Stefani Karita Lima da Silva Martins

Pró-Reitoria Acadêmica
Escola de Saúde
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências
Genômicas e Biotecnologia
Estratégia molecular aplicada ao controle do bicudo-doalgodoeiro: superexpressão de toxina Cry e moléculas de
dsRNA
Autora: Stéfani Kárita Lima da Silva Martins
Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima Grossi de Sá
Co-orientador: Prof. Dr. Leonardo Lima Pepino Macedo
Brasília - DF
2014
II
STÉFANI KÁRITA LIMA DA SILVA MARTINS
ESTRATÉGIA MOLECULAR APLICADA AO CONTROLE DO BICUDO-DOALGODOEIRO: SUPEREXPRESSÃO DE TOXINA CRY E MOLÉCULAS DE
dsRNA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós- Graduação Stricto Sensu em
Ciências Genômicas e Biotecnologia da
Universidade Católica de Brasília, como
requisito parcial para obtenção do Título
de Mestre em Ciências Genômicas e
Biotecnologia.
Orientador (a): Profa. Dra. Maria Fátima
Grossi de Sá
Co-orientador: Prof. Dr. Leonardo Lima
Pepino Macedo
Brasília
2014
III
IV
Dedico este trabalho ao Deus que se
importa com os detalhes de tudo o
que faz.
V
AGRADECIMENTO
Agradeço ao meu Deus, por me escolher para conquistar os sonhos que Ele sonhou
para mim. Eu sou muito grata por tanto amor demonstrado em cada passo que eu
dei. Passos estes, guiados na dependência Dele. Obrigada Pai, por acreditar em
mim.
Agradeço ao meu esposo abençoado, pelo companheirismo durante esses 730 dias
de fortes emoções!!! A certeza de poder abraçá-lo ao fim de todos os dias, me
fortaleceu bastante, acredite! À minha família: Mãe e pai, amo vocês. Agradeço por
tudo mesmo. Irmã, obrigada por me ajudar a ensaiar cada apresentação e me fazer
repetir mil vezes a mesma frase, até que ficasse “bonito” (risos), obrigada!
Agradeço às minhas colegas, que se tornaram amigas, “psicólogas”, “professoras”,
irmãs e muito mais: Liana, Uriele, Rayssa, Rayanne, Rayanne Luzia, Kellyane,
Jéssica, Isis, Thuanne, Priscila, Vânia, Isabela, Janaína, Katiane, Fernanda,
Alessandra, Sineide, Maria Eugênia, Regina e Janny. Por todos os momentos de
estudo, conversa e pelo carinho durante esses anos.
Aos amigos que lutaram comigo até o fim: Laene, Ítalo, Amanda, Meiry, Victor Hugo,
Aloísa, Fran, Cestari, Samara, Gabrielle, Carolina, Shaiene, Camila, Daniela,
Wanda, Lorena. Obrigada!!!!
Agradeço aos meus professores e orientadores, Maria Fátima e Leonardo, por esta
oportunidade única. Obrigada pela paciência e pela confiança que depositaram em
mim.
Agradeço aos demais companheiros por toda ajuda que me deram.
VI
RESUMO
MARTINS, Stéfani Kárita Lima da Silva. Estratégia molecular aplicada ao controle
do bicudo-do-algodoeiro: superexpressão de toxinas Cry e silenciamento
gênico. 2014. 76 folhas. Mestrado em Ciências Genômicas e Biotecnologia –
Universidade Católica de Brasília, 2014.
O Algodão (Gossypium hirsutum) é uma das principais commodities agrícolas, sendo
o Brasil o quinto maior produtor mundial. Dentre os diversos insetos-praga que
atacam a cultura, o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) é o mais destrutivo
e, devido a seu hábito endofítico, a ação de agrotóxicos é dificultada. Além disso,
não há no mercado, nenhum evento transgênico resistente a este inseto-praga. O
presente estudo tem por objetivo validar, em plantas de algodão geneticamente
modificadas, o potencial uso de genes envolvidos na toxicidade e no
desenvolvimento do inseto, por meio de duas abordagens biotecnológicas
piramidizadas: a superexpressão de moléculas inseticidas e o silenciamento gênico.
A estratégia de piramidização de genes foi construída de modo que a expressão da
toxina Cry8Ka5 está controlada pelo promotor específico de botão floral- (GhPGFS1)
e a expressão do dsRNA para o silenciamento gênico, por meio do RNAi da Quitina
sintase II (CHS2) e da vitelogenina do bicudo, que está sob controle do promotor
constitutivo UCeA 1.7. Ademais, o gene de seleção ahas, que confere resistência ao
herbicida Imazapir, faz parte do cassete gênico utilizado na transformação das
plantas. Foram bombardeados 3.500 embriões, os quais originaram 19 eventos
positivos detectados por PCR, conferindo uma eficiência de transformação de
0,54%. Destes, onze eventos mostraram expressão da proteína Cry8Ka5
quantificada pela técnica de ELISA, cujos níveis variaram entre 8-90 g/g de tecido
fresco. Na geração T1, obtida por autofecundação, sete eventos mostraram a
presença dos três transgenes e, dentre estes, foram selecionados os eventos T1 do
parental número 7 (T0), que expressou 60 g de toxina Cry8Ka5/g de tecido floral. A
caracterização molecular avaliada por análises de qRT-PCR mostrou que
larvas/insetos que ingeriram tecidos dessas plantas tiveram uma redução da
expressão quantitativa de CHS2 em larvas de A. grandis alimentadas com o evento
7.5 (T1), que foi 6 vezes menor do que no controle. Estes resultados demonstraram
que a tecnologia de piramidização de genes pode ser usada para engenheirar
cultivares de algodão resistentes a este inseto-praga.
Palavras-chaves: Cry8Ka5. algodão GM. Anthonomus grandis. RNA interferente
VII
ABSTRACT
Applied molecular strategy in the control of the cotton boll weevil:
overexpression of Cry toxins and gene silencing.
Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the main agricultural commodities and Brazil
is the fifth major producer worldwide. Among several insect pest that attacks the
crops, the cotton boll weevil (Anthonomus grandis) is the most destructive and due
its endophytic habit, the pesticide action is hampered. Moreover, there is no
transgenic plant resistant to this particular insect pest current on the market. The
present study aimed to validated, in genetic modified cotton plant, the potential use of
genes involved in the insect’s toxicity and development, by using two
biotechnological approaches: the overexpression of inseticides and gene silencing.
The gene pyramiding strategy was built such as, a flower bud specific
promoter (GhPGFS1) controlled the Cry8Ka5 toxin expression, and the constitutive
promoter UCeA 1.7, controlled the dsRNA expression for the RNAi gene silencing of
the quitin sintase II (CHS2) and vitelogenin of the cotton boll weevil. Furthermore, the
ahas selection gene, which confers resistance to the herbicide Imazapir, is part of the
gene cassett used in the processing plant. 3.500 embryos were bombarbed, which
originated 19 positive events detected by PCR, granting a 0.54% of transformation
efficiency. Of those, eleven events showed Cry8Ka5 protein expression quantified by
ELISA, whose levels ranged from 8-90 g/g of fresh tissue. After obtaining the T1
generation by self-pollination, only seven events showed the presence of the tree
transgenes, and, among them, the T1 events from the parental number 7 (T0) were
selected, for expressing 60 g of Cry8Ka5 toxin per gram of bud tissue. The
molecular characterization by qRT-PCR analysis showed that the ingestion of these
plants reduced the CHS2 quantitative expression of A. grandis larvae feed by the 7.5
(T1) event, which was 6 times lower than the control. These results show that the
gene pyramiding technology could be used to engineer cotton cultivars resistant to
this insect pest.
Keywords: Cry8Ka5. GM cotton. Anthonomus grandis. RNA interference.
VIII
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura
3.
Estrutura
tridimensional
da
toxina
Cry1Aa..........................................................................................................................8
Figura 4. Esquema ilustrando o modelo de formação de poros para a ação das
toxinas Cry....................................................................................................................9
Figura 5. Esquema ilustrando o modelo de transdução de sinal para a ação das
toxinas Cry..................................................................................................................10
Figura 6. Esquema do mecanismo molecular da via do RNAi...................................13
Figura 7. Representação esquemática do cassete de expressão contendo o gene de
seleção
Ahas,
o
gene
para
super-expressão
do
dsRNA-CHS2vit
e
Cry8Ka5......................................................................................................................23
Figura 8. Placa para cultura de células contendo botões florais inoculados por larvas
de bicudo-do-algodoeiro.............................................................................................31
Figura 9. Organograma metodológico da transformação, caracterização e desafio de
plantas de algodão GM..............................................................................................34
Figura
10.
Eventos
T0
detectados
por
PCR
para
o
gene
dsRNA........................................................................................................................37
Figura 11. Eventos T0 detectados por PCR para o gene Cry8Ka5...........................37
Figura 12. Eventos T0 detectados por PCR para o gene AHAS................................37
Figura 13. Avaliação da expressão da entomotoxina Cry8Ka5 pela técnica de
ELISA.........................................................................................................................38
Figura 14. Análise morfológica de larvas de instar III de insetos de A. grandis após
serem alimentados com plantas de algodão GM contendo a construção pBSKdsRNAvitCHS2Cry8Ka5.............................................................................................40
Figura 15. Análise do silenciamento gênico por qPCR de CHS2 em larvas instar III
de A. grandis após ingestão de botão floral de plantas de algodão GM contendo a
construção
pBSKvitCHS2Cry8Ka5
por
um
período
de
sete
dias............................................................................................................................40 
IX
Figura 16. Organograma de resultados da caracterização molecular das plantas de
algodão GM................................................................................................................41
X
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Eventos de algodão GM aprovados no Brasil........................................... 18
Tabela 2. Lista de oligonucleotídeos utilizados na análise de plantas de algodão por
PCR.......................................................................................................................... 28
Tabela 3. Oligonucleotídeos utilizados nas reações de PCR em tempo real para
análise de CHS2........................................................................................................ 33
Tabela 4. Plantas T0 positivas resultantes da análise por PCR para os genes AHAS,
Cry8Ka5 e dsRNA.................................................................................................... 36
Tabela 5. Plantas de algodão geração T1 positivas resultantes da análise por PCR
para os genes AHAS, Cry8Ka5 e dsRNA................................................................ 39
XI
LISTA DE ABREVIATURAS
µg
Micrograma
µL
Microlitro
Algodão GM
Algodão Geneticamente Modificado
Bt
Bacillus thuringiensis
cDNA
DNA complementar
CHS2
Quitina Sintase II
DNA
Ácido desoxirribonucléico
dNTP
Deoxinucleotídeo
dsRNA
RNA dupla fita
GM
Geneticamente modificado
kb
Quilobase - 1000 pares de bases
miRNAs
dsRNA com 21 a 26 nucleotídeos com bases despareadas
mRNA
RNA mensageiro
ºC
Graus Celsius
pb
Pares de bases
PCR
Reação em cadeia da polimerase ("polymerase chain reaction")
PIB
Produto Interno Bruto
Primers
Oligonucleotídeos iniciadores
qRT-PCR
RT-PCR quantitativa (em tempo real)
RNA
Ácido ribonucléico
RNAi
RNA interferente
RT-PCR
Transcrição reversa seguida de PCR
siRNA
dsRNA pequeno com 21 a 26 nucleotídeos com 100% de
complementaridade
XII
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1
1.1 A biodiversidade de insetos ........................................................................... 1
1.1.1 Os insetos-praga e os danos agrícolas ........................................................ 1
1.2 O bicudo-do-algodoeiro e a cotonicultura....................................................... 2
1.3 Estratégias moleculares para a obtenção das plantas geneticamente
modificadas para o controle de insetos-praga ...................................................... 4
1.3.1 Superexpressão de δ-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) ................ 6
1.3.2 O uso do RNA interferente (RNAi) em plantas para o controle de insetospraga................ ................................................................................................... 10
1.3.3 Silenciamento gênico por RNAi da Quitina Sintase II e da Vitelogenina do
bicudo-do algodoeiro ...........................................................................................13
1.3.4
Expressão
tecido-específica
com
a
utilização
de
promotores...........................................................................................................16
1.4 Métodos de transformação genética de plantas mediada por agrobacterium
tumefaciens e por biobalística ............................................................................. 16
1.5 Algodão GM .................................................................................................. 17
1.6 JUSTIFICATIVA ........................................................................................... 20
2. OBJETIVO .......................................................................................................... 22
2.1 Objetivo geral ................................................................................................ 22
2.2 Objetivos específicos .................................................................................... 22
3. METODOLOGIA ................................................................................................. 23
3.1. Construção gênica ....................................................................................... 23
3.2 Transformação genética via biobalística ....................................................... 23
3.3.2 Aplicação da técnica de bombardeio de DNA ............................................ 24
3.3.3 Cultivo de plantas selecionadas por herbicida ........................................... 26
XIII
3.4. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE PLANTAS POTENCIALMENTE
TRANSFORMADAS ........................................................................................... 26
3.4.1 Extração de DNA ....................................................................................... 26
3.4.2 Verificação da amplificabilidade do DNA extraído de folhas de plantas de
algodão ................................................................................................................26
3.4.3 Extração e determinação de proteínas totais ............................................. 28
3.4.4 Quantificação da expressão da entomotoxina Cry8Ka5 por meio de ensaio
imunoenzimático do tipo ELISA .......................................................................... 28
3.5 DESAFIO DAS PLANTAS T1 COM O INSETO-PRAGA ............................. 29
3.5.1 Extração de RNA total de larvas de A. grandis alimentadas por botão floral
transgênico. ........................................................................................................ 30
3.5.2 Síntese de cDNA........................................................................................ 31
3.5.3 Confirmação da síntese do DNA complementar (cDNA) ........................... 32
3.5.4 Análise do silenciamento do gene alvo do ds RNA por qPCR ................... 32
4.
RESULTADOS ................................................................................................... 35
4.1 Bombardeamento de embriões ..................................................................... 35
4.3 Quantificação da expressão de entomotoxina Cry8Ka5 por meio do ensaio
imunoenzimático do tipo elisa ............................................................................. 38
4.4 Identificação de genes por pcr de geração T1 .............................................. 38
4.5 Desafio das plantas gm com o inseto-alvo.................................................... 39
5.
DISCUSSÃO ...................................................................................................... 43
6. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS ..................................................................... 48
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 49
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 A BIODIVERSIDADE DE INSETOS
Os
insetos
compõem
um
grupo
de
animais
muito
diversificado
(TRIPLEHORN; JOHNSON, 2005), visto ser três vezes maior que os demais grupos
de
animais
(RUPERT;
BARNES,
1996).
Estima-se
que
sejam
descritos
aproximadamente um milhão de espécies de insetos, classificados em 32 ordens e
cerca de 762 famílias (DELVARE; ABERLENC, 1989; DALY et al., 1998; GALLO et
al., 2002). Trata-se do grupo mais bem sucedido evolutivamente, devido às
características adaptativas, incluindo, presença de exoesqueleto quitinoso, alta taxa
reprodutiva em curto ciclo de vida, desenvolvimento indireto (metamorfose), dentre
outros (GULLAN; CRANSTON, 1994; RUPERT; BARNES, 1996; ALMEIDA et al.,
2002; GILLOTT, 2005).
Podendo interagir de modo benéfico ou maléfico com o homem e outros
organismos, os insetos executam papéis importantes e intransferíveis. Dentre os
insetos considerados benéficos, encontram-se os que são capazes de produzir mel,
seda e laca, os capazes de polinizar plantas, os que atuam como agentes de
controle biológico, além dos que auxiliam na decomposição de matéria orgânica.
Contrariamente, além de atuarem como vetores de patógenos para diferentes
organismos, existem também insetos que se tornaram os grandes inimigos dos
agricultores pelas incontáveis perdas, ano após ano, em diversos cultivares,
resultando em prejuízos significativos para a agricultura (GILLOTT, 2005).
1.1.1 Os insetos-praga e os danos agrícolas
Segundo Gordh & Headrick (2001), pragas são organismos que reduzem a
qualidade ou a produção de culturas ou outros produtos. De modo abrangente,
pragas são insetos e/ou organismos capazes de causar danos tanto ao homem
quanto às suas criações, culturas ou posses (HILL, 1997). Na visão agrícola, a praga
sempre estará relacionada aos efeitos econômicos, causados pela permanência do
inseto na lavoura (NAKANO, 1981). O que realmente tornará um inseto prejudicial
2
para a agricultura é o nível dos danos e perdas que a população de determinado
inseto será capaz de gerar, sem que haja controle, baseando-se na relação entre
praga e dano (HILL, 1997). Os aspectos problemáticos, resultantes de pragas
agrícolas, têm sua principal razão devido à prática de monoculturas, visto que, se
reduz intensamente a variedade faunística e simplifica-se a flora do local
(LUTZENBERGER, 1978).
Diversas são as plantações que sofrem com o descontrole de insetos que, por
sua vez, já se tornaram pragas. A ação descontrolada dos insetos altera os
processos fisiológicos da planta e reflete no custo de produção, causando danos
diretos ao atacar o produto a ser comercializado; ou indiretos, quando atacam
estruturas vegetais que não poderão ser comercializadas (BENTO, 1999; GALLO et
al., 2002; GILLOTT, 2005).
1.2 O BICUDO-DO-ALGODOEIRO E A COTONICULTURA
No Brasil, o cultivo do algodão é considerado uma das plantações mais
susceptíveis ao desenvolvimento e ataque de insetos-praga, com mais de 20
espécies relatadas e conhecidas (GALLO et al., 2002). A planta de algodão possui
inúmeras glândulas denominadas nectários, que, por sua vez, têm a capacidade de
produzir uma secreção líquido-resinosa açucarada, tornando o algodoeiro bastante
atrativo aos insetos (MONNERAT et al., 2000). Os insetos-praga que atacam o
algodoeiro podem ser divididos em dois grupos: os que ocorrem no estabelecimento
da cultura (broca-da-raiz, bronca-do-ponteiro, pulgão) e as que ocorrem no
florescimento e na frutificação (curuquerê, mosca branca, bicudo-do-algodoeiro)
(MAPA, 2007).
O bicudo-do-algodoeiro, da subfamília Anthonominae, Anthonomus grandis
(Coleoptera: Curculionidae), é considerada uma das ameaças agrícolas mais
prejudiciais para a cotonicultura do Brasil.
Esta praga foi encontrada, em meio às plantações de algodão, inicialmente no
México e nos Estados Unidos, em meados do século XIX e, quase um século
depois, no Brasil (BRAGA SOBRINHO et al., 1983). Desde a sua introdução no
Brasil, este tem ocasionado enormes perdas econômicas, além de refletir
3
diretamente na desvalorização de propriedades, no desemprego e na emigração de
produtores para regiões onde se concentram as grandes cidades (RAMALHO, et al.
2000).
O bicudo-do-algodoeiro, chega a medir aproximadamente 7 mm de
comprimento na fase adulta. Uma fêmea adulta com uma vida média de 20-40 dias é
capaz de ovipositar cerca de 300 ovos, que poderá produzir outros 10.000 insetos
ao final de uma safra (BARBOSA et al., 1983). Seu hábito endofítico resulta em
perdas exorbitantes da cultura de algodão, visto que estes insetos se desenvolvem
no interior de botões florais e maçãs de plantas de algodão, destruindo-o totalmente
(HAYNES; SMITH, 1992). Uma vez que a oviposição das fêmeas ocorre no interior
destas estruturas vegetais, a progênie encontra-se relativamente protegida, até a
sua emergência em fase adulta, devido à sua permanência no interior do botão floral
(BRAGA SOBRINHO; LUKEFAHR, 1983).
A detecção de densidades populacionais deste inseto-praga acima dos níveis
aceitáveis, quando não é seguido da medida de controle, pode inviabilizar o cultivo
do algodoeiro (BASTOS et al., 2005), devido à sua alta capacidade de proliferação.
Além disso, a migração e a dispersão deste inseto é bastante facilitada pelo vento, o
que tem levado a atingir o status de praga chave da cotonicultura (STADLER;
BUTELER, 2007).
Apesar de não ser totalmente eficaz, o controle do bicudo-do-algodoeiro é
largamente voltado para a aplicação de produtos químicos, os quais resultam em
danos significativos à entomofauna benéfica, além dos riscos toxicológicos ao
homem e, elevação do custo de produção (DEGRANDE et al., 2003; RAMALHO;
DIAS, 2003). Adicionalmente, também tem sido usada pelos agricultores, a catação
manual de botões florais e maçãs caídos no solo, a eliminação de plantas nas
margens de estradas, a limpeza severa de máquinas e veículos de transporte, além
do intenso monitoramento e detecção de populações do bicudo (AMPASUL, 2014).
Dentre os maiores consumidores mundiais de agroquímicos, o Brasil ocupa o
terceiro lugar, chegando a consumir cerca de 5.500 toneladas/ano de fungicidas e
inseticidas, superando os Estados Unidos e o Japão. A cultura de algodão é
responsável pela utilização de aproximadamente 27% do total de inseticidas
4
utilizados no Brasil e, ainda mais alarmante é que grande parte desses produtos são
usados para o controle do bicudo-do-algodoeiro (JAMES, 2013).
1.3 ESTRATÉGIAS MOLECULARES PARA A OBTENÇÃO DAS PLANTAS
GENETICAMENTE MODIFICADAS PARA O CONTROLE DE INSETOSPRAGA
Controlar a população de A. grandis nas plantações de algodão tem sido
considerado prioritário para a cotonicultura do Brasil. Devido ao hábito endofítico do
inseto, mais especificamente em botão floral, as atuais formas de controle são
ineficientes, demandando a utilização de meios alternativos (ALMEIDA; SILVA,
1999; DEGRANDE et. al, 2002). O uso de ferramentas biotecnológicas, visando o
desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas (GM) resistentes a insetospraga tem se mostrado uma alternativa eficaz para evitar o intenso uso de
agroquímicos.
Há quase duas décadas (de 1996 a 2013), a economia de diversos países
tem desfrutado dos benefícios decorrentes da adoção das tecnologias GM em
níveis, sem precedentes. No último ano, 175,2 milhões de hectares de variedades
transgênicas foram cultivadas mundialmente, tornando a tecnologia agrícola mais
adotada na história moderna. O Brasil tornou-se um forte líder global na produção de
transgênicos, ocupando uma área de 40,3 milhões de hectares (ha), ou seja, 23% da
área mundial, perdendo apenas para os Estados Unidos. O algodão é a terceira
principal cultura transgênica produzida no mundo, sua adoção comercial por quase
todos os cultivares é resultado dos diversos benefícios gerados após a utilização
desta tecnologia, o que resultou num aumento considerável da produção, redução
da exposição dos cultivares a inseticidas e, por conseqüência, diminuição dos custos
de produção (JAMES, 2013).
Atualmente há 47 eventos algodão GM disponíveis comercialmente, porém no
Brasil apenas 12 estão regulamentados, como pode ser observado na Tabela 1
(ISAAA, 2012; CTNBIO, 2014).
5
Tabela 1. Eventos de algodão GM aprovados no Brasil.
Evento
Gene inserido
Característica
Companhia
Bollgard
Cry1ac
Resistência a insetos
Monsanto
Resistência a insetos
Monsanto
Bollgard II
Cry1Ac +
Cry2Ab2
Resistência a insetos/Tolerância a
WideStrike
Cry1ac + Cry1f
GlyTol™
2mepsps
Tolerância a herbicida
Bayer CropScience
2mepsps + Bar
Tolerância a herbicidas
Bayer CropScience
GlyTol™ Liberty
Link™
2mepsps + Bar
Glytol™ x Twinlink™
+ Cry1Ab
+Cry2ae
Fibermax™ Liberty
Link™
RoundUp Ready
(RR)
Roundup Ready™
Bollgard II™ Cotton
Roundup Ready™
Flex™ Cotton
herbicida
Bayer CropScience
Tolerância a herbicidas
Bayer CropScience
CP4 epsps
Tolerância a herbicida
Monsanto
CP4 epsps+
Cry1Ac +
Cry2ab2
CP4 epsps
CP4 epsps+
Flex™
Cry1Ac +
TwinLink™ Cotton
Resistência a insetos/Tolerância ao
Dow AgroSciences
Bar
Roundup Ready™
Bollgard II™ Cotton
herbicida
Cry2ab2
Resistência a insetos/Tolerância a
herbicida
Tolerância a herbicida
Resistência a insetos/Tolerância a
herbicida
Bar + Cry1Ab
Resistência a insetos/Tolerância a
+Cry2ae
herbicida
Monsanto
Monsanto
Monsanto
Bayer CropScience
(CTNBIO, 2014).
6
Apesar das inúmeras variedades transgênicas de algodão disponíveis no
mercado, atualmente não existe nenhum evento disponível comercialmente que
apresente resistência ao A. grandis. Dessa forma, há forte demanda para o
desenvolvimento de estratégias específicas para o controle deste inseto-praga. A
busca por moléculas que resultem em variedades transgênicas de algodão
resistentes ao bicudo-do-algodoeiro tem sido o alvo de diversos investimentos.
Dentre as diferentes estratégias, visando à obtenção de plantas GM
resistentes a insetos-praga, a equipe do Laboratório de Interação Planta Praga da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (LIMPP/Cenargen) tem focado tanto
em estratégias baseadas na superexpressão de proteínas entomotóxicas, como na
interrupção da expressão de proteínas essenciais do inseto alvo, por meio do
silenciamento genético, utilizando a tecnologia do RNA interferente (RNAi).
A manipulação de promotores específicos que promovam a expressão de
proteínas heterólogas, em níveis adequados para a letalidade do inseto-praga,
também tem sido utilizada no desenvolvimento de plantas transgênicas. Essa
especificidade restringe a expressão da proteína somente (ou em maior quantidade)
no tecido de interesse (ZHENG; MURAI, 1997; GREEN et al., 2002; NEUTEBOOM
et al., 2002).
1.3.1 Superexpressão de δ-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (Bt)
O Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria anaeróbia facultativa, Grampositiva, esporulante, que habita naturalmente o solo. Esse microrganismo possui
atividade entomopatogênica devido à presença da inclusão cristalina produzida
durante a esporulação. Esse cristal é composto por proteínas denominadas:
entomotoxinas Cry. Tais proteínas possuem ampla atividade inseticida por serem
extremamente tóxicas a insetos de diversas ordens. Dentre as estratégias de
obtenção de plantas GM resistentes a insetos, destaca-se a inserção dessas
proteínas Cry (SCHNEPF et al., 1998; MONNERAT; BRAVO, 2000; BRAVO et al.,
2007).
As proteínas Cry pertencem a um grupo de toxinas formadoras de poros, visto
que seus efeitos tóxicos são devido à formação de poros iônicos na membrana das
7
células intestinais do inseto-alvo. Existem mais de 120 diferentes genes que
codificam para proteínas Cry, distribuídas em 22 classes. Essas toxinas vêm sendo
utilizadas como uma ferramenta biotecnológica para o controle de pragas, por meio
de sua expressão em plantas GM (MONNERAT; BRAVO, 2000; BRAVO et al., 2005;
HECKMANN et al., 2006). Conforme relacionado na Tabela 1, todos os eventos de
algodão GM resistentes a insetos, cultivados no Brasil, expressam genes derivados
da bactéria Bt.
As estruturas tridimensionais de algumas entomotoxinas Cry (Cry1Aa,
Cry1Ac, Cry2Aa, Cry3A, Cry3Bb1, Cry4Aa, Cry4Ba, Cry8Ea1) já foram determinadas
(BOONSERM et al., 2005; BOONSERM et al., 2006; DERBYSHIRE et al., 2001;
GALITSKY et al., 2001; GROCHULSKI et al., 2005; GUO et al., 2009; LI et al., 1991;
MORSE et al., 2001) e, são formadas por três domínios (Figura 1). O domínio I
consiste em um feixe de sete hélices antiparalelas, com hélice central hidrofóbica
(LI et al., 1991); o domínio II é formado por três folhas
antiparalelas e duas
hélices curtas, conferindo especificidade de ligação aos receptores (DEAN et al.,
1996); e o domínio III consiste de duas folhas antiparalelas, altamente
envelopadas, contendo a região C-terminal na maioria das proteínas, e está
fortemente envolvido na estabilidade estrutural da molécula inteira, além da
especificidade ou formação de poro juntamente com o domínio I (RUKMINI et al.,
2000).
Figura 1. Estrutura tridimensional da toxina Cry1Aa, mostrando seus domínios. Adaptado de Piggot e
Ellar, 2007.
Domínio I
Domínio III
Domínio II
8
Uma vez que essas proteínas são ingeridas pelo inseto susceptível, estas são
solubilizadas e clivadas por proteases intestinais capazes de localizar os sítios de
clivagem da toxina, tornando-se ativas. Receptores específicos presentes no epitélio
intestinal são reconhecidos pelas proteínas Cry, permitindo passagem de água e
íons livremente nas células, desencadeando na turgidez, lise e morte do inseto-alvo
(KNOWLES; ELLAR, 1987; GILL, 1995; GILL et al., 1992).
São descritos pelo menos 3 modelos para a ação das proteínas Cry. O
modelo de formação de poros (Figura 2) é baseado nos experimentos de interação
entre Cry1Ab e as vesículas da membrana apical do epitélio intestinal do inseto
lepdóptero Manduca sexta (BRAVO et al., 2004; GÓMEZ et al., 2002; ZHUANG et
al., 2002).Este modelo sugere que, após a interação dos monômeros da toxina ao
receptor de membrana, a mesma sofre uma mudança conformacional que facilita a
clivagem da hélice por proteases ligadas à membrana. Esta forma da toxina se
oligomeriza a fim de formar um pré-poro tetramérico que se liga a um receptor
aminopeptidase N, dando início ao processo de formação do poro e morte do inseto.
Figura 2. Esquema ilustrando o modelo de formação de poros para a ação das toxinas Cry. (1)
Solubilização do cristal; (2) ativação proteolítica da protoxina; (3) ligação do monômero ao receptor
Bt-R1 e clivagem da α-hélice 1; (4) formação da estrutura oligomérica pré-poro; (5) ligação do
oligômero a um receptor aminopeptidase e mobilização aos microdomínios; (6) formação do poro
nos microdomínios. Adaptado de Bravo et al. 2004.
9
O modelo de transdução de sinal (Figura 3) baseia-se na ligação entre a Cry e
o receptor BT-R, iniciando uma cascata de sinalizações dependente de Mg 2+,
promovendo a morte celular (ZHANG et al., 2005).
Figura 3. Esquema ilustrando o modelo de transdução de sinal para a ação das toxinas Cry. O
modelo prediz que a citoxicidade associada com as toxinas Cry depende estritamente de respostas
celulares dependentes de Mg
2+
que são iniciadas após a ligação da toxina ao receptor BT-R,
levando à morte celular. Adaptado de Zhang et al. 2005.
Devido a essa atividade entomotóxica, os genes Cry vêm sendo cada vez
mais estudados para o desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes a
insetos-praga.
comercialização
Versões
e
das
foram
proteínas
inseridas
em
Cry
já
se
diversos
tornaram
organismos
passíveis
de
transgênicos,
destacando-se: Cry1Ac (Dekalb DBT418 – Bt XtraTM), Cry9C (Avenis ACS-ZM4-3,
StarLink
TM
) e Cry1Ab (Syngenta Bt176, Bt11; Monsanto Mon80100, Mon802,
Mon809, Mon810) para o milho GM. Para o algodão GM, destacam-se: Cry1Ac
(Monsanto, Mon531-Bollgard®) e Cry1Ac associado ao Cry2Ab (BollgardII®, DOW
3006, Calgene 31807).
A fim de obter plantas de algodão resistentes ao A. grandis, diversos estudos
têm auxiliado na descoberta de genes que codifiquem para proteínas nocivas ao
10
inseto, provenientes de B. thuringiensis. Dessa maneira, em trabalhos anteriores, o
grupo de pesquisa do LIMPP/ Cenargen, isolou e caracterizou três diferentes genes
Cry, cujas toxinas codificadas são eficientes no controle de A. grandis: Cry1Ba,
Cry1Ia12 (MAGALHÃES, 2006) e Cry8K (OLIVEIRA, 2008). Em 2008, Oliveira e
colaboradores construíram uma biblioteca combinatória de mutantes cujos variantes
foram isolados do gene Cry8, proveniente da estirpe S811 de Bt, visando selecionar
as variantes com atividade melhorada para pragas da cotonicultura, principalmente,
o bicudo-do-algodoeiro. A partir disso, foi gerada uma biblioteca recombinada de
variantes dessas toxinas, permitindo a seleção de toxinas mais eficazes para o
controle de A. grandis.
1.3.2 O uso do RNA interferente (RNAi) em plantas para o controle de
insetos-praga
A estratégia de silenciamento gênico, via RNAi, é uma das alternativas que vem
sendo utilizada para o controle de pragas, baseando-se na interrupção da síntese
protéica de genes vitais para o inseto, por meio da inserção de RNA dupla fita em
organismos alvo, através de microinjeção ou ingestão (FIRE et al., 1998). Um dos
primeiros estudos realizados para silenciamento gênico foi com o nematóide e
organismo modelo Caenorhabditis elegans, onde se observou a capacidade de
moléculas de dsRNA em interromper a expressão de determinado gene com
sequência similar ao dsRNA (PRICE e GATEHOUSE, 2008; LILLEY et al., 2012).
Este fenômeno de silenciamento de genes tem sido considerado como uma
estratégia potencial para o controle de insetos-praga, pois a seleção do gene alvo e
a síntese de dsRNA resultam o componente crucial da aplicação dessa tecnologia
(KATOCH; THAKUR, 2012).
Desde a identificação do RNA dupla fita (dsRNA) como a molécula gatilho do
processo de silenciamento gênico, uma década de trabalho resultou na elucidação
do mecanismo molecular da via "clássica" do RNAi. O processo básico da via
"clássica" do RNAi pode ser dividido em três etapas principais (TOMARI e ZAMORE,
2005). Na primeira etapa, um dsRNA endógeno ou exógeno, que é expresso ou
introduzido na célula é processado em pequenas moléculas de dsRNA com 21 a 26
11
nucleotídeos, denominados siRNA (do inglês - short interfering RNA), por uma
ribonuclease do tipo RNAse III, a Dicer. Dependendo do organismo pode existir uma
ou mais DICER’s, cada uma responsável pela produção por um diferente tipo de
dsRNA (MEISTER e TUSCHL, 2004). Por exemplo, em D. melanogaster, Dicer-1
está envolvida, principalmente, na produção de miRNA; enquanto, Dicer-2 é
responsável pelo processamento de dsRNAs longos em siRNA (LEE et al., 2004).
Durante a segunda etapa do mecanismo de RNAi, esses duplexs são transportados
para o complexo efetor RISC (do inglês - RNA-induced silencing complex), onde
ocorre a separação das fitas e uma delas, denominada de fita guia, é
preferencialmente acoplada no complexo proteico RISC. Na última etapa, a fita guia
é utilizada para reconhecer os RNAm alvos pelo pareamento de bases WatsonCrick. O silenciamento do gene é um resultado da degradação do RNAm alvo pela
enzima Argonaute (Ago), uma RNaseH que faz parte do complexo RISC (GAYNOR
et al., 2010). Se o duplex siRNA/mRNA contém bases despareadas no sítio de
clivagem, muitas vezes o caso de miRNAs, o RNAm não é clivado. Neste caso, o
silenciamento do gene é um resultado da inibição da tradução (HAMMOND, 2005;
GHILDIYAL e ZAMORE, 2009).
Uma visão geral do mecanismo de ação do RNAi é mostrada na figura 4.
12
Figura 4. Esquema do mecanismo molecular da via do RNAi. A via do RNAi é iniciada pela presença
de moléculas de dsRNA, as quais podem ser endógenas ou introduzidas experimentalmente.
Moléculas de dsRNAs podem ser produzidas pela transcrição de RNA. Todos esses dsRNAs são
digeridos pela enzima DICER, em siRNA ou miRNA. Uma das fitas desses pequenos dsRNAs são
incorporados ao complexo RISC e induzem a destruição do mRNA alvo ou reprimem sua tradução.
Reimpresso de Mello e Conte, 2004. Com permissão de Nature Publishing Group.
Há mais de uma década, diversos trabalhos têm demonstrado a possibilidade
das plantas produzirem o dsRNA. Dois estudos mostraram a eficiência de plantas
transgênicas expressarem dsRNA, visando o controle de insetos-praga, por meio da
suplementação de dsRNA na dieta dos insetos. As plantas GM, expressando o
dsRNA para genes essenciais do trato digestivo do inseto alvo, causou a morte dos
mesmos em 24 h após contato com o dsRNA. Estas plantas apresentaram
resistência aumentada contra duas pragas importantes para a agricultura, a
Helicoverpa armigera e a Diabrotica vergifera vergifera. Após a ingestão de dsRNA,
formado por sequência homóloga ao gene alvo do inseto, houve uma intervenção na
13
expressão do transcrito, resultando no silenciamento gênico pós-transcricional e, por
fim, na morte do inseto-alvo pela interrupção de genes específicos e vitais para sua
proliferação (BAUM, et al., 2007; MAO, et al., 2007).
A utilização da tecnologia do RNAi tem permitido a compreensão sobre a
funcionalidade de genes, bem como sua função regulatória em rotas metabólicas
que controlam importantes características, colaborando para a produção de plantas
transgênicas que produzam transcritos de interesse (KATOCH; THAKUR, 2013).
Diversos são os trabalhos que descrevem o processo de silenciamento gênico como
participante da regulação da expressão gênica em alguns eucariotos, inclusive
plantas (LILLEY, et al., 2007). Nestes, a interferência por RNA acontece por meio da
inserção de vetores capazes de transcreverem o dsRNA (HORIGUCHI, 2004;
BELLES, 2010; NOH et al., 2012).
Além do entendimento sobre a regulação da expressão gênica, o dinamismo
dessa tecnologia tem surgido como uma poderosa ferramenta para aumento da
produção agrícola, como por exemplo, o incremento dos níveis nutricionais em
plantas de interesse comercial (KATOCH; THAKUR, 2013). Ademais, a metodologia
da interferência por RNA tem sido bastante visada para o controle de insetos seja
esta por meio de ingestão de dsRNA ou por microinjeção (ZHOU et al., 2008;
WALSHE et al., 2009; CHEN et al., 2010; LI et al., 2011). Nos últimos anos, o
silenciamento gênico tem provado seu potencial em inúmeras espécies de
importância para o agronegócio, como resultado de um futuro promissor para a
agricultura (ZHA et al., 2001; BAUM et al., 2007; MAO et al., 2007). Mao e
colaboradores (2011) demonstraram que, plantas de algodão transgênicas
expressando o dsRNA do gene do citocromo P450 (CYP6AE14) de H. armigera,
resultaram em maior resistência a esta praga, que causa grandes prejuízos não
apenas para o algodoeiro, mas também para diversas espécies de importância
econômica.
1.3.3 Silenciamento gênico por RNAi da Quitina Sintase II e da Vitelogenina
do bicudo-do-algodoeiro
Os mais diversos aspectos ecológicos e fisiológicos sobre o bicudo-do-algodoeiro
estão disponíveis em literatura (BRAGA SOBRINHO et al., 1983; HEDIN et al.,
1995). Com base na anotação funcional do transcritoma do bicudo-do-algodoeiro foi
14
possível identificar rotas metabólicas imprescindíveis ao desenvolvimento deste
inseto-praga (FIRMINO et al., 2013). Estudos anteriores relataram a possibilidade de
gerar danos no desenvolvimento de insetos, a partir de alterações no metabolismo
da quitina, tornando-a excelente candidata para a estratégia de controle específico
de insetos-praga (ALVES et al., 2010; AMPASALA et al., 2011; NOH et al., 2012).
Outro evidente candidato, conforme dados experimentais, é a vitelogenina que está
associada ao ciclo reprodutivo do inseto-alvo (COELHO, 2013).
A quitina é o segundo biopolímero mais abundante na natureza, sendo
encontrado na parede celular de fungos, no exoesqueleto de vários crustáceos,
dentre outros, principalmente no exoesqueleto de diversas espécies de artrópodes
(MUZZARELLI, 1980; MERZENDORFER; ZIMOCH, 2003; MERZENDORFER,
2006). Esse polissacarídeo é formado por uma cadeia linear composta por unidades
N-acetil-2-dioxi-D-glicopiranose, interligadas por ligações glicosídicas (1-4), sendo
capaz de estruturar diversas porções anatômicas dos insetos. Encontra-se presente
na constituição da cutícula, traquéia, na membrana peritrófica, a qual reveste o
epitélio intestinal, nas glândulas salivares e nas estruturas bucais, tanto em larvas
quanto em adultos de inúmeros insetos, incluindo A. grandis (MUTHUKRISHNAN et
al., 2012; MACEDO, 2012).
Conforme análises realizadas por difração de raios- X, a quitina pode apresentar
de três formas cristalinas diferentes denominadas e O que caracteriza as
diferenças de seu polimorfismo é o grau de hidratação resultando na diferenciação
de suas propriedades físicas. É previsto que haja diferença funcional decorrente
dessa diferenciação. A forma é a forma mais dominante e estável, podendo ser
encontrada em estruturas que exigem maior resistência, como as cutículas dos
artrópodes. No entanto, as formas e encontram-se onde há maior necessidade
de flexibilidade, devido à sua estrutura mais relaxada, e essas são encontradas na
membrana peritrófica de insetos (RUDALL; KENCHINGTON, 1973; PETERS, 1992).
A outra sequência alvo do presente trabalho é o precursor do vitelo denominada
vitelogenina. Esta é armazenada no interior dos ovos, sendo a principal fonte
proteica para o embrião durante o seu desenvolvimento. Os insetos são capazes de
produzir a vitelogenina nos corpos gordurosos, secretando-a para a hemolinfa e
sendo
estocada
na
formação
dos
ovos
(RAIKHEL;
DHADIALLA,
1992;
15
SNIGIREVSKAYA et al., 1997). Sendo uma das principais reservas de aminoácidos
de vertebrados e invertebrados no período inicial de sua formação (TREWITT et al.,
1992), a interrupção da produção de vitelogenina no interior dos ovos de A. grandis
é uma estratégia promissora para o controle desse inseto-alvo (COELHO, 2013).
1.3.4 Expressão tecido-específica com a utilização de promotores
A manipulação de promotores é uma ferramenta importante para a
biotecnologia a fim de garantir que a expressão do gene de interesse seja efetiva.
Os promotores mais utilizados na produção de plantas GM são o promotor 35S do
Vírus do Mosaico da Couve Flor (CaMv 35S), nopalina sintetase (NOS) e octopina
sintetase (OCS), ambos promotores de genes de Agrobacterium tumefaciens, além
do promotor de gene presente no milho que codifica para ubiquitina (Ubi-1). Apesar
da utilização desses promotores, a expressão de transgenes sob o domínio dos
mesmos, é indefinida, podendo ser baixa em certos casos, não havendo garantia de
expressão no tecido de interesse. A utilização de promotores de genes constitutivos,
como os que codificam a ubiquitina, por exemplo, não é desejável em todos os
casos, já que ativam a expressão gênica do transgene em todos os tecidos da planta
(ZHENG; MURAI, 1997; GREEN et al., 2002; NEUTEBOOM et al., 2002). Portanto, a
expressão tecido-específica de transgenes é de grande importância para insetos de
hábitos endofíticos, como A. grandis, por exemplo, visto que é possível direcionar a
expressão dos transgenes para os botões florais, local de oviposição e
desenvolvimento do inseto-praga (BRAGA SOBRINHO; LUKEFAHR, 1983).
Em busca de novas sequências regulatórias, foi isolado e, posteriormente
caracterizado pelo grupo do LIMPP/Cenargen, o promotor constitutivo proveniente
do gene de conjugação à ubiquitina (UceA 1.7) em algodoeiro (GROSSI-DE-SA et
al., 2008). Plantas modelo de A. thaliana transformadas com este promotor
mostraram expressão desse gene em diversos tecidos, principalmente em raiz e
botão floral, quando comparado ao promotor 35S (GROSSI-DE-SA et al., 2008;
VIANA, 2011). Além deste, outro promotor, denominado GhPGFS1, foi isolado de G.
hirsutum e, por análises de qRT-PCR foi caracterizado como um promotor altamente
expresso e específico de botão floral (ARTICO et al., 2010; ALVES et al., 2014).
16
A partir desse conjunto de informações será possível viabilizar o controle de
insetos-praga, principalmente visando a obtenção de eventos transgênicos
expressando altos níveis de RNAi e/ou entomotoxinas Cry direcionados ao botão
floral.
1.4 MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE PLANTAS MEDIADA
POR AGROBACTERIUM TUMEFACIENS E POR BIOBALÍSTICA
A. tumefaciens é uma bactéria fitopatogênica, encontrada no solo,
pertencente à família Rhizobiaceae (LIPP-NISSINEN, 1993). Essa bactéria causa a
doença conhecida como galha da coroa e a síndrome da raiz em cabeleira (VAN
SLUYS, 1999) e tem sido utilizada para a introdução de genes em células vegetais,
mediada por suas cepas manipuladas (RIVA et al., 1998). A transformação genética
via A. tumefaciens permite a inserção de transgenes em plantas de interesse
(ALIMOHAMMADI; BAGHERIEH-NAJJAR, 2009). Entretanto, a transformação via A.
tumefaciens se limita a espécies que não apresentam características vegetais
recalcitrantes. De outro modo, a metodologia de aceleração de partículas até o
meristema alvo tem sido utilizada para transformar plantas que não apresentam
esse potencial (CHENG et al., 2009).
Na
transformação
via
bombardeamento
de
partículas
(biobalística),
micropartículas de metal são revestidas com DNA de interesse e, em seguida
projetadas ao meristema (ZIOLKOWSKI, 2007). Na fase de separação os
aglomerados dessas partículas são acelerados até o tecido alvo, reduzindo-se a
partículas ainda menores.
Em seguida, essas partículas sofrem desaceleração,
visto que adentraram ao tecido a ser transformado movendo-se mais lentamente até
atingirem as células-alvo (ZHANG et al., 2007). A sequência a ser inserida,
normalmente, apresenta o gene de seleção que confere resistência ao Imazapyr
(ahas). Este gene, isolado a partir de A. thaliana, contém uma mutação que confere
resistência especifica a este herbicida pertencente à classe das imidazolinas. Este
marcador de resistência é o primeiro método de seleção no cultivo in vitro, no qual a
molécula do herbicida é capaz de se translocar sistemicamente através dos eixos
embrionários radiculares, de modo não-letal, porém seletiva, se concentrando na
17
região do meristema. O mecanismo de ação do Imazapyr se dá através da inibição
da enzima aceto-hidroxi-acido-sintase, que catalisa, na região apical meristemática,
os passos iniciais da biossíntese de três aminoácidos essenciais: isoleucina, leucina
e valina, impedindo o crescimento apical da futura planta. Como consequência, após
o bombardeamento das micropartículas, contendo a construção de interesse,
juntamente com gene conferindo resistência ao Imazapyr, as possíveis células
transgênicas da região apical dos eixos embrionários podem ser efetivamente
selecionadas entre as células não transgênicas. Tal seleção se dá pela capacidade
natural de que as células transgênicas têm de crescer quando expressando o gene
ahas, mesmo em presença de Imazapyr (RECH et al., 2008).
Um dos aspectos negativos da utilização da biobalística é a integração
indeterminada de cópias do transgene de interesse (BARAMPURUM; ZHANG,
2011). Entretanto, a biobalística é uma ferramenta biotecnológica bastante eficiente,
uma vez que facilita a transferência de genes para o interior de células vegetais e
além do mais, é o único método de transformação aproveitável para algumas
espécies (TAYLOR; FAUQUET, 2002; ZIOLKOWSKI, 2007).
1.5 ALGODÃO GM
A agricultura no Brasil é um forte contribuinte econômico direta, seja
relacionado à capacidade de gerar empregos ou à comercialização de produtos
(AVELAR; VILELA, 2006), o que tem providenciado destaque brasileiro para o
agronegócio. Dentre as culturas que mais se destacam no Brasil (cana-de-açúcar,
soja, milho, feijão, café e algodão), a cotonicultura foi uma das primeiras atividades
agrícolas desenvolvidas no País e
tem contribuído de forma significativa no
aumento do PIB (CEPEA/USP, 2011; MAPA, 2012).
O cultivo e a utilização da fibra do algodão pelo homem foram apresentados
há mais de vinte séculos por diversas comunidades espalhadas por diferentes
continentes, sendo as principais localizações: Índia, Egito e Peru (BELTRÃO, 1999;
HUCKELL, 1993; MOULHERAT et al., 2002). A partir de então, o algodão se tornou
a principal fibra natural utilizada no mundo principalmente na indústria têxtil
(SANTOS et al., 1999).
18
No Brasil, os índios utilizavam para fiar e tecer o algodão no início do século
XVI. Em 1576, deu-se início aos relatos de suas utilizações: o português Gandavo
relatou que as camas eram feitas de teias de fios de algodão, entretanto para os
indígenas o algodão tinha muitas utilidades, inclusive se tratando de alimentação
(caroço esmagado e cozido) e tratamento de feridas (sumo das folhas) (FREIRE,
1999).
De 1960 a 1970, estima-se que a cotonicultura no Brasil atingiu mais de três
milhões de hectares plantados nas regiões centro-sul e nordeste, conhecida como
agricultura de pequenas áreas e tecnologia remota. No entanto, na década de 80
deu-se início à grande dificuldade de produção desencadeada pela entrada de uma
nova praga, o bicudo-do-algodoeiro (A. grandis), o que reduziu a produtividade
nacional e tornou o Brasil de maior exportador de algodão para o maior importador
mundial (CONAB, 2006). A partir de então, a cotonicultura migrou para a região
centro-oeste, traçando novas metas para a agricultura nacional. No entanto, para o
melhor desenvolvimento e estabilidade da cultura, tornava-se necessário o
aprimoramento de tecnologias voltadas para as novas condições oferecidas pela
região promissora para a cotonicultura (BELTRÃO, 1999).
O surgimento de problemas financeiros e de manejo fitossanitário resultou na
mudança de local de produção para uma nova região com ausência da praga, o que
promoveu um progresso econômico inesperado: o estado do Mato Grosso
conseguiu alcançar um crescimento de aproximadamente 536, 25%, passando de
42,26 mil hectares para 268,87 mil hectares, entre 1998 e 2000, gerando um
aumento de produção de 82,21%. Tamanho sucesso pôde ser justificado pela
utilização dos cultivares adaptados, bem como de novas técnicas de cultivo,
promovendo o controle temporário dos danos causados por pragas (RICHETTI;
MELO FILHO, 2002; CONAB, 2006).
Com a expansão da cultura, entre as décadas de 80 e 90, como resposta às
mudanças regionais, a cotonicultura passou a se concentrar nas regiões sul, sudeste
e nordeste. No entanto, após esse período sua disseminação pela região centrooeste revelou seu perfil produtivo no cerrado brasileiro, espalhando consigo um
crescimento espantoso para a cotonicultura nacional. Em números, o que antes
correspondia a 8,8% de área de algodão do país, passou em 2002, para 63% do
19
total dessa área. Atualmente, somando-se a produção do centro-oeste com a
produção da Bahia e do Maranhão, o algodão representa mais de 80% da produção
nacional (AMPASUL, 2014).
O algodão é uma das culturas que mais tem se beneficiado dos avanços da
biotecnologia, sendo o terceiro principal cultivo transgênico no mundo (JAMES,
2013). Atualmente, a resistência a inseto e tolerância a herbicida são as duas
características agronômicas aprovadas e amplamente comercializadas que foram
introduzidas no algodão através de engenharia genética (MEHBOOB-UR-RAHMAN,
et al., 2012). Nas variedades resistentes a insetos foram incorporados ao genoma do
algodoeiro genes que codificam proteínas entomotóxicas provenientes da bactéria
Bt. Esses eventos GM foram genericamente denominados algodoeiros Bt
(MOREIRA et al., 1999). Já as variedades resistentes a herbicida visam aumentar a
facilidade de manejo de plantas invasoras, nas quais o transgene inserido é um
homólogo do gene alvo insensível ao herbicida ou codifica uma enzima que degrada
o herbicida (SAROHA et al., 1998; BECKIE, 2011; ICAC, 2012).
O avanço tecnológico e o aumento da produtividade do algodão permitiram ao
Brasil passar de maior importador de algodão do mundo para o terceiro maior
exportador do produto em apenas 12 anos. Destinada à indústria têxtil, a produção
nacional de algodão no Mato Grosso e na Bahia é responsável por, cerca de, 82%
da produção nacional e se destaca pelo investimento em biotecnologia,
gerenciamento do setor e novas técnicas de manejo. Apenas a indústria têxtil do
Brasil é capaz de consumir mais de um milhão de toneladas do algodão produzido
no Brasil, totalizando 70% da produção total de 1,5 milhões de toneladas (MAPA,
2012).
No caso do algodão GM, a grande maioria das plantas resistentes a insetospraga, expressa toxina Cry. A utilização dessa entomotoxina tem resultado em
eventos capazes de promover a cultura dessa planta, entretanto, além disso, novas
alternativas vêm sendo estudadas para o controle de insetos. Dessa maneira, na
última década a técnica do RNA interferente tornou-se uma importante ferramenta
genética que fez com que o estudo funcional de genes em insetos não-modelos se
tornasse possível. Estudos de validação funcional por RNAi de genes que codificam
para enzimas da via de síntese de quitina mostraram que esses genes são
essenciais para o desenvolvimento de insetos (ALVES et al., 2010; ZHANG et al.,
20
2010; AMPASALA et al., 2011; ARAKANE et al., 2011). Quando a expressão desses
genes foi inibida no coleóptero modelo, Tribolium castaneum, fenótipos letais foram
observados (ARAKANE et al., 2008). Ademais, a validação da vitelogina, proteína
precursora do vitelo presente no interior dos ovos de insetos, evidenciou a
importância de se estudar o possível silenciamento desse gene em progênies de A.
grandis, resultando na inviabilidade de parte dos ovos decorrentes da diminuição
significativa da síntese dessa proteína (COELHO, 2013). Portanto, uma vez que a
quitina está ausente em plantas e vertebrados, e o desenvolvimento e crescimento
dos insetos dependem da biossíntese deste polímero, a identificação, a
caracterização e o uso do silenciamento de genes envolvidos na síntese de quitina,
assim como na síntese de vitelogenina, apresentam-se como estratégia promissora
para desenvolvimento de novos métodos mais seguros e eficazes de controle desta
praga.
1.6 JUSTIFICATIVA
Há muitos séculos a cotonicultura nacional tem sofrido com ataques e perdas
graves causados por A. grandis. Mesmo com o surgimento de medidas de controle,
principalmente, agrotóxicos, não tem sido muito eficaz pela grande quantidade
necessária para controlar a emergência das infestações, o que implica em onerar o
produto. O bicudo-do-algodoeiro possui uma estrutura adaptada para se nutrir e
ovipor nos botões florais de plantas de algodão e, é completamente dependente
dessa estrutura para a garantia de desenvolvimento de sua progênie, o que torna
difícil o acesso e o desenvolvimento de um inseticida alvo especifico que interfira no
metabolismo e no ciclo de vida do inseto. Dessa forma, os agrotóxicos ainda
apresentam certa toxicidade para o humano, além do que, ocorre o desenvolvimento
de variantes resistentes de outros insetos e de ciclos biológicos concomitantes. Por
esta razão, é imperativo o desenvolvimento de novas alternativas biotecnológicas
que não apresentem efeitos colaterais extremos. Nesse sentido, estudos envolvendo
a inserção de transgenes em plantas de algodão que apresentem a capacidade de
interferir no ciclo de vida e/ou na atividade desse inseto-praga têm demonstrado o
potencial de serem utilizados como bioinseticidas. Assim, o presente estudo visa
obter eventos GM de plantas de algodão resistentes ao A. grandis, por meio da
21
expressão de genes que codificam a proteína Cry e do silenciamento gênico por
RNAi dos genes da quitina sintase II e da vitelogenina. Além disso, o estudo objetiva
a caracterização molecular dos eventos transgênicos e a validação in planta dos
referidos genes por meio de bioensaios.
22
2 OBJETIVO
2.1 OBJETIVO GERAL
Validar genes essenciais de A. grandis, o bicudo-do-algodoeiro, e a
entomotoxina Cry8Ka5, a fim de obter plantas de algodão GM resistentes ao insetopraga.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Sintetizar a construção pBSKdsCH2vitCry8Ka5, contendo dsRNA para os
genes Quitina Sintase II e Vitelogenina, sob controle do promotor constitutivo UCeA
1.7 e, sequência do gene que expressa a proteína Cry8Ka5, sob domínio do
promotor tecido-específico GhPGFS1;
2. Transformar embriões de sementes de algodão da variedade BRS-372,
através da técnica de biobalística com a construção pBSK-dsCH2vitCry8Ka5,
visando a superexpressão da toxina Cry e o silenciamento gênico de quitina e
vitelogenina;
3. Caracterizar molecularmente as plantas de algodão GM por meio das
técnicas PCR, ELISA e qRT-PCR;
4. Desafiar os eventos transgênicos com o inseto alvo, bicudo-do-algodoeiro,
visando o seu controle.
23
3. METODOLOGIA
3.1.
CONSTRUÇÃO GÊNICA
Foi utilizado o cassete pBSK-dsCHSvitCry8Ka5 para transformação de
plantas de algodão, contendo dsRNA para os genes CHS2 e vitelogenina, sob
domínio do promotor constitutivo, UceA 1.7, visando o silenciamento dos dois genes
alvo de A. grandis. Agrupados in tandem (figura 5), na construção pBSKdsCHSvitCry8Ka5, os transcritos dos genes alvos contêm 200pb específicos para
cada um dos genes, cujos agrupamentos possuem direção invertida interrompida
por intron, o que promove a formação de alça após a obtenção do transcrito, auto
anelamento e dsRNA resultante. Além disso, o cassete contém a sequência que
codifica para a proteína Cry8Ka5 sob domínio do promotor botão floral-específico
GhPGFS1 para expressão direcionada para botão-floral. Como marca de seleção, o
cassete possui o gene AHAS que confere resistência ao herbicida, Imazapyr.
Figura 5. Representação esquemática do cassete de expressão contendo o gene de seleção AHAS,
que confere resistência ao herbicida Imazapyr e o gene para super-expressão do dsRNA-CHS2vit,
sob domínio do promotor UCeA 1.7 e o gene para a proteína Cry8Ka5 controlado pelo promotor
tecido-específico GhPGFS1.
3.2 TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA VIA BIOBALÍSTICA
A metodologia desse trabalho foi baseada no protocolo de transformação
genética via biobalística utilizado por Rech et al. (2008). Sementes de algodão da
cultivar BRS 372 foram deslintadas com ácido sulfúrico concentrado (3mL/g de
24
semente) por 1 minuto, em constante homogeneização com bastão de vidro. Em
seguida, as sementes foram transferidas para 5 litros de água destilada, lavadas por
três vezes com água destilada e secas em papel toalha.
As sementes foram desinfestadas com etanol 70%, por 10 minutos, lavadas
com água destilada estéril, por três vezes. Em seguida, foram colocadas em banho
de hipoclorito de sódio 2,5% por 30 minutos e novamente, lavadas por três vezes
com água destilada estéril. O recipiente contendo as sementes submersas em água
destiladas estéril foi vedado e encoberto por papel alumínio, afim de permitir a
germinação no escuro, durante 16 a 18 horas.
Após esse período, as sementes foram lavadas por três vezes com água
estéril, secadas e vedadas em recipiente estéril e ambiente escuro por mais 16 a 18
horas. Posteriormente, os cotilédones de cada semente foram pressionados até que
os eixos embrionários germinados fossem expulsos da casca da semente. Os eixos
embrionários foram excisados, onde o meristema apical foi seccionado na região
das primeiras folíolas, utilizando-se bisturi completamente estéril. Dez eixos
embrionários foram posicionados em círculo para placas de Petri de 5 cm de
diâmetro, a uma distância de 6 a 12 mm do centro da placa com a região
meristêmica apical voltada para cima. O meio de cultura para combardeamento foi
composto de sais basais para meio MS, suplementado com 3% de glicose, 0,8 % de
Phytagel e pH ajustado para 5,7 antes da autoclavagem).
3.3.2 Aplicação da técnica de bombardeio de DNA
O cassete de transformação foi inserido no genoma da planta por meio de
microparticulas de tungstênio, pela técnica de biobalística que com consiste na
aceleração de microprojéteis envoltos de material genético de interesse de forma
não letal à célula. Para a técnica atribuída, seguiu-se o protocolo subseqüente.
Foram pesadas 60mg de partículas de tungstênio que, posteriormente, foram
transferidas para tubos de microcentrífuga, adicionando-se 1mL de etanol 70%. Com
o auxílio do vortex, as partículas foram misturadas por 15 minutos, centrifugadas a
3000g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado por meio de micropipeta, sem
que o sedimento fosse tocado. Foi adicionado 1 mL de água estéril às partículas,
agitando vigorosamente por mais 15 minutos com auxílio do vortex, seguido de
25
centrifugação a 3000g por 5 minutos. Este procedimento foi repetido por mais 2
vezes. Finalizadas as lavagens, o sobrenadante foi descartado e as partículas foram
ressuspendidas em 1 mL de glicerol 50% autoclavado. Posteriormente, as
micropartículas foram distribuídas em tubos de microcentrífuga em 50 µL e agitadas
vigorosamente como o auxílio do vortex por aproximados 30 segundos,
anteriormente sonicadas por 5 minutos, a fim de garantir total desagregação das
partículas. No momento de cada bombardeamento, as partículas receberam o DNA
de interesse numa proporção de 8 µL de DNA para cada 50 µL de partículas de
tungstênio. O DNA de interesse foi previamente pesado e dosado a 1 µg/ µL. Após 2
segundos de rápida agitação em vortex, foram adicionados 50 µL de CaCl 2 2.5 M e
mais uma vez homogeneizadas. Em seguida, 20 µL de espermidina a 0,1 M, mais
uma vez homogeneizados. Deixou-se agitar por 10 minutos em velocidade mínima
no vortex, seguida de centrifugação por 10 segundos a 3000 x g. Descartou-se
sobrenadante, sem que o pellet fosse tocado. Foram adicionados 150 µL de etanol
absoluto e rapidamente homogeneizado e centrifugado a 3000 x g. O sobrenadante
foi descartado e finalmente, adicionou-se 24 µL de etanol absoluto e homogeneizouse mais uma vez. Sonicou-se por 3 segundos cada conteúdo preparado.
Este conteúdo foi distribuído em alíquotas de 3,2 µL para cada membrana
carreadora em sua região central, membrana esta, específica para a realização da
técnica de biobalística. Essas membranas foram encaixadas em seu suporte e
assim, transferidos para placas de sílica gel a fim de evitar umidade. Após
aproximadamente 5 minutos, as placas contendo os suportes e suas membranas
foram retiradas e utilizadas para bombardeamento. Por meio do equipamento de
biobalística, as micropartículas envoltas por DNA foram projetadas sobre as placas
contendo os eixos embrionários, conforme relatado no item 3.3.1.
Após o bombardeamento, as placas contendo os eixos embrionários pósmicroprojetados foram armazenadas por 48 horas em ambiente escuro. Em seguida,
os embriões foram transferidos para caixas tipo Magenta® contendo meio de cultura
e seleção (sais basais para meio MS, glicose 3%, BAP (benzylaminopurina) 13.3µM,
Imazapyr 300nM, carvão ativado 0,1%, Agar 0,6 e pH ajustado para 5.7).
26
3.3.3 Cultivo de plantas selecionadas por herbicida
Após o período de 30 dias, foram descartadas as plantas que apresentaramse
necrosadas
por
ação
do
Imazapyr.
As
plantas
que
demonstraram
desenvolvimento diferenciado perceptível alcançando uma média de 10 cm de
comprimento, foram transferidas e mantidas por 15 dias em copo plástico envolvido
por saco plástico assegurado por elástico, contendo vermiculita, em sala de cultivo in
vitro, sob temperatura (24-28 ºC) e luminosidade (16/8h), controladas. Após este
período, as plantas foram aclimatadas em casa de vegetação, onde permaneceram
por mais 15 dias. Posteriormente, o saco plástico foi retirado e, em mais 15 dias as
plantas foram transferidas para sacos plásticos contendo solo, onde permaneceram
por mais 30 dias até que fossem definitivamente transferidas para vasos. As
análises de caracterização das plantas foram iniciadas assim que suas raízes foram
aprofundadas resultando na garantia de sua adaptação ao solo a que foram
submetidas.
3.4. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE PLANTAS POTENCIALMENTE
TRANSFORMADAS
3.4.1 Extração de DNA
Neste trabalho, para a extração de DNA genômico foi utilizado o kit DNeasy
Plant (QIAGEN). A extração seguiu-se conforme instruções do fabricante. As
amostras foram tratadas com 1 µl de solução RNase (10 µg/µl) e aquecidas a 37º C
por 45 minutos. Posteriormente, foram armazenadas em -80ºC.
3.4.2 Verificação da amplificabilidade do DNA extraído de folhas de
plantas de algodão
Foi verificada a amplificabilidade do DNA extraído das folhas de plantas de
algodão por meio de reações de PCR qualitativo, utilizando-se os primers para
AHAS, RNAi e Cry8Ka5 (tabela 2). Os fragmentos amplificados na PCR foram
27
separados por eletroforese em gel de agarose 1% (p/v) contendo 0,3 µg/ml de
brometo de etídio imerso por tampão TBE 1X (0,1M Trizma base; 90mM ácido
bórico; 2,5mM EDTA ). A PCR para todos os genes foi realizada em um volume final
de 10 µl contendo 5 µl de PCR ReadyMix, 0,4 µl de cada primer 10 µM, 1 µl de
extrato de DNA. As temperaturas de anelamento específicas para cada primer,
foram: 65ºC para AHAS, 55ºC Cry8Ka5 e 55ºC para RNAi .
Para todos os genes obedeceram-se os seguintes passos, alterando-se
apenas a temperatura específica do anelamento de cada primer: 1- desnaturação
inicial a 94ºC por 5 minutos; 2- 40 ciclos de 94ºC por 45 segundos, 65ºC por 45
segundos e 72º C por 1 minuto; 3- extensão final a 72ºC por 10 minutos, para o gene
AHAS.
Tabela 2. Lista de oligonucleotídeos utilizados nas análises por PCR.
Nome do
Oligonucleotídeo
Cry8Ka5_F7
400pb
Cry8Ka5_R7
Ahas_term_fw3
Sequência (5’– 3’)
Tamanho
(pb)
600pb
Temperatura de
Anelamento
GTTACACCCAAGCAGACATCGACC
55°
CAATGAAGGAGCAGGAATAGCAAC
55°
GTCACTGGGTTAATATCTCTCGAATCTT
60°
GCA
Ahas_term_rev3
CCTACTTCCAATGTCTGATTAGTGCTTC
60°
TGG
dsRNA-CHS2vitFw
200pb
CGTCATCAAATCTATATGGCTGGTTATG
55°
ACAAG
dsRNA-CHS2vitRv
CTTCTGTGAATTGCTGCCAAAGTTTTCC
TAGG
55°
28
3.4.3 Extração e determinação de proteínas totais
Para extração de proteínas totais de plantas de algodão foram utilizados
60mg de macerado de botão floral congelado. Adicionou-se ao material macerado
1ml de tampão de extração de proteínas (Tris-HCl 0,5 M, EDTA 50 mM, sacarose
0,7 M, KCl 0,1 M, Triton 0,1%, PMSF 10mM, DTT 1mM e PVPP 0,5%) e inverteu-se
as amostras à 4ºC por 60 minutos, seguida de centrifugação por 45 minutos a 13200
x g. Após isso, coletou-se sobrenadante e transferiu-se para novos tubos de
microcentrífuga.
A concentração das proteínas totais foi estabelecida segundo a metodologia
de Bradford (1976), onde utilizou-se como padrão o BSA (Bovine Serum Albumin),
com leitura em espectrofotômetro a 595 nm.
3.4.4 Quantificação da expressão da entomotoxina Cry8Ka5 por meio de
ensaio imunoenzimático do tipo ELISA
A determinação da expressão de toxina Cry8Ka5 das plantas de algodão
potencialmente transformadas foi feita por ensaio imunoenzimático do tipo ELISA
indireto. Foram utilizadas microplacas de 96 cavidades de fundo plano que, por sua
vez, foram sensibilizadas com 125ng/poço de proteínas totais do extrato de botão
floral. A placa foi sensibilizada com aproximadamente 125 ng de proteínas totais,
dispostas em triplicata, provenientes da extração de proteínas de botão floral e
mantidas à 4ºC over night. Após esse período, descartou-se o conteúdo excedente
não retido à placa. Bloqueou-se os poços com BSA 1% diluído em solução PBS 1X
e tween 0,05% por 2 horas sob homogeneização. Lavou-se a placa por 3 vezes com
solução PBS 1% e tween 0,05%. Cada lavagem foi seguida de batidas fortes em
todos os passos após o bloqueio, a fim de que não houvesse fixação dos anticorpos
na placa. O anticorpo para a proteína Cry8Ka5 foi utilizada na proporção de 1:1000
diluído em solução PBS 1X e distribuídos em 100 µl de solução por poço, onde
permaneceu-se homogeneizando-se a placa por 2 horas. Em seguida, descartou-se
todo o conteúdo da placa, lavou-se novamente com solução PBS 1X e tween 0,05%
29
por 3 vezes. Foi adicionado o segundo anticorpo conjugado com peroxidase, antirabbit, na proporção de 1:3000 diluído em PBS 1X e distribuídos em 100 µl por poço
e homogeneizando por 1 hora. Posteriormente, descartou-se todo o conteúdo da
placa, lavou-se novamente com solução PBS 1X e tween 0,05% por 3 vezes.
A solução de revelação foi preparada, calculando-se o volume a ser
preparado de acordo com o número de cavidades (100 µl/cavidade). Foram
adicionados ao tampão de revelação (ácido cítrico 0,1M e fosfato de sódio dibásico
0,2M, pH 5,0) 10 µl de peróxido de hidrogênio e 1 pastilha de substrato enzimático
para cada 10 ml de solução. Distribuiu-se 100 µl de solução reveladora por cavidade
e esperou-se que a reação acontecesse em ambiente escuro por 30 minutos. Em
seguida, foram distribuídas alíquotas a 50 µl de ácido sulfúrico 2M por cavidade.
A leitura foi realizada em um aparelho de espectrometria de luz UV/visível,
utilizando um filtro específico de 450nm.
3.5 DESAFIO DAS PLANTAS T1 COM O INSETO-PRAGA
Sementes de plantas T1 GM, obtidas por auto-fecundação de indivíduos T0,
foram plantadas e analisadas por PCR utilizando as mesmas condições do item
3.4.2.
Para determinar o efeito da interferência do RNA no bicudo-do-algodoeiro,
larvas de segundo instar foram inoculadas em botões florais de 6mm, de eventos
GM T1, os tratamentos foram separados e mantidos em placas para cultura de
células de 6 poços onde permaneceram por 7 dias a 26ºC, em placas para cultura
de células de 6 poços, fundo chato com tampa (Figura 6). Após esse período, as
larvas coletadas dos botões florais foram colocadas em tubos de microcentrífuga de
1,5ml estéreis, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80ºC até que
fossem utilizadas.
30
3.5.1 Extração de RNA total de larvas de A. grandis alimentadas por
botão floral transgênico.
O RNA total das larvas de A. grandis foi extraído separadamente em tubos de
microcentrífuga de 1,5 ml estéreis. Foram acrescentados aos tubos 500 µL do
reagente Trizol (INVITROGEN, USA) e 5 µL de βetamercaptoetanol para até 100mg
de tecido do inseto macerado em nitrogênio com auxílio de pistilo. Em seguida,
inverteu-se as amostras por 10 minutos e centrifugou-se por 12000 x g por 10
minutos a 4ºC. Transferiu-se sobrenadante para novos tubos de microcentrífuga, a
fim de separá-lo de restos teciduais. Foram adicionados 200µL de clorofórmio aos
tubos e agitados vigorosamente por 15 segundos, incubando-os por 3 minutos em
temperatura ambiente. Após essa etapa, centrifugou-se a 12000 x g por 15 minutos
a 4ºC, a fim de que se formassem três fases. A fase superior foi coletada e
transferida para novo tubo de microcentrífuga, resultando em aproximadamente
300µL, ao qual foi adicionado o mesmo volume de isopropanol. Incubou-se as
amostras a -20ºC over night para melhor precipitação do RNA. Posteriormente, as
amostras foram centrifugadas a 12000 x g por 15 minutos a 4ºC. O sobrenadante,
por sua vez, foi descartado e o pellet foi lavado com 200µL de etanol 70% gelado
seguindo de centrifugação a 12000 x g por 10 minutos à 4ºC. O pellet foi dissolvido
em 100µL de tris-HCl 10mM pH 7,5. A quantificação foi realizada por espectrometria,
utilizando-se 3µL de RNA, variando entre 300 ng/µL e 1000 ng/µL e por sua
qualidade e integridade em gel de agarose 1%. As amostras contendo RNA foram
armazenadas a -80ºC até que fossem utilizadas.
31
Figura 6. Placa para cultura de células contendo botões florais inoculados com larvas de bicudo-doalgodoeiro.
3.5.2 Síntese de cDNA
A reação de síntese de DNA complementar (cDNA) ocorre a partir de um
molde de RNA utilizando-se a enzima transcriptase reversa, na realização desse
papel.
O cDNA foi sintetizado utilizando-se kit Superscript First-Strans Synthesis
System for RT-PCR (Invitrogen) a partir de 2µg de RNA total extraído de larvas de A.
grandis alimentadas por botões florais de plantas de algodão potencialmente
transgênicas, 2 µL de oligo dT a 10µM, completando-se com água estéril para 11 µL
de volume final. As amostras foram incubadas a 70ºC por 3 minutos, colocadas
rapidamente em gelo por mais 3 minutos, adicionando-se, em seguida, mix contendo
4 µL de tampão 5x, 2 µL de ditiotreitol (DTT), 1 µL de dNTP e 1 µL de RNase out.
Prosseguiu-se em 2 minutos de incubação a 42ºC. Em seguida, foram
acrescentadas 40 unidades de transcriptase reversa - Superscript First-Strans
Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). O restante da reação ocorreu em
termociclador obedecendo os passos: 90 minutos a 42ºC, 15 minutos 70ºC e 4ºC. O
cDNA foi armazenado a -20 ºC.
32
3.5.3 Confirmação da síntese do DNA complementar (cDNA)
Foi realizada reação de PCR para o gene constitutivo que transcreve para
Actina, proteína normalmente sintetizada em A. grandis, a fim de confirmar síntese
do cDNA.
A PCR foi realizada em um volume final de 20 µL contendo 2 µL de tampão
10X para Taq DNA polimerase, 0,8 µL de MgCl 50mM, 0,4 µL de dNTP 10 mM, 0,4
µL de cada iniciador (senso e anti-senso) 10 mM, 0,4 µL de Taq DNA Polimerase 5
u/µL e 1 µl de DNA complementar, diluído em 1:20. A reação de PCR foi realizada
em termociclador obedecendo os seguintes passos: 1- desnaturação inicial a 94ºC
por 2 minutos; 2- nova desnaturação a 94ºC por 20 segundos; 3- anelamento de
iniciadores a 55ºC por 20 segundos; 4- extensão a 72ºC por 45 segundos; 5voltando ao passo 2 (repetindo por 30 ciclos sob as mesmas condições
anteriormente descritas). Por fim, foi realizado um último ciclo de extensão a 72ºC,
por 5 minutos. Como controle negativo foi utilizado para a PCR amostra que não
continha cDNA.
O produto amplificado foi analisado através de uma eletroforese em gel de
agarose 1% acrescido de brometo de etídio (0,5 µL/ml), utilizando como padrões de
peso molecular de DNA 1 Kb plus DNA ladder.
3.5.4 Análise do silenciamento do gene alvo do ds RNA por qPCR
O silenciamento de um dos genes alvos foi analisado por qPCR a partir do
cDNA sintetizado de larvas de A. grandis alimentadas de botões florais
potencialmente transgênicos durante 7 dias. Foram utilizados iniciadores para CHS2
e também iniciadores para o gene constitutivo codificador para -actina (Tabela 3),
que por sua vez, foi utilizado como controle interno da reação e referência para
cálculo da expressão relativa de todos os genes. A reação foi realizada em um
volume final de 10 µl contendo 2,5 µl de SyBrGreen, 0, 5 µl de PVP 20%, 0,2 µl de
primers foward e reverse 10mM e 2 µl de cDNA em uma diluição de 1:20. O
programa para qRT-PCR consistiu em um passo inicial a 95ºC por 10 minutos,
seguidos por 40 ciclos de 95ºC por 20 segundos, 60ºC por 30 segundos e 72ºC por
33
30 segundos. Para a análise das amplificações, a Ct (do inglês - cycle of the
threshold) e a eficiência de amplificação de cada oligonucleotídeo (variando de 90%
a 100%) foram determinadas pelo programa Real-time PCR Miner. RNA total
extraído de larvas de A. grandis alimentadas por plantas botões florais de plantas de
algodão potencialmente transgênicas, 2 µL de oligo dT a 10µM, completando-se com
água estéril para 11 µL de volume final. Foram incubadas as amostras a 70ºC por 3
minutos, colocadas rapidamente em gelo por mais 3 minutos e adicionou-se, em
seguida, mix contendo 4 µL de tampão 5x, 2 µL de ditiotreitol (DTT), 1 µL de dNTP e
1 µL de RNase out. Prosseguiu-se em 2 minutos de incubação a 42ºC. Após isso,
foram acrescentadas 40 unidades de transcriptase reversa - Superscript First-Strans
Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). O restante da reação ocorreu em
termociclador obedecendo os passos: 90 minutos a 42ºC, 15 minutos 70ºC e 4ºC.
Tabela 3. Oligonucleotídeos utilizados nas reações de PCR em tempo real para análise de CHS2.
Nome do
oligonucleotídeo
Sequência do
oligonucleotídeo senso (5’-3’)
Sequência oligonucleotídeo
antisenso (5’-3’)
Tamanho do
amplicom
(pb)
Eficiência
(%)
AntgCHS2-RT
AAGGCATTAACGGTGACGAC
TCCAAGTCGTTGATGACTGC
120
101
B-Actina-RT
CCTTTAACACCCCTGCTATG
TGAGGTAGTCGGTCAAGTCA
192
102
Uma visão geral da metodologia empregada na clonagem, caracterização e
avaliação do efeito funcional da estratégia de transformação é mostrada na figura 7.
34
Figura 7. Organograma metodológico da transformação, caracterização e desafio de plantas de
algodão GM.
35
4. RESULTADOS
4.1 BOMBARDEAMENTO DE EMBRIÕES
A técnica de biobalística foi utilizada no intuito de inserir em plantas de
algodão os genes que codificassem para a entomotoxina Cry8Ka5 e para o dsRNA
de sequência homóloga aos genes alvos de A. grandis, cujo silenciamento resultaria
na interrupção da produção da CHS2 e da vitelogenina, resultando em fenótipos
letais. Foram bombardeados 3500 embriões de algodão, variedade BRS-372, dos
quais foram obtidas 186 plântulas contendo o gene de seleção ahas para resistência
ao herbicida Imazapyr.
4.2 CARACTERIZAÇÃO
Para confirmar a presença dos genes de interesse nas 186 plantas T0
resistentes ao herbicida, foram realizadas reações de PCR para os três módulos
gênicos: ahas, Cry8Ka5 e RNAi, das quais, 19 plantas mostraram-se positivas para
a presença dos três genes simultaneamente (Tabela 4). Nas figuras 8, 9 e 10 podem
ser observados os produtos de PCR nos eventos positivos para os genes de dsRNA
(200pb), Cry8Ka5 (400pb) e ahas (600pb), respectivamente.
36
Tabela 4. Plantas T0 positivas resultantes da análise por PCR para os genes AHAS, Cry8Ka5 e
dsRNA.
Plantas
ahas
Cry8Ka5
dsRNA
2
+
+
+
3
+
+
+
7
+
+
+
9
+
+
+
11
+
+
+
12
+
+
+
13
+
+
+
15
+
+
+
32
+
+
+
44
+
+
+
51
+
+
+
52
+
+
+
53
+
+
+
55
+
+
+
58
+
+
+
63
+
+
+
120
+
+
+
144
+
+
+
156
+
+
+
Total de 19 plantas
37
Figura 8. Eventos T0 detectados por PCR para o gene dsRNA. Gel de agarose 1% demonstrando
reação de PCR. Poços 3, 7, 9, 11, 15, 32, 44, 51 e 120 amplificação do fragmento de dsRNA Vitelogenina e CHS2, presença do gene para as nove plantas analisadas; C+: controle positivo
(plasmídeo utilizado no bombardeamento); PM: Padrão de peso molecular em pares de bases (pb).
200pb
NT H20
3
7
9
11
15 32
44
51
120 C+ PM
Figura 9. Eventos T0 detectados por PCR para o gene Cry8Ka5. Gel de agarose 1% demonstrando
reação de PCR. Poços 3, 7, 9, 11, 15, 32 e 44 amplificação do fragmento de Cry8Ka5 - presença do
gene para as sete plantas analisadas; C+: controle positivo (plasmídeo utilizado no
bombardeamento); PM: Padrão de peso molecular em pares de bases (pb).
400pb
3
7
9
11
15
32
44
NT H2O C+
PM
Figura 10. Eventos T0 detectados por PCR para o gene ahas. Gel de agarose 1% demonstrando
reação de PCR. Poços 3, 7, 9, 11, 15 e 32 amplificação do fragmento de AHAS - presença do gene
para as seis plantas analisadas; C+: controle positivo (plasmídeo utilizado no bombardeamento); PM:
Padrão de peso molecular em pares de bases (pb).
600pb
NT H2O
3
7
9
11
15
32
C+
PM
38
4.3 QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO DE ENTOMOTOXINA CRY8KA5
POR MEIO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO DO TIPO ELISA
A concentração de proteína Cry8Ka5 expressa nas plantas de algodão
consideradas positivas por PCR foi medida por ELISA em extrato de tecido do botão
floral. Os níveis de proteína Cry8Ka5 foram detectados utilizando-se plantas de
algodão não transgênico como controle (Figura 11).
Figura 11. Avaliação da expressão da entomotoxina Cry8Ka5 em amostras de botão floral macerado
de plantas potencialmente transgênicas. Das 17 plantas avaliadas pela técnica de ELISA, 11 plantas
(amostras: 3, 7, 9, 11, 13, 44, 52, 3, 55 e 156) demonstraram significativa expressão da entomotoxina
avaliada da construção pBSKdsCH2vitCry8Ka5.
.
100,0
ug de toxina Cry8Ka5/ g de tecido fresco
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
1
2
3
7
9
11
12
13
32
44
51
52
53
55
58
120 156 NT8
4.4 IDENTIFICAÇÃO DE GENES POR PCR DE GERAÇÃO T1
As onze plantas de geração T0 que apresentaram expressão significativa de
proteína Cry8Ka5 foram autofecundadas e dez sementes de cada evento foram
semeadas para obtenção da geração T1. Após a caracterização molecular dessas
linhagens por PCR, foram selecionadas sete plantas contendo a presença dos três
39
genes de interesse (ahas, RNAi e Cry8Ka5), sendo duas oriundas do evento 7 (7.1 e
7.5), duas do evento 11 (11.1 e 11.9), uma do evento 13 (13.10), uma do evento 55
(55.4) e uma do evento 156 (156.1).
Tabela 5. Plantas de algodão geração T1 positivas resultantes da análise por PCR para os genes
ahas, Cry8Ka5 e dsRNA.
Plantas
ahas
Cry8Ka5
dsRNA
7.1
+
+
+
7.5
+
+
+
11.1
+
+
+
11.9
+
+
+
13.10
+
+
+
55.4
+
+
+
156.1
+
+
+
Total de 7 plantas
4.5 DESAFIO DAS PLANTAS GM COM O INSETO-ALVO
Para analisar o silenciamento de CHS2 nas plantas GM foi determinada a
expressão quantitativa desse transcrito pela técnica de qRT-PCR. O RNA total foi
extraído de larvas de A. grandis alimentadas por botões florais de plantas GM e seu
controle (Figura 12) e o cDNA obtido foi utilizado para a realização do experimento
de qRT-PCR.
A expressão dos transcritos alvo em larvas alimentadas por botão floral do
evento 7.5 apresentou uma redução de cerca de 6 vezes na expressão do gene-alvo
(Figura 13), em comparação ao controle, apesar de não ter alterado o tamanho das
larvas (Figura 12). Este resultado sugere que este evento é um potencial candidato
para controle do bicudo-do-algodoeiro pela utilização da metodologia do RNAi. Na
40
figura 14 são apresentadas as etapas para obtenção e seleção do evento
transgênico.
Figura 12. Análise morfológica de larvas de terceiro instar de insetos de A. grandis após serem
alimentados com plantas de algodão GM contendo a construção pBSKvitCHS2Cry8Ka5. As larvas
foram maceradas após 7 dias de inoculação em botão floral.
LARVA CONTROLE
7.1
7.2A
7.2B
7.5
Figura 13. Análise do silenciamento gênico por qPCR de CHS2 em larvas de terceiro instar de A.
grandis após ingestão de botão floral de plantas de algodão GM com a construção
pBSKdsvitCHS2Cry8Ka5 por um período de sete dias. -actina foi utilizado como gene de referência.
(NT: expressão de CHS2 em larva que ingeriu botão floral não transformado, ou seja, amostra
controle; 7.5: expressão de CHS2 em larva que ingeriu botão floral da planta T1 transformada 7.5;
7.1: expressão de CHS2 em larva que ingeriu botão floral da planta T1 transformada 7.1; 7.2A:
expressão de CHS2 em larva que ingeriu botão floral da planta T1 transformada 7.2; 7.2B: expressão
de CHS2 em larva que ingeriu outro botão floral da planta T1 transformada 7.2.
41
Uma visão geral dos resultados obtidos distribuídos entre caracterização e
avaliação do efeito funcional da estratégia de transformação é mostrada na figura
14.
42
Figura 14. Organograma de resultados da caracterização molecular das plantas de algodão GM.
3500 embriões bombardeados
186 eventos
selecionadas por herbicida
Caracterização
19 eventos T0 detectadas por PCR
(AHAS, Cry8Ka5 e dsRNA)
11 eventos T0
expressando a
proteína Cry8Ka5
pela técnica de
7 eventos GM T1
9 sementes de cada
planta GM T1 foram
plantadas
detectadas por PCR
(ahas, Cry8Ka5 e dsRNA)
Elisa
Evento 7.5
apresentando
evidências de
silenciamento
quando ingerida por
larvas de
A. grandis
Bioensaio de 2
eventos transgênicos
43
5. DISCUSSÃO
As ferramentas biotecnológicas têm permitido a comercialização de plantas
GM capazes de expressar altos níveis de resistência específica a pragas em
culturas diversificadas (PERLAK et al, 1993). A principal vantagem da implantação
de eventos transgênicos resistentes a insetos no mercado é a grande redução do
uso de pesticidas químicos sendo estes causadores de riscos à saúde e ao meioambiente (SHELTON et al, 2002; CATANNEO et al., 2006). Até o momento, há 47
eventos de algodão GM disponíveis comercialmente, porém no Brasil apenas 12
estão regulamentados (ISAAA, 2012). Entretanto, nenhum desses expressam
qualquer resistência ao bicudo-do-algodoeiro.
A cotonicultura é uma das principais commodities do mundo, sendo
responsável pelo desenvolvimento socioeconômico das regiões centro-oeste e
nordeste do Brasil (FREIRE, 2007). Há alguns anos, a cultura tem sofrido um
declínio em sua produção decorrente de intensos ataques de diversas pragas.
Segundo a literatura, pelo menos, trinta espécies de insetos e três ácaros são
declarados como pragas específicas do algodoeiro (GONDIM et al., 2001). Dentre as
principais pragas que assolam as plantações de algodão, destaca-se o bicudo-doalgodoeiro, A. grandis.
A partir da adoção comercial de algodão Bt em 1996 nos Estados Unidos e
Austrália, o número de países que o produzem comercialmente e a área cultivada
vêm aumentando consistentemente. Em 2011, o algodão Bt foi cultivado em 17,9
milhões ha, o que corresponde a mais de 72 % área total do algodão cultivado em
todo o mundo (JAMES, 2011). A Índia é hoje o país com a maior área plantada de
algodão Bt (8,4 milhões de ha), seguido pela China (3,7 milhões ha) e os EUA (2
milhões ha). Cerca de 8,25 milhões de produtores de algodão utilizam plantas GM,
dos quais 90% são pequenos agricultores. Segundo estudo realizado na Índia, o
algodão Bt foi responsável pelo aumento do rendimento da produção e da
lucratividade em 24% e 50%, respectivamente (QAIM, 2010; KOUSER; QAIM, 2011;
KATHAGE).
Com relação ao bicudo-do-algodoeiro, somente 4 toxinas foram relatadas na
literatura como sendo tóxicas a esse inseto, são elas a Cry1Ba, a Cry1Ia12, a
Cry10Aa e a Cry8Ka5 (GROSSI-DE-SA et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2011; AGUIAR
et al., 2012). No entanto, as doses efetivas para essas toxinas variam de 5,6 – 610
44
g/mL, o que é uma concentração muito elevada para fins de aplicação
biotecnológica, já que em algodão, os níveis de expressão protéica em eventos
transgênicos variam entre 0,2-0,29g de toxina/g de tecido fresco (TORRES et al.,
2006). Entretanto, um estudo recente demonstrou que o nível de expressão de
toxina Cry1Ac é de 0,7g da toxina/g de tecido vegetal fresco de algodão
transgênico Bt (YU et al., 2014).
Das proteínas Cry inseridas em plantas de algodão que já se tornaram
passíveis de comercialização são: a Cry1Ac (Monsanto, Mon531-Bollgard®) e a
Cry1Ac associado a Cry2Ab (BollgardII®, DOW 3006, Calgene 31807) (MONSANTO,
2008).
Além da utilização das proteínas Cry como modo de controle aos insetospraga, a elucidação do mecanismo de silenciamento gênico por RNA de
interferência tem demonstrado resultados promissores em diversos estudos, abrindo
caminhos para uma segunda alternativa biotecnológica para a produção de
transgênicos (PRIDGEON et al., 2008). O silenciamento gênico refere-se a uma
série de mecanismos envolvidos na repressão da expressão de genes-alvo, por
meio da inibição da transcrição ou da tradução. O silenciamento gênico
transcricional pode ocorrer através de metilação na região promotora do gene,
causando a inibição da transcrição, e o pós-transcricional ocorre através da
destruição do transcrito ou inibição da tradução (GORDON; WATERHOUSE, 2007;
PRICE; GATEHOUSE, 2008).
Várias pesquisas utilizando RNAi têm sido realizadas visando a degradação
de RNAm essenciais para a sobrevivência de insetos considerados pragas para a
agricultura (GHANIM; KONTSEDALOV; CZOSNEK, 2007; MAO et al., 2007). Baum
et al. (2007) demonstraram a possibilidade de silenciar genes essenciais para a
sobrevivência do coleóptero Diabrotica virgifera virgifera, praga prejudicial às
plantações de milho, por meio da produção de plantas de milho GM, com a
metodologia do RNAi. Essas plantas de milho GM contendo RNAi homólogo ao gene
da V-ATPase A
apresentaram supressão da expressão desse gene quando
desafiadas com o inseto-alvo, resultando na diminuição dos danos causados às
raízes. No caso do algodão foi obtido um evento GM pela metodologia de RNAi para
resistência ao lepdóptero H. armigera, praga também bastante prejudicial à cultura,
45
por meio do silenciamento do gene do citocromo P450 que resultou na perda de
resistência ao gossipol e morte de larvas (MAO et al., 2007).
Em trabalhos anteriores foi demonstrada a capacidade de silenciar genes em
insetos por meio da metodologia do RNAi (BAUM et al., 2007; MAO et al., 2007) e a
capacidade letal que as proteínas Cry apresentam sobre insetos (BRAVO et al.,
2004; GÓMEZ et al., 2002; ZHUANG et al., 2002). Entretanto, nenhum desses
trabalhos propôs qualquer modo de controle ao inseto A. grandis. A partir dos dados
da análise do transcritoma do inseto (FIRMINO, 2013) determinou-se a viabilidade
de manipular genes que fossem essenciais para o ciclo de vida do inseto-praga.
Dentre estes, foram destacados a importância da quitina sintase II (CHS2)
(MACEDO, 2012) e da vitelogenina (COELHO, 2013) para o desenvolvimento do
bicudo-do-algodoeiro. Estes genes foram patenteados a fim de serem utilizados
como genes alvo para silenciamento, visando o controle de A. grandis, por meio da
transformação genética de plantas de algodão.
Baseado nos resultados destes estudos, no presente trabalho foi realizada a
transformação genética de algodoeiro por meio da técnica de biobalística, utilizando
uma construção gênica contendo, de forma piramidizada, dois módulos gênicos, um
módulo gênico visando a expressão de dsRNA e no outro, a superexpressão da
entomotoxina Cry8Ka5, a fim de induzir resistência ao inseto A. grandis. Tratando-se
de uma espécie de planta economicamente importante que, por sua vez, tem sofrido
inúmeros ataques por esta praga, foram selecionados dois genes de suma
importância para o ciclo biológico e desenvolvimento de A. grandis a fim de serem
silenciados: CHS2 e vitelogenina (MACÊDO, 2012; COELHO, 2013). Além disso,
dentre as entomotoxinas Cry foi escolhida para este trabalho aquela que melhor
apresentasse potencial de ação em coleópteras, por isso, a proteína Cry8Ka5
(OLIVEIRA, 2008).
Dessa maneira, foi sintetizado um cassete contendo ambas as estratégias,
com seleção para o herbicida Imazapyr, utilizado nos meios de seleção. A
metodologia de inserção do vetor nos embriões (biobalística) garantiu a eficiência
esperada de transformação para o evento transgênico 0,54%. Segundo Rech et al.
(2008), a eficiência do bombardeamento deve ser maior ou igual a 0,5% do total de
embriões bombardeados, baseando-se na razão entre o número de plantas
transgênicas e o número de embriões bombardeados.
46
A técnica de transformação utilizada nesse trabalho apresentou eficiência e
maior do que a de transformação de algodão via tubo polínico que foi de 0,1%
(OLIVEIRA NETO et al., 2005), reforçando a viabilidade da utilização da mesma
para a transformação do algodão. As variedades de algodão GM resistente a alguns
lepdópteros, expressando Cry2Ab2 e Cry2Ab2i, que é comercializado livremente no
Brasil, foram obtidas em 2009 (BRASIL, 2009). Portanto, esse fato reforça a
viabilidade do desenvolvimento e o lançamento de novas variedades de algodão GM
para o controle de outros insetos-praga.
Das 186 plantas de algodão que apresentaram resistência Imazapyr, 19
plantas continham as três sequências gênicas detectadas por PCR. Destas, apenas
11 expressaram a entomotoxina Cry8Ka5 detectada por ELISA variando entre 8 e 90
µg/g de tecido vegetal da entomotoxina em botões florais. De acordo com a
literatura, a expressão de proteína Cry pode variar em função do tecido analisado,
sendo maior para folhas apicais. Nos demais tecidos, o nível de expressão pode ser
reduzido em até 44% em botão floral, 50% nos óvulos e 58% no pólen, quando
comparados aos níveis de expressão em folhas apicais (GRENPLATE, 1999;
SIVASUBRAMANIAM et al., 2008). Entretanto, no presente estudo, a utilização do
promotor tecido-específico (GhPGFS1) aumentou a expressão de Cry8Ka5 nos
botões florais, onde quase que 60% da plantas analisadas expressaram essa
entomotoxina.
Para
a
metodologia
do
RNAi
não
foram
realizados
experimentos
demonstrando os níveis de expressão dos genes nas plantas de algodão GM.
Entretanto, a partir da geração T1, foi realizado um desafio entre plantas GM e o
inseto-alvo que revelaram uma possível atividade do silenciamento. Nas larvas de
A.grandis alimentadas por 7 dias com botões florais de algodão GM, detectou-se
pela técnica de qRT-PCR a diminuição da expressão de um dos genes alvo. A
expressão de CHS2 da larva que se alimentou de botão floral do evento GM 7.5 foi
seis vezes menor que a expressão na larva controle alimentada por botão floral não
transgênico durante o mesmo período. Curiosamente, este evento T1 (7.5) é oriundo
do parental T0 (7) que, dentre as plantas PCR positivas para os três genes, foi o que
conferiu maior nível de expressão de Cry8Ka5 (60 µg/g). A larva alimentada com o
evento 7.1 teve expressão de CHS2 semelhante ao controle. Isto demonstra o
potencial do evento 7.5 para o controle de A. grandis. O fato dos outros eventos
transgênicos T1 (7.1 e 7.2) originários do mesmo parental T0 (7) não terem
47
mostrado o silenciamento da CHS2 nas larvas, pode ser inferido pela possível
inserção do transgene em alguma região não codificadora do genoma da planta.
Apesar de não haverem sido concluídos todos os experimentos esperados
para a caracterização das plantas de algodão resultantes desse trabalho, esses
resultados demonstram a viabilidade da técnica de RNAi para obtenção de plantas
de algodão GM resistentes ao bicudo-do-algodoeiro, contribuindo para o
melhoramento genético desta cultura e, consequentemente, para o agronegócio
brasileiro.
48
6. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos no presente estudo mostraram que a técnica de
biobalística foi eficiente no processo de transformação da cultivar de algodão BRS
372. Dos eventos PCR positivos para os três genes, 11 expressaram a entomotoxina
Cry8Ka5 em níveis variando de 8 a 90 µg/g de tecido de botão floral, destacando-se
para os eventos T0 3 e 156 (~90 µg/g) e o evento 7 (60 µg/g). Os dados mostraram
que, houve redução na expressão de CHS2 nas larvas alimentadas com o evento
transgênico 7.5 (T1), sendo 6 vezes menor, quando comparado com o controle. A
transformação por meio da expressão de duas diferentes estratégias demonstrou ser
eficiente e a piramidização de toxina Cry e dsRNA realizada, pode representar uma
ferramenta eficaz para o controle do bicudo-do-algodoeiro.
Futuros experimentos serão realizados para a caracterização molecular
desses eventos transgênicos, assim como a avaliação da viabilidade das progênies
das larvas alimentadas com botões florais oriundos dessas plantas.
49
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