efeito do ultra-som na recuperação de músculo tibial

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EFEITO DO ULTRA-SOM NA RECUPERAÇÃO DE MÚSCULO TIBIAL
ANTERIOR DE RATO LESADO
CIBELE MARLI CAÇÃO PAIVA GOUVÊA (*)
PEDRO MANUEL NUNES VIEIRAL (**)
ANDRÉ CAPALDO AMARA (***)
RESUMO
O presente trabalho avaliou o efeito do ultra-som terapêutico na recuperação do músculo tibial anterior de rato,
injuriado por lesão incisiva. Observou-se que o padrão histológico do músculo lesado e tratado com ultra-som foi muito
diferente do padrão histológico do músculo lesado e não tratado (controle) e dos submetidos a tratamento simulado. A
reação inflamatória foi acelerada pelo uso do ultra-som, o que possibilitou uma remoção mais eficiente de fibras necróticas
no músculo tratado. O músculo tratado apresentou um maior número de vasos e fibras musculares recém-formadas. Os
dados demonstram que o ultra-som estimulou a regeneração muscular, com conseqüente diminuição de tecido fibrótico.
DESCRITORES: Ultra-som, tibial anterior, lesão muscular, regeneração muscular.
SUMMARY
ULTRASOUND-EFFECT ON THE RECOVERY OF INJURED RAT TIBIALIS ANTERIOR MUSCLE
The present work evaluated the therapeutic ultrasound effect on the recovery of the rat tibialis anterior muscle
injured by laceration. We observed that the histological pattern of the treated muscle was significantly different from the
control and sham-irradiated muscles. The ultrasound treatment accelerated the inflammatory reaction, with a more efficient
removal of necrotic fibers. The treated muscle showed a greater number of vessels and newly formed muscle fibers, as
compared to control muscles. Our data suggest that the ultrasound stimulated muscle regeneration, with consequent lesser
fibrotic tissue formation.
KEY WORDS: Ultrasound, tibialis anterior, muscular lesion, muscular regeneration.
1.INTRODUÇÃO
A regeneração é uma adaptação que ocorre
no músculo esquelético em resposta ao traumatismo.
Após trauma direto ou doença, a regeneração resulta
no restabelecimento da estrutura original e função do
músculo. Esse processo é bem descrito, embora pouco
seja conhecido sobre as interações celulares que o
controlam. A extensão e sucesso da regeneração
variam com a natureza da lesão, mas em todas as
situações a regeneração envolve revascularização,
infiltração celular, fagocitose do músculo necrosado,
proliferação de células precursoras do músculo e sua
fusão e finalmente reinervação.
O músculo esquelético pode ser danificado por
diferentes agentes incluindo lesão incisiva, aplicação
local de anestésico (Carlson e Faulkner, 1983),
amassamento e miotoxinas. Independentemente do
método utilizado para lesar o músculo, este sofrerá o
processo de reparo, que parece seguir passos comuns.
Inicialmente há um período de degeneração da fibra
muscular, caracterizado pela desorganização e
dissolução das unidades sarcoméricas, sarcossoma,
retículo sarcoplasmático e mionúcleo. Essa resposta
imediata é seguida por um estágio no qual ocorre
autólise dos componentes musculares lesados. A perda
do homeostase do cálcio é a ocorrência chave nesse
processo. A entrada de cálcio na célula ativa proteases
cálcio-dependentes, chamadas calpaínas, as quais
clivam proteínas miofibrilares e do citoesqueleto como
a miosina, actina, talina e vinculina (Fox et al., 1985).
A clivagem proteolítica de outras enzimas pela calpaína
pode induzir a amplificação da proteólise.
Os processos que se seguem a esses eventos
catabólicos levam à regeneração e reparo da fibra
muscular. Assim, pelo menos duas populações de
células respondem à injúria muscular: células
inflamatórias envolvidas na remoção de restos celulares
e células miogênicas envolvidas na reposição da fibra
danificada. A fagocitose das fibras lesadas é importante
para a regeneração efetiva do músculo, sendo esta
inibida pela persistência de tecido necrótico (Grounds,
(*) Professora Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular, UNIFENAS, C.P. 23, 37130-000Alfenas-MG, e-mail: [email protected]
(**) Acadêmico do curso de Fisioterapia, UNIFENAS, bolsista de iniciação científica FAPEMIG
(***)Professor IOCS UNIFENAS, C.P. 23, 37130-000, Alfenas-MG, e-mail: [email protected]
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C. M. C. P. GOUVÊA et al.
1987). A remoção do músculo necrosado é resultado,
principalmente, da fagocitose por macrófagos.
Neutrófilos que também são fagocíticos são
observados abaixo da lâmina basal, dentro das fibras
danificadas, 3 horas após a injúria focal e macrófagos
estão presentes após 6 horas (Papadimitriou et al.,
1990).
As células satélites, presentes abaixo da
lâmina basal, sobrevivem ao evento traumático inicial
e resistem ao ambiente deletério. Após a remoção dos
componentes celulares da fibra muscular lesada, as
células satélites são ativadas, dando origem a uma
população de mioblastos, os quais vão se fundir,
formando miotúbulos multinucleados, com núcleo
central, os quais se diferenciam em fibras musculares
maduras, com núcleo periférico. A integridade da
lâmina basal é importante para o sucesso da
regeneração e sua presença minimiza a formação de
fibrose (Mcgeachie e Grounds, 1987).
Como em qualquer tecido lesado, a
revascularização é um evento importante para a
formação de novas fibras musculares. A isquemia
prolongada e a baixa tensão de oxigênio favorecem a
proliferação de fibroblastos. Parece provável que a
eficiência da revascularização esteja relacionada à
extensão da fibrose após a lesão muscular (Tidball,
1995).
Os efeitos mecânicos, térmicos e químicos do
ultra-som ainda não estão completamente esclarecidos.
Sua aplicação, entretanto, leva a inúmeros bioefeitos,
que podem ser classificados em primários e
secundários. Os primários são as reações orgânicas
gerais que geralmente se manifestam ao nível vascular
e vegetativo. Em conseqüência das vibrações
longitudinais, características do ultra-som, um
gradiente de pressão é desenvolvido nas células
individuais. Como resultado desta variação de pressão
positiva e negativa, elementos da célula são obrigados
a se moverem, sentindo-se assim, um movimento de
micromassagem. Este efeito aumenta o metabolismo
celular, o fluxo sangüíneo e o suprimento de oxigênio.
Alguns efeitos não-térmicos são obtidos através do
ultra-som pulsátil, evitando-se a cavitação. A
predominância da micromassagem produz alteração
da permeabilidade da membrana celular, facilitando o
fluxo de nutrientes. Quando o ultra-som penetra nos
tecidos, ocorrem os efeitos biológicos devido à
absorção desta energia.
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O ultra-som tem sido utilizado por
aproximadamente 5 décadas para o restabelecimento
das funções e promoção da cicatrização de tecidos
moles danificados. Observações clínicas determinam
o uso do ultra-som em diversas situações, incluindo a
dor, bursite e traumatismo do músculo esquelético
(Gillete e Mitchel, 1991, Reher et al., 1997). Gillete e
Mitchel (1991) estudaram lesão muscular induzida por
anestésicos e observaram que o ultra-som diminuiu o
tempo para indução da regeneração muscular. Ensaios
com estimulação local de tecidos duros mostrou que
foi possível acelerar o reparo da fratura da fíbula
utilizando ultra-som de 1,5 ou 3,0 MHz, pulsátil, com
freqüência de 0,5 W/cm2 (Reher et al., 1997). Apesar
dessas observações, relativamente poucos trabalhos
de pesquisa têm sido relatados sobre os efeitos do ultrasom clínico ou outros recursos da fisioterapia e a
evidência da eficiência tem sido obtida, primariamente,
por parâmetros subjetivos (Wang et al., 1994). Para o
estabelecimento da eficiência de um tratamento
específico é imperativo que haja um parâmetro objetivo
mensurável que possa ser empregue para determinar
a eficiência do agente terapêutico (Dyson et al., 1976).
O presente trabalho teve como objetivo avaliar
o efeito do ultra-som terapêutico na regeneração e
reparo do músculotibial anterior de rato, que sofreu
lesão incisiva.
2.MATERIAL E MÉTODOS
2.1.Material animal
Neste estudo foram utilizados 30 ratos (Rattus
norvegicus) brancos machos Wistar, pesando 270 ±
30 g, obtidos do Biotério Central da UNIFENAS. Os
animais foram mantidos em gaiola e receberam
alimento e água ad libitum e foram divididos em três
grupos experimentais, com 5 animais por grupo: G1;
controle não tratado, G2, tratados com ultra-som e
G3, simulação do tratamento com ultra-som. O
experimento foi realizado em duplicata.
2.2.Lesão muscular
O músculo tibial anterior da pata direita foi
lesado através de uma incisão, com bisturi contendo
EFEITO DO ULTRA-SOM NA RECUPERAÇÃO DE MÚSCULO TIBIAL ANTERIOR...
duas lâminas com separação de 1 mm. O corte com 2
mm de profundidade estendeu-se por toda a largura
do músculo, na região mediana ventral.
2.3.Tratamento com ultra-som terapêutico
O tratamento com ultra-som foi conduzido
utilizando-se um aparelho KW com cabeçote reduzido.
Foi utilizada a freqüência de 1,0 MHz, com intensidade
de 0,5 W/cm 2, modo pulsátil 1:5, por 5 min. O
tratamento com utilização do ultra-som e simulação
foi iniciado 24 h após a indução da lesão muscular.
Os animais foram submetidos a eutanásia aos 3, 7 14
e 21 dias após a indução da lesão. O tratamento dos
animais foi realizado durante três dias, para os que
foram submetidos à eutanásia 3 dias após a indução
da lesão. Os animais submetidos à eutanásia aos 7
dias foram tratados por 5 dias, os de 14 dias foram
tratados por 10 dias e os de 21 dias foram tratados
por 15 dias. O músculo tibial anterior lesado foi
analisado em preparação histológica.
2.4.Análise histológica
A análise histológica foi utilizada para
determinar a extensão da regeneração e reparo. O
músculo removido foi fixado em formol 10% por dois
dias. A seguir incluído em parafina e os cortes (5 µm
de espessura) foram corados com hematoxilina-eosina.
2.5.Análise estatística
Os dados obtidos para os números de
macrófagos, vasos sangüíneos, fibroblastos e fibras
musculares novas dos três grupos experimentais foram
analisados estatisticamente por análise de variância
(one way ANOVA).
3.RESULTADOS
O tratamento com ultra-som favoreceu a
regeneração muscular avaliada através da análise do
padrão histológico aos 3, 7 14 e 21 dias após a indução
da lesão (Fig. 1, 2, 3 e 4). O grupo tratado com ultrasom mostrou um padrão histológico significativamente
diferente dos grupos controle e placebo (tratamento
simulado) e foram observadas três zonas distintas no
sítio da lesão em recuperação. Os animais tratados
com ultra-som apresentaram um padrão histológico
compatível com regeneração e pouco reparo tecidual.
A análise morfométrica do tecido muscular tratado
167
com ultra-som demonstrou poucas fibras necróticas
e neutrófilos, um reduzido número de macrófagos (38
± 3,88; p<0,1), um grande número de vasos (11 ±
1,13; p< 0,1) e fibroblastos (62 ± 3,53; p<0,1) e novas
fibras musculares (5 ± 0,35; p<0,001).) por µm2 de
tecido. O grupo com tratamento simulado apresentou
um padrão histológico semelhante ao controle.
A análise histológica do grupo controle
mostrou um padrão histológico com o descrito por
Huerme et al. (1991) e Kääriäinen et al. (1998). No
modelo de lesão por laceração, utilizado no presente
trabalho, foram observadas diferentes zonas após a
injúria. No grupo controle analisado aos 3 dias após
a indução da lesão (Figura 1), as extremidades do
músculo cortado sofreram retração das miofibras,
necrose das miofibras e houve formação de tecido de
granulação frouxo, com poucas células inflamatórias
e fibroblastos. Nos músculos de animais tratados
(Figura 1) houve a demarcação de uma área de
regeneração bem delineada, a partir da zona de
sobrevivência das fibras musculares que
permaneceram intactas.
Aos 7 dias após a indução da lesão, no grupo
controle a necrose das miofibras ainda foi evidente,
com maior número de fibroblastos e células
inflamatórias (Figura 2). Durante este período o tecido
conjuntivo da zona profunda se tornou
progressivamente mais denso e ao mesmo tempo
contraiu-se. Esse padrão não foi observado no grupo
tratado (Figura 2), no qual houve regeneração evidente
das miofibras.
A análise histológica do grupo controle feita
14 dias após a indução da lesão (Figura 3) mostrou a
presença de muitas células inflamatórias e o início da
maturação dos miotúbulos em miofibras, visíveis pelos
núcleos centrais, arredondados e cromatina
descondensada e pela estriação citoplasmática. No
grupo tratado (Figura 3) as fibras musculares em
regeneração praticamente preencheram toda a região
seccionada. Aos 21 dias após a indução da lesão
(Figura 4) as fibras musculares em regeneração
mostraram-se entrelaçadas com o tecido conjuntivo
compactado. No grupo tratado após este tempo
(Figura 4) houve a formação de uma estrutura
organizada de fibras interlaçadas.
Em todos os tempos analisados após a
indução da lesão (Figura 1, 2, 3 e 4) o padrão
histológico do grupo placebo foi muito semelhante ao
padrão histológico do grupo tratado.
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Figura 1. Corte transversal do músculo tibial anterior de rato, 3 dias depois de submetido à lesão incisiva,
corado com hematoxilina-eosina. A, controle, não tratado, B, tratamento simulado com ultra-som,
C, tratamento por 3 dias com ultra-som, 1, região superficial, 2, região intermediária, 3, região
profunda. Aumento 200x.
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Figura 2. Corte transversal do músculo tibial anterior de rato, 7 dias depois de submetido à lesão incisiva,
corado com hematoxilina-eosina. A, controle, não tratado, B, tratamento simulado com ultra-som,
C, tratamento por 5 dias com ultra-som, 1, região superficial, 2, região intermediária, 3, região
profunda. Aumento 200x.
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Figura 3. Corte transversal do músculo tibial anterior de rato, 14 dias depois de submetido à lesão
incisiva, corado com hematoxilina-eosina. A, controle, não tratado, B, tratamento simulado com
ultra-som, C, tratamento por 10 dias com ultra-som, 1, região superficial, 2, região intermediária,
3, região profunda. Aumento 200x.
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Figura 4. Corte transversal do músculo tibial anterior de rato, 21 dias depois de submetido à lesão incisiva, corad
com hematoxilina-eosina. A, controle, não tratado, B, tratamento simulado com ultra-som, C, tratamento p
15 dias com ultra-som, 1, região superficial, 2, região intermediária, 3, região profunda. Aumento 200x.
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C. M. C. P. GOUVÊA et al.
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4.DISCUSSÃO
Neste trabalho foi desenvolvido uma nova
modificação da injúria muscular por laceração, com
a separação das fibras musculares em cotos proximal
e distal e foram analisados os padrões histológicos
durante o processo de regeneração e/ou reparo do
músculo tibial anterior de rato em animais tratados
por ultra-som terapêutico e não tratados (controle).
Assim, o exame histológico da recuperação muscular
possibilitou relacionar os efeitos do ultra-som com
alterações biológicas durante o processo de
recuperação do músculo. Estes dados são muito
importantes, tendo em vista que foi utilizado um
protocolo de tratamento semelhante ao clínico e não
há dados disponíveis na literatura sobre o
acompanhamento do efeito do ultra-som ao nível
histológico ao longo do tempo.
O músculo tibial anterior foi considerado ideal
para esses estudos porque é de fácil acesso para a
cirurgia, apresenta-se ligado aos músculos vizinhos
pelo epimísio, o que previne que ele se destaque após
a transecção, ainda que parcial. As fibras musculares
são paralelas da origem proximal à inserção distal e
isto garante que a incisão corte todas as miofibras
uniforme e perpendicularmente ao sentido longitudinal
da fibra. A ausência de tendão no sítio da lesão
assegura que o processo de recuperação seja
caracterizado apenas pelas potencialidades do tecido
muscular e do tecido de cicatrização.
As alterações histológicas demonstraram que
o ultra-som induziu a capacidade de recuperação
muscular, com regeneração das fibras musculares e
pouca formação de tecido fibrótico. O tratamento com
ultra-som adiantou o processo inflamatório, sendo
assim, pró-inflamatório. Isto talvez tenha sido
importante para determinar a regeneração e menor
reparo muscular, pois é conhecido que a remoção
rápida de tecido necrótico estimula a formação de
miotúbulos e diminui a proliferação de fibroblastos
(Grounds, 1991). Além disso, o ultra-som estimulou
também a angiogênese, outro fator importante no
restabelecimento da lesão. O suprimento sangüíneo
adequado possibilita a melhor nutrição do tecido,
facilitando a presença das células de defesa. Isto foi
observado pela presença de neutrófilos e macrófagos,
no tecido tratado. A irrigação leva uma maior
circulação do sangue aumentando a tensão de
oxigênio. A alta tensão de oxigênio inibe a proliferação
de fibroblastos, o que provavelmente contribuiu para
a menor formação de tecido fibrótico nos animais
tratados. Kääriäinen et al. (1998), estudando o
processo de reparo do músculo sóleo de rato lesado
por laceração completa, demonstraram que este
músculo tem excelente capacidade de recuperação,
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com continuidade funcional, porém, houve formação
de tecido cicatricial, atrofia muscular e falhas
biomecânicas do músculo recuperado. O padrão
histológico do músculo tibial anterior não tratado
obtido no presente trabalho foi semelhante ao obtido
por Garret et al. (1984). Esses autores observaram a
formação de cicatriz densa no músculo extensor longo
dos dedos de coelho, 12 semanas após a indução da
lesão incisiva. A recuperação do tibial anterior em
um período de tempo menor que o observado por
outros autores sugere que este músculo apresenta boa
capacidade de recuperação, mesmo sem tratamento
local. No presente trabalho, aos 14 dias após a indução
da lesão, nos animais tratados as fibras musculares
em regeneração praticamente preencheram toda a
região seccionada e aos 21 dias formaram uma
estrutura organizada de fibras interlaçadas. Em uma
lesão como no presente modelo a reinervação deve
ter ocorrido em 3 semanas (Rantanen et al., 1995).
As maiores diferenças entre os grupos de
animais tratados e controle, ocorreram entre 3 e 7
dias após a indução da lesão. Nos animais do grupo
controle foi evidente o reparo tecidual, observado pela
presença de fibras musculares em degeneração e
fibrose. O padrão histológico do grupo placebo foi
semelhante ao controle, porém, apresentou menos
tecido fibrótico (diferença estatisticamente não
significativa), o que pode ser atribuído ao pequeno
efeito de massagem do ultra-som, mesmo desligado.
O modelo padronizado de lesão muscular por
laceração oferece uma forma confiável para estudos
de recuperação da lesão muscular e para outros
estudos decorrentes do processo de regeneração em
geral. Foi demonstrado que o ultra-som possibilita a
regeneração muscular, sugerindo que a funcionalidade
muscular foi reestabelecida. Estudos estão em
progresso para avaliar a dose efetiva do tratamento
com ultra-som.
5.CONCLUSÃO
Os resultados do presente trabalho permitem
concluir que o padrão histológico do músculo lesado
e tratado com ultra-som foi muito diferente do padrão
histológico do músculo lesado e não tratado (controle)
e dos submetidos a tratamento simulado. A reação
inflamatória foi acelerada pelo uso do ultra-som, o
que possibilitou uma remoção mais eficiente de fibras
necróticas no músculo tratado. O músculo tratado
apresentou um maior número de vasos e fibras
musculares recém-formadas. Os dados demonstram
que o ultra-som estimulou a regeneração muscular,
com conseqüente diminuição de tecido fibrótico.
EFEITO DO ULTRA-SOM NA RECUPERAÇÃO DE MÚSCULO TIBIAL ANTERIOR...
AGRADECIMENTOS
À FAPEMIG pela concessão de bolsa de
iniciação científica.
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