ESCOLA DE ENFERMAGEM WENCESLAU BRAZ APOSTILA DE LABORATÓRIO DISCIPLINA DE PARASITOLOGIA / 1º PERÍODO DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA / 2º PERÍODO MICROSCOPIA Msc Thomazine, GR Março 2006 1 ÍNDICE Introdução, 3 Parte mecânica, 3 Sistema óptico de iluminação, 4 Sistema óptico de observação, 4 Lente objetiva, 5 Uso do microscópio, 6 Uso da objetiva de 100X, 6 Término do trabalho, 6 Anexo a apostila: Comunicado Técnico da EMBRAPA Nº3, Nov/96, p.1-7. 2 APOSTILA 3 - MICROSCÓPIO ÓPTICO Introdução: O estudo de preparações citológicas (microbiológicas ou parasitológicas) exige sistemas ópticos adequados para observar as estruturas celulares. O aparelho mais comumente utilizado é o microscópio óptico que utiliza a luz comum. Um Microscópio basicamente compõe-se de : PARTE MECÂNICA: 3 PÉ ou BASE: Estrutura firme e relativamente pesada que se continua por um braço pelo qual o instrumento pode ser erguido. Esse braço apóia-se o sistema óptico de observação. TUBO ou CANHÃO: Na parte superior encontra-se a lente ocular e na parte inferior encontra-se a lente objetiva. REVÓLVER: No microscópio de uso comum que contém mais de uma lente objetiva, dispõe-se de um mecanismo acessório de rotação, o revólver, que permite facilmente substituir as objetivas. PLATINA: Uma pequena mesa, com uma abertura na parte central que serve de apoio para o material a ser observado. CHARRIOT: Dispositivo acessório que segura a lâmina através de uma garra, dá movimentação ao material a ser observado por meio de cremalheiras perpendiculares, e dá também o posicionamento do material focado por meio de escalas milimetradas. SISTEMA DE APROXIMAÇÃO: Encontra-se na coluna, permitindo a movimentação do sistema óptico em relação ao objeto. Consiste de dois parafusos, como comando externo bilateral, um destinado a movimentos relativamente grosseiros denominado MACROMÉTRICO e o segundo, mecanismo de enfoque de precisão denominado MICROMÉTRICO. SISTEMA ÓPTICO DE ILUMINAÇÃO ESPELHO: Espelho refletor de luz natural / artificial. FONTE LUMINOSA: Lâmpada colocada na região basal do microscópio. CONDENSADOR: É também possível aumentar a quantidade de luz que atravessa o objeto, tanto no caso da luz ser fraca, como no caso em que o aumento da objetiva exija raios mais intensos. Nesse caso utiliza-se o condensador, que concentra os raios luminosos. No sistema óptico o condensador tem por finalidade dar uma iluminação uniforme. É importante manter o condensador em altura ideal para as diferentes lâminas observadas. Portanto não deverá ser abaixado ou levantado com o propósito de alterar a intensidade da luz, esta deverá ser controlada pelo botão regulador da intensidade de luz. A variação de altura do condensador regula o contraste da imagem. SISTEMA ÓPTICO DE OBSERVAÇÃO LENTE OBJETIVA: Projeta a imagem do objeto colocado sobre a platina na lente superior (ocular). Essa imagem apresenta inversão lateral e horizontal. Para conseguir focalizar a imagem nesse nível é necessário usar os mecanismos de aproximação antes mencionados. LENTE OCULAR: É basicamente uma lupa que aumenta uma porção da imagem real, formada ao nível de diafragma. Para se obter o aumento real máximo obtido basta 4 multiplicar o número de vezes que aumenta a ocular pelo número de vezes que aumenta a objetiva. LENTE OBJETIVA: Limite de resolução é a menor distância que pode existir entre dois pontos que possam ser distinguidos como tais. A qualidade de uma lente objetiva encontra-se não tanto na sua possibilidade de aumentar a imagem do objeto, mas no poder de resolução que esta tenha. O limite de resolução de uma objetiva pode ser calculado pela seguinte fórmula: LR = K* λ A K= constante com o valor de 0,81 λ = comprimento de onda da luz empregada em µm (luz branca = 0,55µm) A = abertura numérica da lente em uso. A abertura numérica é proporcional ao ângulo máximo dos raios que atingem a lente e ao índice de refração do meio entre o objeto e a lente. Esta relação pode ser representada: A = n * senα n = índice de refração do meio α = ângulo que forma o raio mais externo captado pela lente As lentes objetivas trazem inscrições que especificam suas características. Exemplo: 10/032 160 - ou 10/0,32 160/0,17 10 = aumento de 10 vezes. 0,32 = valor da abertura numérica 160 = comprimento mecânico do tubo em mm (distância da rosca da objetiva até a ocular). 0,17 = espessura da lamínula que deve ser utilizada - = esta anotação indica que a objetiva é insensível a variações pequenas de espessura da lamínula. Denomina-se imersão a técnica pela qual se coloca um fluído entre a objetiva e o preparado, o que acarreta um aumento de A (abertura numérica). As objetivas de 100X são sempre de imersão. O n do ar é igual a 1,0 e o do óleo mineral é igual a 1,5. As lentes oculares também ampliam a imagem, de forma que o aumento total da imagem deve ser o resultado da multiplicação do aumento da ocular pelo aumento da objetiva. 5 USO DO MICROSCÓPIO Seqüência de passos para se efetuar observações ao microscópio óptico: 01-) Limpar a lâmina a ser observada e as lentes do microscópio. Para esta operação, utilize apenas lenço de papel. 02-) Colocar a menor objetiva na posição de foco. 03-) Elevar ao máximo a posição da platina. 04-) Colocar a lâmina sobre a platina (com a lamínula sempre voltada para cima). 05-) Ajustar o charriot de modo a centrar o material a ser observado no orifício da platina. 06-) Olhar pela ocular, ao mesmo tempo que se abaixa lentamente a platina, girando o parafuso do macrométrico, até que a preparação apareça focalizada. Os ajustes finais do focalização devem ser efetuados com o micrométrico. 07-) Deslocar a lâmina sobre a platina afim de efetuar observações em toda sua extenção, utilizando-se o charriot. 08-) Após obter uma boa focalização utilizar as objetivas de 10X e 40X. USO DA OBJETIVA DE 100X 01-) Após focar com a objetiva de 40X, colocar o revólver em posição intermediária, entre a objetiva de 40X e 100X. 02-) Colocar uma gota de óleo de imersão em cima da estrutura a ser obervada. 03-) Abaixar a objetiva de 100X e focalizar somente mexendo o micrométrico. TÉRMINO DO TRABALHO 01-) Abaixar totalmente a platina. 02-) Limpar a lâmina e a objetiva com lenço de papel. 03-) Desliga o botão de intensidade da luz. 04-) Efetuar limpeza no microscópio, conforme manda Comunicado Técnico Nº3, Nov/96, p.1-7. 6 INVESTIGAÇÃO DE MICRORGANISMOS POR MICROSCOPIA A procura por estruturas de bactérias, fungos ou protozoários deve ser minuciosa, com calma e atenção, no decorrer de toda a lâmina sempre utilizando o micrometro para a perfeita investigação nos diferentes planos (focos). Paciente 0000 Amostra 0000 Data: 31/02/2006 A lâmina deverá apresentar-se sempre etiquetada e bem identificada. A busca óptica por estruturas deverá ser sempre no sentido vai e vem, tomando cuidado para não passar várias vezes pelo mesmo campo. 7