Encefalomielite equina do leste no Distrito Federal e entorno

Acta Scientiae Veterinariae, 2015. 43: 1268.
RESEARCH ARTICLE
ISSN 1679-9216
Pub. 1268
Encefalomielite equina do leste no Distrito Federal e entorno
Eastern Equine Encephalitis on Federal District of Brazil and Surrounding Areas
Susy Karoline Hermes de Sousa1, Luciana Sonne2, Fabiano José Ferreira de Sant’Ana1 & Janildo Ludolf Reis Jr.1
ABSTRACT
Background: Eastern equine encephalitis (EEE) is a highly lethal zoonotic disease caused by Eastern equine encephalitis
virus (EEEv), an RNA virus of the genus Alphavirus, family Togaviridae. The transmission of these alphaviruses is through
mosquitoes, mainly species of Culex, Aedes, Anopheles and Culiseta. Horses and humans are considered accidental hosts
and the main reservoirs are birds and some wild rodents. The disease has been identified in Brazil by serological studies,
but investigations with clinico-pathological descriptions are scarce. The present study aimed to describe the epidemiology
and clinical-pathological findings of four cases of EEE in horses from Midwestern Brazil.
Materials, Methods & Results: Four confirmed cases of EEE in horses from the necropsy and histopathology files of the
Laboratory of Veterinary Pathology (LPV) of the University of Brasília (UnB) were reviewed. Cases occurred between
January 2005 and April 2012. Samples of brain and spinal cord samples were fixed in formalin 10%, processed routinely
for histopathology, and stained by hematoxylin and eosin (HE). Immuno-histochemistry (IHC) with the peroxidase streptoavidin-biotin method was done to confirm the diagnosis of EEEv infection in all cases. The slides were incubated with
the anti-EEEv monoclonal primary antibody (overnight, 1:100 dilution). The disease affected both young and adult horses.
One case occurred in the summer and the other three in the fall. Clinical signs more frequently observed included circling,
blindness, paresis, paralysis, somnolence, ataxia, head pressing, and recumbence. Clinical course varied from two to fifteen
days (average eight days). Gross findings were not observed at necropsy of the four horses. The main histopathological
changes were noted in the telencephalic lobes, thalamus and basal nuclei, and included multifocal meningoencephalitis,
necrotizing vasculitis, thrombosis, swelling of endothelial cells, gliosis, neuronal necrosis, and neuronophagia. In all cases,
moderate, granular, and positive immunoreaction to EEEv was observed in perikaryon of neurons, astrocytes and inflammatory cells (mainly lymphocytes) of the perivascular cuffs. Similar reaction was observed in the brain of positive control
horse. EEE diagnosis was confirmed by immunohistochemistry.
Discussion: In the current study, the four cases of EEEv infection occurred in the summer and fall, suggesting seasonality
of the disease. In Midwestern Brazil, these periods present high rainfall indices facilitating the proliferation and survival of
the vector insects. Similar epidemiological features were observed in other outbreaks of the disease elsewhere. All horses
of this study presented typical clinical signs of neurological disease, as detected in other investigations carried out in Brazil
and United States of America. Usually, no gross lesions are noted in EEE cases. When these gross changes are observed,
traumatic hemorrhages can be observed. Histopathology and IHC findings were conclusive for the diagnosis of EEE. This
study demonstrates, for the first time, that EEE occur in the Distrito Federal of Brazil, and in one neighboring city. These
results enlarge the Brazilian areas with clinico-pathological description of this important arboviral disease and reinforce
the importance of keeping in place epidemiologic and anatomopathological investigations across the country for control
and prevention of these infectious diseases.
Keywords: neuropathology, eastern equine encephalitis virus, epidemiology.
Descritores: neuropatologia, vírus da encefalite equina do leste, epidemiologia.
Received: 26 October 2014
Accepted: 20 March 2015
Published: 17 April 2015
Laboratório de Patologia Veterinária, Universidade de Brasília (UnB), Campus Universitário Darcy Ribeiro, Brasília, DF, Brazil. 2Setor de Patologia
Veterinária, Faculdade de Veterinária (FaVet), Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Porto Alegre, RS, Brazil. CORRESPONDENCE:
J.L. Reis Jr. [[email protected] - +55 (61) 3107-2829]. Universidade de Brasília (UnB). Campus Universitário Darcy Ribeiro. Laboratório de Patologia
Veterinária (LPV), L4 Norte, Asa Norte. CEP 70910-900 Brasília, DF.
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S.K.H. Sousa, L. Sonne, F.J.F. Sant’Ana & J.L. Reis Jr. 2015. Encefalomielite equina do leste no Distrito Federal e entorno.
Acta Scientiae Veterinariae. 43: 1268.
INTRODUÇÃO
hematoxilina-eosina (HE). Amostras adicionais de 1
cm de espessura do telencéfalo frontal, tálamo, cerebelo
e medula espinhal cervical foram encaminhadas para
diagnóstico virológico de raiva (imunofluorescência
direta e inoculação intracerebral em camundongos). Para
a confirmação do diagnóstico de infecção pelo EEEv, foi
realizada a técnica de imuno-histoquímica (IHQ) pelo
método estreptavidina-biotina peroxidase. Os cortes
foram incubados com anticorpo primário monoclonal
anti-EEEv (clone ab64285)1, “overnight”, em uma diluição de 1:100 utilizando o kit comercial Universal Dako
LSAB® (K0690)2; a reação foi revelada com o cromógeno DAB3 (3,3’- diaminobenzidina). Os cortes foram
contracorados com Hematoxilina de Harris. Como
controle positivo foi utilizado fragmento histológico de
encéfalo de equino naturalmente infectado oriundo de
um surto de EEE [18]. Como controles negativos, em
cada protocolo, o anticorpo anti-EEEv foi aplicado em
fragmentos de encéfalos de equinos negativos e sem lesões de EEE. Adicionalmente, cortes da mesma amostra
usada como controle positivo foram utilizados em cada
protocolo, sendo aplicado soro de camundongo hígido
em substituição ao anticorpo anti-EEEv.
A encefalomielite equina do leste (EEE) é uma
virose zoonótica causada pelo Eastern equine encephalitis virus (EEEv), um RNA vírus do gênero Alphavirus
pertencente à família Togaviridae [9]. É transmitida por
mosquitos, principalmente dos gêneros Culex, Aedes,
Anopheles e Culiseta e representa zoonose de alta
letalidade, sendo os equinos e humanos hospedeiros
acidentais, e tendo como principais reservatórios os
pássaros e alguns roedores silvestres [3,15].
A infecção pelo EEEv tem sido confirmada
esporadicamente em equinos no Brasil por avaliações
sorológicas e/ou virológicas em Minas Gerais [13],
Bahia [1], Pernambuco [6], São Paulo [16], Pantanal
[12], Paraná [8], Pará [5,10] e Paraíba [2]. Entretanto,
casos clínicos com descrição das alterações clínico-patológicas e confirmação laboratorial da encefalomielite
equina do leste em equinos são pouco diagnosticados
em todo o país, conforme observado recentemente nas
regiões Nordeste [18] e Norte [4]. Adicionalmente,
dados oficiais brasileiros da incidência da enfermidade
não estão disponíveis [3]. Casos humanos de infecção
pelo EEEv são descritos com pouca frequência, mas
costumam ser fatais [1], enquanto que na América do
Sul, há apenas um relato humano no Brasil e outro em
Trinidad e Tobago e, na América do Norte, a enfermidade humana é mais frequente, provavelmente devido
às características patogênicas do agente e vetores
envolvidos nessas regiões [20].
O presente trabalho objetiva descrever as características epidemiológicas, clínicas e patológicas
de quatro equinos com encefalomielite equina do leste
oriundos do Distrito Federal (DF) e entorno goiano,
entre 2005 e 2012.
RESULTADOS
Os dados epidemiológicos e clínicos dos quatro
animais diagnosticados com EEE encontram-se resumidos na Tabela 1. Em cada caso, um equino de cada
propriedade morreu ou foi sacrificado após manifestação
dos sinais clínicos neurológicos. Na propriedade do caso
2, um potro da égua afetada também apresentou sinais
clínicos semelhantes. Na propriedade do caso 3, também
já havia morrido um cavalo e um potro com o mesmo
quadro clínico. Na necropsia do equino do caso 4,
observaram-se numerosas escaras cutâneas nas regiões
úmero-rádio-ulnar, cabeça (principalmente próxima às
órbitas) e pélvica. Adicionalmente, esse animal apresentou bexiga acentuadamente distendida. Nos demais
casos, não foram observadas alterações macroscópicas.
O exame histológico de todos os casos revelou lesões mais acentuadas nos telencéfalos frontal e
parietal, tálamo e núcleos basais, principalmente na
substância cinzenta. Alterações de menor gravidade
afetaram o telencéfalo occipital, ponte, bulbo, mesencéfalo e cerebelo. A medula espinhal apresentou
lesões discretas em apenas um animal (equino 4) e
em nenhum equino foram detectadas alterações no
hipocampo. Observaram-se manguitos perivascu-
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram revisados quatro casos confirmados de
EEE em equinos a partir de pesquisa nos arquivos de
necropsias e exames histopatológicos do Laboratório
de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade de
Brasilia (UnB), durante o período de janeiro de 2005 a
abril de 2012. Dados relativos à epidemiologia, sinais
clínicos e lesões macroscópicas foram obtidos nos
respectivos protocolos e laudos arquivados.
Em todos os casos, foram coletadas amostras
de encéfalo e medula espinhal que foram fixadas em
solução de formol tamponado a 10%, processadas
rotineiramente para histopatologia e coradas pela
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lares multifocais leves a acentuados de linfócitos,
neutrófilos e macrófagos ocasionais, que afetavam
principalmente o neurópilo e, em menor intensidade,
a leptomeninge. Outras lesões comumente encontradas eram vasculite necrotizante linfoplasmocítica
multifocal leve a moderada (Figura 1) com formação de pequenos trombos e tumefação de núcleos
de células endoteliais, especialmente em arteríolas
de pequeno calibre e capilares, e gliose multifocal
leve a moderada (Figura 2). Adicionalmente, dois
equinos (1 e 4) apresentaram áreas focais de necrose
neuronal no telencéfalo (Figura 3) e núcleos basais,
e de neuronofagia e astrogliose nos fragmentos mais
afetados. Notou-se gliose de Bergman multifocal leve
no cerebelo do equino 2.
Em todos os casos, foi observada imunomarcação positiva moderada e granular para EEEv no pericário de neurônios, astrócitos e células inflamatórias
(principalmente linfócitos) presentes nos manguitos
perivasculares (Figura 4), de aspecto similar ao visualizado no controle positivo. O controle negativo não
apresentou imunomarcação.
Tabela 1. Dados epidemiológicos e clínicos de quatro equinos com encefalomielite equina do leste oriundos do Distrito Federal (DF) e entorno goiano,
entre 2005 e 2012.
Caso Ano
Mês
Município
Raça
Idade
Sexo
Curso
clínico
Sinais clínicos
Abril
Brasília/DF
SRD
Adulto
F
4 dias
Deambulação progressiva,
torcicolo e torneio
Padre
Bernardo/GO
SRD
8 meses
M
12 dias
Pressão da cabeça contra
obstáculos e cegueira
M
2 dias
Decúbito lateral, paresia que
progrediu para paralisia de
membros torácicos e pélvicos, prostração e apatia
M
15 dias
Déficits de propriocepção
e ataxia
1
2005
2
2010 Outubro
3
2011
Maio
Guará/DF
4
2012
Março
Brasília/DF
Mangalarga
6 meses
Marchador
SRD
5 anos
SRD: sem raça definida; F: fêmea; M: macho.
Figura 1. Equino 4, telencéfalo parietal. Há vasculite linfocítica moderada
com tumefação de células endoteliais (HE, obj. 40X).
Figura 2. Equino 3, tálamo. Nota-se gliose multifocal moderada (HE,
obj. 20X).
3
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Figura 3. Equino 1, telencéfalo parietal. Observa-se três neurônios
necróticos com picnose nuclear e citoplasma retraído e eosinofílico
(HE, obj. 40X).
Figura 4. Equino 4, telencéfalo frontal. Exame imuno-histoquímico com
anticorpo anti-EEEv revela linfócitos perivasculares e alguns neurônios
adjacentes ao manguito com imunomarcação positiva (Contracoloração
com hematoxilina de Harris, Obj. 40X).
DISCUSSÃO
equinos, conforme citado por outros autores [3,7,14,19].
Áreas de hemorragias na leptomeninge e medula espinhal podem ocorrer em alguns casos da doença [4], mas,
usualmente, lesões circulatórias macroscópicas ocorrem
devido aos traumatismos e não em função da ação do
EEEv sobre o sistema nervoso central.
As alterações microscópicas detectadas no
presente estudo foram muito semelhantes às observadas
em outras investigações e ocorreram especialmente na
substância cinzenta [4,7,14,18,19]. Alguns autores citam que o infiltrado inflamatório, em casos de infeção
por EEEv em equinos, é predominante de linfócitos T
[7], embora no início da infecção ocorra predomínio de
neutrófilos [14]. Nos quatro casos do presente trabalho, o
diagnóstico foi confirmado pela imuno-histoquímica com
a reatividade positiva ao anticorpo anti-EEEv no pericário
de neurônios, astrócitos e linfócitos perivasculares. Dados
imuno-histoquímicos muito similares foram notados em
estudos realizados nos Estados Unidos [7,17].
O diagnóstico diferencial foi realizado especialmente com raiva, leucoencefalomalacia, infecção
por herpesvírus equino-1 (EHV-1), mieloencefalite equina protozoária (MEP) e intoxicação por
Crotalaria retusa, que são as principais enfermidades
neurológicas de equinos do Brasil. Os resultados
virológicos negativos descartaram a possibilidade de
raiva, enquanto que a ausência de milho e derivados
contaminados na alimentação, bem como a falta de
malacia na substância branca não indicou o diagnóstico
de leucoencefalomalacia. Não foram observadas lesões
macroscópicas e histológicas indicativas de MEP.
C. retusa não é uma planta comumente encontrada
Os quatro casos de EEE da presente investigação ocorreram no verão e outono, sugerindo sazonalidade da doença, visto que esses períodos apresentam
maior precipitação pluviométrica no Centro-Oeste
brasileiro, o que favorece a manutenção e proliferação
dos insetos vetores. Conforme observado nos casos
desses estudos, muitos surtos de infecção equina por
EEEv em regiões tropicais ocorrem no final do período
chuvoso e início do outono, quando há aumento da
população de vetores [3,4,11,18].
Três equinos deste estudo eram oriundos de
diferentes propriedades do DF e de uma do entorno
goiano. Os animais eram de ambos os sexos, bem como
de raças variáveis. Todos os equinos apresentavam
quadro clínico condizente com afecção neurológica, incluindo incoordenação, paresia e paralisia de membros,
decúbito lateral, deficiência de propriocepção, ataxia,
pressão da cabeça contra objetos, torneio e cegueira,
com curso que variou de 2-15 dias. Dados clínicos
muito semelhantes foram observados em um estudo
realizado nos Estados Unidos [7] e em outro trabalho
prévio brasileiro, que, além de equinos, também detectou a doença em uma mula e um burro [18]. Andar em
círculos tem sido um sinal clínico comum observado
em equinos afetados por essa enfermidade no Pará [4].
Alguns equinos enfermos podem desenvolver doença
sistêmica, incluindo sinais como febre, cólica, perda
de apetite e taquicardia [7,19].
À avaliação macroscópica, não foram observadas alterações no sistema nervoso central dos quatro
4
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Acta Scientiae Veterinariae. 43: 1268.
no Centro-Oeste brasileiro, bem como nenhum dos
quatro equinos apresentou lesões hepáticas crônicas
que levassem a encefalopatia hepática. Alguns achados histológicos visualizados nos equinos do presente
estudo são semelhantes às infecções pelos vírus da
raiva e do EHV-1, entretanto a imuno-histoquímica foi
essencial para a confirmação da etiologia pelo EEEv.
Técnicas moleculares e de hibridização in situ também
têm sido utilizadas para a confirmação do diagnóstico
de infecção pelo EEEv em equinos [4,7,17,18].
goiano, ampliando áreas do território brasileiro com descrição desta importante arbovirose. Estes achados reforçam a importância de se manter estudos epidemiológicos
e clínico-patológicos em todo o país para que o controle
e a prevenção dessas enfermidades sejam efetivamente
realizados pelos órgãos oficiais de vigilância.
CONCLUSÃO
Declaration of interest. The authors report no conflicts of
interest. The authors alone are responsible for the content and
writing of the paper.
MANUFACTURERS
Abcam. Cambridge, MA, USA.
1
Dako. Carpinteria, CA, USA.
2
Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA.
3
Este trabalho demonstra que a EEE também está
presente na região do Distrito Federal e cidades do entorno
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