2013.2 IMUNOLOGIA
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2013.2 IMUNOLOGIA Profª: Jamilie Sena 2 INTRODUÇÃO À IMUNOLOGIA AImunologia é uma ciência recente. Historicamente, o primeiro exemplo claro de manipulação do sistema imune sob condições controladas, foi o da vacinação bem-sucedida contra a varíola. Sua origem é atribuída, por alguns autores, a Edward Jenner, que, em 1796, verificou proteção induzida pelo cowpox (vírus da varíola bovina) contra a varíola humana, nomeando tal processo da vacinação. No entanto, é sabido que, na antiguidade, os chineses já inalavam o pó das crostas secas das pústulas de varíola ou as inseriam em pequenos cortes na pele, em busca de proteção. Fig. 1 Edward Jenner Em 1789 Jenner observou que as vacas tinham nas tetas feridas iguais às provocadas pela varíola no corpo de humanos. Os animais tinham uma versão mais leve da doença, a varíola bovina, ou bexiga vacum. Em 1796, resolveu pôr à prova a sabedoria popular que dizia que quem lidava com gado não contraía varíola. Ao observar que as mulheres responsáveis pela ordenha quando expostas ao vírus bovino tinham uma versão mais suave da doença, então ele conduziu sua primeira experiência com James Phipps, um menino de oito anos. Jenner inoculou com o pus extraído de feridas de vacas contaminadas recolhendo o líquido que saía destas feridas e o passou em cima de arranhões que ele provocou no braço do garoto. O menino teve um pouco de febre e algumas lesões leves, tendo uma recuperação rápida. A partir daí, o cientista pegou o líquido da ferida de outro paciente com varíola e novamente expôs o garoto ao material. Semanas depois, ao entrar em contato com o vírus da varíola, o pequeno passou incólume à doença. Estava descoberta assim a propriedade de imunização. No ano seguinte, ele relatou seu experimento à Royal Society - a Academia de Ciências do Reino Unido -, mas as provas que ele apresentou foram consideradas insuficientes. Ele realizou então novas inoculações em outras crianças, inclusive em seu próprio filho. Em 1798, seu trabalho foi reconhecido e publicado. No entanto, seus críticos procuravam ridicularizá-lo, denunciando como repulsivo o processo de infectar gente com material colhido de animais doentes. Mas as vantagens da vacinação, porém, logo se tornaram tão evidentes tornando imune à varíola humana, uma das doenças epidêmicas mais mortais da humanidade. A varíola só seria erradicada na década de 1980, de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Edward Jenner foi capaz de descobrir a vacina para essa doença que tanto matava naquela época. As vacinas foram sendo criadas para quase todo o tipo de doença, e está sendo uma das melhores coisas já criadas pelo homem, pois tem salvado a vida de muita gente. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 3 Fig. 1.2 Jenner injetando o material de uma pústula de varíola no braço de um menino de 8 anos. Quando Jenner introduziu a vacinação, ele nada sabia sobre os agentes infecciosos que causam as doenças. No século XIX, Robert Koch provou que as doenças infecciosas eram causadas por microorganismos patogênicos, cada qual responsável por uma determinada enfermidade ou patologia. Atualmente, existem quatro grandes categorias de microorganismos causadores de doença ou patógenos: os vírus, as bactérias, os fungos e os parasitas. Fig. 1.3 LuisPauter As descobertas de Koch e outros pesquisadores do século XIX possibilitaram odesenvolvimento da imunologia, estendendo a vacinação para outras doenças. Por volta de 1880, Louis Pasteur projetou com sucesso uma vacina contra a cólera aviária e desenvolveu uma vacina anti-rábica também bem sucedida na inoculação de uma criança mordida porum cão raivoso. Tantos triunfos práticos resultaram na busca pelos mecanismos de proteçãoimunológica. Pasteur, embora bem sucedido no desenvolvimento de vacinas, possuía muito poucoconhecimento sobre os mecanismos envolvidos no processo de imunização. Ele sugeriu queorganismos na vacina eram capazes de remover nutrientes essenciais do corpo e, assim,evitar o crescimento e proliferação dos agentes causadores de doença. Aproximadamentedez anos mais tarde, em 1890, Emil vonBehring e ShibasaburoKitasato demonstraram quea proteção induzida pelos processos de vacinação não se devia a remoção de nutrientes, masestavam associadas ao surgimento de fatores de proteção no soro dos indivíduos vacinados. Estas substâncias foram denominadas de anticorpos, as quais se ligavam especificamente e eram capazes de neutralizar os agentes infecciosos. Emil vonBehring recebeu, em 1901, oprimeiro prêmio Nobel em medicina pelo seu trabalho sobre a produção de anticorpos. A primeira grande controvérsia em imunologia surgiu quando Elie Metchnikoff demonstrouem 1882, primeiro em animais invertebrados e depois nos mamíferos, que algumas célulaseram capazes de “comer” microorganismos. Estas células foram denominadas de fagócitos, e ele propôs que elas compunham o principal mecanismo de defesa contra estesmicroorganismos. Ele sugeriu que os anticorpos apresentavam pouca importância nosistema imunológico. O conflito quanto à relevância dos fagócitos Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 4 e anticorpos foiresolvido em 1904 quando Almroth Wright e Joseph Denys demonstraram que osanticorpos eram capazes de se ligar a bactérias e promover a sua destruição pelos fagócitos. O sistema imune é o conjunto de células, tecidos, órgãos e moléculas que os humanos e outros seres vivos usam para a eliminação de agentes ou moléculas estranhas, inclusive o câncer, com a finalidade de se manter a homeostasia do organismo. Os mecanismos fisiológicos do sistema imune consistem numa resposta coordenada dessas células e moléculas diante dos organismos infecciosos e dos demais ativadores, o que leva ao aparecimento de respostas específicas e seletivas, inclusive com memória imunitária, que também pode ser criada artificialmente, através das vacinas. Na ausência de um sistema imune funcional, infecções leves podem sobrepujar o hospedeiro e levá-lo à morte. Porém, mesmo com um sistema imune funcional, o homem, por exemplo, pode adquirir uma doença infecciosa ou um câncer, pois a resposta imune específica, diante de um agente agressor, leva tempo para se desenvolver e, além disso, tanto organismos estranhos, como células neoplásicas, desenvolvem mecanismos de evasão para fugir da resposta imune. ÓRGÃOS, TECIDOS E CÉLULAS ENVOLVIDOS NA RESPOSTA IMUNITÁRIA Células que participam do sistema imunitário: As respostas imunes são mediadas por uma variedade de células e por moléculas que estas células expressam. Os leucócitos são as células que desempenham as principais ações, mas outras células, que se encontram nos tecidos, também participam da resposta imunitária, enviando sinais e recebendo estímulos dos leucócitos. As células que participam do sistema imunitário se originam na medula óssea, onde muitas evoluem para a fase adulta. A partir da medula, e por meio de vasos sanguíneos, elas migram junto com todos os elementos celulares do sangue. Inclusive as hemácias, que transportam o oxigênio, e as plaquetas que participam da coagulação, uma vez que estes elementos se originam das células-tronco progenitoras da medula. As células que derivam do progenitor mieloide e do progenitor linfoide são as que mais interessam para o entendimento das ações do sistema imunitário, de modo que, neste texto, não serão considerados os megacariócitos e os eritrócitos. O progenitor mieloide é o precursor dos granulócitos, fagócitosmononucleares (macrófagos), células dendríticas e mastócitos do sistema imune. Os macrófagos são as células fagocitárias mais relevantes. Estas células sãoa forma diferenciada dos monócitos sanguíneos, que se encontram estrategicamentedistribuída em vários tecidos para dar origem ao sistema fagocitário mononuclear. Os microgliócitos são os macrófagos do cérebro, as células de Kupffer são os macrófagos do fígado, os macrófagos alveolares fazem parte do tecido pulmonar, entre outros macrófagos residentes em diferentes tecidos. As funções dos macrófagos se caracterizam pela neutralização, ingestão e destruição de partículas, incluindo os biopatógenos, além de processar e apresentar antígenos para os linfócitos T. Neste contexto, são as células dendríticasas mais especializadas na captura e na apresentação de antígenos para os linfócitos T. As células dendríticas imaturas migram do sangue para residirem nos tecidos e realizam tanto a fagocitose quanto a micropinocitose. Após o encontro com um patógeno, maturam rapidamente e migram para os nódulos linfáticos, onde encontram o ambiente adequado para a apresentação de antígenos. Os granulócitos recebem essa denominação por possuírem grânulos em seu citoplasma que se coram densamente por corantes hematológicos tradicionais. São também chamados de leucócitos polimorfonucleares, devido às formasde seus núcleos. Existem três tipos de granulócitos, sendo eles os neutrófilos, os eosinófilos e os basófilos; todos com um tempo de vida relativamente curto e produzido em grande número durante as respostas inflamatórias. Os neutrófilos, assim como os macrófagos e as células dendríticas, sãorepresentantes do grupo de células fagocitárias do sistema imunitário, mas, diferentemente destas células, não apresentam antígenos para os linfócitos T. Os neutrófilos são os elementos celulares mais numerosos e importantes da resposta inata. Os Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 5 eosinófilos parecem ser importantes, principalmente na respostadiante de infecções parasitárias ou processos alérgicos, já que seu número aumenta no curso destas reações. A função dos basófilos provavelmente é similar e complementar à dos eosinófilos e mastócitos. Os mastócitos, cujo precursor parece ser comum aos basófilos, devido a semelhanças funcionais, também se diferenciam ao chegar aos tecidos onde residem. Eles se localizam principalmente à margem dos vasos sanguíneos e liberam mediadores que agem nas paredes vasculares quando ativados. O progenitor linfoide comum dá origem aos linfócitos. Os linfócitos sãoas células que reconhecem, especificamente, os antígenos. Sua morfologia típica consiste em uma pequena célula redonda com núcleo esférico. Apesar da aparência uniforme à microscopia ótica, vários tipos de linfócitos podem ser distinguidos com base nas suas propriedades funcionais e proteínas específicas que expressam. A distinção mais fundamental consiste na classificação destas células em duaslinhagens principais, conhecidas como linfócitos B e linfócitos T. Os linfócitos B, também chamados de células B (de bursa ou bolsa deFabricius, nas aves, e derivadas da medula óssea, nos mamíferos), quando ativados, proliferam e se diferenciam em células plasmáticas ou plasmócitos,que são as células efetoras da linhagem B, cuja função principal é a secreção de anticorpos. Os linfócitos T, ou células T (derivados do timo), se apresentam em duas classes principais. Uma se diferencia, quando ativada, em células T CD8+ ou citotóxicas, que matam as células infectadas, ao passo que a outra classe de células T, chamadas de células T CD4+ ou auxiliares, atuam na ativação de outras células, como os linfócitos B e os macrófagos, além de coordenar a resposta imunitária. O receptor de antígeno da célula B (BCR) é uma forma de anticorpo ligada à membrana que a célula B passa a produzir, após sua ativação e diferenciação em célula plasmática. Os anticorpos são moléculas agrupadas em uma classe de substâncias denominadas imunoglobulinas, e o receptor de antígeno do linfócito B é também conhecido como imunoglobulina de membrana. A imunidade humoral é a principal função das células B e dos plasmócitos, e consiste em secretar anticorpos no sangue e em outros líquidos orgânicos, resultando efeitos protetores, mediados por líquidos teciduais. O receptor de antígeno da célula T (TCR) constitui uma classe heterogênea de proteínas de membrana que, embora estejam relacionadas evolutivamente com as imunoglobulinas, são diferentes delas, já que estão adaptadas para detectar antígenos derivados de proteínas estranhas ou patógenos que entram nas células hospedeiras. Todavia, em contraste com as imunoglobulinas, os TCRs nunca são secretados, de modo que a célula T precisa migrar até as áreas de lesão para exercer seus efeitos protetores, por meio de contato direto com a célula alvo ou para influenciar as atividades de outras células do sistema imunitário. Juntamente com os macrófagos, as células T desenvolvem uma categoria de resposta imune denominada imunidade mediada por células. A maioria dos linfócitos virgens possui uma sobrevida muito curta,sendo programada para morrer em poucos dias após ter saído da medula óssea ou do timo. No entanto, se uma dessas células receber sinais indicando a presença de um imunógeno (antígeno que estimula uma resposta imuneespecífica), ela poderá responder por meio de um fenômeno conhecido como ativação, durante o qual pode sofrer vários ciclos de divisão celular. Algumas das células-filhas retomam ao estado de repouso, tornando-se célulasde memória, que podem sobreviver por vários anos. Estes linfócitos dememória representam uma grande proporção das células do sistema imunitário. A outra progênie do linfócito virgem ativado diferencia-se em células efetoras, que sobrevivem apenas alguns dias, mas que, durante este período, executam atividade que resultam em defesa. Outra classe de células linfoides, chamada de células matadoras naturaisou células natural killer (NK), é desprovida de receptores antígenoespecíficos, sendo parte do sistema imune inato. Essas células circulam Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 6 no sangue como grandes linfócitos, com diferentes grânulos citotóxicos, e sãocapazes de reconhecer e matar algumas células anormais, tais como células tumorais e células infectadas por vírus. E parecem ser importantes na defesa contra biopatógenos intracelulares na imunidade inata. CELULAS: Linfócitos: são mais comuns no sistema linfático. Os três tipos principais são: Linfócitos B: Células B produzem anticorpos que se ligam ao patógeno para sua posterior destruição. Células B também são responsáveis pelo sistema de memória ("guardam resposta contra um novo ataque do mesmo agente patógeno"). Linfócitos T Auxiliares ou (CD4+): coordena a resposta imune. Linfócitos T citotóxicos (ou CD8+): Destroem as células infectadas. Natural killers (ou NK): capazes de matar o vírus Morfologia: Geralmente os linfócitos entre os leucócitos do sangue são as menores células. Os linfócitos possuem núcleo esférico, preenchendo quase toda a célula, deixando o citoplasma com pequena área. O núcleo é bem maciço. Fig. 1.4 Linfócitos Linfócitos T e linfócitos B são indiferenciados pela microscopia, sendo portanto, diferenciáveis pelas técnicas imunocitoquímicas para detecção de receptores específicos de membrana. Neutrófilos: estão envolvidos na defesa contra infecção bacteriana e outros pequenos processos inflamatórios. Também são chamados Micrófagos e são o tipo mais abundante no sangue humano. São leucócitos polimorfonucleados, têm um tempo de vida médio de 6h no sangue e 1-3 dias nos tecidos e são os primeiros a chegar às áreas de inflamação, tendo uma grande capacidade de fagocitose. Morfologia: Seu núcleo é polilobulado geralmente apresenta três lóbulos ligados por um fino filamento nuclear. Seu citoplasma é abundante e possui grânulos finos dispersos. Os seus grânulos são divididos em primários e secundárias. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 7 Os primários aparecem no estágio promielócito. Os secundários (específicos) encontrados no estágio mielocitico e predominantes no neutrófilo maduro. Eosinófilos: são responsáveis pelo combate às infecções no corpo por parte de parasitas. É classificado comogranulócito por ter grânulos citoplasmáticos que podem ser visualizados através de microscopia de luz, seus grânulos são acidófilos (têm afinidade por corantes ácidos) e são corados pelo corante eosina. Morfologia: Seu núcleo contém dois lóbulos ligados por um fino filamento nuclear. Seu citoplasma é tomado por grânulos vermelhos-alaranjados. Macrófagos: Resulta da diferenciação dos Monócitos. Possuem grande capacidade fagocítica. Estão ausentes no sangue. Intervêm na defesa do organismo contra infecções. Também são ativos no processo de involução fisiológica de alguns órgãos. Morfologia: Têm núcleo presente. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 8 ÓRGÃOS Timo: é um órgão linfoepitelial e consiste em células epiteliais organizadas nas áreas corticais (parte externa) e medulares (central) que são infiltradas com células linfóides. O córtex é densamente povoado por linfócitos de várias dimensões. Está localizado no mediastino anterior. É vital contra a autoimunidade. É o órgão linfático mais desenvolvido no período pré-natal. Ele involui desde o nascimento até a puberdade. A função do timo é promover a maturação dos linfócitos T que vieram da medula óssea Morfologia: É um órgão dividido em dois lobos, o direito e o esquerdo, revestido por uma cápsula fibrosa, que vai penetrando pelo parênquima tímico e formando os septos conjuntivos que divide os lobos em inúmeros lóbulos. Cada lóbulo possui uma zona cortical e uma medular. Tanto a zona cortical quanto a medular apresentam células de estrutura epitelial misturadas com um grande número de linfócitos T (mais presentes na zona cortical). Fig. 1.4Zona cortical; Medular. Bursa de Fabricius: órgão linfóide, onde são formados os linfócitos B, responsáveis pela produção de anticorpos. É umdivertículo oval em forma de saco na zona dorsal da parede do proctodeu, uma parte da cloaca das aves. Os mamíferos não possuem bursa de Fabricius. Morfologia: Este tecido está dividido em lóbulos poliédricos (folículos) por septos de tecido conjuntivo. Cada folículo apresenta córtex e medula. Uma camada de células epiteliais indiferenciadas ocupa a periferia da medula, que é separada do córtex por uma camada capilar. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 9 Linfonodos: Atuam na defesa do organismo humano e produzem anticorpos. Quando o corpo é invadido pormicroorganismos, os linfócitos dos linfonodos, próximos ao local da invasão, começam a se multiplicar ativamente para dar combate aos invasores. Eles “filtram” a linfa que chega até eles, e removem bactérias, vírus, restos celulares, etc Morfologia: Os linfonodos são órgãos encapsulados constituídos por tecido linfóide e, em geral, apresentam o formato de um rim. O parênquima do linfonodo é dividido em: Região cortical: Nessa região, os linfócitos agrupam-se em formações arredondadas (folículos ou nódulos). As células predominantes na região cortical são os linfócitos B. Região medular: Nessa região, os linfócitos agrupam-se em cordões linfáticos, entre os quais se formam os seios medulares. Região paracortical: Situada entre as duas regiões já citadas, sem limites morfológicos precisos. Nela, há um predomínio de linfócitos T. Baço: É o maior dos órgãos linfáticos e faz parte do Sistema Retículo-Endotelial, participando dos processos dehematopoiese. Função: Formação de linfócitos, destruição de eritrócitos desgastados (hemocaterese), defesa do organismo contra invasores e armazenamento de sangue. O baço é o único órgão linfóide interposto na circulação sanguínea, por isso atua como um “filtro” para o sangue. Morfologia: O baço é um órgão compacto, intensamente corado de violeta (hematoxilina) devido à presença de uma infinidade de linfócitos. O baço tem dois compartimentos: Fig. 1.5Polpa Branca Esplênica e a Polpa Vermelha Esplênica. A polpa branca esplênica é constituída por cordões irregulares de tecido linfóide denso que se continua com os nódulos ou folículos linfáticos. A polpa vermelha esplênica é constituída por cordões esplênicos, separados por sinusóides. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 10 CONCLUSÃO As células do sistema imune são altamente organizadas como um exército. Cada tipo de célula age de acordo com sua função. Algumas são encarregadas de receber ou enviar mensagens de ataque, ou mensagens de supressão (inibição), outras apresentam o “inimigo” ao exército do sistema imune, outras só atacam para matar, outras constroem substâncias que neutralizam os “inimigos” ou neutralizam substâncias liberadas pelos inimigos”. ANOTAÇÕES _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ TIPOS DE IMUNIDADE A imunidade nada mais é do que a capacidade de resistir a organismos ou toxinas que tendem a lesar os tecidos e órgãos do ser humano. A imunidade divide-se em: Imunidade inata, que abrange: a fagocitose de agentes invasores por leucócitos e células do sistema de macrófagos teciduais; a destruição de microrganismos deglutidos pelas secreções ácidas do estômago e pelas enzimas digestivas; a resistência da pele à invasão por microorganismos; a presença no sangue de certos compostos químicos que se fixam aos microorganismos estranhos ou às toxinas, destruindo-os (lisozima, polipeptídios básicos, linfócitos citotóxicos naturais, etc.). Outra parte da imunidade é a Imunidade adquirida que faz parte do sistema imune especial formador de anticorpos e linfócitos ativados que atacam e destroem os microorganismos ou toxinas específicas. IMUNIDADE ADQUIRIDA A imunidade adquirida quase sempre pode conferir grau extremo de proteção. Por exemplo, a toxina tetânica, pode ter sua ação anulada em doses até 100.000 vezes a quantidade que seria letal sem imunidade. O organismo possui dois tipos básicos e estreitamente ligados de imunidade adquirida: imunidade humoral ou imunidade das células B, onde o organismo forma anticorpos circulantes, que são moléculas de globulina capazes de atacar o agente invasor. O outro tipo é a imunidade celular ou imunidade das células T, onde ocorre a formação de um grande número de linfócitos ativados, produzidos especificamente para atacar o agente invasor. IMUNIDADE HUMORAL É uma subdivisão da imunidade adquirida onde a resposta imunológica é realizada por moléculas existentes nosangue, denominadas de anticorpos, produzidos pelos linfócitos B, diferente da imunidade mediada por células, que são realizadas pelos linfócitos T. É importante no combate a organismos extracelulares e pode ainda haver participação de mastócitos/basófilos, com eliminação de grânulos contendo substâncias com atividade microbicida. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 11 Tipos de Imunidade humoral: Ativa natural: adquirida através de doença clínica ou subclínica Ativa artificial: adquirida por meio de vacinas Passiva natural: passagem de IgG por meio da placenta (congênita) Passiva artificial: passagem de anticorpos prontos (Ex. soro antitetânico) ANTÍGENOS A imunidade adquirida não ocorre até que haja uma primeira invasão. Cada toxina ou tipo de microrganismo contém quase sempre um ou mias compostos químicos específicos na sua estrutura que difere de todos os outros compostos. Em geral trata-se de proteínas ou polissacarídeos, sendo eles que desencadeiam a imunidade adquirida. Essas substâncias são conhecidas como antígenos. FUNÇÃO DOS LINFÓCITOS NA IMUNIDADE ADQUIRIDA A imunidade adquirida é o produto do sistema linfóide do organismo. Os linfócitos são essenciais para a vida humana. Os indivíduos com deficiência genética ou que tiveram seus linfócitos destruídos por irradiação ou substâncias químicas, não podem desenvolver qualquer imunidade adquirida. Os linfócitos localizam-se predominantemente nos linfonodos, mas também são encontrados em tecidos especiais, como o baço, áreas submucosas do tubo gastrointestinal e medula óssea. O tecido linfóide possui distribuição muito propícia no organismo para interceptar os microrganismos invasores ou as toxinas antes que possam disseminar-se extensamente. Ambos os tipos de linfócitos originam-se no embrião a partir de células-tronco hemopoéticas pluripotentes que se diferenciam e se tornam compromissadas para formar linfócitos. Eles ainda sofrem maior diferenciação da seguinte maneira: Os linfócitos destinados eventualmente a formar linfócitos ativados migram a princípio para o timo (linfócitos T). São responsáveis pela imunidade celular. A outra parte dos linfócitos, destinada a produzir anticorpos, é pré-processada pela medula óssea (linfócitos B). São responsáveis pela imunidade humoral. O PAPEL DO PRÉ-PROCESSAMENTO Felizmente, o mecanismo imune normalmente “reconhece” os tecidos da própria pessoa como totalmente distintos dos tecidos dos invasores, de modo que seu sistema de imunidade forma poucos anticorpos e células ativadas contra seus próprios antígenos. Esse fenômeno é conhecido como autotolerância aos próprios tecidos do corpo. A maior parte do mecanismo de tolerância ocorre durante o processamento dos linfócitos T no timo e linfócitos B na medula óssea. Existe também outro tipo de autotolerância que é formado pelas células T supressoras. Elas atuam quando ocorre uma reação auto-imune contra os próprios tecidos do organismo servindo numa espécie de feedback negativo a esta reação. Este processo ainda não foi totalmente elucidado. Falhas no mecanismo de tolerância causam as chamadas doenças auto-imunes. Geralmente, o processo de perda de parte da tolerância imune aos próprios tecidos ocorre com o avanço da idade. Exemplos mais clássicos de doenças auto-imunes estão o lúpus e o reumatismo. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 12 VACINAÇÃO A vacinação é um processo que provoca imunidade adquirida contra doenças específicas. A vacinação pode ser basicamente de três maneiras: utilizando microrganismos mortos, que não são mais capazes de causar doença, mas que ainda possuem seus antígenos químicos (utilizados basicamente em doenças bacterianas). O segundo tipo de vacinação utiliza-se de toxinas previamente tratadas com substâncias químicas, de modo que sua natureza tóxica tenha sido destruída, com preservação dos antígenos para causar imunidade (utilizados contra botulismo e demais doenças tóxicas). O terceiro tipo de vacinação utiliza-se de microrganismos vivos previamente “atenuados”. Esses microrganismos cresceram em meios de cultura especiais ou passaram por uma série de animais até sofrerem mutações suficientes para não causar mais a doença, mas ainda possuírem antígenos específicos (utilizados basicamente em doenças causadas por vírus). IMUNIDADE PASSIVA Toda imunidade adquirida discutida até o momento foi a imunidade ativa, ou seja, o próprio indivíduo desenvolveu anticorpos e linfócitos ativados em resposta à invasão por antígeno estranho. Contudo, pode-se obter imunidade temporária em um indivíduo sem injetar qualquer tipo de antígeno. Para isso, administram-se anticorpos, células T ativadas ou ambos, obtidos de outra pessoa ou de algum animal que tenha sido ativamente imunizado contra o antígeno. Os anticorpos permanecerão entre duas e três semanas e, durante esse tempo, a pessoa ficará protegida contra a doença invasora. Esta transfusão de anticorpos é chamada imunidade passiva. IMUNOGLOBULINA Anticorpos (Ac), imunoglobulinas (Ig), são glicoproteínassintetizadas e excretadas por células plasmáticas derivadas dos linfócitos B, os plasmócitos, presentes no plasma, tecidos e secreções que atacam proteínas estranhas aocorpo, chamadas de antígenos, realizando assim a defesa do organismo (imunidade humoral). Depois que o sistema imunológico entra em contato com um antígeno (proveniente de bactérias, fungos, etc.), são produzidos anticorpos específicos contra ele. Há cinco classes de imunoglobulina com função de anticorpo: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Os diferentes tipos se diferenciam pela suas propriedades biológicas, localizações funcionais e habilidade para lidar com diferentes antígenos. As principais ações dos anticorpos são a neutralização de toxinas, opsonização (recobrimento) de antígenos, destruição celular e fagocitose auxiliada pelo sistema complemento. IgM é a primeira imunoglobulina a ser expressa na membrana do linfócito B durante seu desenvolvimento. Na membrana das células B, a IgM está na forma monomérica. O primeiro anticorpo produzido numa resposta imune primária é sempre IgMpentamérica. IgD perfaz menos de 1% do total de imunoglobulinas plasmáticas e a função biológica precisa dessa classe de imunoglobulina é ainda incerta. A IgD é co-expressa com a IgM na superfície de quase todas as células B maduras. IgG é a imunoglobulina mais abundante no soro e está distribuída uniformemente entre os espaços intra e extravasculares. É o anticorpo mais importante da resposta imune secundária. Em humanos, as moléculas de IgG de todas as subclasses atravessam a barreira placentária e conferem um alto grau de imunidade passiva ao feto e ao recém-nascido. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 13 IgA é a imunoglobulina predominante nas secreções mucosserosas como saliva, colostro, leite e secreções traqueobronquiais e geniturinárias. IgE é encontrada nas membranas superficiais dos mastócitos e basófilos em todos os indivíduos. Essa classe de imunoglobulina sensibiliza as células nas superfícies das mucosas conjuntiva, nasal e brônquica. A IgE pode, ainda ter papel importante na imunidade contra os helmintos, embora nos países desenvolvidos esteja mais comumente associada a reações alérgicas como asma e febre do feno. Sistema completo O nome complemento foi originado a partir da atividade complementar deproteínas na ação bactericida de alguns Acs. O sistema complemento é um complexoproteico existente no plasma, sob a forma inativa, constituído por substânciastermolábeis e/ou termoestáveis; e que tem como função a eliminação de um agenteestranho pela ativação de mecanismos inespecíficos, que se constitui de: Fagocitose - quando algumas proteínas ativadas do complemento unem-se bactérias, opsonizando-as para ingestão pelos fagócitos portadores de raceptores do complemento; Reação inflamatória - quando os pequenos fragmentos de proteínas promovem eventos vasculares e recrutam fagócitos ao local da atividade inflamatória. Lise - quando uma vez desencadeada a cascata, os componentes terminaisdo complemento lesam certas bactérias, vírus e células com a formação deporos na membrana celular. Além dessas três funções, o sistema complemento também é responsávelpela depuração imune, que consiste na remoção de complexos imunes da circulaçãono baço e no fígado. Este sistema, com cerca de 30 proteínas ou mais, interage porativação enzimática. O complemento pode agir sozinho ou com Ac e são conhecidas3 vias, a clássica, a alternativa e a via das lectinas. A via clássica é ativada porcomplexos imunes, enquanto as vias alternativa e das lectinas são ativadas pormicrorganismos. Todas as vias de ativação convergem para uma etapa final de reação em cadeia denominada sequência comum ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS – ELISA Os estudos preliminares que tornaram passíveis de execução os métodosimunoenzimáticos foram realizados, simultaneamente, em 1966, por Nakane e Pierce, nos Estados Unidos, e por Avrameas e Uriel, na França, com autilização da peroxidase (horseradishperoxidase - HRP) para a confecção de conjugados proteicos, tendo como precursor o processo de marcação deproteínas com corantes fluorescentes, criado por Coons, em 1941. Em 1971, dois grupos de pesquisadores, um holandês, formado porVan Weemen e Schurs, e um sueco, formado por Engvall e Perlmann, idealizarame introduziram, pioneiramente, o método imunoenzimático para detecçãoe quantificação de antígenos ou anticorpos específicos. Estes grupos observaramque Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 14 proteínas poderiam ser imobilizadas em uma superfície sólida depoliestireno e a reação imune, ser revelada pela formação de produtos coloridosda reação enzima-substrato, na presença de um componente doador deelétrons, denominado cromógeno. O método ELISA, quando efetuado em ótimas condições (enzimasaltamente ativas, antígenos puros, substratos de alta qualidade, anticorpo econjugado), apresenta sensibilidade semelhante ao radioimunoensaio, com avantagem de não ser necessário utilizar material radioativo. Entretanto, essemétodo apresenta algumas desvantagens, pois alguns substratos usados nessas reações são teratogênicos e a presença de enzimas endógenas interferem nosresultados quando se usa células inteiras como antígenos. A reação é desenvolvida frequentemente em placas plásticas demicrodiluição (suporte), contendo séries de orifícios, onde são depositados osimunorreagentes, antígenos ou anticorpos, dependendo do objetivo do método. O processo de revestimento da placa com o imunorreagente adequadodenomina-se sensibilização. Para sensibilizar a placa deve-se tratar oimunorreagentecom solução alcalina, deixando-o com carga efetiva negativa, eassim promover, passivamente, a adsorção à placa por interações eletrostáticas (forças coulômbicas), as quais ocorrem em virtude das cargas positivas dopoliestireno ou polivinil (polyvinylchloride - PVC) utilizado para confeccioná-las. Além das placas de microdiluição de 96 cavidades, também são utilizadosoutros suportes, entre os quais, esferas de sefarose, esferas de poliestireno oude PVC, ou tubos de poliestireno ou PVC, que possibilitam a adsorçãoadequada da maioria dos imunorreagentes. As etapas de lavagem das placas de microdiluição interpõem-se às demaisetapas de execução do método e servem para retirar excessos de imunorreagentesnão ligados. Podem ser usados procedimentos manuais ou automáticos, que vãodesde o uso de jorradeiras contendo a solução de lavagem, ou de pente multicanaladaptado a um sistema de vácuo (lavadora semiautomática), até a utilização delavadoras de placas automáticas, que reduzem o tempo de realização do teste eproporcionam maior uniformidade ao processo. O revestimento da superfície interna da placa de ELISA, pelo menosno plano teórico, não é absoluto e, portanto, algumas regiões permanecemlivres de ligação. espaços devem ser ocupados com qualquer moléculaalheia ao sistema reacional, no sentido de reduzir, ou mesmo evitar, a ligaçãoinespecífica, não imune, de componentes da amostra, geradores de reaçõesindesejáveis que possibilitam falsas interpretações. A cobertura destes espaçosvazios é chamada de bloqueio. Entre as proteínas mais Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 15 empregadas nesta etapadestacam-se a soro albumina bovina (BSA), a ovalbumina e a caseína, além deum complexo proteico, como o soro de cobaia. Dependendo do material a ser pesquisado, pode-se conjugar antígenoscom enzimas (Ag-E) e anticorpos ou anti anticorpos com enzimas (Ac-E). Enzimas são macromoléculas de natureza proteica, com função biológicade alto poder catalítico de reações químicas e elevada especificidade aosubstrato correspondente. As mais usadas nestes testes são a fosfatasealcalina e a peroxidase. Para revelar a presença da enzima no complexo formado, utiliza-se umasolução reveladora, que consiste em um tampão adequado, onde se adicionamo substrato correspondente à enzima conjugada e um componente doador deelétrons (cromógeno). A enzima conjugada quebra o substrato e seus produtosatuam no cromógeno, alterando a coloração do sistema . Esquema do ensaio imunoenzimático ELISA indireto,para pesquisade anticorpos específicos A leitura da reação em condições de trabalho de campo pode ser feitade forma visual, simplesmente pela observação da alteração da coloração. Emcondição laboratorial utiliza-se espectrofotômetro apropriado para leitura dosorifícios das placas, que transforma a intensidade de cor em números. Quantomaior a leitura, maior será a concentração de enzima conjugada e,consequentemente, maior será a concentração da substância pesquisada emtécnicas não competitivas. O método ELISA pode ser classificado de acordo com sua atividadede amplificação, ou seja, por métodos diretos não competitivos, ou baseados em sua atividade moduladora, que são métodos competitivos. O ELISA direto é mais usado em imuno-histoquímica. Seu fundamentoconsiste na utilização de anticorpos primários marcados com enzima, que se combinam especificamente aos antígenos presentes em cortes histológicos. Aaplicação da solução reveladora destaca o material pesquisado. O ELISA indireto é empregado para a pesquisa de anticorpos, ondeamostras de soro ou plasma são colocadas para reagir com antígenos imobilizadosem uma fase sólida (placas de ELISA). Posteriormente, são revelados comauxílio de conjugado enzimático específico levando a formação de um produtocorado ao agir sobre substratos cromogênicos. Para pesquisa de antígenospresentes em material biológico, a amostra é posta para reagir com anticorposespecíficos imobilizados na fase sólida. O ELISA competitivo consiste na pesquisa de antígeno, onde oanticorpo é mobilizado na fase sólida e o antígeno correspondente compete com uma quantidade padronizada e marcado para sítios de combinação disponível. Nesse caso, a redução da reação indica maior quantidade de antígenona solução. Para pesquisar anticorpos, o antígeno é imobilizado e poderá seligar ao anticorpo da amostra ou ao já conhecido e marcado (conjugadoenzimático), para, assim, decrescer a intensidade de coloração da reação. Emambos os métodos competitivos (Figura 30), dois procedimentos podem serseguidos: a competição simultânea, cujo antígeno ou anticorpo marcado éadicionado junto com a amostra; ou a saturação sequencial, onde o antígenoou anticorpo é adicionado primeiro, seguido de uma incubação com oimunorreagente marcado. WESTERN BLOT – WB A técnica de Western Blotting, também chamada de immunoblottingou imunoeletrotransferência, é uma ferramenta de grande utilidade para acaracterização de antígenos, ou para pesquisa de anticorpos específicos paraum determinado componente antigênico. A técnica de WB baseia-se numa combinação de três métodos muitoaplicados em biologia molecular: a separação de macromoléculas através deeletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de duodecilsulfato desódio (SDS-PAGE); sua transferência eletrolítica para membranas (geralmentede nitrocelulose); e o ensaio de revelação, utilizando anticorpos ou proteínaA, marcados por enzimas, radionuclídeos, fluorocrômos, metais coloidais oucomplexobiotinina-avidina-peroxidase. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 16 Assim, as proteínas de um dado antígeno são separadas, transferidaseletroliticamente para membranas de nitrocelulose e postas a reagir com anticorposmarcados. No final, a reação antígeno-anticorpo é revelada por meio deimunocomplexos formados com proteínas definidas, e facilmente identificadaspelos seus pesos moleculares característicos. A origem do nome Western Blotting partiu de uma brincadeira acadêmicabaseada no nome Southern, do autor de um método de eletrotransferênciade fragmentos de ácidos nucleicos (DNA), que recebeu o nome de SouthernBlot. Pouco tempo mais tarde, Alwine e cols conseguiram fazer uma adequação na técnica de Southern Blotting, que se consistiu na eletrotransferência deácido ribonucleico (RNA), o qual, por sua vez, foi analisado através desondas de DNA. Assim, seguindo o princípio da brincadeira inicial, resolveusechamar a nova técnica de NorthernBlotting. Pouco mais tarde, em 1979,Towbin, Staehelin e Gordon desenvolveram o método de eletrotransferênciade proteínas. Para seguir a já então tradicional forma de referir-se ao métodoresolveu-se batizar a nova técnica de Western Blotting. A razão para transferirem-se proteínas, a partir de um gel de poliacrilamidapara uma membrana sintética, está na possibilidade de manuseio contínuo do material para análise, além de se poder trabalhar com vários reveladores aomesmo tempo, ou com sondas de elevado peso molecular, uma vez que apoliacrilamida não é um material muito adequado para que moléculas de grandetamanho sejam difundidas. As membranas mais utilizadas para o blotting são derivadas danitrocelulose. Apesar disso, elas são frágeis e apresentam uma baixa capacidadede ligação às macromoléculas eletrotransferidas. As membranas de nylonsão muito mais resistentes e ligam-se muito fortemente às proteínas. Suacapacidade de ligação é seis vezes maior que a das membranas de nitrocelulose. Sua limitação está relacionada a não impregnação por corantes, comumenteempregados na revelação de proteínas (azul de Comanssie e negro de amido), e à grande quantidade de reações inespecíficas, requerendo, assim,um bloqueio muito bem feito antes de se desenvolver o ensaioimunoenzimático para a revelação do Western Blotting. Outro aspecto muitoimportante é a porosidade da membrana. Recomenda-se a utilização demembranas com 0,45mm para o uso genérico e com diâmetros bastantemenores 0,2mm para estruturas proteicas, com pesos moleculares inferioresa 20 kDa. As melhores membranas, embora sendo bastante caras, são asde difluoreto de polivinilideno (PVDF). Elas combinam a excelente capacidade ligante e a resistência mecânica à manipulação necessária para a elaboração das fitas, contendo proteínas eletrotransferidas. Teste imunocromatográfico O dispositivo de imunocromatografia é composto de uma membranaporosa de celulose modificada e membranas absorventes acessórias de fibra devidro, contendo os elementos de reação, ajustadas em um invólucro plásticoapropriado com uma janela para se acrescentar a amostra de teste e outra paraleitura do resultado da reação. O princípio de funcionamento do testeimunocromatográfico baseia-se na reação específica antígeno-anticorpo e seconstitui por uma fase sólida (membrana porosa), onde estão imobilizadoselementos de captura, e por uma fase móvel, onde estão suspensos o conjugado(que pode ser a proteína A, ligada ao ouro coloidal ou outros conjugadosdisponíveis) e a molécula alvo da amostra. A fase móvel migra sobre a fase sólida por efeito de capilaridade,conduzindo o complexo formado entre a molécula alvo e o conjugado, que,por sua vez, será retido na linha de captura da fase sólida, formando umcomplexo macromolecular colorido visível ao olho humano. Caso a amostranão contenha a molécula alvo, esta linha de reação não se formará. Umasegunda linha de reação, denominada linha de controle, se forma pela capturado conjugado livre, que permite a confirmação da migração da fase móvel Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 17 Imuno-histoquímica A imuno-histoquímica (IHQ) reúne a interação antígeno anticorpo invitro, técnicas histológicas e reações químicas, em um método que permitedetectar diferentes estruturas de tecidos, revelados por diversos tipos de processosde visualização. É utilizada no diagnóstico anatomopatológico de váriasdoenças degenerativas ou parasitárias, bem como na identificação de estruturas normais em estudos de histologia básica. As técnicas de IHQ permitem alocalização de proteínas nas células de uma seção de tecido, fixados em formolou incluído em blocos de parafina. Existe, atualmente, a disponibilidade de umnúmero crescente de anticorpos para uso em IHQ, o que vem possibilitadouma maior precisão diagnóstica. Existem dois tipos de técnicas de imuno-histoquímica: Técnica direta- Os anticorpos primários são ligados a um marcadorapropriado, e o corte de tecido, que contém antígenos específicos,é incubado com o anticorpo durante algum tempo. Após a interaçãoentre os anticorpos e as proteínas, os anticorpos que não se ligaram são removidos por lavagem. Dependendo do marcador utilizado, aleitura da reação será realizada pela microscopia adequada; paramarcadores fluorescentes, por exemplo, o corte é observado pormicroscopia de imunofluorescência, enquanto para outros marcadores,utiliza-se a microscopia ótica convencional. Técnica indireta- Nesta técnica, se utiliza o anticorpo primárioespecífico para uma determinada proteína e para o anticorpo secundário, uma anti-imunoglobulina marcada que reconhece oanticorpo primário. O corte de tecido é incubado com o anticorpoespecífico para determinada proteína. Depois de lavado, é incubadocom o imunoconjugado, que se vai ligar ao anticorpo primário. Em seguida, há a observação por microscopia adequada, dependendodo marcador utilizado.A técnica de IHQ pode também estar associada a um processoenzimático de coloração, como ao complexo avidinabiotina-enzimacromógeno. O complexo é formado pela ligação de umamolécula de estreptavidina com várias de biotina associadas a uma enzima(peroxidase ou fosfatase alcalina), que tem como função a conversão deum cromógeno incolor em um produto final colorido. O cromógeno maisutilizado é o DAB (diaminobenzidina), que confere cor marrom-ferruginosaao precipitado permanente. O anticorpo marcado com a peroxidase pode se ligar a sítios teciduaisinespecíficos, prejudicando a resultado do exame. A utilização de proteínas inertes alheias ao sistema reacional, tais como soro fetal bovino, soro albuminabovina ou caseína, ao competirem com os sítios de ligação inespecíficos, reduzem a reação inespecífica. A peroxidase endógena, encontrada em diferentestecidos, também pode mascarar uma reação e deve ser inibida pelaincubação prévia do corte com peróxido de hidrogênio. A fosfatase alcalinaestá amplamente distribuída nos tecidos humanos e é encontrada em altasconcentrações na mucosa intestinal e nos túbulos proximais dos rins, entreoutros tecidos. A biotina endógena, assim como as outras proteínas utilizadasna IHQ, também é encontrada em tecidos, particularmente no fígado, pulmão, baço, tecido adiposo, glândula mamária, rim e cérebro. A atividade dabiotina pode ser suprimida pelo uso de tampões alcalinos, pela pré-incubaçãocom avidina ou com leite desnatado. A avidina é uma glicoproteína básica com PM de aproximadamente68 mil, obtida a partir da clara do ovo de várias espécies de aves. A moléculade avidina é quadrivalente e simétrica, onde cada lado da molécula contém umpar de receptores para a biotina. A estreptavidina, obtida a partir do Streptomycesavidinii, possui ponto isoelétrico próximo ao neutro e mantém as propriedadesde ligação da avidina sem apresentar prejuízos ao resultado final. O sistemaavidina-biotina permite a amplificação de sinal, pois muitas moléculas de biotina podem se ligar a um anticorpo. E a adição da avidina marcada com Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 18 corantesfluorescentes, ou com enzimas, resultam em uma amplificação da reação, facilitandoa visualização do corte corado. Preparação do tecido Tipicamente, amostras podem ser tomadas, tanto de um tecido biológico quanto de uma cultura de células. As amostras são resfriadas ou aquecidas rapidamente. Elas são homogenizadas por sonicação (quebra das células por ondas sonoras de alta freqüência) ou por força mecânica. O resultante é a mistura homogênea dos componentes da célula, e pode ser usado da forma que está ou sujeita a centrifugação em uma série de passos para se isolar as frações do material citosóico (material do interior da célula externo ao seu núcleo) e nuclear. Na amostra preparada é então quantificada, para que uma quantidade consistente de proteína possa ser retirada de cada amostra diferente. As amostras são fervidas de um a cinco minutos em uma solução tampão, contendo corante, um composto sulfuroso e um detergente conhecido como dodecil sulfato de sódio (SDS). A ebulição e o detergente desnaturam a proteína, desenovelando-a completamente. O SDS então cerca a proteína, deixando-a coberta por uma carga negativa, e o enxofre impede a formação de pontes de dissulfeto na proteína. Eletroforese em gel As proteínas da amostra são separadas de acordo com o peso molecular usando-se a eletroforese em gel. Géis têm várias formulações dependendo do laboratório, peso molecular das proteínas de interesse e tampões disponíveis, os géis de poliacrilamida são os mais comuns. Desde que as proteínas caminham apenas em uma direção ao longo do gel, as amostras são carregadas lado-a-lado em "valas" feitas no gel. As proteínas são então separadas por massa em "bandas" dentro de cada canaleta. Uma canaleta é reservada para um "marcador", ou ladder, uma mistura disponível comercialmente de proteínas de pesos moleculares conhecidos. Também é possível usar um gel 2-D que separa as proteínas de uma única amostra em duas dimensões e as proteínas são separadas na primeira dimensão de acordo com o ponto isoelétrico (pH no qual elas têm uma carga total igual a zero), e na segunda de acordo com seus pesos moleculares. Transferência A fim de fazer as proteínas acessíveis à detecção do anticorpo, elas são movidas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou de PVDF. A membrana é colocada face-a-face com o gel, e uma corrente elétrica é aplicada entre grandes placas de cada lado, então as proteínas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantém a mesma disposição que continham no gel. Como resultado desse processo de "borramento" (blotting em Inglês), as proteínas são expostas a uma fina camada para detecção (veja abaixo). Ambas as variedades de membranas são escolhidas por suas propriedades de ligar proteínas não especificamente (isto é, liga todas as proteínas igualmente bem). A ligação das proteínas à membrana é baseada tanto em interações hidrofóbicas quanto em interações de cargas entre a membrana e as proteínas. As membranas de nitrocelulose são mais baratas que as de PVDF, porém são mais frágeis e não suportam bem a repetidas amostragens. Bloqueio Desde que a membrana foi escolhida por sua habilidade de ligar proteínas, passos precisam ser feitos para impedir as interações não específicas entre a membrana e o anticorpo usado para a detecção da proteína alvo. O bloqueio da ligação não específica é alcançado pondo-se a membrana em uma solução diluída de uma proteína - tipicamente albumina de soro bovino (BSA) ou leite seco desnatado, com uma pequena quantidade de detergente como Tween 20 ou carbono coloidal. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 19 Detecção Durante o processo de detecção testa-se a membrana com anticorpos da proteína de interesse, e se liga eles com uma enzimareveladora, a qual leva a uma mudança de cor ou sinal fotométrico. Por uma variedade de razões, isto tradicionalmente toma lugar em processo de dois passos, embora existam métodos de detecção de um passo disponíveis para certas aplicações. Método de dois passos Anticorpo primário: Anticorpos são gerados quando uma espécie hospedeira ou uma cultura de células imunes são expostos à proteína de interesse (ou a uma parte dela). Normalmente uma parte da resposta imune é colhida e usada como ferramenta de detecção específica e sensível que se liga à proteína diretamente - por isso anticorpo primário. Depois de bloqueada a membrana, uma solução diluída do anticorpo primário (geralmente entre 0,5 e 5 microgramas/mL) é encubada com a membrana sobre leve agitação. Tipicamente, a solução é composta de uma solução salina tamponada, e às vezes com BSA ou leite em pó. A solução de anticorpos e a membrana podem ser seladas e incubadas juntas de 30 minutos a uma noite. Também podem ser incubadas em diferentes temperaturas, com temperaturas mais altas sendo associadas com mais ligações, tanto específicas à proteína alvo (o sinal) e não específicas (o ruído). Anticorpo secundário Depois de se enxaguar a membrana para remover o anticorpo primário não ligado, ela é exposta a outro anticorpo, direcionado a porções espécies-específicas do anticorpo primário. Este é conhecido como anticorpo secundário. Ele geralmente é ligado a biotina ou a uma enzima reveladora como por exemplo fosfatase alcalina. Esse passo confere a vantagem de que vários anticorpos secundários se ligarão a um anticorpo primário, providenciando um sinal intensificado. Mais comumente, uma peroxidase - ligada secundariamente é usada em conjunção com um agentequimioluminescente, e a reação produz fluorescência proporcionalmente à quantidade de proteína. Um filme fotográfico é colocado contra a membrana, e exposta à luz da reação é criada a imagem dos anticorpos ligados ao blot. Com os procedimentos ELISPOT e ELISA, a enzima pode ser provida com uma molécula substrato que será convertida pela enzima a um produto colorido de reação que será visível na membrana (veja a figura acima com as bandas azuis). Uma terceira alternativa é usar um marcador radioativo acoplada ao anticorpo secundário, por exemplo marcando uma proteína capaz de se ligar ao anticorpo como a proteína A de Staphylococcus com um isótopo radioativo de iodo. Desde que outros métodos são mais seguros, mais rápidos e mais baratos; isto caiu em desuso. Método de um passo Historicamente, o processo de sondagem era feito em dois passos por causa da relativa facilidade em se produzir anticorpos primários e secundários em diferentes processos. Isso dá aos pesquisadores e corporações grandes vantagens em termos de flexibilidade, e adiciona um passo de amplificação ao processo de detecção. Dado ao advento da análise em larga escala de proteínas e menores limites de detecção, contudo, tem havido o interesse de se desenvolver sistemas de sondagem em um passo os quais permitam o processo ocorrer mais rapidamente e com um menor material consumido. Isso requer um Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 20 anticorpo sonda que reconheça tanto a proteína de interesse e que tenha uma marcação detectável (sondas que estão freqüentemente disponíveis para seqüências proteicas conhecidas). A sonda primária é incubada com a membrana de uma forma similar àquela do anticorpo primário do processo de dois passos, e então está pronta para a detecção direta depois de uma série de passos de lavagem. Depois das sondas não ligadas serem lavadas, o Western blot está pronto para a detecção das sondas marcadas e ligadas à proteína de interesse. Em termos práticos, nem todos os Westerns blots revelam proteínas em apenas uma banda da membrana. Aproximações de tamanho são tomadas pela comparação das bandas coloridas àquelas do marcador ou ladder carregado durante a eletroforese. O processo é repetido para uma proteína estrutural, como actina ou tubulina, que não devem mudar entre amostras. A quantidade de proteína alvo é indexada à proteína estrutural para o controle entre grupos. Essa prática garante a correção do total de proteína na membrana no caso de erros ou transferência incompleta. Detecção colorimétrica O ingenuo da detecção colorimétrica depende da incubação do Western blot com um substrato que reage com a enzima reveladora (com a peroxidase) que é ligada ao anticorpo secundário. Isso converte o corante solúvel em uma forma insolúvel de uma cor diferente que precipita próximo à enzima e então colore a membrana de nitrocelulose. O desenvolvimento da mancha é então parado lavando-se o corante solúvel. Os níveis de proteína são avaliados por densitometria (o quão intensa a mancha é) ou espectrofotometria. Quimioluminescência Os métodos de detecção quimioluminescentes dependem da incubação do Western blot com um substrato que fluoresce quando exposto à enzima reveladora no anticorpo secundário. A luz é então detectada por um filme fotográfico ou mais recentemente por câmeras CCD as quais capturam uma imagem digital do Western blot. A imagem é analisada por densitometria, a qual avalia a quantidade de proteína colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade óptica. Novos softwares permitem uma análise mais além da informação como a análise do peso molecular se padrões apropriados forem usados. A detecção de quimioluminescência ampliada é considerada entre os métodos mais sensíveis para análise em blot. Detecção radioativa Marcadores radioativos não requerem substratos enzimáticos, mas em vez disso permitem a colocação de filmes médicos de raios-Xdiretamente contra o Western blot, o qual exposto à sonda cria regiões escuras as quais correspondem às bandas da proteína de interesse (veja a imagem à direita). A importância dos métodos de detecção radioativa está declinando, porque são muito caros, apresentam riscos à saúde e à segurança e a detecção quimioluminescente prevê uma alternativa mais útil. Detecção fluorescente A sonda marcada fluorescentemente é excitada por luz e a emissão da excitação é então detectada por um fotosensor como uma câmera CCD equipada com filtros de emissão apropriados os quais capturam uma imagem digital do Western blot e permitem uma análise mais além dos dados como a análise do peso molecular e uma análise quantitativa do Western blot. Fluorescência é considerada entre os métodos mais sensíveis para análise em blot. Uma diferença marcante entre membranas de nitrocelulose e de PVDF diz relação à habilidade de cada uma de suportar a revelação dos anticorpos e de reusar a membrana para sondas subseqüentes de anticorpos. Enquanto existem protocolos bem estabelecidos disponíveis para a revelação de membranas de nitrocelulose, a mais dura PVDF permite uma revelação mais fácil, e mais reuso antes do ruído de fundo limitar os experimentos. Outra diferença é que, diferente da de nitrocelulose, a de PVDF precisa sem Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 21 embebida emmetanol 100% ou isopropanol antes do uso. As membranas de PVDF também tendem a ser mais densas e muito mais resistentes ao dano decorrido da manipulação normal. O teste confirmatório de HIV emprega um Western blot para detectar o anticorpo anti-HIV na amostra de soro humano. Proteínas de células conhecidas infectadas com o HIV são separadas e "blotadas" em uma membrana como acima. Então, no soro a ser testado é aplicado o anticorpo primário no passo de incubação; o anticorpo livre é lavado, e um anticorpo antihumano secundário é ligado, e uma enzima reveladora é adicionada. As bandas impregnadas então indicam os anticorpos do soro dos pacientes marcados com o anticorpo anti-humano. Um Western blot também é um teste definitivo para a doença da vaca louca. Algumas formas do teste da Doença de Lyme empregam o Western blot. GLOSSÁRIO DE IMUNOLOGIA ADCC Citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Lise de células-alvo através da ação de anticorpos e neutrófilos, macrófagos ou células nulas. Adjuvante Material que facilita a resposta imune normal. Afinidade Medida da força de ligação entre um sítio de combinação de anticorpo e um determinante anti gênico. É calculado através da lei de ação das massas e é expressa em litros de mol. Aglutinação Ajuntamento de antígenos particulados tais como bactérias ou eritrócitos pela ação de anticorpos. Alérgeno Antígeno que estimula a produção de anticorpos reagínicos. Alergia Termo que atualmente engloba qualquer conseqüência adversa, imunologicamente mediada, devido a exposição a antígenos, mas que deveria ser restrita à descrição da hipersensibilidade imediata (Tipo I). Aloenxerto Enxerto entre animais alogênicos. (O termo homoenxerto foi anteriormente empregado neste sentido). Alogênico Genéticamente diferente porém da mesma espécie. Alotipo Determinantes antigênicos geneticamente controlados encontrados em moléculas de proteínas dealguns indivíduos de uma espécie. Anafilaxia Forma de hipersensibilidade imediata (Tipo I) mediada pôr anticorpos reagínicos e resultante da liberação aguda de agentes farmacologicamente ativos por mastócitos ou basófilos. Pode ser lo cal ou sistêmica. Anergia Ausênsia de imunidade mediada por células (usualmente uma resposta de hipersensibilidade tardia) em um animal que foi sensibilizado. Animal gnotobiótico Animal que é estéril ou contaminado com uma população conhecida de bactérias. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 22 Anticorpo Imunoglobulinas formadas em resposta à introdução de material dentro do corpo que é por ele reconhecido como estranho. Sua propriedade característica é combinar-se com o material indutor (antígeno) em condições fisiológicas. Anticorpo bloqueador Anticorpo não citotóxico, não fixador de complemento que, através do revestimento de células, pode protegê-las contra a destruição mediada por células. Anticorpo reagínico Anticorpo que media a hipersensibilidade tipo I , isto é , IgE e algumas subclasses de IgG. Anticorpos citofílicos Imunoglobulinas que são capazes de se ligar a receptores celulares devido a um sítio específico em sus região Fc. Anticorpos homocitrópicos Termo que inclui anticorpos citofílicos e todos os anticorpos que se ligam especificamente a células na mesma espécie, como aquelas em que eles são produzidos. Por convencão, o uso desse termo é restrito àqueles anticorpos que se ligam a mastócitos ou basófilos e ediam a hipersensibilidade tipo I, isto é, anticorpos reagínicos. Anticorpos incompletos A nticorposque , embora possam se ligar a partículas antígênicas, são incapazes de agregá-las e provocar sua aglutinacão. É preferível o termo anticorpos não aglutinantes. Estes podem ser detectados através de um teste de antiglobulina. Antígeno Material que pode provocar uma resposta imune. Antígeno histocompatibilidade de Antígenos encontrados na superfície de células nucleadas característicos de um indivíduo que provocam rejeição de aloenxerto e regulam as repostas imunes. Antígenos heterófilos Determinantes antigênicos amplamente distribuídos e encontrados na natureza, por exemplo, em bactérias, plantas e várias espécies de animais. Atopia Termo usado para descrever a tendência herdada para desenvolver hipersensibilidade imediata (Tipo I) encontrada em alguns seres humanos e cães. Auto-anticorpo Anticorpo dirigido contra determinantes antigênicos dos constituintes do próprio animal. Avidez Termo confuso usado por alguns para descrever uma propriedade do anticorpo que determina a velocidade com que ele reage com o antígeno, mas usado por outros para se referir á força de combinação de um antígeno. Bacterina Preparação de bactérias mortas usada para imunização. Blastogênese Produção de células em divisão. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 23 "Capping" Agregação de moléculas de membranas celulares a uma região restrita da superfície de uma célula. Carregador Molécula imunogênica à qual está ligado um hapteno. Célula efetora Célula que realiza uma função especifica. Célula matadora natural (NK) Célula linfóide mal definida encontrada em animais normais e capaz de destruir células infectadas por tumores ou vírus. Células K (killer) Linfócitos não-T e não-B que podem destruir células-alvo através da citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Células nulas Linfócitos aos quais faltam marcadores de superfície de células T ou B. Clone População de células ou organismos idênticos provenientes de uma única célula ou organismo precursor. Complemento Sistema de proteínas, razoavelmente complexo, ligado a enzima e auto agregador que é ativado por vários fatores, em particular pela interacão antígeno-anticorpo, e que resulta numa ampla variedade de conseqüências biológicas tais como lise de menbrana celular e opsonização. Conglutinina Constituinte do soro bovino, não relacionado com as imunoglobulinas, que se combina com o terceiro componente fixo do complemento. Se este C3 fixo é ligado a uma partícula como um eritrócito, então a conglutinina fará o eritrócito se agregar, caracterizando uma reação conhecida como conglutinação. Doença auto-imune Doença causada por resposta imune dirigida contra os próprios tecidos do animal. Endotoxina Componente lipopolissacarídico da parede celular de bactérias gramnegativas que possui atividade inespecífica. Exotoxina Proteínas solúveis secretadas por bactérias vivas ou liberadas pelo citoplasma de organismos mortos e que têm um efeito tóxico específico. São usualmente produzidas por organismos gram-positivos. Facilitação Prolongamento da sobrevida de um aloenxerto ou a facilitação do crescimento tumoral permitido pelos anticorpos bloqueadores. Fagocitose É o ato de comer realizado pelas células. O termo compreende vários processos, inclusive quimiotaxia, aderência ingestão e digestão ede partículas. Fator reumatóide Auto-anticorpo dirigido contra imunoglobulina normal. É encontrado em muitas doenças auto-imunes, especialmente na artrite reumatóide e no lúpus eritematoso sistêmico. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 24 Floculação Forma de reação de precipitação observada quando se usa soro eqüino como fonte de anticorpo que dá o precipitado é relativamente restrita. Gamaglobulina O grupo de proteínas plasmáticas que tem a mais lenta mobilidade eletroforética. É dentro deste grupo que os anticorpos (imunoglobulinas) são encontrados. Globulinas Proteínas precipitadas pela adição de um volume igual de solução saturada de sulfato de amônio ao soro. Hapteno Molécula não protéica que pode se ligar a sítios específicos de combinação de anticorpos mas não pode, pôr si só, iniciar uma resposta imune. Hemadsorção Agregação de eritrócitos à superfície de células animais, em meio de cultura, após infecção por vírus. Hemaglutinação Agregação de eritrócitos pôr anticorpo ou vírus. Hemaglutinação viral É o agregamento de células vermelhas que ocorre em presença de certos vírus como resultado na ligação de vírus e estas células. Hibridoma Linhagem celular cultivada e formada pela fusão de células de mieloma com células B produtoras de anticorpo. Hipersensibilidade imediata Hipersensibilidade mediada pôr anticorpos reagínicos em que a administração de antígeno produz uma resposta detectável dentro de segundos ou minutos. Hipersensibilidade tardia. Reação da pele a um antígeno injetado, mediada pôr células. Assim denominada porque a reação não atinge a intensidade máxima até 24 a 48 horas após a administração do antígeno Um exemplo disso é a reação de tuberculina. Idiotipo Variabilidade antigênica de uma população de moléculas de proteína dentro de um animal. Esse tipo de variação é observado nas imunoglobulinas e está associado a diferentes seqüências de aminoácidos nos sítios de combinação de anticorpos. Imunização Em sentido escrito é a administração de antígeno a um animal com a intenção de produzir imunidade protetora. Entretanto, atualmente vem sendo comumente usada para descrever o procedimento para induzir uma resposta imune. Imunoconglutininas Auto-anticorpos dirigidos contra o terceiro ou quarto componentes fixos do complemento. Quando estes componentes do complemento são fixados a partículas, a presença de conglutininas pode provocar sua agregação. Isto é chamado anticonglutinação. Imunógeno Substância que é capaz de suscitar uma resposta imune. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 25 Imunoglobulinas Classe de proteínas que possuem atividade de anticorpo. Inibição da hemaglutinação Inibição da hemaglutinação viral mediada pôr anticorpo especifico contra o vírus. Interferons Grupo de proteínas de baixo peso molecular capaz de interferir na replicação viral e de regular a atividade imune. Isotipo Variabilidade antigênica entre proteínas relacionadas, encontradas em todos animais da mesma espécie. Pôr exemplo, as diferenças antígenicas entre subclasses de imunoglobulinas são isotípicas. Lectinas Proteínas, usualmente de origem vegetal, que se ligam a monossacarídeos específicos. A maioria das lectinas usadas em imunologia estimula a proliferação de linfócitos quando se liga a açucares de menbrana celular. Linfocinas Glicoproteínas obtidas de linfócitos, as quais controlam as atividades de outras células. Deste modo elas servem para regular muitos aspectos das respostas imunitárias.. Microrganismo patogênico Microrganismo que tem a capacidade de provocar doença em animais susceptíveis. Mieloma Tumor de plasmócitos. Mitógeno Substancia que estimula a proliferação celular. Monocinas São produtos protéicos de fagócitos mononucleares que influenciam as atividades de outras populações celulares. Opsonina Substância que se liga a partículas e facilita sua fagocitose. Pinocitose Literalmente é o ato de beber realizado pelas células. Prinofílico. Corado em rosa pela pironina. A pironina tem afinidade pôr RNA e assim detecta ribossomos no citoplasma celular. Uma vez que os ribossomos estão associados com a síntese protéica, uma célula com citoplasma pirinofílico é uma célula sintetizadora de proteínas Precipitação O agregamento de moléculas de antígenos solúveis pelos anticorpos para produzir um precipitado visível. Este contém tanto antígenos como anticorpos. Premunição Forma de imunidade observada nas infecções pôr protozoários e alguns helmintos que depende da presença contínua do parasita. A superinfecção é evitada enquanto os parasitas persistem no hospedeiro mas a imunidade desaparece rapidamente após a eliminação do parasita. Proteínas de Bence Jones Proteínas encontradas na urina de indivíduos com mieloma. Precipitamse na urina ao aquecê-la até cerca de 60ºC e redissolvem-se em Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 26 temperaturas maiores. Estas proteínas são usualmente cadeias leves de imunoglobulinas. Prozona Ausência da reação imunológica detectável em um sistema de teste na presençã de baixas diluiçôes de anti-soro de alto título. Isto pode ser devido a um largo excesso de anticorpo ou à inibição da aglutinação pelo complemento ou anticorpo não aglutinante. Quimera Animal que foi populado com sucesso, naturalmente ou artificialmente, pôr células alogênicas. Quimiotaxia Movimento de células ou organismos sob a influência de um estímulo quimico externo. Este pode ser positivo ou negativo. Reação anafilactóide Sindrome de choque aparentemente semelhante à anafilaxia mas que não é imunológicamente mediada. Reação de Arthus Reação inflamátória local mediada pôr complexo antígeno-anticorpo (hiperssensibilidade Tipo III) na pele. ReaçõesShwartzman Reações tóxicas e endotoxinas bacterianas em que ocorre coagulação intravascular local ou sistémica. A reação é precipitada pela ativaçâo da via alternativa do complemento. Resposta anaminéstica Resposta imune secundária. Otermo é geralmente aplicado a uma resposta secundária que ocorre após um tempo considerável depois da primeira exposição ao antígeno. Singênico Geneticamente idêntico. Soro Fluido amarelo claro que surge quando o sangue se coagula e o coágulo se contrai. Sorotipo Suptipo dentro de um grupo de organismos que pode ser identificado somente por técnicas sorológicas. Teste de antiglobulina Teste que emprega um anticorpo dirigido contra imunoglobulinas para aglutinar partículas carregadoras de anticorpos não aglutinantes em sua superfície. Também chamado teste de Coombs, segundo o veterinário que o desenvolveu. Teste de Coombs Veja teste de antiglobulina. Teste de hemaglutinação passiva Teste de hemaglutinação provocada pôr anticorpo dirigido contra um antígeno artificialmente ligado à superfície de eritrócitos. Pode também ser chamado de hemaglutinação indireta. Título Medida do número de unidades de anticorpo pôr unidade de volume do soro. É usualmente expresso como a recíproca da diluição do soro no último tubo em uma série de diluições crescentes que mostram o efeito desejado. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena 27 Tolerância Falha do sistema imune em responder a um antígeno específico. Toxóide É a modificação de uma toxina de modo que sus toxicidade é destruída mas não sua imunogenicidade. Usualmente isto é conseguido tratando a toxina com formaldeído. Vacina autógena Vacina preparada a partir de organismos causadores de doença num indivíduo ou população e subsequentemente usada nesse mesmo indivíduo ou população para estimular a imunidade, tendo em vista auxiliar sua recuperação. Isto pode ser últil quando a imunidade é altamente linhagem específica. Vacina mista Vacina contendo uma mistura de diferentes antígenos usada com a intenção de promover imunidade contra vários microrgarnismos ou toxinas através de uma única injecção. Pôr exemplo, as vacinas contra cinomose canina, hepatite infecciosa e leptospirose podem ser satisfatoriamente combinadas em vacina mista. Vacinação A administração de antígeno (vacina) em u animal com intenção de estimular uma resposta imune protetora. Virulência Este termo é usado para quantificar a potência da produção de doença pôr um microrganismo patogênico particular. Xenoenxerto Enxerto entre indivíduos xenogênicos, isto é, indivíduos de espécies diferentes. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ABBAS, A. K. ; LICHTMAN, A. H. ; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. 6.ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008. BACAL, N. S, FAULHARER, M. H. W. Aplicação prática em citometria de fluxo. São Paulo: Atheneu, 2003. BENJAMINI, E. ; COICO, R. ; SUNSHINE, G. Imunologia. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. DUARTE, R. Ensaio imunoenzimático (ELISA) para identificação experimental de fontes alimentares em PanstrongylusmegistusBurmeister, 1835 (Hemiptera: Reduviidae). Dissertação (Mestrado). Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 1997. FERREIRA, W.; ÁVILA, S.L.M. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-imunes. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001 FORTE, W. N. Imunonolgia básica e aplicada. Editora Artmed. 2004. Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena
