráfico entre o Núcleo e o Citoplasma
Invólucro nuclear:
− Separa o conteúdo nuclear do citoplasma
− É consitituido por 2 membranas
− Impede a passagem livre de moléculas entre o núcleo e o citoplasma
− Mantém o núcleo como um compartimento bioquímico distinto
− É interrompido por poros que permitem a passagem de moléculas
− Permite um tráfico selectivo de proteínas e RNA’s.
1. Estrutura do invólucro nuclear
−
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−
−
−
−
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−
−
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−
−
2 membranas nucleares:
São uma expansão do retículo endoplasmático
A externa está directamente em contacto com o RE
O espaço intermembranar contacta com o lúmen do RE
A membrana externa tem ribossomas ligados à superfície citoplasmática
São constituídas por uma bicamada fosfolipidica apenas permeável a moléculas
apolares (pequenas)
Lâmina nuclear
Localiza-se na membrana interna
Fornece suporte estrutural ao núcleo
É consitituido por proteínas – as lâminas
As proteínas filamentosas relacionam-se entre si formando filamentos
Esta associação começa com a formação de dimeros, nos quais as regiões em αhélice enrolam-se entre si.
Depois estes dimeros associam-se uns aos outros.
Existem lâminas que servem como pontos onde a cromatina se vai juntar
A organização normal da lâmina nuclear é essencial para a replicação do DNA e
na regulação da transcrição.
2. Complexo do poro nuclear
−
−
−
Poros:
São canais que permitem a passagem de pequenas moléculas polares, iões e
macromoléculas (proteínas e RNA’s)
Desempenha um papel fundamental na célula eucariótica visto que controlam a
passagem de substâncias entre o citoplasma e o núcleo
São estruturas selectivas e complexas
35
FML – Biologia Molecular da Célula
Molécula que sai do núcleo:
• RNA
Moléculas que entram no núcleo:
• Proteínas com funções nucleares (polimerase)
• Hitonas
Consoante o tamanho da molécula, existem diferentes mecanismos de passagem
pelos poros:
Moléculas pequenas:
− Passam livremente pelo poro nos 2 sentidos (núcleo Æ citoplasma; citoplasma Æ
núcleo)
− Passam por difusão passiva
Moléculas grandes (proteínas e RNA’s)
− Passam por um processo activo
− As proteínas e RNA’s são reconhecidas pelos poros e são seleccionadas numa
direcção específica.
3. Transporte selectivo de proteínas para e do núcleo
Proteínas essenciais para o transporte através do poro nuclear:
• Receptor de transporte nuclear
9 Importinas (transportam macromoléculas para dentro do núcleo)
9 Exportinas (transportam macromoléculas para o citoplasma)
• Proteína ligante do GTP (small GTP-binding protein) – Ran
−
−
−
−
−
A actividade e conformação da Ran são reguladas pela ligação de GTP e
hidrólise.
As enzimas que estimulam a passagem de GTP a GDP encontram-se no lado
citosólico do invólucro, enquanto que as que transformam GDP em GTP localizamse no lado nuclear.
Este facto vai gerar um gradiente GTP/Ran ao longo do poro nuclear que poderá
determinar a direcção do transporte nuclear.
Proteínas importadas para o núcleo
Tem um sinal de reconhecimento nuclear composto por aminoácidos que não
necessitam de estar juntos na cadeia polipeptidica (sequência bipartida)
Durante a importação de proteínas, a importina reconhece o sinal de
reconhecimento nuclear da proteína, processo facilitado pela interacção com
Ran.
1. O complexo importina-Ran/GDP liga-se à proteína que contém o sinal de
reconhecimento nuclear.
2. O complexo formado liga-se a filamentos citoplasmáticos do poro.
3. Ligação a proteínas nucleares especificas que se vão localizando cada vez
mais longe o poro.
4. O GDP ligado ao Ran é transformado em GTP, o que vai modificar a
conformação da importina que se separa da proteína importada.
5. O complexo importina-Ran/GTP é exportado para o complexo do poro
6. O GTP é hidrolisado a GDP para regenerar o complexo importina-Ran/GDP.
Î Existem proteínas que entram e saem do núcleo: transportadores (p. ex. de RNA) ou
coordenadores de funções nucleares e citoplasmáticas.
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FML – Biologia Molecular da Célula
Proteínas exportadas do núcleo para o citoplasma:
−
−
−
−
−
Contêm um sinal de exportação nuclear
Este sinal é reconhecido pelas exportinas, se ligam a Ran
Ran/GTP promove a formação de complexos estáveis entre as exportinas e as
proteínas
O complexo atravessa o poro nuclear
O GTP é hidrolisado a GDP levando à dissociação da proteína.
4. Transporte de RNA’s
−
−
−
−
−
O RNA é transportado do núcleo para o citoplasma
O transporte de RNA é um processo activo, dependente de energia que requere
Ran para se ligar ao GTP.
Os RNA’s são transportados como complexos ribonucleicos (RNP’s)
Algumas proteínas do complexo têm sinais de exportação nuclear que são
reconhecidos pelos receptores de transporte nuclear.
O rRNA está associado a proteínas ribossomais, mRNA especifico e às subunidades
ribossomais.
37
FML – Biologia Molecular da Célula
Organização Interna no Núcleo
O núcleo é mais que um contentor de cromatina, RNA’s e proteínas nucleares
pois contém uma estrutura interna que organiza o material genético e localiza as
funções nucleares para domínios específicos.
Durante a interfase, existe:
• Heterocromatina: cromatina que se mantém condensada
9 Heterocromatina constutiva: contém DNA que nunca é transcrito
9 Heterocromatina facultativa: contém DNA que não é transcrito naquela
célula, mas pode ser noutra.
• Eucromatina: cromatina que descondensa e distribui-se para fora do núcleo.
−
−
−
Durante a interfase os cromossomas estão organizados e divididos em domínios
funcionais discretos que impõe um papel importante na regulação da expressão
genética.
Os genes transcritos activamente estão localizados na periferia destes territórios,
perto de canais que separam os cromossomas.
Como células diferentes, expressão genes diferentes, a heterocromatina facultativa
é diferente e varia nos cromossomas.
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FML – Biologia Molecular da Célula
Nucléolo
−
−
−
É o local de transcrição e processamento de rRNA e da formação de ribossomas.
É uma fábrica de ribossomas designada para preencher as necessidades de
produção regulada e eficiente de rRNA e formação das subunidades do
ribossoma.
O nucléolo não está envolvido por membrana, está associado às regiões
cromossómicas que contêm os genes que transcreve: 5,8S, 18S e 28S.
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FML – Biologia Molecular da Célula
9. Selecção e Transporte Proteico
−
−
Cada proteína pode ter diferentes destinos, consoante o seu tipo e função.
Os destinos possíveis são:
• Núcleo
• Retículo endoplasmático
• Aparelho de Golgi
• Membrana Plasmática
• Lisossomas
• Secreção
• Citoplasma
• Peroxissomas
• Mitocondrias
Retículo Endoplasmático
−
−
É um centro de membranas em tubos e sacos (cisterna) que se estende do
invólucro nuclear para o citoplasma
Tipos de RE:
• Rugoso (coberto de ribossomas)
• Transitório (local onde as vesículas saem para o aparelho de Golgi)
• RE liso (é envolvido em lípidos)
1. Retículo endoplasmático e secreção de proteínas
Via de secreção:
RE rugoso Æ A. Golgi Æ Vesículas de Secreção Æ Lisossomas
Æ Membrana celular
Æ Exterior da célula
−
−
As proteínas que são transferidas para o retículo endoplasmático são sintetizadas
nos ribossomas ligados ao RE (rugoso), apesar do início ocorrer em ribossomas livres
no citoplasma.
As proteínas que ficam no citoplasma são sintetizadas em ribossomas livres
(sempre)
Existem 2 tipos de translocação:
Translocação co-translacional: síntese proteica nos ribossomas do RE.
Translocação pós-translacional: síntese proteica nos ribossomas livres.
Translocação co-translacional
1. Associação de ribossomas com o RE:
− Os ribossomas estão marcados para se ligarem ao RE pela cadeia polipeptidica
que está a ser sintetizada.
− Os ribossomas ligados ao RE e livre não têm diferença alguma.
− A síntese começa sempre com ribossomas livres.
2. Marcação da proteína por um sinal:
− A marcação ocorre na extremidade amina
− O sinal é constituído por aminoácidos hidrofóbicos
− Este sinal marca as proteínas para a sua correcta localização
40
FML – Biologia Molecular da Célula
−
−
−
O sinal é reconhecido e liga-se à partícula reconhecedora do sinal (SRP) = 6
péptidos.
O SRP liga-se ao ribossoma tal como o sinal, inibindo a tradução, marcando o
complexo para o RE pela ligação ao receptor SRP
Esta ligação liberta o SRP do ribossoma e do sinal
3. Ligação do ribossoma a um complexo proteico de translocação
− O sinal entra para dentro do canal membranar ou translocão.
4. Síntese da cadeia polipeptidica para dentro do RE
− O sinal liga-se a uma peptidase e o polipéptido é libertado para o lúmen do RE.
Translocação pos-translacional
1. Síntese em ribossomas livres no citoplasma
2. O sinal é reconhecido por proteínas receptoras associadas ao translocão
3. É necessário a ligação de Hsp70 citosólico à cadeia polipeptidica para manter a
cadeia numa conformação para entrar no translocão
4. Hsp70 serve para puxar para dentro a cadeia polipeptidica (BiP)
2. Inserção de proteínas na membrana do RE
−
−
−
−
As proteínas destinadas à incorporação da membrana plasmática ou outras
membranas são inicialmente inseridas na membrana no RE, em vez de irem para o
lúmen.
As proteínas membranares são embebidas na membrana por regiões hidrofóbicas
que se expandem da bicamada fosfolipidica.
A porção intramembranar destas proteínas é geralmente em α-hélice consistindo
em 20 a 25 aminoácidos hidrofóbicos.
A formação da α-hélice maximiza as pontes de hidrogénio entre o péptido e os
aminoácidos hidrofóbicos das cadeias laterais interagem com os ácidos gordos
dos fosfolipidos da bicamada.
Variações na inserção de proteínas intrínsecas:
−
−
Algumas têm mais que um domínio transmembranar
A orientação pode ser diferente (extremidade carboxilo para o lado citosólico ou
para o interior do lúmen)
A orientação das proteínas mantém-se ao longo da via:
−
−
A parte que está virada para o lúmen fica virada para o lado extracelular (no caso
de proteínas da membrana plasmática), pois a composição do lúmen do RE é
semelhante à do espaço extracelular.
A porção que contacta com o citosol, permanece sempre em contacto com o
citosol.
41
FML – Biologia Molecular da Célula
Inserção de proteínas transmembranares com a extremidade carboxilo orientada para
o citosol:
1. O sinal da extremidade amina que direcciona a proteína para o retículo
endoplasmático é clivado
2. A síntese continua até que uma sequência STOP transferência bloqueia a
transferência e a proteína fica ancorada à membrana por um domínio αhélice.
3. O translocão fecha devido à sinalização
4. A porção com a extremidade C é sintetizada no citosol
5. As subunidades do translocão separam-se e o domínio transmembranar fica na
bicamada.
Inserção de proteínas transmembranar ancoradas pelo sinal de internalização:
−
−
−
O sinal de internalização é reconhecido pela SRP
O sinal não é clivado e actua como um domínio transmembranar em α-hélice.
A proteína fica ancorada à membrana através do sinal.
Î As proteínas inseridas na membrana deste modo podem estar orientadas dos 2
modos possíveis, dependendo de onde se encontra o sinal.
As proteínas transmembranares com mais que um domínio membranar têm séries
alternativas de sequências de sinalização interna e seqências STOP transferência.
3. Moldagem e processamento proteico no RE
Na via secretória, as proteínas são moldadas durante a sua translocação no RE ou já
dentro do lúmen
Processos que ocorrem no RE:
• Moldação de proteínas (para 3 dimensões)
• Formação de subunidades
• Formação de ligações dissulfito (o ambiente oxidante do RE permite a
formação destas ligações numa reacção catalizada pela Proteína Disulfito
Isomerase)
• Glicolisação (primeiras etapas – N glicolização)
• Adição de ancoras de glicolipidos
Chaperona Hsp70 (Bip): liga-se à cadeia polipeptidica durante a sua passagem para o
RE e medeia a moldagem e formação de subunidades nas proteínas.
Glicosilação:
− Ocorre nos resíduos de asparagina (N-glicolisação)
− Os oligossacarídeos (14 açucares) são sintetizados num lipido (dolicol) ligado à
membrana do RE.
− A enzima, oligossacarideo transferase, transfere o bloco para os resíduos de
asparagina
− 4 açucares (3 glicose e 1 manose) são removidos
− Processam-se várias alterações antes da proteína passar para o A. Golgi.
42
FML – Biologia Molecular da Célula
Î Algumas proteínas estão ligadas à membrana por glicolipidos – âncoras de
glicosilfosfatidilinositol (GPI) – através da extremidade carboxilo. Estas proteínas são
transportadas tal como as proteínas transmembranares na via secretória.
−
−
Muitas proteínas são degradadas assim que são produzidas, devido à sua
incorrecta formação
Um papel do RE é marcar essas proteínas e dirigi-las para a via de degradação –
controlo de qualidade.
4. Exportação de proteínas e lípidos do RE
−
−
−
−
Tanto as proteínas como os lípidos viajam ao longo da via secretória em vesículas
As membranas das vesículas fundem-se com as do organelo para onde viajam.
As proteínas que são transportadas por meio de vesículas mantêm a sua
orientação – o lado que está virado para o citosol fica no citosol.
Algumas proteínas permanecem no RE, estando sinalizadas.
Sinal das proteínas:
• Que ficam no RE (KDEL – proteínas que voltam para o RE; KKXX – proteínas
transmembranares que ficam no RE)
• Que vão para o A. Golgi
−
−
Se ocorrerem mutações ao nível dos sinais que identificam as proteínas que ficam
no RE, vão ocorrer alterações no seu destino. Estas vão passar para o A. Golgi e
vão ser secretadas para fora da célula.
A introdução do sinal KDEL vai fazer com que as proteínas que normalmente iriam
para o Golgi permaneçam no RE.
43
FML – Biologia Molecular da Célula
Aparelho de Golgi
1. Organização do Golgi
−
−
−
−
É consitituido por membranas em cisterna associadas a vesículas
Tem uma polaridade diferente na sua estrutura e função
As proteínas do RE entram, na face cis (face de entrada) e saem pela face trans
(face de saíde)
O aparelho de Golgi aparenta ter 4 regiões distintas
• Cis Golgi
• “Golgi Stack”
9 Medial
9 Trans
• Trans Golgi
2. Glicolisação proteica no aparelho de Golgi
−
−
−
O processamento de proteínas no aparelho de Golgi envolve a modificação e
síntese de carbohidratos das glicoproteinas, tal como a modificação da ligação Nglicosodica (realizada no RE)
Após a glicosilação no RE, a proteína é processada sendo alterada por diversos
processos:
1. Remoção de 3 residuos adicionais de manose
2. Adição sequencial de N-acetilglucosaminas
3. Adição de 3 galactores e 3 ácidos sialicos
As glicoproteinas processadas poderão ser diferentes dependendo da proteína e
das enzimas presentes neste processo que vão originar diferentes ligações Nglicosidicas.
O processamento das ligações N-glicosidicas das proteínas lisossomais difere daquelas
que são secretadas e das plasmáticas.
1. Adição de N-acetilglucosamina fosfato a resíduos específicos de manose
2. Remoção do grupo N-acetilglucosamina, deixando os resíduos de manose 6fosfato na ligação N-glicolitica
−
−
−
Estes resíduos de manose 6-P são depois reconhecidos por receptores ao nível da
membrana do trans Golgi que direcciona o transporte destas proteínas para os
lisossomas.
O passo crítico deste processo envolve o reconhecimento da forma da proteína
lisossomas pela enzima que adiciona a N-acetilglucosamina fosfato.
No aparelho de Golgi também ocorre a O-glicosilação, pela adição de
carbohidratos a cadeias laterais.
3. Metabolismo lipídico e polissacarídeo no A. Golgi
−
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−
O glicerol, fosfolipidos, colesterol e ceramida são sintetizados no RE
A Esfingomielina e glicolipidos são sintetizados a partir da ceramida no Aparelho de
Golgi
A esfingomielina é sintetizada no interior do A. Golgi mas a adição de glicose à
ceramida ocorre no lado citosólico.
44
FML – Biologia Molecular da Célula
4. Selecção de proteínas e exportação do aparelho de Golgi
−
−
−
As proteínas, lipidos e polissacarídeos são transportados do aparelho de Golgi pela
via secretória
As vesículas formam-se no trans Golgi e entregam o conteúdo aos locais celulares
apropriados
Existem proteínas que têm que se manter no aparelho de Golgi, contendo o seu
sinal na parte transmembranar, evitando a incorporação em vesículas deixando o
trans Golgi
Via secretória constitutiva:
− Existe a incorporação de novas proteínas e lipidos na membrana plasmática
− Leva a uma secreção de proteínas não regulada
Veia secretória regulada
− Proteínas específicas são secretadas de acordo com sinais do meio.
45
FML – Biologia Molecular da Célula
Mecanismo de Transporte Vesicular
−
−
O transporte vesicular é responsável pelo tráfico molecular entre os vários
compartimentos membranares.
A selectividade do transporte é baseada num envolvimento selectivo dependente
das vesículas que reconhecem e se fundem com a membrana apropriada.
1. Selecção, proteínas e vesículas
Processos da via secretória, na qual as proteínas transmembranares e proteínas do
lúmen e os seus receptores são envolvidos em vesículas
1. Proteínas são selecionadas de proteínas marcadas para outros destinos e de
proteínas que necessitam de ficar para trás.
2. Formação da vesícula por enrugamento da membrana
3. Transporte da vesícula para a membrana marcada.
Vesículas revestidas por clatrina: responsáveis pela endocitose e transporte do
aparelho de Golgi para o lisossoma.
O revestimento de clatrina resulta da união de 2 complexos de proteínas: clatrina e
adaptadores proteicos (que se agregam no lado citosólico da membrana e unem a
clatrina à membrana)
Vesículas sem clatrina: interagem com os sinais de permanência no RE e aparelho de
Golgi.
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FML – Biologia Molecular da Célula
Lisossomas
−
−
São organelos membranares que contêm uma série de enzimas capazes de
destruir qualquer tipo de polímeros.
Função
• Degradar material:
9 Vindo do exterior da célula
9 Componentes obsoletos da própria
• Sistema imunitário
1. Hidrolases ácidas lisossómicas
− São capazes de hidrolisar proteínas, DNA, RNA, polissacarídeos e lipidos
− Mutações nessas enzimas são responsáveis por muitas doenças genéticas.
Doenças lisossomais: causadas por defeitos na produção das enzimas; a alteração de
um nucleótido por alterar toda a função da hidrolase
−
−
pH
O pH óptimo de actuação das hidrolases é ácido (5) ao contrário do pH do
citoplasma (7)
O pH ácido fornece uma dupla protecção para a degradação incontrolada:
1. Inactiva as hidrolases fora dos lisossomas de modo a não destruírem tudo
2. Transporta protões (H+) para dentro da célula de modo a manter o pH ácido,
acompanhado pela hidrólise de ATP.
2. Endocitose e formação de lisossomas
−
−
−
−
O material do exterior da cálula é captado por vesículas endociticas (cobertas por
clatrina)
As vesículas depois fundem-se com endossomas que amadurecem e são
percurssores de lisossomas, baixando o pH para 5,5 e recebendo as hidrolases
As hidrolases são marcadas com resíduos de manose 6-P que são reconhecidos por
receptores específicos no trans Golgi e incorporam em vesículas envolvidas por
clatrina
No endossoma maduro, as hidrolases são libertadas dos receptores devido ao pH
baixo.
3. Fagocitose e Autofagia
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−
Fagocitose
Os macrofagos “apanham” e degrada partículas grandes (bactérias, células
velhas)
As partículas são transportadas em vesículas facociticas (fagossoma) que se
fundem com os lisossomas
Os lisossomas resultantes – fagolisossoma – podem ser grandes e ter diferentes
formas
Autofagia
O organito envolvido por uma membrana formando uma vesícula –
autofagossoma
A membrana de vesícula interage com a membrana do lisossoma, sendo o
organito posteriormente destruído.
47
FML – Biologia Molecular da Célula
10. Bioenergética e Metabolismo
Mitocôndria
−
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−
Geram grande parte da energia metabólica em células eucariotas produzindo ATP
por fosforilação oxidativa.
Muitas proteínas mitocondriais são traduzidas em ribossomas livre no citoplasma e
são importadas para o organelo por sinais específicos.
As mitocondrias contêm o seu próprio DNA que codifica tRNA, rRNA e algumas
proteínas mitocondriais.
1. Organização e função da mitocôndria
−
−
A mitocôndria está rodeada de um sistema membranar duplo (membrana interna
e membrana externa) cujas membranas estão separadas por um espaço
intermembranar.
A membrana interna forma cristas que se estendem para a matriz mitocondial,
aumentando a área da superfície interna levando a um aumento da produção de
ATP (nas células musculares, as mitocondrias têm maior número de cristas)
A matriz contém:
•
•
DNA mitocondrial
Enzimas do metabolismo oxidativo (ciclo de Krebs, via de degradação de
ácidos gordos e glicose)
Membrana interna:
−
−
−
−
Contém os complexos que fazem parte da cadeia respiratória (fosforilação
oxidativa)
Têm uma superfície aumentada devido à presença de cristas
Contém as enzimas que participam na fosforilação oxidativa bem como proteínas
que intervêm no transporte de metabolitos, entre o citosol e a mitocôndria
É impermeável a iões e moléculas pequenas (propriedade critica para manter o
gradiente de protões)
Membrana externa
−
−
É permeável a pequenas moléculas
Contém porinas, proteínas que formam canais que permite a difusão livre de
pequenas moléculas
Espaço intermembranar
−
Tem uma composição semelhante à do citosol
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FML – Biologia Molecular da Célula
2. O sistema genético da mitocôndria
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As mitocôndrias contêm o seu próprio DNA, que é separado e distinto do genoma
nuclear da célula.
Este facto apoia a hipótese endossimbiótica, pois foram encontradas bactérias
parasitas que só se reproduzem em células eucariotas
O DNA mitocondrial é circular, cujo tamanho caria consoante as espécies
Mas nos genomas mitocondriais maiores predominam sequências não codificantes
e sem informação genética, apesar destes genomas codificarem mais proteínas
O DNA mitocondrial codifica o rRNA e tRNA necessário para a tradução das
sequências codificantes
Outras proteínas são codificadas por genes nucleares que foram transferidos da
mitocondria ancestral para o núcleo.
3. Genoma da mitocôndria humana
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−
−
Codifica 13 proteínas envolvidas no transporte de electrões e na fosforilação
oxidativa
Codifica 16S e 12S rRNA’s e 22 tRNA’s, que são necessários para a tradução das
proteínas
O pequeno nº de tRNA’s permite o uso de um código genético diferente do
código universal.
Tal como o genoma nuclear, o DNA mitocondrial pode sofrer mutações
Como todas as mitocôndrias dos ovos fertilizados provêm do oócito e não do
espermatozóide, uma mutação nas células germinais do seu DNA mitocondrial são
transmitidos à próxima geração pela mãe.
São mutações hereditárias que podem causar doenças:
• Neuropatia óptica hereditária de Leber
• Envelhecimento devido à acumulação de mutações no genoma mitocondrial
Características do DNA mitocondrial face a mutações:
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Tem a mesma probabilidade de mutações espontânea que o nuclear
Como é mais pequeno a probabilidade de ocorrerem mutações é menor
Como são mais abundantes por existirem em todas as mitocondrias vai originar
mais mutações
Existe uma maior probabilidade de mutações no DNA mitocondrial, devido:
• Maior nº de divisões mitocondriais
• Radicais livres de oxigénio
• Inexistência de sistemas de reparação de DNA
Pelo facto de existirem poucas regiões não codificantes, a probabilidade das
mutações afectarem as proteínas é maior.
Células mais sujeitas a doenças por mutações no DNA mitocondrial:
• Neurónios
• Células musculares
Manifestação da doença
• Depende do nº de mitocôndrias mutadas herdadas
• Manifesta-se em idade tardia
A análise de DNA nuclear é substituída pela análise do genoma mitocondrial, porque:
− É mais pequeno, longo menos sujeito a degradação (mas não é mais resistente)
− Existe em maior nº visto que existem em todas as mitocondrias de todas as células,
ao invés de ser uma molécula única no núcleo de cada célula.
Î A resistência do DNA mitocondrial e do DNA nuclear é igual, pois tem a ver com a
quebra das ligações fosfodiéster entre os nucleótidos.
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FML – Biologia Molecular da Célula
Peroxissomas
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São pequenos organelos membranares
Contém enzimas envolvidas numa variedade de reacções
São morfologicamente semelhantes a lisossomas
Também são produzidos a partir de proteínas livres no citoplasma, tal como as
mitocondrias
No entanto, os peroxissomas não contém o seu próprio genoma, apenas se
replicam por divisão tal como as mitocondrias
1. Função dos peroxissomas
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Têm enzimas envolvidas em várias vias bioquímicas
Promovem as reacções oxidativas que produzem peróxido de hidrogénio
Possuem a catalase que permite a decomposição do peróxido de hidrogénio a
água ou a sua utilização para oxidar outro componente
As enzimas oxidativas degradam:
• Ácido úrico
• Aminoácidos
• Purinas
• Metanol
• Ácidos gordos
Estão envolvidos na biossintese:
• Lípidos (colesterol e dolicol)
• Aminoácido lisina
• Ácidos biliares (no fígado)
• Plasmogéneos (família dos fosfolipidos, constituinte membranar)
Os peroxissomas têm diferentes funções consoante o tecido.
2. Formação dos peroxissomas
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−
É semelhante à das mitocondrias e cloroplastos
As enzimas necessárias são sintetizadas em ribossomas livres no citoplasma e depois
são transportadas para os peroxissomas
Os fosfolipidos também são importados para os peroxissomas do RE
Os novos peroxissomas são formados por divisão dos mais velhos.
Translocação de proteínas para os peroxissomas:
1. As proteínas estão marcadas por uma sequência de 3 aminoácidos na sua
extremidade carboxilo (PTS1); PTS2 Æ marcação por 9 aminoácidos
2. PTS1 e PTS2 são reconhecidos por diferentes receptores citosólicos ou proteínas
transportadoras
3. As proteínas são transferidas para um complexo que medeia a sua
translocação através da membrana peroxissomal.
4. O sinal de marcação não é clivado
−
−
A maturação do peroxissoma envolve a importação de diferentes classes de
proteínas em diferentes alturas.
Primeiro chegam os receptores das membranas peroxissomais (através de uma
vesícula lipidica pré-peroxissomal)
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FML – Biologia Molecular da Célula
12. Superfície Celular
Endocitose
Processo de internalização de material pela célula, rodeando-o de membrana
plasmática, que se enruga para o interior da célula e forma um endossoma.
1. Facocitose
A célula endocita partículas grandes ou células intactas:
1. A partícula liga-se a receptores
2. Emissão de pseudopodes que rodeiam a partícula
3. Formação do fagossoma
4. Fusão com o lisossoma – fagolisossoma
5. Digestão no interior pelas hidrolases ácidas
6. Reciclagem dos receptores da membrana plasmática
Em seres multicelulares, a endocitose permite a defesa contra microorganismos e
elimina células velhas ou degradadas.
2. Endocitose mediada por receptores
Pinocitose: ingestão de partículas dissolvidas através de endocitose mediada por
receptores
Endocitose mediada por receptores: ingestão especifica de macromoléculas por um
mecanismo selectivo
1. As macromoléculas ligam-se a receptores específicos da superfície celular,
recobertos internamento por “clatrina coated-pits”
2. Formação de vesículas recobertas por clatrina com os receptores e os ligandos
3. Fusão das vesículas com outros endossomas
4. Selecção do transporte para a membrana plasmática ou lisossoma.
Ex.: Internalização do colesterol
1. Incorporação de colesterol em lipoproteinas (LDL)
2. Ligação das apoproteinas, que se encontram na superfície da lipoproteina, a
receptores específicos
3. Formação de vesículas revestidas por clatrina
4. Reciclagem dos receptores para a membrana plasmática
5. A LDL funde-se com o lisossoma libertando o colesterol
Hipercolesterolémia familiar:
• Elevada concentração de colesterol no sangue
• Não há internalização das LDL
• Mutações possíves:
9 Na zona do receptor que se liga às apoproteinas
9 Na zona do receptor que interage com a clatrina, impedindo a
internalização
−
−
Os fluidos celulares também podem ser endocitados sem selecção Æ endocitose
de fase fluida
A endocitose pode ser independente da clatrina
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FML – Biologia Molecular da Célula
3. Tráfico proteico na endocitose
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As vesículas com clatrina perdem o seu revestimento e fundem-se com
endossomas
Endossoma: vesícula com extensões tubulares localizadas na periferia da célula.
A fusão das vesículas endociticas com endossomas é mediada por:
• Rab GTP-binding proteins
• Os seus receptores
• Pares complementares das proteínas transmembranares
• Membranas marcadas
O endossoma serve como um compartimento selectivo do destino das moléculas,
que poderá ser:
• Reciclagem para a membrana plasmática
• Degradação nos lisossomas
Os endossomas mantêm um pH interno ácido (6 a 6,2) e como resultado vai haver
a dissociação dos ligando dos receptores
Os ligandos e as proteínas membranares destinadas à degradação nos lisossomas,
são transportadas dos endossomas mais recentes para outros mais velhos,
localizados perto do núcleo.
Este transporte é mediado pelo movimento de grandes vesículas endociticas
através de microtubulos
O endossoma velho é mais ácido (5,5 a 6) sendo por isso capaz de se fundir com
vesículas provenientes do aparelho de Golgi com hidrolases ácidas
Os endossomas velhos transformam-se em lisossomas com pH ainda mais baixo (5)
Com as hidrolases o material endocitico é degradado.
Os receptores tanto podem ser reciclados para a membrana plasmática como
podem ser degradados em conjunto com os seus ligandos nos lisossomas (ex.:
factores de crescimento)
Nos neurónios:
− Os neurotransmissores a mais são endocitados
− Ficam no endossoma até que são exocitados aquando o disparar do potencial de
acção
−
−
Transcitose:
Ocorre em células polarizadas (células epiteliais)
Permite que os receptores internalizados sejam transferidos para o domínio oposto
da membrana plasmática.
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