Diagnóstico das infecções virais [Modo de Compatibilidade]

26/04/2012
DIAGNÓSTICO
LABORATORIAL
DAS VIROSES
Profª Dra. Maria Luzia da Rosa e Silva
UFJF - ICB- DPMI
Por quê fazer ???
• Comprovação laboratorial da presença do
vírus no paciente
1- Detectar o patógeno.
2- Detectar um produto do patógeno
3- Detectar uma resposta imune
● Identificação do patógeno → tratamento
Situações em que é
importante uma definição:
manejo do paciente (rubéola/gestante)
intervenção quimioterápica possível
(herpesvírus, HIV, HBV, HCV)
medida de Saúde Pública: controle do
vetor (dengue e febre amarela); vacinação
(raiva, pólio, sarampo, rubéola)
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diferenciar doenças que apresentam
quadros
clínicos
semelhantes:
mononucleose, citomegalovirose
e
rubéola
busca de um agente etiológico para
determinada doença: descoberta da
maioria dos vírus
Diagnóstico de doenças virais em humanos:
1ºs métodos: sorológicos (detecção de Ags/Acs)
1929: FC – Acs VVZ e vaccínia
1º isolamento de patógenos humanos em CC: Weller e Enders,
1948 – grande avanço no diagnóstico.
CC: padrão de referência (gold standard) para o
diagnóstico de muitas viroses
Outros avanços:
1970: Acs monoclonais ( reagentes com alta especificidade)
1980: testes para diferentes viroses utilizando Acs
monoclonais
1985: PCR
final da década de 1990: PCR em tempo real
Para se fazer um
diagnóstico seguro:
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1- Coleta adequada do
material :
local da colheita depende dos sinais e
sintomas e do conhecimento da
patogenia da doença (sítio da replicação
e excreção viral)
2- Época da coleta:
logo após aparecerem os primeiros
sintomas (na fase aguda da doença),
quando normalmente o vírus é encontrado
em
grande
quantidade.
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Processamento da amostra para inoculação em
sistemas hospedeiros:
- adição de mais antibiótico e antifúngico
- centrifugação para retirada de restos celulares e
contaminantes
Para o diagnóstico sorológico:
Soro fase aguda (sfa): 1ºs dias da doença
Soro fase convalescente (sfc): 2 a 4 semanas depois
Teste para IgM: apenas amostra sfa
Estocagem: 4ºC (Igs estáveis em soro/plasma)
- 20 ºC ou - 70 ºC: estoque prolongado
3- Transporte
*isolamento viral: importante manter a viabilidade da partícula
partículas virais são instáveis a fatores ambientais:
transporte: solução salina balanceada e tamponada, pH 7,2,
com ATB e antifúngico
armazenamento: manter o material refrigerado, sem
congelar e enviar imediatamente para o laboratório .
estocagem: consultar sobre condições ideais para o agente
suspeito
* Para longas distâncias: gelo seco.
Junto ao material, enviar a ficha do
paciente (nome, sexo, idade, descrição do
material, época da colheita, suspeita clínica,
histórico de vacinas, situação epidemiológica da
doença na zona residencial , do trabalho ou
proximidades, viagens para locais endêmicos,
etc...)
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Métodos utilizados no Diagnóstico Virológico
1- isolamento e identificação do vírus
2-sorologia: detecção de Ags ou Acs
3- detecção direta da partícula viral
4- amplificação de ácidos nucléicos virais
Diagnóstico Laboratorial das
Viroses:
Método Clássico: isolamento, identificação,
sorologia
Método Rápido (kits): sorologia, detecção direta,
amplificação de AN virais (confirmar suspeita
clínica)
CLÁSSICO:
1-isolamento (depende do cultivo
hospedeiro: CC, animais, OE)
em
sistema
2-identificação do vírus (reações sorológicas com Acs
específicos: EIE, aglutinação, IF, WB, testes
imunocitoquímicos)
3-sorologia pareada: confirmação de que o vírus isolado
é o causador da doença.
Conversão Sorológica: comprovação do aumento
significativo do nível de Acs específicos
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Rápido:
necessidade de um resultado rápido
(detecção direta no material)
1- :detecção direta da partícula viral: ME, IME
2- detecção de Ags virais ou Acs: EIE, AL, IF
*Acs: condição imunológica do paciente
IgM específica: infecção recente
3- detecção do genoma viral: EGPA, PCR, hibridização
4- esfregaços de células infectadas: coloração por
Giemsa e hematoxilina: na MO presença de inclusões
(citoplasma ou núcleo): identificação presuntiva ou
confirmação (Ex: corpúsculos de Negri – vírus da raiva)
Diagnóstico Sorológico:
⇒ método indireto para o diagnóstico da infecção viral
muito utilizado nos
casos em que o
isolamento viral é
difícil ou não
disponível
Aglutinação em látex
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Imunofluorescência
Imunofluorescência
Teste de Neutralização
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Inibição da Hemaglutinação
Fixação do
Complemento
Aglutinação
Passiva
Ensaio
imunoenzimático
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Western Blot - WB
Diagnóstico Molecular
⇒ identificação de sequencias únicas do ácido
nucléico viral
VANTAGENS DAGENOTIPAGEM SOBRE A FENOTIPAGEM
-Alta capacidade de diferenciação (gênero/espécie/estirpe, etc)
-Capacidade de processamento de múltiplas amostras
simultâneas.
-Resultados em poucas horas.
-Alta sensibilidade e especificidade para amostras com poucos
microorganismos ou com mistura de microorganismos
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A BIOLOGIA MOLECULAR PROCURA O PATÓGENO
Presença/ausência (Detecção): CMV, EBV, HAV, VZV, Dengue,
Adenovírus, HIV, HCV, HBV ou Influenza (suína, frango, outras)
Outras utilidades:
Determinação dos Genótipos virais (HCV)
Identificar diferentes estirpes virais (Dengue 1,2,3,4)
Determinação da carga viral (HIV, HCV...)
Pesquisar contaminações em IMUNOBIOLÓGICOS
Reação em Cadeia da Polimerase - PCR
PCR em Tempo Real - qPCR
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PCR em Tempo Real - qPCR
Sequenciamento
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