MARJORIE PARRA DE LIMA

INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Mestrado em Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
APLICABILIDADE DO SANGUE SECO EM PAPEL DE FILTRO PARA
ESTUDOS DE PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE
C EM DIFERENTES GRUPOS
MARJORIE PARRA DE LIMA
RIO DE JANEIRO
JANEIRO DE 2015
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós Graduação em Medicina Tropical
MARJORIE PARRA DE LIMA
APLICABILIDADE DO SANGUE SECO EM PAPEL DE FILTRO PARA
ESTUDOS DE PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE
C EM DIFERENTES GRUPOS
Dissertação
apresentada
ao
Instituto
Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Medicina
Tropical
Orientadora: Prof. Dra. Livia Melo Villar
RIO DE JANEIRO
JANEIRO DE 2015
Ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós Graduação em Medicina Tropical
AUTOR: MARJORIE PARRA DE LIMA
APLICABILIDADE DO SANGUE SECO EM PAPEL DE FILTRO PARA
ESTUDOS DE PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C
EM DIFERENTES GRUPOS
ORIENTADORA:
Prof. Dra. Livia Melo Villar
Aprovada em: 23/01/2015
EXAMINADORES:
Prof. Dra. Vanessa Salete de Paula
Prof. Dr. Filipe Anibal Carvalho Costa
Prof. Dr. Francisco Inácio Pinkusfeld Monteiro Bastos
Prof. Dra. Debora Regina Lopes dos Santos
Prof. Dr. Adilson José de Almeida
Rio de Janeiro, 23 de Janeiro de 2015
iii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
AUTOR: MARJORIE PARRA DE LIMA
APLICABILIDADE DO SANGUE SECO EM PAPEL DE FILTRO PARA
ESTUDOS DE PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE
C EM DIFERENTES GRUPOS
Orientadora: Prof. Dra. Livia Melo Villar
EXAMINADORES:
Prof. Dra. Vanessa Salete de Paula
Prof. Dr. Filipe Anibal Carvalho Costa
Prof. Dr. Francisco Inácio Pinkusfeld Monteiro Bastos
Prof. Dra. Debora Regina Lopes dos Santos
Prof. Dr. Adilson José de Almeida
Rio de Janeiro, 23 de janeiro de 2015
iv
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Hepatites Virais
do Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ
v
Agradecimentos
À FIOCRUZ, CAPES, e a Pós-graduação em Medicina Tropical por
proporcionarem apoio financeiro para a execução deste trabalho.
À orientadora Dra. Livia Melo Villar, pela orientação, suporte, paciência e
dedicação ao me orientar ao longo da realização deste trabalho.
À Dra. Elisabeth Lampe, chefe do Laboratório de Hepatites Virais, pela
oportunidade de desenvolver o projeto.
Aos pesquisadores, Dra. Vanessa Salete de Paula, Dr. Adilson José de
Almeida, Dr. Filipe Aníbal Carvalho-Costa, Dr. Francisco Inácio Bastos, Dra
Débora Regina Lopes dos Santos por aceitarem fazer parte da banca
avaliadora.
Aos colaboradores em cada centro coparticipante: Dra. Cristiane Alves VillelaNogueira (UFRJ), Dra. Priscila Pollo-Flores e Dra. Eliane Bordalo Cathalá
Esberard (UFF), Msc. Cynara Carvalho Parente (UFC/Sobral), Dra. Maria
Rosangela Cunha Duarte Coelho (LIPA/Pernambuco), Dra. Ana Cecilia
Cavalcanti Albuquerque (Faculdade Associação Caruaruense de Ensino
Superior), Dra. Lia Laura Lewis-Ximenez (Ambulatório de Hepatites Virais),
Dra. Ana Rita Motta-Castro (UFMS), Msc. Flávio Augusto Pádua Milagres
(UFT), Dr. Marcelo Santos-Cruz (IPUB/UFRJ), Dr. Filipe Aníbal Carvalho-Costa
(Fiocruz Piauí), Dr. Francisco Inácio Bastos (ICICT/FIOCRUZ).
Aos profissionais do laboratório de hepatites virais que participaram na coleta,
processamento e realização de testes imunoenzimáticos de amostras incluídas
neste estudo, em especial, Dra. Vanessa Salete de Paula, Elisângela Ferreira
da Silva, Juliana Miguel, Helena Medina Cruz, Vanessa Alves Marques, Brunna
Lemos Marques, Letícia de Paula Scalioni e Renata Tourinho.
As amigas que dividiram não só o espaço físico, mas também todos os
momentos de vitória durante essa caminhada: Helena Medina Cruz, Vanessa
Cortes Faria, Elisângela Ferreira da Silva, Juliana Custódio Miguel, Geane
Lopes Flores, Ana Carolina da Fonseca Mendonça, Gabriela Cardoso Caldas,
Ludmila Callado e Joyce Magalhães.
Aos amigos do mestrado, pelo incentivo, momentos de descontração e
convivência intensa, em especial as amigas, Tayany de Deus e Caroline
Magalhães.
Aos meus pais Antonio e Ivany por todo o apoio, incentivo e amor,
principalmente na reta final da conclusão do trabalho.
vi
“De um começo tão simples, infinitas formas tão belas e maravilhosas
evoluíram e continuam evoluindo”
Charles Darwin, Origem das espécies, 1859
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
APLICABILIDADE DO SANGUE SECO EM PAPEL DE FILTRO PARA ESTUDOS DE
PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C EM GRUPOS
RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM MEDICINA TROPICAL
Marjorie Parra de Lima
O diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) emprega testes imunoenzimáticos e
moleculares em amostras de soro obtidas a partir de punção venosa. O uso de fluidos alternativos,
como o sangue seco em papel de filtro (SSPF) pode ser uma opção vantajosa para o diagnóstico,
pois a coleta é menos invasiva e o material pode ser armazenado e transportado em temperatura
ambiente. O objetivo deste estudo foi determinar a utilidade do SSPF para diagnóstico e estudos de
prevalência da infecção pelo HCV em diferentes regiões geográficas do Brasil e avaliar os fatores de
risco associados. Para isto, foram incluídos indivíduos provenientes de 4 regiões geográficas do
Brasil (Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste), divididos em 3 grupos: (I) Área de baixa
endemicidade (n=1465); (II) Indivíduos com alta vulnerabilidade para aquisição da infecção pelo HCV
(n=491); (III) Área de alta endemicidade (n=254). A detecção do anti-HCV foi feita utilizando um
ensaio imunoenzimático comercial (Murex anti-HCV v.4.0, Diasorin, Itália), onde o protocolo do
fabricante foi seguido para amostras de soro e para as amostras de SSPF foi aumentado em 20
vezes (volume final igual a 100µL). Amostras de soro anti-HCV reagentes foram submetidas a
detecção do HCV RNA por PCR em tempo real comercial (Abbot Real time HCV, Abbott, EUA) e
ensaios de genotipagem (Abbott Real Time Genotype II). Para análise dos fatores de risco
associados à infecção pelo HCV, foram incluídas variáveis sociodemograficas e de comportamento
de risco, onde analise bivariada foi realizada no grupo III e análises descritivas foram feitas em
todos os grupos. O valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significante. A concordância
entre resultados de detecção de anti-HCV em soro e SSPF na população total foi igual a 99,7% com
valor de kappa igual a 0,930. Os valores de estatística kappa foram iguais a 0,726, 0,496, 0,651 nos
grupos I, II e III, respectivamente. No grupo I, a prevalência de anti-HCV empregando soro foi igual a
0,4% e com SSPF foi igual a 0%. No grupo II, a prevalência de anti-HCV empregando soro foi igual a
1,02% e com SSPF foi igual a 0,4%. No grupo III, verificamos que a prevalência de anti-HCV foi igual
a 90% empregando o soro e 83,3% empregando o SSPF. A detecção do anti-HCV em SSPF não
esteve associada à presença do HCV RNA no soro e a maioria dos indivíduos apresentavam o
genótipo 1 (84,9%) seguido pelos genótipos 3 (9,1%), 2 (1,3%) e 5 (1,3%). Nas análises descritivas
para os grupos I e II, os históricos de cirurgia, transfusão de sangue, prática de manicures e
tratamento dentário foram os fatores de risco mais frequentes. No grupo III, observamos que as
variáveis idade e compartilhamento de escova de dente foram estatisticamente significantes em
relação à presença de anti-HCV em SSPF. Conclui-se que o SSPF pode ser empregado para
detecção de anti-HCV, principalmente no grupo de indivíduos atendidos em ambulatórios de
hepatologia indicando a utilidade deste método para triagem de casos positivos neste grupo.
Palavras-chave: hepatite C, sangue seco em papel de filtro, diagnóstico, prevalência.
ix
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
APPLICABILITY OF DRIED BLOOD SPOTS FOR PREVALENCE STUDIES OF HEPATITIS C
VIRUS INFECTION IN DIFFERENT GROUPS
ABSTRACT
MASTER DISSERTATION IN TROPICAL MEDICINE
The diagnosis of hepatitis C virus (HCV) infection uses enzyme immunoassays and molecular
tests in serum samples obtained from venipuncture. The use of alternative fluids such as dried
blood spots (DBS) could be an attractive alternative for diagnosis, due to the less invasive
collection and the material can be stored and transported at room temperature. The aim of this
study was to determine the usefulness of the DBS for diagnosis and prevalence studies of HCV
infection in different geographical regions of Brazil and to evaluate the associated risk factors.
So, individuals from four geographic regions in Brazil (North, Northeast, Midwest and
Southeast) were included and divided into 3 groups: (I) Low endemicity area (n=1465); (II)
Individuals at high risk for acquisition of HCV infection (n=491); (III) High endemicity area
(n=254). Anti-HCV detection was performed using a commercial enzyme immunoassay (Murex
anti-HCV v.4.0, DIASORIN, Italy), following the manufacturer's protocol for serum samples and
for DBS samples, the volume was 20fold increased (final volume equal to 100µL). Reactive antiHCV serum samples were submitted to real time PCR for HCV RNA detection (Abbott HCV real
time, Abbott, USA) and genotyping assay (Abbott Real Time Genotype II). For analyze of risk
factors associated to HCV infection, sociodemographic and behavior risk variables were
included, where bivariate analysis were done for group III and descriptive analysis were
conducted for all groups. P value < 0.05 was considered statistically significant. The
concordance between anti-HCV results in serum and DBS in total population was 99.7% with
kappa value of 0.930. The kappa values were 0.726, 0.496, and 0.651 in groups I, II e III,
respectively. In group I, anti-HCV prevalence using serum was equal to 0.4% and in DBS was
equal to 0%. In group II, anti-HCV prevalence using serum was equal to 1.02% and for DBS
was equal to 0.4%. In group III, we found that anti-HCV prevalence was equal to 90% using
serum and 83.3 % using DBS. The detection of anti- HCV in DBS was not associated to the
presence of HCV RNA in serum and most of individuals presented genotype 1 (84.9 %)
followed by genotypes 3 (9.1%), 2 (1.3%) and 5 (1.3%). In the descriptive analyzes for groups I
and II, history of surgery, blood transfusion, manicure practice and dental treatment were the
most frequent. In group III, the variables age and toothbrush sharing were statistically significant
for the presence of anti-HCV in DBS. It is concluded that DBS can be used for anti-HCV
detection, especially in the group of individuals referred at hepatology ambulatories indicating
the utility of this material for screening of positive cases in this group.
Key-words: hepatitis C, Dried blood spots, diagnosis, prevalence.
x
SUMÁRIO
RESUMO ..........................................................................................................VII
ABSTRACT .....................................................................................................VIII
Lista de Figuras ................................................................................................ IX
Lista de Tabelas .................................................................................................X
Lista de Quadros ...............................................................................................XI
Lista de sinais, símbolos e unidades de medida ............................................XII
Lista de Abreviaturas .......................................................................................XIII
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................1
1.1. Histórico ......................................................................................................1
1.2. Estrutura Viral e Genômica ........................................................................ 2
1.3. Replicação Viral ......................................................................................... 4
1.4. Diversidade Genética ................................................................................. 6
1.5. Aspectos Clínicos ....................................................................................... 9
1.6. Formas de transmissão .............................................................................11
1.7. Epidemiologia ............................................................................................12
1.8. Diagnóstico Laboratorial ............................................................................14
1.8.1. Diagnóstico Bioquímico ..........................................................................14
1.8.2. Testes Sorológicos .................................................................................14
1.8.3. Testes Moleculares ................................................................................ 16
1.9. Prevenção ................................................................................................ 17
1.10. Tratamento .............................................................................................. 18
1.11. Utilização de sangue seco em papel de filtro ......................................... 20
2. JUSTIFICATIVA .......................................................................................... 21
3. OBJETIVOS ................................................................................................ 23
3.1. Objetivo Geral ........................................................................................... 23
3.2. Objetivos Específicos ................................................................................ 23
4. METODOLOGIA .......................................................................................... 24
4.1. População de Estudo ................................................................................ 24
4.2. População de baixa endemicidade para o HCV ....................................... 26
4.2.1. Região Centro-Oeste ............................................................................. 26
4.2.2. Região Norte .......................................................................................... 29
4.2.3. Região Sudeste ..................................................................................... 31
4.2.4. Região Nordeste .....................................................................................32
4.3. População com maior vulnerabilidade para aquisição do HCV................. 36
4.4. População de alta endemicidade para o HCV .......................................... 37
4.5. Coleta de amostras biológicas .................................................................. 38
4.6. Determinação de anticorpos contra o vírus da hepatite C (Anti-HCV).......40
4.6.1. Princípio do teste imunoenzimático.........................................................40
4.6.2. Procedimento do teste Murex anti-HCV versão 4.0 (Diasorin, Itália)......41
4.7. Detecção do RNA do HCV (Abbott Real Time HCV, Abbott, EUA)............42
4.7.1. Princípio do teste Abbott Real Time HCV ..............................................42
4.7.2. Procedimento do Ensaio Abbott Real Time HCV ...................................43
4.7.2.1. Preparação das amostras e extração do HCV RNA ............................43
4.8. Teste de Genotipagem (Abbott Real Time HCV Genotype II) ...................44
4.8.1. Princípio do teste de Genotipagem .........................................................44
4.8.2. Procedimento do teste de Genotipagem ................................................47
4.9. Avaliação do desempenho do ensaio imunoenzimático em amostras de
SSPF e dos fatores de risco para infecção do HCV .........................................48
5. RESULTADOS ............................................................................................ 50
5.1. Detecção de marcadores anti-HCV em soro e sangue seco em papel de
filtro .................................................................................................................. 50
5.2. Determinação da prevalência de anticorpos anti-HCV em soro e sangue
seco em papel de filtro nos grupos estudados .................................................54
5.2.1. Prevalência de anti-HCV de acordo com as regiões estudadas .............54
5.3. Detecção de marcadores anti-HCV em SSPF em comparação a detecção
do HCV RNA no soro ....................................................................................... 54
5.4. Genotipagem das amostras HCV RNA detectado .....................................56
5.5. Características sócio demográficas da população estudada .....................57
5.6. Comportamento de risco nos grupos estudados ...................................... 59
5.7. Prevalência de marcadores do HCV de acordo com comportamento de
risco da população estudada ............................................................................62
6. DISCUSSÃO ................................................................................................ 63
7. CONCLUSÕES ............................................................................................ 69
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 71
ANEXO A .........................................................................................................81
ANEXO B ........................................................................................................83
ANEXO C .........................................................................................................86
Lista de Figuras
Figura 1.1:Organização do genoma do vírus da hepatite C. .............................. 4
Figura 1.2: Mecanismo de replicação viral (Bartenslanger et al., 2013) ............. 5
Figura 1.3: Árvore filogenética representativa dos 7 genótipos identificados.
(Smith, DB. 2014). .............................................................................................. 7
Figura 1.4: Distribuição global dos genótipos do HCV (Hussain Z, 2013). ......... 9
Figura 1.5: Evolução dos marcadores bioquímicos e sorológicos durante o
curso da infecção pelo vírus da hepatite C ...................................................... 10
Figura 4.1:Coleta de amostras realizada nas comunidades Passo do Lontra,
Serra do Amolar e Porto da Manga na região do Pantanal/MS........................ 27
Figura 4.2: Mapa demonstrando a localização das comunidades Passo do
Lontra, Serra do Amolar e Porto da Manga na Região do Pantanal/MS .......... 27
Figura 4.3: Habitações da área rural da cidade de Tocantinópolis/TO e coleta e
processamento de amostras ............................................................................ 29
Figura 4.4: Mapa demonstrando a localização da cidade de Tocantinópolis/TO
......................................................................................................................... 29
Figura 4.5: Localidade de Santa Isabel do Rio Negro/AM ................................ 30
Figura 4.6: Mapa da localização da localidade de Santa Isabel do Rio Negro. 30
Figura 4.7: Coleta realizada no Colégio Estadual Figueira, no bairro Miguel
Couto, município de Nova Iguaçu, Rio de Janeiro ........................................... 31
Figura 4.8: Mapa da localização da cidade de Nova Iguaçu, RJ.......................31
Figura 4.9: Mapa da cidade de Caruaru, PE. ................................................... 32
Figura 4.10: Mapa da cidade de Recife, PE ..................................................... 33
Figura 4.11: Mapa da localização da cidade de Sobral, CE ............................. 33
Figura 4.12: Mapa da localização da cidade de Nossa Senhora de Nazaré, PI.
......................................................................................................................... 34
Figura 4.13: Mapa da localização da cidade de Nossa Senhora de Nazaré,
Piauí. ................................................................................................................ 35
Figura 4.14: Coleta realizada na feira de negócios para profissionais de beleza,
Niterói/RJ.......................................................................................................... 36
Figura 4.15: Ambulatório de Hepatites Virais FIOCRUZ, UFRJ e UFF ............ 37
Figura 4.16: Procedimento para a coleta de sangue por punção venosa, para
obtenção do soro, ou aplicação no papel de filtro. ........................................... 37
Figura 4.17: Procedimento para a coleta de sangue por punção digital, para
aplicação no papel de filtro. .............................................................................. 38
Figura 4.18: Etapas do processamento das amostras de sangue coletadas em
papel de filtro. ................................................................................................... 39
Figura 4.19: Regiões alvo do gene do vírus HCV utilizadas para o teste de
genotipagem utilizando o equipamento Abbott Real Time HCV Genotype II. .. 44
Lista de Tabelas
Tabela 5.1: Características demográficas dos grupos selecionados. Os valores
das variáveis foram expostas de maneira descritiva quantitativa. ................ Erro!
Indicador não definido.
Tabela 5.2: Características epidemiológicas da suposta via de infecção pelo
HCV de acordo com os grupos estudados ....................................................... 60
Tabela 5.3: Valores de acurácia do teste de detecção de anti-HCV em SSPF
em comparação aos resultados obtidos em amostras de soro em cada grupo
estudado.............................................................. Erro! Indicador não definido.
Tabela 5.4: Comparação entre a detecção de anti-HCV em SSPF e a detecção
do HCV RNA em amostras de soro (n=235). ................................................... 54
Tabela 5.5: Comparação dos resultados obtidos na genotipagem do HCV em
amostras de soro em relação aos resultados de anti-HCV obtidos em amostras
de soro e SSPF. .............................................................................................. 55
Tabela 5.6: Análise Bivariada dos fatores de risco associados a prevalência de
anti-HCV em amostras de SSPF no grupo III (pacientes provenientes dos
Ambulatórios de Hepatites Virais). (n=253) ...................................................... 61
Lista de Quadros
Quadro 4.1: Sondas utilizadas para detecção dos genótipos e subtipos..........50
ix
Lista de sinais, símbolos e unidades de medida
% - porcentagem
Nm - nanômetro
> - menor
UI/mL – unidades internacionais por mililitro
mL - mililitro
Km - quilômetros
g - gravidade
ºC – graus Celsius
h - hora
N - Normal
< - maior
R$ - reais
± - símbolo de mais um menos
n – número amostral
kDa - Dalton
Lista de siglas e abreviaturas
ALT - Alanina aminotransferase
AM – Estado do Amazonas
anti-HCV - Anticorpos contra o vírus da hepatite C
BOC - Boceprevir
BSA – Albumina sérica bovina
cDNA – fita de DNA complementar
CI - Controle interno
CDC – Center of Disease Control
x
CE – Estado do Ceará
CEP – Comitê de Ética em Pesquisa
DAAs - Medicamentos de ação direta contra o vírus
DNA – Ácido desoxirribonucleico
ECLIA - Eletroquimiluminescência
EIE - Ensaio imunoenzimático
E - Especificidade
HAV - Vírus da hepatite A
HBV - Vírus da hepatite B
HCV - Vírus da hepatite C
HIV – Vírus da imunodeficiência humana
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IC - Intervalos de confiança
IOC – Instituto Oswaldo Cruz
IP - Inibidores de protease
INNOLIPA – hibridização in vitro
kDa – unidade de massa atômica
LAHEP – Laboratório de Hepatites Virais
LDLR – Receptores de LDL
MS – Estado do Mato Grosso do Sul
NANB - hepatite não-A, não-B
OR - Odds ratio
OMS – Organização Mundial de Saúde
ORF - Região aberta de leitura
PAM – Postos de atendimento médico
xi
PE – Estado de Pernambuco
PEG-IFN - Interferon peguilado
PBS – Tampão fosfato salino
PCR - “Polymerase chain reaction “ Reação em cadeia da polimerase
PI – Estado do Piauí
RER - Retículo endoplasmático rugoso
RJ – Estado do Rio de Janeiro
RpRd - RNA polimerase-dependente de RNA
RNA – Ácido Ribonucleico
SENAD – Secretaria Nacional de Políticas sobre Drogas
SSPF - Sangue seco em papel de filtro
Sc – Sensibilidade clínica
SUS – Sistema Único de Saúde
TCLE - Termos do consentimento livre e esclarecido
TMA - Amplificação mediada por transcrição
TMB - tetrametilbenzidina (TMB)
TGP – Transaminase glutâmico pirúvica
TO – Estado do Tocantins
TVR - Telaprevir
UFBA – Universidade Federal da Bahia
UFF – Universidade Federal Fluminense
UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro
VPP - Valor preditivo positivo
VPN - Valor preditivo negativo
xii
1. Introdução
1.1. Histórico
A história da classificação das hepatites virais começa nas décadas de 50 e
60 com a categorização das hepatites em dois grupos principais: hepatite infecciosa
e hepatite por soro homólogo (Krugman et al. 1962). Posteriormente, foi comprovado
por Feinstone et al. 1973 que a infecção por hepatite infecciosa era causada pelo
vírus da hepatite A (Hepatitis A virus ou HAV) e por Blumberg et al. (1968) que o
vírus da hepatite B (Hepatitis B virus ou HBV) era a causa da hepatite por soro
homólogo.
Na década de 70, com o desenvolvimento dos testes sorológicos para a
detecção do HAV e HBV, foram observados vários casos de hepatite por
transmissão sanguínea que não eram causadas pelo HAV e HBV (Feinstone et al.
1975) e, assim estabeleceu-se o conceito de hepatite não-A, não-B (NANB).
Observou-se, também, que pelo menos 10% das transfusões sanguíneas resultava
em hepatite NANB (Berman et al. 1979; Aach et al. 1981), causando dano hepático
persistente e evoluindo em pelo menos 20% dos casos para cirrose hepática nas
infecções crônicas (Hoofnagle e Alter 1985). Além disso, uma parcela dos casos
ocorria esporadicamente na comunidade e não estava associada necessariamente à
transfusão sanguínea e à recepção de derivados do sangue (Alter et al. 1982).
Em 1989, o vírus da hepatite C (HCV) foi descrito por Choo e cols (1989)
como o principal agente etiológico das hepatites conhecidas como NANB utilizando
estudos de clonagem e sequenciamento genético de uma cepa isolada do plasma
de um chimpanzé cronicamente infectado com o vírus das hepatites “não-A não
B”(Choo et al. 1989). A partir da identificação do agente etiológico da hepatite NANB
e utilização de testes de detecção de anticorpos contra o HCV (anti-HCV), utilizando
peptídeos recombinantes (Kuo et al. 1989), foram possíveis esclarecer que os casos
clínicos de hepatite pós-transfusional NANB (Alter et al. 1989) tinham como
responsável o HCV.
1
1.2. Estrutura viral e genômica
O vírus da hepatite C (HCV) é classificado na família Flaviviridae, gênero
Hepacivirus (ICTV 2014). A partícula viral mede cerca de 40-70 nm de diâmetro, o
capsídeo/nucleocapsídio é arredondado, exibindo simetria poliédrica e é envolvido
por envelope lipoproteico. (Choo et al. 1991; Li et al. 1995; Hoffmann et al. 2012)
O genoma do HCV apresenta duas regiões não codificantes nas
extremidades 5’ e 3’(5’NC e 3’NC) e uma única região aberta de leitura (ORF) que
codifica uma poliproteína de cerca de 3000 aminoácidos (3010 – 3033 aa) que
durante e após a tradução, sofre uma série de clivagens por proteases virais e do
hospedeiro que geram proteínas estruturais e não estruturais (Choo et al.1991;
Valoup-Fellous et al. 2006). A fase de leitura aberta é dividida em três regiões:
região amino terminal que compreende as proteínas estruturais [core (C),
glicoproteínas do envelope 1 (E1) e envelope 2 (E2)]; uma região central que inclui
duas proteínas (p7 e NS2) que podem ter papel essencial na morfogênese viral visto
que a expressão excessiva de proteínas p7 induz a apoptose em culturas de célula
Huh 7 (Aweya et al. 2012); e região carboxi terminal que compreende as proteínas
não estruturais necessárias para a replicação do ácido ribonucleico (RNA) (NS3,
NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) (Figura 1.1).
A proteína do core do HCV é a proteína de nucleocapsídeo viral com funções
diversas envolvendo RNA circulante, modulação imunológica, a sinalização celular,
potencial oncogênico e autofagia, esta também se associa com as gotículas
lipídicas, fazendo com que ocorra a montagem da partícula viral. As proteínas do
envelope E1/E2 são glicoproteínas glicosiladas do envelope que rodeiam as
partículas virais. A proteína p7 forma um canal iônico necessário para maturação e
liberação do vírus (Lemon et al., 2007).
Entre as proteínas não estruturais, a proteína NS2 é uma proteína de 23 kDa
e, responsável pela clivagem da junção NS2/NS3 (NS2/NS3 protease) e pela
maturação das proteínas não estruturais restantes (Dumoulin et al. 2003). A
atividade de protease da NS2 é fundamental para que ocorra a replicação completa
do HCV in vivo, entretanto a mesma é dispensável para replicação do vírus in vitro
(Roingeard et al. 2004).
2
A proteína NS3 (serina protease específica) é uma proteína não
estrutural
hidrofílica
de
aproximadamente
70
kDa.
É
uma
proteína
multifuncional e contém um domínio serino-protease na porção amino terminal
e um domínio RNA helicase/ NTPase na porção carboxi terminal (Lindenbach
et al., 2005). O papel da helicase do HCV ainda não foi bem descrito, mas
acredita-se que esteja envolvida na iniciação da síntese de RNA, sendo
responsável pela dissociação das fitas de RNA de seus moldes (Pang et al.
2002). Além disso, estudos mostraram que a NS3 pode interferir nas funções
da célula hospedeira, influenciando desta forma a resposta imune inata e
celular (Gale et al.1998; Borowski et al.1999; Gale & Foy, 2005; Meylan et al.
2005).
A região genômica de NS4 codifica duas proteínas: NS4A (8 kDa) e
NS4B (23 kDa). A proteína NS4A é composta por aproximadamente 54
aminoácidos e funciona como cofator para serina protease NS3 e é também
incorporada como componente integral do core (Roingeard et al. 2004;
Dubuisson et al. 2002). A proteína NS4B (p27), por sua vez, é a proteína viral
do HCV menos caracterizada, porém alguns estudos sugeriram que ela seja
responsável por induzir alterações nas membranas celulares denominadas
“teias membranosa” (Roingeard et al. 2004; Dubuisson et al. 2002; Moradpour
& Blum 2004).
A proteína NS5B é uma RNA-polimerase dependente do RNA viral,
responsável pela replicação do material genético viral, sendo este empacotado
para dar origem a novos vírions. A organização genômica do HCV está
esquematizada na Figura 1.1.
3
Figura 1.1: Organização do genoma do vírus da hepatite C. Representação da fase de leitura
aberta (ORF – open reading frame) codificando genes estruturais e não-estruturais como as
regiões 5’ e 3’. Adaptado de Moradpour, 2007.
1.3. Replicação Viral
O HCV entra no hepatócito através da adsorção da partícula viral.
Algumas moléculas de superfície celular foram identificadas como possíveis
receptores para o HCV nos processos de adsorção e internalização do HCV na
célula hospedeira. Dentre os candidatos a receptores do HCV, receberam
maior destaque as moléculas CD81 (forte interação com E2), encontradas na
superfície de muitos tipos celulares, incluindo hepatócitos (Pileri et al. 1998),
receptores LDL (LDLR) (Agnello et al. 1999) e SR-BI (scavenger receptor class
B type I) (Scarselli et al. 2002). A claudina-1 foi descrita como molécula
coreceptora necessária à internalização do HCV na célula (Evans et al. 2007).
Após o processo de adsorção da partícula viral, ocorre a endocitose e a
imediata fusão do envelope viral com a membrana da vesícula endocítica
(endossomos), cobertas por clatrinas e o genoma é liberado para o citossol.
Inicia-se a tradução do RNA, onde os ribossomos reconhecem a sequência
IRES, que se localiza junto ao códon AUG, na extremidade 5'NC (Honda et al.
1996; Hellen et al. 2001).
4
Durante o processo de tradução, as proteases celulares executam
clivagens que originam as proteínas estruturais (C, E1 e E2) e o polipeptídeo
p7. Uma vez liberada a primeira das proteínas não-estruturais, a NS2, esta
inicia sua autoclivagem e uma série de eventos bioquímicos que dão origem as
outras proteínas não estruturais (NS3, NS4A, NS5A e NS5B), a partir do
restante da cadeia proteica. A associação da NS5A com a NS5B inicia a
atividade da RNA polimerase-dependente de RNA (RpRd), gerando fitas de
RNA complementares com polaridade negativa que servem de molde para que
a RpRd sintetize as novas fitas de RNA de polaridade positiva (Pawlotsky 2004;
Penin et al. 2004). As novas fitas de RNA viral são então encapsidadas no
retículo endoplasmático formando os nucleocapsídeos, os quais serão
envelopados e maturados no aparelho de Golgi, e serão então liberados do
espaço pericelular por exocitose (Pawlotsky 2004). A figura 1.2 esquematiza o
ciclo replicativo do HCV em todas as etapas: adsorção, desnudamento,
tradução, processamento, maturação e liberação da partícula viral infectante.
Figura 1.2: Mecanismo de replicação viral. Partículas de HCV se ligam à célula hospedeira via interação
específica entre as glicoproteínas do envelope e receptores celulares. As partículas ligadas são então
internalizadas, provavelmente por meio de endocitose mediada por receptor. Após a liberação do genoma viral
no citoplasma (desnudamento) ocorre a tradução, no retículo endoplasmático rugoso (RER) em uma poliproteína
que é clivada nas proteínas estruturais e não-estruturais. As proteínas nãoestruturais participam da replicação
viral e as estruturais fazem parte da estrutura do capsídeo e glicoproteínas do envelope. O local de montagem
das partículas virais ainda não foi identificado, mas acredita-se que seja em membranas intracelulares derivadas
do retículo endoplasmático ou do compartimento de Golgi. Os vírions recém montados são então liberados da
célula
hospedeira,
possivelmente
por
meio
da
via
secretória.
https://islaslab.wikispaces.com/file/view/lifecycle.jpg/342594818/290x195/lifecycle.jpg
5
Adaptado
de
1.4. Diversidade genética
O genoma do HCV é caracterizado por uma considerável diversidade
geográfica e variabilidade genética sendo atualmente classificado em sete
genótipos confirmados e 67 subtipos (Figura 1.3) (ICTV 2014). Essas variações
do HCV influenciam no diagnóstico, na patogênese, no tratamento da infecção
e no desenvolvimento de vacinas (Irshad et al., 2010). O consenso proposto
em 2005 para a classificação do HCV apresentou uma nomenclatura
concordante e uniforme para as variantes do HCV e os critérios para a sua
atribuição em genótipos e subtipos. Desde a sua publicação, o conjunto de
dados disponíveis de sequencias do HCV expandiu enormemente através do
avanço nas tecnologias de sequenciamento de nucleotídeos e com um foco
crescente sobre o papel da variação genética do HCV na progressão da
doença, no tratamento e nos resultados. (Smith et al., 2011).
6
Figura 1.3: Árvore filogenética representativa dos 7 genótipos identificados (Smith, 2014). A
análise filogenética das sequencias que contêm > 95% da região codificante revela sete
grandes filogenética agrupamentos correspondentes aos genótipos 1 ao 7.
A replicação do HCV é muito propensa a erros e gera mutações em uma
taxa de aproximadamente 1012 por nucleotídeo por replicação, gerando uma
elevada diversidade viral (Stumpf & Pybus 2002). Desta forma, foi proposta
uma classificação do HCV em genótipos (homologia de 65,7% a 68,9%) e
subtipos (homologia de 76,9% a 80,1%) baseados em análises filogenéticas da
região 5'NC e sequenciamento. Tornou-se evidente que isolados de diferentes
indivíduos ou países mostraram substancial diversidade genética (Simmonds,
2005).
7
A heterogeneidade genética do HCV faz com se apresente sob a forma
de quasispécies, que são vírus com genomas muito semelhantes, porém com
homologia entre 90,8% a 99,0% nas sequências de nucleotídeos (Ueda et al.
2004). Quanto às regiões utilizadas para genotipagem são:
região 5´ NC
(RFLP e PCR em Tempo Real) e NS5B (sequenciamento).
Globalmente, o genótipo 1 é o mais prevalente em todo mundo (46%),
com proporções decrescentes dos genótipos 3 (22%), 2 (13%), 4 (13%), 6
(2%), 5 (1%). O subtipo 1b é o subtipo mais prevalente em todo mundo (22%).
Entretanto variações regionais, locais e no âmbito dos países são observadas.
Na América do Norte, América Latina e Europa, o genótipo 1 é o mais
prevalente (62-71%) sendo o subtipo 1b responsável por 26%, 39% e 50% das
infecções, respectivamente. Na Austrália e em grande parte da Ásia, o genótipo
1 é mais prevalente, com exceção do sul da Ásia onde o genótipo 2 é mais
frequentemente encontrado. Os genótipos 4 e 5 são principalmente
identificados na África e no Oriente Médio: o genótipo 4a é prevalente no Egito,
enquanto o genótipo 4c é altamente prevalente na África Central. O genótipo 5
é mais frequentemente encontrado na África do Sul. O genótipo 6 e seus
numerosos subtipos são encontrados principalmente no Sudeste Ásia e, em
alguns países, como Tailândia, Vietnã, e Myanmar. O genótipo 7 tem uma
menor relevância clínica e foi recentemente encontrado em pacientes da África
Central e Tailândia (Hussain et al., 2013; Gower et al., 2014).
No Brasil, um estudo sobre a prevalência de anti-HCV e a distribuição
dos genótipos de amostras coletadas de pacientes cronicamente infectados
pelo HCV, em diferentes regiões, o genótipo 1 (subtipos 1a, 1b) 2b e 3a foram
detectados na população geral brasileira dentro das macrorregiões (Pereira et
al., 2013). Em trabalho realizado em populações que incluem indivíduos que
usam drogas injetáveis e que não são usuários, das regiões Centro-Oeste e
Sudeste, os subtipos mais frequentes encontrados foram 1a, 1b e 3a (Lampe et
al., 2010). Mais especificamente entre usuários de drogas injetáveis
provenientes do estado do Rio de Janeiro, os subtipos circulantes encontrados
foram 1 e 3 em estudos realizados entre 1994-1997 e 1999-2001 (Oliveira et
al., 2009)
8
Figura 1.4: Distribuição global dos genótipos do HCV (Hussain, 2013).
1.5. Aspectos Clínicos
De modo geral, a hepatite C aguda é assintomática, podendo levar de 2
a 12 semanas após a exposição ao vírus, aos sintomas e sinais clínicos, porém
o aparecimento do anticorpo anti-HCV poderá ser tardio e poder ser detectado
em 80% dos pacientes após 15 semanas de exposição (Foccacia et al., 2013).
Uma vez que o indivíduo é infectado com o HCV, o vírus é transportado
na corrente sanguínea até o fígado onde ocorre a replicação. A viremia ocorre
em associação à ausência ou presença de poucos sintomas, e raros são os
casos de hepatite aguda fulminante. Geralmente, os pacientes não eliminam o
vírus naturalmente, de modo que a infecção pelo HCV evolui para infecção
persistente (Dwyre et al. 2011). Aproximadamente 15-45% das pessoas que
estão infectadas com o HCV irão ter resolução espontânea da infecção.
Estudos prospectivos têm demonstrado que 80% de casos de hepatite C aguda
progridem para a infecção crônica e destes cerca de 10-20% desenvolvem
9
complicações da doença crônica do fígado, tais como cirrose hepática e / ou
carcinoma hepatocelular (Lavanchy, 2011; Zhou et al . 2010).
Sintomas de infecção aguda podem ter início cerca de 6 a 12 semanas
após a exposição ao HCV. Em apenas 20% dos pacientes sintomáticos o início
dos sintomas precede a soroconversão, a qual raramente ocorre em período
superior a 6 meses. Os níveis séricos de alanina aminotransferase (ALT/TGP)
começam a aumentar entre 2 e 8 semanas após a exposição indicando
necrose dos hepatócitos e frequentemente atingem níveis superiores ao limite
superior da normalidade (10 vezes) (MS, 2011) (Figura1.5).
O HCV RNA pode ser detectado no sangue com 1-3 semanas após a
exposição inicial (Figura 1.5). Dentro de 4-12 semanas, a lesão das células do
fígado se manifesta pela elevação da ALT. A infecção aguda pode ser grave,
porém raramente, fulminante. Os sintomas são inespecíficos e geralmente eles
desaparecem depois de várias semanas assim como ocorre o declínio dos
níveis de ALT (NIH, 2002). O nível do HCV-RNA aumenta rapidamente durante
as primeiras semanas, atingindo seus níveis máximos (10 5 e 107 UI/mL)
imediatamente antes do pico dos níveis séricos de aminotransferases,
coincidindo com o início dos sintomas, exceto nos assintomáticos (Figura 1.5).
Figura 1.5: Evolução dos marcadores bioquímicos e sorológicos durante o curso da infecção
pelo vírus da hepatite C (Adaptado de Ministério da Saúde, 2011).
10
1.6. Formas de Transmissão
O HCV é transmitido pela via parenteral e o uso de drogas por via
intravenosa é um dos principais modos de transmissão. O uso de seringas
contaminadas parece ser o principal fator de risco para a infecção por HCV em
vários países e o compartilhamento de objetos de higiene pessoal pode
explicar a transmissão do vírus em determinadas situações (Wolff et al. 2010).
Entre as situações que podem levar a transmissão do HCV, podemos citar:
hemodiálise, acupuntura, piercings e tatuagem sem utilização de materiais
descartáveis ou contaminados, uso de drogas, compartilhamento de material
em manicures e barbeiros sem esterilização, exposição ocupacional,
transplante de órgãos e tecidos. (Pacheco et al., 2014; Villar et al., 2014,
Secretaria de Vigilância em Saúde, 2010).
Em relação à provável via de transmissão dos casos notificados no
Brasil, observa-se que as maiores proporções de casos estão relacionadas ao
uso de drogas (18%), à transfusão de sangue e/ou hemoderivados (16%) e à
transmissão sexual (9%), com elevado percentual de casos com etiologia
ignorada (Ministério da Saúde, 2012). Situações específicas como a privação
de liberdade, o viver em situação de rua e os transtornos mentais graves são
fatores de vulnerabilidade e também requerem abordagens específicas,
multidisciplinares e intersetoriais (Ministério da Saúde, 2012).
Atualmente, o compartilhamento de objetos para a utilização de drogas é
o principal método de transmissão do HCV em todo o mundo. Estima-se que
mais de 60% de novos casos de HCV registrados anualmente ocorram devido
ao uso de drogas ilícitas (Aceijas et al., 2007). No Brasil, foram observadas
prevalências de HCV de 5% a 36% em usuários de drogas ilícitas situado nas
regiões Nordeste, Centro-Oeste, Sul e Sudeste (Oliveira et al., 2006, 2009;
Silva MB et al., 2009). Em estudo realizando pela Secretaria Nacional de
Políticas sobre Drogas (Senad), nas principais capitais brasileiras, no período de
2011 a 2013, a prevalência de anti-HCV em usuários de crack no Brasil foi de
0,9%. O uso de crack constitui um problema grave em cidades de todo o Brasil.
Embora os dados existentes sugiram que o uso de crack, este geralmente
concentra-se entre os jovens desprivilegiados, com problemas de saúde
11
abrangentes e envolvimento criminal, existem lacunas de dados extensos.
(Santos Cruz et al., 2013).
Outra forma de transmissão do HCV seria pela via sexual, embora esta
forma de transmissão tenha importância epidemiológica secundária quando
comparada às formas de transmissão percutânea (Terrault, 2002). Casos de
hepatite C aguda com soroconversão para anti-HCV em parceiros sexuais de
indivíduos infectados pelo HCV tem sido relatados. Nestes casos, nenhum
outro fator de risco foi identificado, exceto a relação sexual desprotegida e as
cepas presentes entre os parceiros sexuais apresentaram elevado grau de
similaridade genômica (Halfon et al., 2001).
1.7. Epidemiologia
O HCV é uma das principais causas da doença crônica do fígado em
todo o mundo (Shepard et al., 2005). De acordo com a Organização Mundial de
Saúde (OMS), existem 130 a 150 milhões de pessoas infectadas com o HCV
(OMS, 2014).
A avaliação da prevalência e das formas de transmissão da hepatite C
permite que as autoridades de cada nação possam priorizar as medidas
preventivas e fazer uso mais adequado dos recursos disponíveis. A distribuição
mundial do HCV ocorre entre pessoas de diferentes etnias, gêneros e faixas
etárias. O reflexo socioeconômico da infecção pelo HCV não foi estabelecido
na maioria dos países, mas as consequências da hepatite C crônica, do estágio
terminal de cirrose hepática e do carcinoma hepatocelular, têm mostrado um
impacto cada vez maior nos sistemas nacionais de saúde (Diament, 2007).
As regiões do mundo que apresentam maior número de pessoas com
anti-HCV são do Sul da Ásia (> 50 milhões), da Ásia (> 50 milhões), África do
Norte / Oriente Oriental (> 15 milhões), Sudeste Asiático (> 11 milhões), e
Europa Ocidental (> 10 milhões). As áreas de menor prevalência do HCV
incluem Austrália (2,6%), América do Norte (3,6%) e Europa (2,4-2,9%)
(Hanafiah et al., 2013). Na América Latina, a prevalência de HCV é de 1,2%
(Te e Jensen, 2010), porém esta prevalência varia de região para região, com
2% no Chile e 3,4% no Nordeste do Brasil (Carrilho e Corrêa, 1998; Soza et al.,
12
2010; Te e Jensen, 2010). Assim, estima-se que haja 6,8-8,9 milhões de
indivíduos infectados pelo HCV na América Latina com uma prevalência
estimada de 1,5% nas Américas (Kershenobich et al., 2011).
O Brasil é considerado um país de baixa endemicidade para a hepatite
C, com uma prevalência da infecção estimada entre 1 e 2%. Maiores
prevalências de infecção pelo HCV foram observadas na região Norte (3,22%),
com proporções decrescentes nas regiões Sul (1,70%), Centro-Oeste (1,64%),
Sudeste (1,63%) Distrito Federal (1,09%) e Nordeste (0,97%) (Pereira et al.,
2013).
No Brasil, a prevalência da infecção pelo HCV varia de acordo com o
grupo estudado. Em usuários de drogas ilícitas das regiões metropolitanas do
Nordeste, Centro-Oeste, Sul e Sudeste do Brasil, as prevalências de HCV
variam de 5% a 36% (Aceijas et al., 2007; Martins et al., 2011). Em usuários de
drogas não injetáveis, a prevalência de anti-HCV varia de 1,25 a 27,7% (Santos
Cruz et al., 2013, Von Diemen et al., 2010) e em profissionais de Beleza a
prevalência de anti-HCV varia de 0,8 a 2% (Oliveira e Focaccia, 2010; Villar et
al., 2014).
1.8. Diagnóstico laboratorial
O diagnóstico laboratorial da infecção pelo HCV utiliza testes de
detecção de anticorpos, testes de detecção combinada de antígeno e anticorpo
do HCV e testes de detecção do ácido nucleico viral. Os testes de detecção de
anticorpos são utilizados como testes de triagem na suspeita de infecção pelo
HCV.(Patowsky, 2002).
1.8.1 – Diagnóstico Bioquímico
O diagnóstico bioquímico consiste em provas de função hepática, e
inclui os exames utilizados na determinação da atividade de indicadores como:
bilirrubinas, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, fosfatase
alcalina e gama-glutamiltransferase. As aminotransferases ou transaminases
13
são as mais utilizadas no diagnóstico bioquímico, por serem marcadores
sensíveis de lesões do fígado e por atingirem picos elevados no início dos
sintomas. Altos valores destas enzimas sugerem extenso acometimento do
parênquima hepático, especialmente nas hepatites agudas, porém valores
baixos não excluem o diagnóstico de hepatite. O padrão bioquímico mais
comumente observado na hepatite C crônica é o de flutuações das enzimas
hepáticas intercalados com períodos de normalização bioquímica, ou de
elevação persistente das aminotransferases. Entretanto, a infecção crônica
pode cursar com grande variabilidade dos parâmetros laboratoriais, inclusive
com dissociação bioquímico-virológica (EASL, 2010).
1.8.2 - Testes Sorológicos
Os testes sorológicos compreendem imunoensaios para detecção de
anti-HCV. Os imunoensaios disponíveis comercialmente para a detecção do
anti-HCV em soro ou plasma incluem ensaios imunoenzimáticos (EIE) e de
eletroquimiluminescência
(ECLIA).
Estes
ensaios
utilizam
antígenos
recombinantes derivados de proteínas do core e de regiões não estruturais
(NS3, NS4, e NS5) do genoma do HCV para detecção de anticorpos dirigidos
contra antígenos virais, estruturais e não estruturais, no soro ou plasma de
indivíduos infectados. (Cossart, 1999, Lambert 2007)
Nos EIEs os antígenos recombinantes são fixados em poços de
microplacas, pequenas esferas ou artifícios específicos usados para capturar
os anticorpos circulantes no soro. A presença de anticorpos é revelada por
anticorpos ligados à enzima que catalisa a transformação do substrato em um
composto colorido. Os EIEs são baratos, de fácil uso, podem ser
automatizados e facilmente adaptados para grande volume de testes
(Chevaliez et al., 2012).
A primeira geração de EIE permitia a detecção apenas de anticorpos
contra a região NS4, com a utilização do antígeno recombinante c100-3. Com o
desenvolvimento da segunda geração de testes, foram adicionados antígenos
do core, da região NS3 e uma parte do c100-3 (chamado 5-1-1) da região NS4.
A terceira geração incluiu um antígeno adicional da região NS5 e uma
14
reconfiguração dos antígenos do core e NS3 (Kesli et al., 2009). Recentemente
desenvolvida, a quarta geração de testes permite a detecção simultânea
anticorpos anti-HCV e antígenos do core viral (Gonçales e Gonçales Jr. 2007).
A janela imunológica foi reduzida significantemente com a introdução dos EIEs
de quarta geração. A quarta geração de testes pode detectar anticorpos a partir
de 14 a 20 dias de infecção, comparados com 28 a 70 dias detectados pelos
testes de terceira geração, 82 dias da segunda geração e 150 dias da primeira
geração (Lambert, 2007).
Os testes disponíveis no mercado capazes de detectar anticorpos antiHCV apresentam especificidade maior que 99% e sensibilidade entre 95-99%
(Gonçales; Gonçales Jr. 2007). Os testes que detectam antígeno e anticorpo
apresentam sensibilidade de 100% e especificidade igual ou maior que 99,5%
(Lambert, 2007). Pacientes imunossuprimidos podem não apresentar sorologia
reagente (anti-HCV), em virtude da diminuição ou ausência da produção de
anticorpos. Nesses casos, o diagnóstico deverá ser realizado por meio de
testes moleculares (Ministério da Saúde, 2011).
1.8.3 - Testes moleculares
São testes de detecção ou quantificação do genoma viral. A detecção
qualitativa do HCV pode ser realizada pela transcrição reversa seguida da
reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) ou pela amplificação mediada por
transcrição (TMA). A RT-PCR consiste na utilização do RNA do HCV como
matriz para a síntese da fita complementar (cDNA) por transcrição reversa.
Posteriormente, o cDNA é amplificado pela ação da DNA polimerase em
múltiplas cópias de ácido desoxirribonucleico (DNA) dupla fita. Esses testes
são capazes de detectar até 50 UI/mL do HCV RNA com sensibilidade similar
para qualquer genótipo, utilizando testes comerciais. A TMA consiste na
amplificação mediada por transcrição com limite de detecção de 5-10 UI/mL e
sensibilidade e especificidade acima de 96% independente do genótipo. Um
teste TMA disponível comercialmente é o Versant™ HCV RNA Qualitativos
(Siemens Medical Solutions Diagnostics, Alemanha) (Lange e Sarrazin, 2010).
15
A quantificação do HCV RNA pode ser obtida através de técnicas de
amplificação do sítio alvo, como a PCR em tempo real que realiza a
quantificação de ácidos nucleicos com alta reprodutibilidade, uma vez que os
valores são determinados na fase exponencial da reação, baseados na
emissão de fluorescência à medida que o material genético está sendo
amplificado ou a amplificação de sinal, como o DNA ramificado baseado na
detecção por amplificação de sinal. Na reação, após a transcrição reversa do
HCV RNA, a fita complementar resultante liga-se a oligonucleotídeos com
sequências específicas de regiões conservadas do genoma do HCV.
Atualmente no mercado estão disponíveis os testes que utilizam a PCR
em tempo real como o Cobas Taqman HCV (Roche). De acordo com
informações do fabricante, a técnica é capaz de quantificar o HCV RNA com
limite de detecção de 9.3UI/mL em amostras de plasma e de 8.8UI/mL em
amostras de soro para o genótipo 1 e para os demais genótipos (2 – 6) o limite
de detecção é de 20UI/mL. Outro teste de PCR em tempo real disponível é o
Abbott Real Time™ HCV (Abbott), cuja sequência alvo está na região 5’NC do
genoma do HCV e o limite de detecção é de 12UI/mL quando o volume de
0,5mL é empregado para o teste e de 30UI/mL, quando se utiliza 0,2mL de
amostra. O teste Versant™ HCV RNA (Siemens Medical Solutions Diagnostics,
Alemanha) utiliza a metodologia de DNA ramificado (bDNA) tendo o limite de
detecção da versão atual 3.0 do Versant™ HCV RNA (Siemens) de 615 UI/mL
(Lange e Sarrazin, 2010).
A determinação do genótipo do HCV também é importante para
definição do tipo de tratamento. Existem atualmente diversas metodologias
comerciais para genotipagem do HCV, destas a maioria se baseia na analise
da região 5'NC, devido ao alto grau de conservação entre os isolados dos
diferentes genótipos, porém testes baseados na analise da região NS5B
também são utilizados devido à variabilidade genética nesta região. (Pawlotski,
2002)
No Brasil, o método mais comumente utilizado para genotipagem do
HCV é a técnica de RT-PCR que é capaz de detectar os genótipos 1, 2, 3, 4, 5
e 6, e precisamente os subtipos 1a e 1b através do uso de sondas
fluorescentes marcadas com oligonucleotídeos específicos para cada genótipo.
16
Os métodos de PCR em tempo real são específicos e sensíveis, usam sondas
e iniciadores específicos para detectar sequências alvo. Além disso, esta
técnica é executada em uma plataforma automatizada sem a necessidade de
procedimentos de pós-PCR, minimizando, assim, a contaminação e reações
cruzadas entre as amostras proporcionando uma análise mais rápida (Nakatani
et al., 2010).
1.9 - Prevenção
Até o momento, não existe uma vacina para a prevenção da hepatite C,
por isto devem ser adotadas medidas de prevenção primárias e secundárias.
As medidas primárias visam à redução do risco para disseminação da doença
e as secundárias à interrupção da progressão da doença em uma pessoa já
infectada. Dentre as medidas de prevenção primária, destacam-se: triagem
sorológica em bancos de sangue e centrais de doação de sêmen para garantir
a distribuição de material biológico não infectado; triagem de doadores de
órgãos sólidos como coração, fígado, rim e pulmão; triagem de doadores de
córnea ou pele; cumprimento das práticas de controle de infecção em hospitais,
laboratórios, consultórios dentários e serviços de hemodiálise. As medidas de
prevenção secundária são: tratamento dos indivíduos infectados, quando
indicado; abstinência ou diminuição do uso de álcool, não exposição a outras
substâncias hepatotrópicas (SVS - Ministério da Saúde 2005, 2011).
Estudos têm sido realizados para o desenvolvimento de vacinas contra
o vírus da hepatite C, onde vetores virais em conjunto com proteínas do
envelope foram desenvolvidos e utilizados para imunização em modelos
animais (ratos e macacos) sendo capazes de produzir anticorpos neutralizantes
(Garrone et al., 2011). Vacinas que utilizam peptídeos do envelope foram
capazes de reduzir a carga viral do HCV em pacientes que não haviam
respondido a terapia convencional (El-Awady et al., 2013), assim como vacinas
recombinantes empregando as glicoproteínas do envelope se mostraram
imunogênica em cobaias (Stamataki et al., 2007) e chimpanzés (Meunier et al.,
2011) e capazes de induzir respostas imunes protetoras em modelos
17
experimentais usando cepas homologas e heterólogas do genótipo 1a do HCV
(Meunier et al., 2008).
Vacinas de DNA também têm se mostrado capazes de induzir
respostas humorais e celulares in vivo (Beckebaum et al., 2005). Existem duas
vacinas de DNA sendo avaliadas, uma, em Fase I de ensaios clínicos,
demonstrou alta tolerância,
se mostrou segura e imunogênica (Alvarez-
Lajonchere et al., 2009) e a outra está em Fase II, porém ainda não se conhece
o seu potencial de imunogenicidade (Xue et al., 2014).
1.10 - Tratamento
De acordo com a portaria Nº 25 de 12 de Novembro de 2013, os
medicamentos de ação direta contra o vírus (DAAs) já estão disponíveis para
tratamento dos pacientes com hepatite C. Estes medicamentos são inibidores
de protease viral, como o Boceprevir (BOC) e Telaprevir (TVR), e são indicados
para pacientes infectados cronicamente pelo genótipo 1 do CV e com fibrose
avançada (Metavir F3 e F4) ou cirrose hepática compensada (Child-Pugh ≤ 6).
O esquema terapêutico consiste na associação de um destes inibidores de
protease (IP) com PEG-INF + RBV, por 12 semanas quando há indicação do
uso do Telaprevir, tendo administração continuada de PEG-INF ate 48ª
semana, e quando houver indicação do uso do Boceprevir, a terapia tripla deve
seguir o esquema terapêutico por 48 semanas.
O tratamento padrão da infecção crônica pelo HCV, atualmente, consiste
na administração da combinação de interferon peguilado alfa-2a ou alfa-2b
(PEG-IFN) e ribavirina (Fried et al., 2002). A resposta virológica sustentada é
determinada pela ausência de RNA viral, seis meses após o tratamento
(Pawlotsky 2009). A duração do tratamento com terapia dupla em indivíduos
monoinfectados pelo HCV depende do genótipo viral, e o tempo de duração
varia de 24 a 48 semanas em pacientes infectados pelos genótipos 2 ou 3 e 48
a 72 semanas para indivíduos infectados pelos genótipos 1 e 4 (Ministério da
Saúde, 2011).
18
1.11 – Utilização do Sangue seco em papel de filtro
A coleta de amostras de sangue é necessária para estabelecimento do
diagnóstico etiológico da infecção pelo HCV, porém há necessidade de pessoal
treinado para a realização da punção venosa, além de infraestrutura para
coleta em condições adequadas de biossegurança. Estas condições nem
sempre estão disponíveis em áreas distantes do laboratório.
O uso de amostras de SSPF para o diagnóstico de desordens metabólicas
congênitas em recém-natos foi introduzido no Brasil em 1976, pelo pediatra
Benjamin J. Schmidt e se tornou obrigatório em todo o país em 1990, através
da lei federal n. 8.069/90. Em 2001 o Ministério da Saúde criou o Programa
Nacional de Triagem Neonatal.
A grande vantagem da utilização de papel de filtro para o diagnóstico da
hepatite C é a facilidade na coleta tornando esta uma alternativa satisfatória e
conveniente, principalmente em estudos populacionais em larga escala em
áreas remotas, pois requer espaço mínimo de estocagem, apresenta pouco
risco biológico, é pouco onerosa, e o transporte das amostras é simples e
possui baixo custo.
19
2. JUSTIFICATIVA
O Brasil apresenta grande extensão territorial, e a prevalência da
infecção pelo HCV varia de acordo com as diferentes regiões geográficas.
Além disto, muitas áreas não apresentam infraestrutura adequada para coleta,
armazenamento de amostras e o diagnóstico padrão das hepatites virais. O
diagnóstico da infecção pelo HCV é feito pela detecção de antígenos,
anticorpos e genoma viral em amostras de sangue obtida por punção venosa
periférica. No entanto, a coleta de sangue é extremamente difícil em
determinados
grupos
populacionais
como
crianças,
idosos,
obesos,
hemodialisados, usuários de drogas injetáveis, assim como em áreas remotas,
onde há pouca infraestrutura para coleta e dificuldade na remessa e recepção
de amostras biológicas.
A obtenção de amostras de sangue seco em papel de filtro (SSPF) é um
método menos invasivo para coleta de amostras biológicas. Esta metodologia
já foi utilizada com bom desempenho para diagnóstico da infecção pelo HIV
(De Crignis et al., 2010). De acordo com a portaria n.º 247 de 09 de novembro
de 2012 do Ministério da Saúde, testes em papel de filtro podem ser utilizados
para triagem da toxoplasmose, (Imunoglobulina M (IgM) e Imunoglobulina G
(IgG), Hepatite B (Anti-HBcAg e HBsAg), hepatite C (anti-HCV), TSH, sífilis
recombinante e HIV em gestantes). Do mesmo modo, o Ministério da Saúde
também instituiu em 6 de junho de 2011 (Portaria GM/MS N.º822), a portaria de
triagem neonatal ampliando a triagem neonatal existente (fenilcetonúria e
hipotireoidismo congênito) para a detecção precoce de outras doenças
congênitas, tais como a fibrose cística, as hemoglobinopatias e as doenças
falciformes.
Estudos demonstram que o SSPF pode ser útil na detecção de
marcadores da infecção pelo HIV e pelo HBV em áreas endêmicas e em
grupos com fatores de risco associados (De Crignis et al., 2010; Mohammed et
al., 2013). Nosso grupo já demonstrou que marcadores da infecção pelo HBV
(anti-HBc, HBsAg e anti-HBs) e HCV (anti-HCV e antígeno HCV) podem ser
detectados em SSPF através de ensaio imunoenzimático comercial (Villar et
al., 2011; Marques et al., 2012; Brandão et al., 2013). O ensaio
20
imunoenzimático otimizado para detecção de anti-HCV apresentou bom limite
de detecção e boa repetitividade e reprodutibilidade, porém os estudos
anteriores empregavam amostras provenientes somente do Estado do Rio de
Janeiro e principalmente de indivíduos atendidos em centros de diagnóstico e
tratamento das hepatites virais. Logo, torna-se necessário avaliar a efetividade
do ensaio otimizado em indivíduos com perfis de endemicidade distintos e de
diferentes regiões geográficas do Brasil a fim de avaliar a eficiência do método
em diferentes grupos e a sua utilização para o diagnóstico e estudos de
prevalência.
21
3. OBJETIVOS
3.1 - Objetivo geral
Avaliar a factibilidade da utilização do sangue seco em papel de filtro
para diagnóstico e estudos de prevalência da infecção pelo HCV em diferentes
regiões geográficas do Brasil.
3.2 - Objetivos específicos
 Determinar a presença de anticorpos anti-HCV em amostras de sangue
seco em papel filtro utilizando um ensaio imunoenzimático comercial adaptado;
 Comparar a detecção de anticorpos anti-HCV em amostras pareadas
de soro e sangue seco em papel de filtro para determinar os parâmetros de
qualidade do ensaio;
 Estimar a prevalência de anticorpos anti-HCV utilizando amostras de
SSPF provenientes de indivíduos de áreas de alta e baixa endemicidade, e em
grupos com comportamento de risco;
 Detectar a presença de RNA do HCV em amostras de soro anti-HCV
reagentes para verificar se a presença do RNA viral está relacionada com a
reatividade em sangue seco em papel de filtro;
 Identificar os fatores de risco associados à infecção pelo HCV
utilizando o ensaio otimizado.
22
4. METODOLOGIA
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) da FIOCRUZ, sob o número CAAE 34055514.9.0000.5248 para a sua
execução. (Anexo C)
4.1 - População de Estudo
Neste estudo foram incluídos indivíduos provenientes de 4 regiões
geográficas do Brasil (Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste), divididos em
3 grupos:
(I) Indivíduos de área de baixa endemicidade;
(II) Indivíduos com vulnerabilidade acrescida para aquisição da infecção
pelo HCV;
(III) Indivíduos de áreas de alta endemicidade.
O cálculo amostral foi feito com o auxílio do programa Epi Info 7(Center
of Disease Control - CDC), com erro amostral de ±5% e nível de confiança de
95-97%, considerando a taxa de prevalência da hepatite C para os grupos
selecionados de acordo com a literatura, sendo de 1,38% para o grupo I
(Boletim Epidemiológico para Hepatites Virais, 2012); 2,3-2,9% para o grupo II
(Secretaria Nacional de Políticas Sobre Drogas - Senad, 2013; Santos Cruz et
al., 2013), e para o grupo III, considerando uma população de 1500 pacientes
com HCV atendidos nos ambulatórios de Hepatites virais.
Deste modo, foi realizado o seguinte cálculos quantitativos para cada
grupo estudado, tomando como base o número de indivíduos residentes em
cada localidade de estudo segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística (IBGE, 2010):
- Grupo I (Indivíduos de área de baixa endemicidade): mínimo de 360
indivíduos para a Região Centro-Oeste do Brasil (Pantanal de Mato Grosso do
Sul); 570 indivíduos para a região Norte do País (Tocantinópolis, Tocantins e
23
Manaus, Amazonas); 494 indivíduos para a região Nordeste (Recife e Caruaru,
Pernambuco; Sobral, Ceará; Nossa Senhora de Nazaré, Piauí); 140 indivíduos
da região Sudeste (Nova Iguaçu, Rio de Janeiro).
- Grupo II (Indivíduos com maior vulnerabilidade para aquisição da
infecção pelo HCV): mínimo de 240 indivíduos profissionais de beleza
(manicures, pedicuras, depiladores) e 180 usuários de drogas não injetáveis
residentes no Rio de Janeiro e Salvador.
Grupo III (Pacientes atendidos em Centros de Referência para Hepatites
Virais Ambulatório de Hepatites Virais do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) e
Hospital Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ): mínimo de 200 pacientes foi incluído com objetivo de avaliar o
desempenho do teste em uma população sabidamente infectada (sensibilidade,
ou proporção de testes positivos / pessoas infectadas).
Os indivíduos foram previamente informados do estudo e suas dúvidas
esclarecidas. Os resultados foram encaminhados aos mesmos e no caso de
portadores, os mesmos foram encaminhados aos Serviços de Saúde para
aconselhamento e tratamento necessários. Somente foram incluídos no estudo
indivíduos que assinaram o termo de consentimento. Menores de idade tiveram
o termo assinado pelo representante legal.
Os critérios de inclusão para os grupos foram:
Grupo I
Ser residente da Região onde os estudos foram realizados;
Não apresentar hepatite viral diagnosticada ou sintomas sugestivos no
momento da inclusão no estudo.
Grupo II
Indivíduos maiores de 18 anos;
Profissionais
da
área
de
beleza,
como
manicures,
pedicuras,
cabeleireiros e depiladores;
Indivíduos que utilizavam droga não injetável nos últimos 12 meses e
não estivessem sobre o efeito da droga no momento da coleta de informações
e amostras biológicas.
24
Grupo III
Indivíduos maiores de 18 anos;
Pacientes com suspeita de hepatite viral, ou hepatite C confirmada
através de testes sorológicos e moleculares no soro.
Os critérios de exclusão do estudo para os 3 grupos foram: alguma
intercorrência durante a coleta da amostra, como: não ter acesso venoso ou
impossibilidade de coleta de sangue.
4.2 - População de baixa endemicidade para o HCV
O Grupo I foi composto por indivíduos da população em geral,
provenientes de quatro regiões geográficas do Brasil (Sudeste, Nordeste, Norte
e Centro-Oeste), com o objetivo de incluir aqueles indivíduos que possuem
baixa vulnerabilidade para aquisição da infecção pelo HCV.
4.2.1 – Região Centro-Oeste
Foram incluídos indivíduos residentes na região do Pantanal do Mato
Grosso do Sul que viviam em casas de pau-a-pique e palafitas, com arquitetura
adaptada para períodos de inundações. A maioria da população era constituída
principalmente por pescadores que utilizam o rio como fonte de subsistência. A
coleta de amostras de soro e SSPF e dados foi realizada em todos os
indivíduos residentes nas comunidades ribeirinhas Passo do Lontra, Serra do
Amolar e Porto do Manga (Figura 4.1) no ano de 2010 que concordaram em
participar do estudo após assinatura de termo de consentimento (Tourinho,
2011).
A população ribeirinha possui um modo de vida bastante simples que
apresentam como principal atividade ocupacional a pesca artesanal e a coleta
e venda de iscas vivas. As casas são modestas e rústicas, sendo muitas ainda
construídas de pau-a-pique. Próximo as suas residências mantêm atividades
agrícolas de subsistência além da criação de animais domésticos. O rio é
utilizado além da pesca, como auxiliar na higiene pessoal (banhos) e doméstica
25
(louças e roupas). Não possuem saneamento básico ou sequer pronto
atendimento. Sua população é predominantemente infantil devido à alta taxa de
natalidade, as escolas oferecem Ensino Fundamental e Médio e o principal
meio de transporte são os barcos e canoas.
A comunidade Serra do Amolar/São Lourenço, localiza-se a 217 km de
Corumbá (via fluvial) em uma planície inundável onde a maioria das casas é
construída sobre palafitas (sistema construtivo usado em edificações
localizadas em áreas alagadiças) assim como a comunidade Porto do Manga
(localizada na estrada Parque pantanal sul-mato-grossense a 385 km de
Campo Grande) que possui suas casas construídas sobre toras de madeira
como medida de proteção às cheias. Esta comunidade conta com uma unidade
educacional que atende principalmente as crianças e adolescentes em idade
escolar. A atividade econômica gira em torno da pesca de iscas vivas e
também do trabalho como brigadistas do Parque Nacional do Pantanal matogrossense, aproximando o pantaneiro dos processos de conservação da
biodiversidade.
A comunidade Passo do Lontra fica localizada na estrada do Parque do
Pantanal, a 300 km da capital Campo Grande. É constituída por pescadores,
piloteiros de barco e serviços gerais turísticos. Nesta região está localizada a
Base de Estudos do Pantanal da UFMS, a qual oferece atendimento médico e
odontológico periódico e, foi fundamental para a elaboração deste estudo com
a população ribeirinha do Pantanal de Mato Grosso do Sul (Figura 4.1).
26
Figura 4.1 Coleta e processamento de amostras realizada no Campus da Universidade
Federal de Mato Grosso do Sul e habitações das comunidades Passo do Lontra, Serra do
Amolar e Porto da Manga na região do Pantanal/MS. (Fonte: Laboratório de Hepatites Virais IOC - FIOCRUZ; Bigaton, 2009
Figura 4. 2 - Mapa demonstrando a localização das comunidades Passo do Lontra (1), Serra
do Amolar (2) e Porto da Manga (3) na Região do Pantanal/MS (Fonte: Adaptado de
CreativeCommons - http://commons.wikimedia.org/wiki/User:Raphael.lorenzeto
27
4.2.2 – Região Norte
Na região Norte foram recrutados indivíduos residentes na cidade de
Tocantinópolis situada no Estado de Tocantins (Figuras 4.3 e 4.4) que
forneceram amostras de soro e SSPF em junho de 2010 e na localidade de
Santa Isabel do Rio Negro no Amazonas (Figuras 4.5 e 4.6). A cidade de
Tocantinópolis está localizada no Norte do Estado as margens do Rio
Tocantins, a 523 km da capital Palmas e a 715 km de São Luiz do Maranhão.
De acordo com dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE)
de 2010, a população de Tocantinópolis é estimada em 22.608 habitantes e
sua economia compõe-se basicamente dos seguintes setores: funcionários
públicos, comércio varejista, prestadores de serviços, atividades agropecuárias,
pequenas indústrias, e também mercado informal. Na pecuária destaca-se a
predominância de criação de bovinos e suínos, para produção de leite e carne
e apenas para o consumo da população local. A agricultura é voltada para a
produção de arroz, milho, feijão e mandioca. Este estudo foi desenvolvido em
Tocantinópolis durante o projeto de “Ações integradas de vigilância de doença
de chagas, hepatites, leishmaniose, malária, saúde do trabalhador e tracoma”
organizado pela Secretaria Estadual de Saúde do Estado de Tocantins. Os
indivíduos provenientes deste estudo residiam em povoados rurais (Mumbuco,
Folha Grossa, Cacau e Fazenda Bela Vista) e na área urbana que foram
selecionadas de acordo com a presença de casos confirmados de doença de
Chagas nos últimos anos.
28
Figura 4.3 - Habitações da área rural da cidade de Tocantinópolis/TO e coleta e
processamento de amostras (Fonte: Laboratório de Hepatites Virais - IOC - FIOCRUZ).
Figura 4.4 - Mapa demonstrando a localização da cidade de Tocantinópolis (Estado de
Tocantins) (FONTE:CreativeCommons
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tocantins_MesoMicroMunicip.svg)
A localidade de Santa Isabel do Rio Negro se encontra na bacia do Alto
Rio Negro, no Estado do Amazonas, distante 781 km da capital do estado, a
cidade de Manaus (Figura 4.5). Somente amostras de SSPF foram obtidas
nesta localidade em novembro de 2013. O acesso à cidade só é possível por
barco ou avião. O município tem aproximadamente 11.000 habitantes. No
29
centro urbano vivem cerca de 5.000 pessoas, distribuídas em seis distritos. O
restante da população está distribuído em diversas comunidades ribeirinhas no
interior do município. Os habitantes de Santa Isabel do Rio Negro e de outras
regiões da bacia do Alto Rio Negro descendem de populações pré-colombianas
tendo como idioma o Tukano Oriental e Aruak (ISA 2012). A infraestrutura
sanitária é marcadamente deficiente, pois a grande maioria das casas não têm
fossas sépticas para a recepção de resíduos sólidos (Bóia et al. 2006).
Figura 4.5: Localidade de Santa Isabel do Rio Negro/AM
(Fonte: Laboratório de Hepatites Virais - IOC - FIOCRUZ)
Figura 4.6: Mapa da localização da localidade de Santa Isabel do Rio Negro. (FONTE:
CreativeCommons - http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Amazonas_MesoMicroMunicip.svg)
4.2.3 – Região Sudeste
Na região Sudeste foram recrutados indivíduos residentes do Bairro Miguel
Couto no município de Nova Iguaçu (Rio de Janeiro). Estes indivíduos forneceram
amostras de soro e SSPF por ocasião de um evento para conscientização sobre
30
hepatites virais no colégio estadual Figueira realizado em setembro de 2012 (Figuras
4.7 e 4.8). A cidade de Nova Iguaçu se localiza na região noroeste da capital do
Estado, distante cerca de 28 km da capital e ocupa uma área de 523.888 km². Em
2012, o IBGE estimou sua população em 801.746 habitantes, dos quais 52% eram
mulheres. A principal fonte de arrecadação do município é proveniente do comércio
e os serviços, possuindo um dos centros comerciais mais importantes do estado. A
indústria na cidade tem uma grande relevância econômica, contando com indústrias
nos ramos alimentício, de siderurgia e de cosméticos.
Figura 4.7: Coleta realizada no colégio estadual Figueira, no bairro Miguel
Couto, município de Nova Iguaçu, Rio de Janeiro
(Fonte: Laboratório de Hepatites Virais - IOC - FIOCRUZ)
Figura 4.8: Mapa da localização da cidade de Nova Iguaçu, RJ. (FONTE: CreativeCommons http://commons.wikimedia.org/wiki/File:RiodeJaneiro_MesoMicroMunicip.svg)
4.2.4 – Região Nordeste
Na Região Nordeste foram incluídos indivíduos de 3 Estados
(Pernambuco, Ceará e Piauí). No Estado de Pernambuco, foram incluídos
31
indivíduos incluídos residentes da cidade de Caruaru e Recife que forneceram
somente amostras de sangue seco em papel de filtro no ano de 2013.
O município de Caruaru está localizado a cerca de 130 km da capital do
Estado, tendo sua população em torno de 342 mil habitantes (IBGE, 2010)
(Figura 4.9). Sua economia baseia-se na agricultura e agropecuária,
principalmente, sendo a lavoura uma das principais fontes de renda no setor
primário. A indústria tem uma grande representação no setor secundário, tendo
grande destaque a produção têxtil.
Figura 4.9: Mapa da cidade de Caruaru, PE. (FONTE: CreativeCommons
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Brazil_Pernambuco_location_map.svg)
-
O município de Recife (Figura 4.10), a capital do estado, ocupa a
posição central no litoral do nordeste do Brasil, situando-se na área central da
Região Metropolitana, a 800 km das metrópoles regionais de Salvador e
Fortaleza, tem sua população estimada em 1.537.704 milhões de habitantes
(IBGE, 2010), sendo uma das principais capitais do nordeste, onde a principal
fonte de renda encontra-se nos Portos de Suape e o Porto do Recife,
importantes parques tecnológicos do país e referência mundial na produção de
softwares.
(http://www2.recife.pe.gov.br/a-cidade/aspectos-gerais/aspectos-
economicos).
32
Figura 4.10: Mapa da cidade de Recife, PE (FONTE: CreativeCommons http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Brazil_Pernambuco_location_map.svg)
No Estado do Ceará, foram incluídos indivíduos residentes na cidade
de Sobral que forneceram somente amostras de sangue seco em papel de filtro
em 2013. Sobral é um município situado no Estado do Ceará com população
de 199.750 habitantes sendo a quinta cidade mais povoada do estado e a
segunda maior do interior, estando localizada a 238 km de distância da capital
do Estado (Figura 4.11). Dentre as principais atividades econômicas da cidade,
destacam-se a agricultura, pecuária, mineração, extrativismo e o polo industrial
que conta com indústrias especializadas na fabricação de calçados,
cosméticos, embalagens etc. O turismo na cidade também é uma forte fonte de
renda para o município. As amostras de SSPF foram coletadas pelos técnicos,
funcionários da Universidade Federal do Ceará, assim como as informações do
questionário, e enviados para o Laboratório de Hepatites Virais (FIOCRUZ)
Figura 4.11: Mapa da localização da cidade de Sobral, CE (FONTE: CreativeCommons http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ceara_MesoMicroMunicip.svg
33
Também foram incluídas amostras de indivíduos residentes da cidade de
Nossa Senhora de Nazaré no Estado do Piauí. Este grupo forneceu somente
amostras de SSPF em setembro de 2014 em colaboração com a Fiocruz Piauí
e a Secretaria Municipal de Saúde da Cidade de Nossa Senhora de Nazaré
(Figuras 4,12 e 4.13). As coletas foram realizadas de forma domiciliar com
indivíduos da população urbana e rural da cidade, após a assinatura do termo
de consentimento. O município está localizado a 86 km da capital, sua
população é de 4559 habitantes (IBGE, 2010) tendo como atividades principais
a lavoura de subsistência e comercial, porém em menor escala e de forma
temporária.
Figura 4.12: Cidade de Nossa Senhora de Nazaré, PI.
(Fonte: Laboratório de Hepatites Virais - IOC - FIOCRUZ)
34
Figura 4.13: Mapa da localização da cidade de Nossa Senhora de Nazaré, Piauí
(FONTE:CreativeCommons
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Piaui_MesoMicroMunicip.svg)
4.3 – População com maior vulnerabilidade para aquisição do HCV
O grupo II foi composto por indivíduos que apresentam alta
vulnerabilidade para aquisição do HCV que forneceram amostras de soro e
SSPF. Foram incluídos profissionais de beleza (manicures, pedicuras,
depiladores, cabelereiros e afins) residentes no Estado do Rio de Janeiro e
usuários de drogas não injetáveis (crack) residentes dos Estados do Rio de
Janeiro e da Bahia.
Os profissionais de beleza foram recrutados em uma feira de negócios
para profissionais da área realizada na cidade de Niterói/RJ, no ano de 2010.
Esse evento contou com os mais variados profissionais da área (manicures,
pedicuras, cabelereiros, depiladores e afins) que participavam da exposição ou
adquiriram produtos. (Figura 4.14)
35
Figura 4.14: Coleta realizada na feira de negócios para
profissionais de beleza, Niterói/RJ (Fonte: Laboratório de
Hepatites Virais - IOC - FIOCRUZ)
Os usuários de crack foram recrutados em centros de tratamento ou em áreas
de consumo da droga nas cidades de Macaé, Rio de Janeiro, Salvador no período
de novembro de 2010 a junho de 2011. Este estudo foi realizado em colaboração
com o Instituto de Psiquiatria da UFRJ e Universidade Federal da Bahia (UFBA) e
tinha como objetivo avaliar a prevalência de doenças infecciosas como hepatites B e
C, e HIV bem como a análise de fatores de risco para a aquisição destes agravos e
características de uso da droga nesta população.
4.4 - População de alta prevalência para o HCV
O grupo III foi composto por pacientes atendidos em Centros de
Referência para Hepatites Virais, como o Ambulatório de Hepatites Virais do
IOC, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF/UFRJ) e Hospital
Universitário Antonio Pedro (HUAP/UFF) (Fig. 4.15) no período de junho de
2011 a novembro de 2012. Os indivíduos encaminhados a estes centros de
referência são provenientes de postos de atendimento médico (PAM), bancos
de sangue ou hospitais associados ao Sistema Único de Saúde (SUS). O
36
Ambulatório de Hepatites virais do IOC atende em média 100 pacientes por
semana, o ambulatório de hepatologia do HUCFF tem média de 200 pacientes
semanais e o ambulatório de hepatites do HUAP tem média de 30 pacientes
semanais. Todos estes centros são locais de esclarecimento de diagnóstico ou
tratamento de hepatites virais.
A
B
C
Figura 4.15: Ambulatório de Hepatites Virais - IOC – Fiocruz (A) (Fonte:
Laboratório de Hepatites Virais - IOC - FIOCRUZ; Hospital Universitário
Clementino Fraga Filho – UFRJ (B); (C) Hospital Universitário Antonio Pedro
(Fontes: http://www.olharvirtual.ufrj.br; Laboratório de Hepatites Virais – IOC –
FIOCRUZ; http://www.huap.uff.br)
4.5 - Coleta de amostras biológicas
As amostras de sangue foram coletadas por punção venosa periférica (8
mL) (Figura 4.16) e submetidas à centrifugação a 3000g (Centrífuga Centurion
Vector Invertes System, Laborline, Brasil) à temperatura de 25.ºC durante 10
minutos para obtenção do soro. O soro foi acondicionado em um microtubo
previamente identificado com o número de registro e armazenado à
temperatura de -20ºC até a realização das análises.
Figura 4.16: Procedimento para a coleta de sangue por
punção venosa, para obtenção do soro, ou aplicação no
papel de filtro. (Fonte: Laboratório de Hepatites Virais IOC - FIOCRUZ)
37
A coleta de SSPF foi realizada por punção venosa periférica ou punção
digital, onde 3 a 5 gotas (cerca de 70 µl) de sangue total foram aplicados em
um circulo de 12,5 mm de diametro de papel de filtro (Whatman Protein Saver
Card 903, GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Suécia) (Figura 4.17). Após a
coleta, o SSPF foi mantido à temperatura ambiente por 4 horas até a completa
absorção, e colocado em sacos plásticos individuais contendo um envelope
com sílica gel e armazenados a -20ºC até o processamento.
Figura 4.17: Procedimento para a coleta de sangue por
punção digital, para aplicação no papel de filtro.(Fonte:
Cristiane Albuquerque - Agencia Fiocruz de Notícias http://www.agencia.fiocruz.br/sangue-seco-alternativa-para-odiagostico-da-hepatite-b)
Para o processamento da amostra de SSPF, um disco de papel de 3 mm
de diametro foi cortado e acondicionado em tubo com 300 µl de tampão
fosfato-salino com adição de albumina sérica bovina (PBS/BSA) 0,5% por 1824 h a 2-6 ºC. Em seguida, o disco de SSPF foi transferido do tubo com auxílio
de uma ponteira para o interior de uma seringa de 3 mL. Esta seringa foi
acoplada em um tubo de 15 mL contendo um microtubo com o tampão de
eluição. Em seguida, este sistema foi submetido à centrifugação durante 10
min a 2200g à temperatura ambiente, e apenas os microtubos contendo o
eluato foram removidos do sistema e armazenados para testagem (Villar et al.,
2011; Marques et al., 2012) (Figura 4.18).
38
Figura 4.18: Etapas do processamento das amostras de sangue coletadas em papel de filtro.
A) 300µl de tampão PBS/BSA 0,5% são colocados em criotubos de 1 ml. B e C) um disco de 3
mm é cortado, utilizando cortador manual. D) o disco é colocado no criotubo contendo o
tampão PBS/BSA 0,5%. E) As amostras são homogeneizadas. F, G e H) os discos são
transferidos para uma seringa acoplada a um tubo Falcon de 15ml, com auxílio de uma
ponteira. J) as amostras são centrifugadas por 5 minutos. L) os eluatos obtidos são as
amostras que serão testadas (Fonte: Laboratório de Hepatites Virais - IOC - FIOCRUZ)
4.6 - Determinação de anticorpos contra o vírus da Hepatite C (anti-HCV)
A
detecção
do
anti-HCV
foi
realizada
utilizando
um
ensaio
imunoenzimático comercial (Murex anti-HCV v.4.0, Diasorin, Itália), e 20 µl de
soro foram utilizados no teste de acordo com instruções do fabricante. Para a
detecção do anti-HCV em amostras de SSPF, o volume de amostra,
aumentado em 20 vezes (volume final igual a 200µL) e as etapas seguintes do
protocolo foram realizadas seguindo as recomendações do fabricante (Marques
et al., 2012).
4.6.1 Princípio do teste imunoenzimático
O teste Murex anti-HCV (versão 4.0) consiste em um método de
detecção direta, e são empregados micropoços revestidos com antígenos da
região do core, NS3, NS4 e NS5 do HCV. Durante o curso da primeira
incubação da amostra de soro diluída no respectivo micropoço, todos os
39
anticorpos anti-HCV presentes na amostra se ligam aos antígenos imobilizados
presentes sensibilizados na placa. Após a lavagem que irá remover o material
não ligado, os anticorpos anti-HCV capturados são incubados com um
conjugado que contém anticorpos anti-IgG monoclonais humanos ligados a
peroxidase. Na segunda incubação, o conjugado se liga aos anticorpos
imobilizados na primeira etapa. Após a remoção do excesso de conjugado, a
enzima ligada é detectada através da adição de uma solução contendo 3,3',
5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e peróxido de hidrogênio. As amostras com
resultado reagente apresentaram coloração roxa. A reação enzimática é
interrompida com a adição de ácido sulfúrico e aparecimento de coloração
laranja cor. A quantidade de conjugado ligado, e, portanto, a cor, nos poços,
está diretamente relacionada com a concentração de anticorpo na amostra e
será medida pela fotometria, na faixa de leitura de 450 nm usando como faixa
de referência 620-690 nm.
4.6.2- Procedimento do teste Murex anti-HCV versão 4.0 (Diasorin, Itália)
Para a realização do ensaio, foram adicionados 20 µl de amostras soro e
controles e 180 µl de diluente de amostra na respectiva micro cavidade da
placa de 96 poços, e para os testes em SSPF foram adicionados 100µl da
amostra eluída e 100 µl do diluente. Em seguida a reação foi incubada a 37ºC
por 1 hora. Após a incubação, cada cavidade da microplaca foi lavada com
aproximadamente 300 µL, utilizando tampão de lavagem (glicina/borato) em
uma concentração de 20:1, fornecida pelo teste por 5 vezes. Em seguida,
foram adicionados 100 µL do conjugado e a reação foi incubada a 37ºC por 30
minutos, protegido da luz, após o término, a microplaca foi lavada como
descrito anteriormente. Logo após, foram adicionados 100µL da solução de
substrato, onde permaneceu em incubação a 37ºC por 30 minutos. Por fim,
adicionou-se 50µL de ácido Sulfúrico (1N) para que a reação fosse
interrompida e realizou-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro com
filtro de 450nm e com filtro de referência de 620-630 nm.
40
O cálculo do valor de corte foi realizado de acordo com as instruções do
fabricante, realizando-se a média dos dois controles negativos, e a este valor
foi somado 0,6. As amostras que forneceram uma absorbância inferior ao valor
do ponto de corte foram consideradas não reagentes no ensaio, logo as que
tiveram valor igual ou superior ao ponto de corte foram consideradas reagentes
no ensaio.
4.7 - Detecção do RNA do HCV (Abbott Real time HCV, Abbott, EUA)
As amostras anti-HCV reagentes foram submetidas à detecção do HCV
RNA utilizando PCR em tempo real comercial (Abbott Real time HCV, Abbott,
EUA). O ensaio Abbott RealTime HCV emprega a transcrição reversa
associada a reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para a quantificação
do RNA do HCV em soro e plasma humano utilizando como alvo a região 5'NC
do HCV com alta precisão (Shinol et al., 2012).
O HCV Abbott RealTime é capaz de detectar os genótipos do 1 - 6 do
HCV (Mallory et al., 2014) e apresenta limite de detecção de 12 IU/mL (1.08 log
IU/mL) quando 0.5 mL de volume de amostra é empregado. O teste apresenta
especificidade de ≥ 99.5% (Abbott Real Time HCV, 2011).
4.7.1 Princípio do teste Abbott Real Time HCV
Este ensaio utiliza a RT-PCR para detectar e amplificar a região 5’NC e
gerar o produto amplificado a partir do genoma de RNA do HCV nas amostras,
e uma sequência de RNA sem relação com a sequência alvo do HCV é
introduzida em cada uma das amostras no início da preparação. Esta
sequência de RNA isolada é simultaneamente amplificada por RT-PCR, e
serve de controle interno (CI) para demonstrar que o processo foi corretamente
executado em cada uma das amostras. A quantidade de sequência alvo do
HCV presente em cada ciclo de amplificação é medida no equipamento Abbott
m2000rt™ através da utilização de sondas de oligonucleotídeos marcadas com
fluorescência. As sondas não geram sinal se não estiverem especificamente
41
ligadas ao produto amplificado. O ciclo de amplificação no qual o sinal de
fluorescência é detectado pelo Abbott m2000rt é proporcional ao logaritmo da
concentração de RNA do HCV presente na amostra original (Abbott Real Time
HCV, 2013).
4.7.2 Procedimento do Ensaio Abbott Real Time HCV
4.7.2.1 - Preparação das amostras e extração do HCV RNA
O ensaio utilizado para o procedimento de extração do RNA viral foi o
Abbott Real Time (Abbott, Chicago, EUA), que utiliza um sistema de
Preparação de Amostra (Sample Preparation System – Abbott Promega) que
contém os seguintes reagentes: (1) Solução de lise (TRIS 100 mM contendo
tiocianato de guanidina e detergente), (2) Solução de lavagem 1 (Acetato 50
mM contendo tiocianato de guanidina e detergente), (3) Solução de lavagem 2
(água livre de nuclease), (4) Tampão de eluição (solução fosfato 20 mM com
conservante), (5) Micropartículas (1,5% de micropartículas em 50% de solução
de lise).
Antes de iniciar o procedimento, as amostras, controles internos, positivo
e negativo e os demais reagentes da amplificação foram descongelados a 4ºC
e em seguida as amostras foram centrifugadas a 2000 x g durante 5 minutos.
Após o descongelamento, as amostras contendo volume total de 0,8 mL (0,5
mL requerido no teste e volume sobressalente de 0,3 mL) foram colocadas na
rack do equipamento m24sp. O protocolo de extração foi configurado no
programa do equipamento m24sp conforme instruções do fabricante.
4.7.2.2 – Amplificação e detecção do HCV RNA
Após a etapa de extração do HCV RNA, procedeu-se a preparação
manual da mistura de reação (Abbott RealTime HCV genotype II Amplification
Reagent kit), que consiste em três reagentes: A (Reagente de ativação), B
(Enzima DNA Polimerase rTth) e C (Reagente de oligonucleotídeos). O
42
equipamento m24sp foi organizado de acordo com o protocolo de preparação
da placa e o programa foi configurado para o procedimento de amplificação. No
equipamento, 50µl de RNA eluído obtido no processo de extração foi
adicionado em cada micro cavidade da placa de 96 poços (Abbott 96-well
optical reaction plate) que contem 50 µl da mistura de reação. Em seguida, a
placa foi selada e transferida para o equipamento m2000rt.
A concentração de RNA viral do HCV na amostra ou controle é calculada
a partir da curva de calibração memorizada. O equipamento Abbott m2000rt
apresenta automaticamente os resultados na estação de trabalho do m2000rt.
Os resultados do ensaio podem ser apresentados em UI/ml ou em log UI/ml.
4.8 Teste de Genotipagem (Abbott Real Time HCV Genotype II)
As amostras de soro que tiveram HCV RNA detectado com quantificação
acima de 500 UI/mL foram genotipadas utilizando o teste Abbott RealTime HCV
Genotype II. Esta metodologia determina os genótipos 1, 2, 3, 4, 5 e 6, e os
subtipos 1a e 1b por meio do uso de sondas fluorescentes marcadas com
oligonucleotídeos específicos dos genótipos e subtipos, através da tecnologia
de PCR em Tempo Real.
4.8.1 Princípio do Teste de Genotipagem (Abbott RealTime HCV
Genotype II)
Este teste tem como alvo a região 5'NC do vírus, para a classificação
dos genótipos do HCV 1, 2, 3, 4, 5 e 6, e a região de NS5B para determinação
dos subtipos 1a e 1b (Figura 4.19). Este ensaio utiliza sonda do tipo Taqman
Minor Grove Binder (MGB) Probe, uma sonda linear composta por uma
molécula quencher e outra repórter, que são atraídas uma pela outra. Este
teste possui limites de detecção de 500UI/mL, tendo como especificidade de
100% e sensibilidade de 98,3%-100%.
43
Figura 4.19: Regiões alvo do gene do vírus HCV utilizadas para o teste de genotipagem
utilizando o equipamento Abbott Real Time HCV Genotype II.
Este teste utiliza quatro conjuntos de iniciadores da PCR, o primeiro
conjunto de iniciadores tem como alvo uma sequência dentro da região 5' não
traduzida do genoma do HCV, projetado para amplificar os vírus isolados. O
segundo conjunto de iniciadores é desenhado para amplificar a região não
estrutural 5b (NS5b) do genótipo 1 O terceiro conjunto de iniciadores do HCV é
projetado para amplificar a região NS5b do genótipo 1b. Por último, o quarto
conjunto de iniciadores amplificam o controle IC.
O ensaio requer três reações separadas para detectar os genótipos 1 ,
1a , 1b e 2-5. A reação A é projetada para detectar todos os isolados do HCV,
o genótipo 3, e subtipo 1a. A reação B é projetada para detectar o genótipo 1,
2, e o subtipo 1b. A reação C é capaz de detectar os genótipos 4, 5 e isolados
do genótipo 6 (Quadro 4.1) A amplificação de ambos os alvos do HCV e do
controle interno acontece simultaneamente na mesma reação. As sondas
específicas dos genótipos e específicas do IC, dentro de cada reação são
marcadas com fluoróforos diferentes, permitindo assim a detecção simultânea
dos produtos de amplificação dos alvos mencionados.
44
Quadro 4.1 – Sondas utilizadas para detecção dos genótipos e subtipos
Reação
A
B
C
Sonda
Corante Fluorescente
Todos os isolados do HCV
FAM
Subtipo 1a
VIC
Genótipo 3
NED
Genótipo 2
FAM
Subtipo 1b
VIC
Genótipo 1
NED
Genótipo 4
FAM
Genótipo 5
VIC
Genótipo 6
NED
Controle interno (CI)
Quasar 670
Corante de referência
ROX
A-C
Durante a fase de hibridização de cada ciclo de amplificação, as sondas
hibridizam em seus respectivos alvos. A extremidade 5’ de cada sonda
específica do HCV é marcada com uma porção da sonda fluorescente,
enquanto que a extremidade 3’ é marcada com um quencher. Na ausência das
sequências alvo, a fluorescência não é emitida, enquanto que na presença da
sequencia alvo e consequente amplificação, ocorre a hidrolise da sonda.
Durante a extensão da cadeia de DNA, a atividade exonuclease 5’ a 3’ da
polimerase rTth degrada a sonda hibridizada em nucleotídeos constituintes,
separando assim o quencher e o fluorórofo, permitindo a emissão fluorescente
e a detecção.
45
4.8.2 Procedimento do ensaio de genotipagem Abbott Real Time HCV
Genotype II
A extração do RNA foi realizada conforme descrito do item 4.7.2.1,
seguindo as recomendações do fabricante. Todo o armazenamento e
preparação da amostra e controles foram realizados em área exclusiva de
preparação.
As amostras e os controles utilizados foram descongelados a uma
temperatura entre 15-30ºC, e submetidos ao agitador por 2-3 segundos. Os
reagentes de
amplificação foram armazenados na geladeira para o
descongelamento
a
4ºC
durante
o
período
da
extração
automática
(aproximadamente 3 horas).
A mistura de reação de amplificação foi feita utilizando os seguintes
itens:
(1) Controle interno (menos de 0,01% de Armored RNA não infeccioso
com sequências do controle interno em plasma humano negativo);
(2) Reagente de amplificação A: contém oligonucleotídeos sintéticos (6
primers e 5 sondas), dNTPs, e dimetilsulfoxida em solução tamponada com
corante de referência; rTth polimerase, e Reagente de ativação (30mM de
solução de cloreto de manganês);
(3) Reagente de amplificação B: contém oligonucleotídeos sintéticos (6
primers e 5 sondas), dNTPs, e dimetilsulfoxida em solução tamponada com
corante de referência; rTth polimerase, e Reagente de ativação (30mM de
solução de cloreto de manganês);
(4) Reagente de amplificação C: contém oligonucleotídeos sintéticos (4
primers e 4 sondas), dNTPs, e dimetilsulfoxida em solução tamponada com
corante de referência; rTth polimerase, e Reagente de ativação (30mM de
solução de cloreto de manganês);
Os reagentes foram manualmente distribuídos na placa de 96 poços,
sendo 40L da mistura correspondente (A, B e C), e 20L do RNA extraído da
mesma amostra dispostos em três poços distintos, conforme as instruções do
fabricante. A placa foi selada e incubada por 10 minutos a temperatura
46
ambiente (23ºC). Em seguida, a etapa de amplificação e detecção foi realizada
no equipamento Abbott m200rt.
O
equipamento
Abbott
m2000rt
apresenta
automaticamente
os
resultados “Genotype Call” na estação de trabalho Abbott m2000rt. Os
resultados do ensaio e as interpretações serão apresentados em genótipo e/ou
subtipo, no caso do genótipo 1, e os controles com a informação “passed”,
quando válidos.
4.9 - Avaliação do desempenho do ensaio imunoenzimático em amostras
de SSPF e dos fatores de risco para infecção pelo HCV
Os dados obtidos dos resultados dos testes sorológicos e moleculares
foram codificados e digitados em uma planilha de dados criada no programa
Microsoft Excel XP. Análise estatística descritiva foi realizada com cálculo de
médias, frequências e intervalos de confiança (IC) de 95%. Para comparação
de prevalências, foi utilizado o teste do Qui-quadrado. Um valor de p< 0,05 foi
estabelecido como nível de significância.
Apenas amostras com resultados definidos (reagentes ou não
reagentes) foram incluídas para avaliação do desempenho dos testes.
Amostras com sorologia indeterminada foram excluídas da análise.
Para avaliação da concordância entre o perfil sorológico das amostras
dos painéis e os resultados apresentados pelos testes imunoenzimáticos em
SSPF, procedeu-se à análise de tabelas de contingência e cálculo da
estatística Kappa. O desempenho dos testes foi avaliado com base na
sensibilidade clínica (Sc), especificidade (E), valores preditivos positivo (VPP) e
negativo (VPN). Para avaliar os fatores de risco, a reatividade de anti-HCV foi
empregada como fator dependente.
Toda a análise estatística, incluindo os cálculos de sensibilidade e
especificidade dos testes diagnósticos foram realizados utilizando o
programa GraphPad InStat 3.01 (GraphPad software, San Diego, CA),
MedCalc (version 9.2.1.0, MedCalc Software, Bélgica) e SPSS versão 20.0.
47
Para a análise dos fatores de risco associados à infecção pelo HCV,
foi empregado o programa Statistical Package for the Social Sciences
(SPSS for Windows, versão 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). As
estatísticas descritivas foram geradas para as respostas obtidas nos
questionários, e foi utilizado o qui-quadrado de independência ou de
tendência.
As
variáveis
foram
selecionadas
dos
questionários
socioeconômicos e de fatores de risco, pela sua relevância e significância
estatística utilizando análise bivariada utilizando o modelo de regressão
logística de forma gradual. Os intervalos de confiança de 95% (IC 95%)
também foram calculados e um valor de p <0,05 foi considerado
estatisticamente significativo na análise bivariada.
48
5. RESULTADOS
A tabela 5.1 mostra o número de amostras de soro e sangue seco
coletadas de acordo com os Estados e as diferentes regiões do Brasil,
pertencentes ao Grupo I, e as Populações que compõem os Grupos II e III.
Tabela 5.1 – Número de amostras de soro e SSPF coletadas em cada estado e
populações.
Grupos
Estados
Soro
SSPF
Mato Grosso do Sul
330
330
Tocantins
582
582
Amazonas
230
230
Pernambuco
0
56
Ceará
0
53
Piauí
0
83
131
131
Usuários de Drogas não
injetáveis
207
207
Profissionais de beleza
289
289
Pacientes com suspeita de
Hepatite C
254
254
Grupo I – Indivíduos de área de baixa
endemicidade
Rio de Janeiro
Populações
Grupo II – Indivíduos com maior vulnerabilidade
para aquisição da infecção pelo HCV
Grupo III – Indivíduos de área de alta
endemicidade
5.1 – Detecção de marcadores anti-HCV em soro e sangue seco em papel
de filtro
As amostras de soro e SSPF foram submetidas a detecção de
anticorpos anti-HCV (EIE) em cada grupo para determinação os valores de
sensibilidade, especificidade e concordância.
Considerando a população total estudada, 1788 amostras pareadas de
soro e SSPF foram analisadas. Nesta avaliação, 240 amostras de soro foram
anti-HCV reagentes e destas 215 também apresentaram resultado reagente no
49
SSPPF fornecendo sensibilidade igual a 89,58%. Por outro lado, o anti-HCV
não foi detectado em 1548 amostras de soro, dentre as quais 1545 também
não apresentaram este marcador no SSPF apresentando especificidade igual a
99,81%. A concordância geral do ensaio foi igual a 98,4% e a concordância
kappa foi igual a 0,930 indicando um teste com excelente desempenho.
No grupo I foram avaliadas 1043 amostras pareadas de soro e SSPF,
onde 7 amostras foram reagentes para anti-HCV no soro, e destas 4 foram
reagentes em SSPF fornecendo sensibilidade igual a 57,1%. Das 7 amostras
anti-HCV reagentes no soro, 5 foram submetidas à detecção do RNA do HCV e
3 tiveram carga viral detectada, com carga viral média igual a 2380 (±1880,4)
UI/mL. Em relação às amostras não reagentes no soro (n=1036), todas
também foram não reagentes no SSPF obtendo 100% de especificidade. A
concordância geral do ensaio neste grupo foi igual a 99,7% e a estatsística
kappa foi 0,726.
Em relação ao desempenho do teste por localidade no grupo I,
observamos proporções semelhantes de resultados verdadeiro negativos,
porém houve maior número de resultados falso positivos no Mato Grosso do
Sul (1,5%), seguido pelo Rio de Janeiro (0,7%) e Tocantins (0,2%) (Tabela
5.3).
No grupo II, foram incluídos 491 indivíduos que forneceram amostras
pareadas de soro e SSPF, sendo 5 amostras foram reagentes para anti-HCV
no soro e destas 2 também tiveram resultado reagente no SSPF com
sensibilidade igual a 40%. Entre as 5 amostras anti-HCV reagentes no soro,
apenas 1 teve o HCV RNA detectado no soro com carga viral igual a 6582
UI/mL (Log 3,82). Em relação as 486 amostras não reagentes no soro, 485
também foram não reagentes no SSPF fornecendo especificidade igual a
99,8%. A concordância do ensaio neste grupo foi igual a 99,2% e a estatística
kappa foi igual a 0,496. Neste grupo observamos 487 amostras com resultados
concordantes para anti-HCV entre soro e SSPF e 4 amostras com resultados
discordantes entre os fluidos. Foi detectado HCV RNA em duas amostras de
soro com resultados discordantes (anti-HCV reagentes no soro e não
reagentes no DBS), e somente uma apresentou resultado reagente com carga
viral de 6582UI/mL.
50
O grupo III compreendeu 254 pacientes, e 228 foram anti-HCV
reagentes no soro e destes 209 também tiveram anti-HCV em SSPF
fornecendo
uma
sensibilidade
igual a 91,7%.
Destas 209
amostras
concordantes, 164 também tiveram o HCV RNA detectado no soro com a
média de carga viral em aproximadamente 21915 (±40923) UI/mL. Vinte seis
amostras foram anti-HCV não reagentes no soro e destas 24 também foram
não reagentes no SSPF fornecendo uma especificidade igual a 92,3%. A
concordância do ensaio neste grupo foi igual a 91,7% e a estatística kappa foi
igual a 0,651. Os valores preditivos positivos e negativos foram 99% e 54%,
respectivamente. Neste grupo houve grande quantidade de resultados
verdadeiro positivos (91,6%) e negativos (98,2%) em comparação com os
resultados falsos positivos (8,3%) e negativos (7,7%) (Tabela 5.3.)
Na tabela 5.2, podemos observar o número de resultados concordantes
e discordantes em cada população avaliada que forneceu amostras pareadas
de soro e SSPF.
51
Tabela 5.2 - Valores de acurácia do teste de detecção de anti-HCV em SSPF em comparação aos resultados obtidos em amostras
de soro em cada grupo estudado
Grupos/Populações
VP
FN
VN
FP
Sens (%)
Esp (%)
VPP (%)
VPN (%)
População geral (n=1788)
215
3
1545
25
89,58 (85,01-93,14)
99,81 (99,43-99,96)
98,62 (96,03-99,70)
98,41(97,66-98,87)
Tocantins (n=582)
3
0
578
1
75,00 (19,41-99,37)
100,00 (99,36-100)
100,00(29,24-100)
99,83(99,04-100)
Rio de Janeiro (n=131)
0
0
130
1
NR
100,00 (97,20-100)
NR
99,24(85,82-99,98)
Mato Grosso do Sul (n=330)
1
0
324
5
16,67 (0,42-64,12)
100,00 (98,87-100)
10,000(2,50-100)
98,48(96,49-99,50)
2
1
285
2
50 (6,76-93,24)
99,46 (97,04-99,99)
66,67(9,43-99,16)
98,93(96,19-99,87)
0
0
200
1
NR
100,00(98,17-100,00)
NR
99,50(97,26-99,99)
209
2
24
19
91,67 (87,29-94,91)
92,31 (74,87-99,05)
99,05(96,62-99,89)
55,81(39,88-70,92)
Grupo I
Grupo II
Profissionais de Beleza
(n=290)
Usuários de crack (n=201)
Grupo III
Provenientes dos ambulatórios
(n=254)
52
5.2 - Determinação da prevalência de anticorpos anti-HCV em soro e
sangue seco em papel de filtro nos grupos estudados
A prevalência de anticorpos anti-HCV foi determinada utilizando as
amostras de SSPF e de soro, onde o número de indivíduos anti-HCV reagentes
foi dividido pelo número total de indivíduos estudados. No grupo I, a
prevalência de anti-HCV empregando soro foi igual a 0,4% e com SSPF foi
igual a 0%. No grupo II, a prevalência de anti-HCV empregando soro foi igual a
1,02% e com SSPF foi igual a 0,4%. No grupo III, verificamos que a prevalência
de anti-HCV foi igual a 90% empregando o soro e 83,3% empregando o SSPF.
5.2.1 - Prevalência de anti-HCV de acordo com as regiões
estudadas
As prevalências de anticorpos anti-HCV em soro e SSPF também
foram determinadas em cada localidade do grupo I, e os valores foram iguais a
0,68% em soro e 0,51% em SSPF em Tocantinópolis; 0,76% em soro e 0% em
SSPF em Nova Iguaçu; 1,81% em soro e 0,3% em SSPF nas comunidades do
Pantanal. Ao avaliar a prevalência de anti-HCV em profissionais de beleza
observamos 0,8% em soro e 0,7% em SSPF e em usuários de crack as
prevalências foram 0,5% em soro e 0% em SSPF.
Os indivíduos do Pernambuco, Amazonas, Ceará e Piauí forneceram
somente amostras de SSPF, onde uma amostra anti-HCV foi detectada em
Pernambuco correspondendo a uma prevalência de 1,7% (1/56) e nos outros
locais a prevalência de anti-HCV de 0%.
5.3 - Detecção de marcadores anti-HCV em SSPF em comparação a
detecção do HCV RNA no soro
Entre as 240 amostras de soro anti-HCV reagentes, 235 foram
submetidas à detecção do HCV RNA e destas 176 foram HCV RNA reagentes.
Ao avaliarmos, a concordância entre a detecção de anti-HCV no SSPF e a
detecção do HCV RNA no soro, verificamos que a maioria das amostras com
HCV RNA detectado no soro também apresentaram anti-HCV no SSPF, 94,3%
53
(166/176). Entretanto o anti-HCV também foi detectado na maioria das
amostras de SSPF cujo soro não apresentava RNA do HCV, demonstrando a
aplicabilidade do método independentemente da detecção do HCV RNA no
soro (81,3%). (Tabela 5.4).
As médias de densidade ótica/valor de corte (DO/PC) das amostras
concordantes e discordantes também foram calculadas. No grupo de 166
amostras que foram anti-HCV reagentes no SSPF e tiveram HCV RNA
detectado no soro, a média da relação da densidade ótica e ponto de corte
(DO/PC) foi de 6,275 (±2,375) em amostras de SSPF e 6,638 (±2,209) em
soro. No grupo de amostras que tiveram o HCV RNA detectado no soro e
foram anti-HCV não reagente no SSPF (N=10), a média de DO/PC foi de 0,670
(±1,625) em SSPF e 4,420 (±2,993) em soro. Para as 11 amostras que foram
HCV RNA não detectado no soro e anti-HCV não reagente no SSPF, a média
de DO/PC foi igual a 0,688 (±1,165) em SSPF e 3,644 (±2,208) em soro. Por
fim, no grupo de 48 amostras que foram anti-HCV reagentes no SSPF e HCV
RNA não detectado no soro, a média de DO/PC de a 5,491 (±2,425) de SSPF e
5,882 (±2,552), em soro.
Tabela 5.3 - Comparação entre a detecção de anti-HCV em SSPF
e a detecção do HCV RNA em amostras de soro (n=235).
Anti-HCV em SSPF
HCV RNA no soro
Detectado
Não detectado
Reagente
166
48
Não Reagente
10
11
54
5.4 - Genotipagem das amostras HCV RNA detectado
Foi possível realizar a genotipagem do HCV RNA em 153 amostras HCV
RNA reagentes (153/176), a maioria dos indivíduos apresentava o genótipo 1
(84,9%) com proporções decrescentes para os genótipos 3 (9,1%), 2 (1,3%) e
5 (1,3%). A tabela 4.5 mostra o número de amostras que tiveram anti-HCV
reagentes e o HCV RNA detectados como amostras concordantes, e as
amostras anti-HCV reagentes que não tiveram o HCV RNA detectado como
amostras discordantes.
Tabela 5.4 - Comparação dos resultados obtidos na genotipagem
do HCV em amostras de soro em relação aos resultados de antiHCV obtidos em amostras de soro e SSPF.
Anti-HCV reagente Soro e no
SSPF
Anti-HCV reagente no
soro
127
7
2 (2)
2
0
3 (14)
14
0
4 (0)
0
0
5 (2)
2
0
6 (0)
0
0
Genótipos (n)
1 (134)
55
5.5 - Características sócio demográficas da população estudada
As características sócio demográficas de cada grupo avaliado no
estudo estão apresentadas na tabela 5.5. O grupo I era composto por 1465
indivíduos, o grupo II contava com 491 indivíduos e o grupo III, 254 indivíduos.
Houve predomínio do sexo feminino em todos os grupos e a média de idade foi
maior no grupo III com médias decrescentes para os grupos II e I.
Nos grupos I e III havia maior número de indivíduos casados e com
ensino médio, enquanto no grupo II havia maior número de indivíduos solteiros
e com ensino fundamental. A maioria dos indivíduos recebia entre 1 a 3
salários mínimos em todos os grupos avaliados. Em relação à raça, houve
predomínio de indígenas no grupo I, pardos no grupo II e brancos no grupo III.
56
Tabela 5.5 - Características sócio demográficas dos grupos incluídos no estudo
Dados
Grupo I
n=1465
Grupo II
n=491
Grupo III
(n=254)
798 (54,5%)
542 (37,0%)
125 (8,5%)
250 (48,7%)
239 (50,9%)
2 (0,4%)
154 (60,6%)
99 (39,0%)
1 (0,4%)
29,7 (±18,1)
31,06 (±13,8)
54,7 (±10,6)
Estado Civil
Solteiro
Casado
Divorciado
União estável
Viúvo
Não informado
79 (5,4%)
95 (6,5%)
7 (0,5%)
21 (1,4%)
5 (0,3%)
1258 (85,9%)
261 (53,1%)
153 (31,2%)
38 (7,7%)
0 (0%)
8 (1,6%)
31 (6,3%)
64 (25,2%)
129 (50,8%)
24 (9,4%)
6 (2,4%)
22 (8,6%)
9 (3,5%)
Escolaridade
Analfabeto
Educação Infantil
Ensino fundamental
Ensino médio
Ensino superior
Pós Graduação Completa
Não informado
33 (2,2%)
76 (5,2%)
199 (13,6%)
258(17,6%)
72 (4,9%)
23 (1,5%)
804 (54,9%)
6 (1,2%)
38 (7,7%)
233 (47,4%)
167 (34,0%)
31 (6,3%)
01 (0,2%)
15 (3,0%)
2 (0,8%)
54 (21,2%)
62 (24,4%)
94 (37,0%)
27 (10,6%)
03 (1,2%)
12 (4,7%)
Sexo
Feminino
Masculino
Não informado
Idade (anos)
Média (±desvio padrão)
Renda (salário mínimo)
Menos de 1 salário mínimo
74 (5,0%)
10 (2,0%)
12 (4,7%)
1 a 3 salários mínimos
232 (15,8%)
222 (45,2%)
163 (64,2%)
4 a 6 salários mínimos
94 (6,4%)
102 (20,8%)
46 (18,1%)
7 a 9 salários mínimos
34 (2,3%)
25 (5,1%)
05 (1,9%)
10 a 12 salários mínimos
26 (1,8%)
06 (1,2%)
10 (3,9%)
Mais de 12 salários mínimos
34 (2,3%)
04 (0,8%)
04 (1,6%)
Não informado
971 (66,3%)
122 (24,8%)
14 (5,5%)
Cor ou Raça
Preto
37 (2,5%)
91 (18,5%)
39 (15,3%)
Branco
81 (5,5%)
61 (12,4%)
111 (3,7%)
Amarelo
02 (0,1%)
05 (1,0%)
03 (1,2%)
Pardo
162 (11,0%)
108 (22,0%)
06 (2,4%)
Indígena
314 (21,4%)
01 (0,2%)
00 (0%)
Não informado
869 (59,3%)
22(5,8%)
95 (37,4%)
Grupo I – Indivíduos de área de baixa endemicidade; Grupo II – Indivíduos com maior
vulnerabilidade para aquisição da infecção pelo HCV; Grupo III – Indivíduos de alta
endemicidade;
57
5.6 - Comportamento de risco nos grupos estudados
Os comportamentos de risco para aquisição da infecção pelo HCV
foram sumarizados em cada grupo na tabela 5.6.
No grupo I, composto pelos indivíduos residentes em área de baixa
endemicidade, observou-se baixa frequência de comportamento de riscos.
Neste grupo, houve relato frequente de tratamento dentário (23,2%), seguido
pela prática de manicure (15,08%). Entre os que frequentavam manicure, 27
(14,2%) relataram o uso de alicate próprio e 63(33,3%) relataram o uso de
materiais esterilizados e/ou descartáveis durante o procedimento. Entre os 66
(4,5%) indivíduos que frequentavam pedicura, 13 (19,6%) relataram o uso de
alicate próprio e 43 (65,1%) relataram o uso de materiais esterilizados e/ou
descartáveis durante o procedimento. Entre os 242 indivíduos que relataram ter
sido vacinados para hepatite B, 98 completaram o esquema vacinal. Em
relação à cirurgia, dos 135 indivíduos que relataram ter realizado este
procedimento, somente 19 fizeram a cirurgia antes de 1994. Dos 37 indivíduos
que receberam transfusão de sangue, 8 (21,6%) deles receberam antes de
1994. A maioria dos indivíduos era heterossexual e grande parte deles não
usavam preservativo durante a relação sexual. Trinta e oito indivíduos
relataram doença sexualmente transmissível, 4 indivíduos relataram relação
sexual com parceiro com hepatite viral ou HIV, assim como 31 indivíduos
relataram convivência com pessoa com hepatite viral em casa. Entre os
indivíduos que relataram consumo de bebida alcoólica, 71 relataram o
consumo pelo menos 1 vez por semana.
No Grupo II, os fatores de risco mais frequentes foram: uso de drogas
ilícitas (41,8%), cirurgia (37,6%), tratamento dentário (34,8%), prática de
manicure (33%), tatuagem (31,2%) e pedicura (30,5%). Dos 162 indivíduos que
frequentavam manicure, 33 (20,3%) relataram o uso de alicate próprio e
94(58%) relataram o uso de materiais esterilizados e/ou descartáveis durante o
procedimento. Entre os 150 indivíduos que frequentavam pedicura, 30 (20%)
relataram o uso de alicate próprio e 85 (56,6%) relataram o uso de materiais
esterilizados e/ou descartáveis durante o procedimento. Entre os 75 indivíduos
58
que faziam depilação, 64 (85,3%) relataram o uso de material esterilizado e/ou
descartável.
Entre os 115 (16,5%) indivíduos que relataram vacinação para hepatite
B, 31(26,9%) completaram o esquema vacinal. Sessenta e cinco indivíduos
receberam transfusão de sangue, onde a transfusão foi realizada antes de
1994 em 36 (55,3%) deles. A maioria dos indivíduos era heterossexual e
raramente ou nunca utilizavam preservativo durante a relação sexual. Trinta e
seis indivíduos relataram doença sexualmente transmissível, 10 indivíduos
relataram relação sexual com parceiro com hepatite ou HIV, assim como 71
indivíduos relataram convivência com pessoa com hepatite em casa.
No Grupo III, composto por indivíduos provenientes dos ambulatórios
de Hepatites Virais, os comportamentos de risco mais frequentes foram
tratamento dentário (88,6%), uso de medicamento por via intravenosa (73,6%),
ida a manicure (64,6%) e transfusão sanguínea (49,6%).
O uso de alicate próprio foi relatado por 40 e 2 entre aqueles que
frequentavam manicure e pedicura, enquanto 73 e 5 relataram o uso de
materiais esterilizados e/ou descartáveis durante o procedimento de manicure
e pedicura, respectivamente. No grupo de indivíduos que relataram vacinação
para hepatite B, 98 (87,5%) completaram o esquema vacinal. Dos 126
indivíduos que receberam transfusão de sangue, 113 (89,6%) deles receberam
antes de 1994. A maioria dos indivíduos era heterossexual, tinha parceiro fixo,
porém não usavam preservativo durante a relação sexual. Dezenove indivíduos
relataram doença sexualmente transmissível, 18 indivíduos relataram relação
sexual com parceiro com hepatite viral ou HIV, assim como 45 indivíduos
relataram convivência com pessoa com hepatite viral em casa. Entre os 58
indivíduos que relataram consumo de bebida alcoólica, 29 relataram o
consumo pelo menos 1 vez por semana.
59
Tabela 5.6 - Características epidemiológicas da suposta via de infecção pelo HCV de
acordo com os grupos estudados
Grupo I
Grupo II
Grupo III
n=1465
n=491
n= 254
Comportamento de risco
Histórico de Cirurgia
135 (9,2%)
185 (37,6%)
36 (14,2%)
Transfusão de sangue
37 (2,5%)
65 (13,2%)
126 (49,6%)
Medicamento intravenoso
146 (9,9%)
77 (15,7%)
187 (73,6%)
Vacinação prévia para hepatite B
242 (16,5%)
115 (23,4%)
112 (44,1%)
Piercing
21 (1,4%)
79 (16,1%)
4 (1,5%)
Tatuagem
74 (5,0%)
153 (31,2%)
31 (12,2%)
Hemodiálise
3 (0,2%)
5 (1,0%)
4 (1,6%)
Acupuntura
48 (3,2%)
24 (4,9%)
34 (13,4%)
Manicure
189 (12,9%)
162 (33,0%)
164 (64,6%)
Pedicure
66 (4,5%)
150 (30,5%)
5 (1,9%)
Depilação
53 (3,6%)
75 (15,3%)
28 (11,0%)
Compartilhamento de lâminas
208 (14,2%)
75 (15,3%)
79 (31,1%)
Compartilhamento de escova de
dente
53 (3,6%)
NA
24 (9,4%)
Tratamento dentário
339 (23,1%)
171 (34,8%)
225 (88,6%)
Heterossexual
596 (40,7%)
285 (58,0%)
232 (91,3%)
Homossexual
5 (0,3%)
2 (0,4%)
03 (1,2%)
Bissexual
4 (0,3%)
0 (0%)
04 (1,6%)
Não informado
860 (58,7%)
204 (41,5%)
261 (17,8%)
217 (44,2%)
160 (63,0%)
103 (7,0%)
56 (11,4%)
57 (22,4%)
17 (1,2%)
4 (0,8%)
09 (3,5%)
Sempre
121 (8,2%)
52 (10,6%)
57 (22,4%)
Frequentemente
26 (1,8%)
17 (3,5%)
04 (1,6%)
Raramente
131 (8,9%)
114 (23,2%)
29 (11,4%)
Orientação Sexual
Número de parceiros sexuais por
ano
Fixo
<5
>5
Frequência de uso de camisinha
60
Nunca
182 (12,4%)
85 (17,3%)
138 (54,3%)
Prática de sexo oral
170 (11,6%)
187 (38,0%)
113 (44,4%)
Prática de sexo anal
94 (6,4%)
110 (22,4%)
81 (31,9%)
Uso de bebida alcoólica
249 (16,9%)
NA
58 (22,8%)
Uso de drogas ilícitas
28 (1,9%)
205 (41,8%)
38 (14,9%)
Grupo I – Indivíduos de área de baixa endemicidade; Grupo II – Indivíduos com maior
vulnerabilidade para aquisição da infecção pelo HCV; Grupo III – Indivíduos de alta
endemicidade; NA – não avaliado
5.7 - Prevalência de marcadores do HCV de acordo com comportamento
de risco da população estudada.
A análise bivariada dos comportamentos de risco para aquisição da
infecção pelo HCV foi realizada somente no grupo III (indivíduos provenientes
dos Ambulatórios de Hepatites Virais) devido a maior prevalência de anti-HCV
(Tabela 5.7). Nesta análise observamos que as variáveis idade (p-valor 0,008)
e compartilhamento de escova de dentes (0,032) não apresentaram associação
quando a presença de anti-HCV em SSPF foi considerada variável
dependente.
Tabela 5.7 - Análise Bivariada dos fatores de risco associados à prevalência de antiHCV em amostras de SSPF e soro no grupo III (pacientes provenientes dos
Ambulatórios de Hepatites Virais) (n=254).
Anti- HCV SSPF
Reagente
(n=211)
Variáveis
Não
reagente
(n= 42)
Idade
Análise
Bivariada
P-valor
0,008
≤50 anos
50
19
>50 anos
159
23
Compartilhamento de escova
de dentes
0,032
Sim
24
0
Não
154
39
61
6. DISCUSSÃO
Os estudos realizados em amostras de sangue seco em papel de filtro
tem seu início década de 60 na detecção de fenilcetonúria em neonatos
(Guthrie e Suzi, 1963) e posteriormente este tipo de coleta e amostras têm sido
empregados na detecção de marcadores de diversas doenças infecciosas, uma
vez que a coleta é fácil, não exige flebotomistas e técnicos especialistas
qualificados, e apresenta boa aplicabilidade para laboratório distantes dos
grandes centros, onde o envio e estocagem podem ser fatores críticos
(Solmone et al., 2001). A vigilância passiva de doenças infecciosas com uma
elevada proporção de casos assintomáticos ou longos períodos de incubação
não reflete a real situação epidemiológica da doença (Toledo Jr et al., 2001).
Portanto, a utilização do SSPF para detecção do marcador anti-HCV pode ser
útil para triagem de casos suspeitos de hepatite C, bem como para estudos
epidemiológicos.
O principal objetivo do presente estudo foi determinar a utilidade do
sangue seco em papel de filtro para diagnóstico e estudos de prevalência da
infecção pelo HCV em diferentes populações. Neste estudo foi possível
detectar o marcador anti-HCV em amostras de SSPF provenientes de grupos
com
diferentes
perfis
de
endemicidade
empregando
um
ensaio
imunoenzimático comercial adaptado como descrito previamente (Marques et
al., 2012). Considerando a população geral, o teste apresentou excelente
especificidade (99,7%) quando comparado com outros estudos realizados no
Brasil e exterior (Tuaillon et al., 2009; Marques et al., 2012; Ross et al., 2013) e
boa sensibilidade (89,4%), embora esta última tenha apresentado valores
menores do que aqueles observados em estudos anteriores (97 a 99,1%), o
que pode ter ocorrido devido às diferenças de valores preditivos nos testes
realizados nas populações ou dos ensaios imunoenzimáticos empregados
(Marques et al., 2012; Tuaillon et al., 2009; Ross et al., 2013).
Ao avaliar a eficiência do teste de detecção de anti-HCV em SSPF em
cada grupo do estudo, verificamos maiores valores de sensibilidade no grupo III
(91,7%) quando comparado aos grupos I (57,1%) (indivíduos saudáveis) e II
(40%) (indivíduos com comportamento de risco). Outro estudo realizado em
populações com recursos limitados na Índia demonstrou 100% de sensibilidade
62
na detecção de anti-HCV em SSPF, porém o número de amostras empregadas
foi relativamente menor (n=60) e o número de amostras anti-HCV reagentes foi
maior (51%, 31/60) (Nandagopal et al., 2014). Provavelmente os baixos valores
de sensibilidade encontrados nos grupos I e II, se devem ao fato de poucas
amostras terem apresentado resultados positivos, em especial no grupo dos
indivíduos saudáveis da população em geral, o que era esperado uma vez que
o Brasil possui baixa prevalência da doença.
A detecção do anti-HCV em SSPF também foi avaliada em relação à
detecção do HCV RNA nas amostras de soro anti-HCV reagentes
correspondentes, onde observamos que a detecção do anti-HCV em ocorre em
94,3%% (166/176) da presença do HCV RNA no soro. Do mesmo modo Mc
Carron e colaboradores (1999) também não observaram associação entre a
presença do HCV RNA no soro e detecção do anti-HCV em SSPF. Estes
resultados demonstram a aplicabilidade do SSPF para identificação de casos
de infecção ativa ou de resolução espontânea com boa sensibilidade e
especificidade.
Neste estudo também foi possível determinar os genótipos do HCV em
amostras de soro a fim de avaliar a possível interferência deste parâmetro na
detecção do anti-HCV em SSPF. No presente estudo, foi observada maior
prevalência do genótipo 1 (33,4%), seguido pelos genótipos 3 e 2 tal como
observado em outros estudos no Brasil e no mundo (Campiotto et al., 2005;
Gower et al., 2014; Messina et al., 2014; Veras et al., 2009; Vieira et al., 2011).
Maior prevalência do genótipo 1 do HCV também foi observada em estudo
realizado com amostras de SSPF (62%), seguido pelos genótipos 2 (23%) e 3
(15,3%) (Tejada-Strop et al., 2014). Provavelmente devido à alta prevalência do
genótipo 1 neste grupo, a detecção do anti-HCV em SSPF não foi associada ao
genótipo do HCV.
Em relação às prevalências de anti-HCV em SSPF e soro, verificamos
maior concordância do teste no grupo III, com proporções decrescentes pelos
grupos II e I, demonstrando maior eficiência do teste no grupo com maior
prevalência da infecção pelo HCV e indicando que o método pode ser bastante
útil na triagem de indivíduos com suspeita de hepatite C tal como observado
anteriormente (Marques et al., 2012).
63
No grupo I, foram incluídos indivíduos de diferentes regiões geográficas
do Brasil, onde a prevalência variou de 0% a 0,4%. Na região Norte, a
prevalência de anti-HCV em SSPF foi igual a 0,51% em Tocantins e 0% no
Amazonas, valores menores do que observado em estudo realizado com
amostras de soro na região Norte do país (3,22%) (Pereira et al., 2009). Na
região Nordeste, não houve detecção de anti-HCV em SSPF provenientes do
Piauí e Ceará, enquanto que em Pernambuco, a prevalência foi igual a 1,7%.
Almeida e colaboradores (2006) observaram prevalência de anti-HCV em soro
igual a 0,4% em estudo conduzido no interior da Bahia. Na região CentroOeste, a prevalência de anti-HCV foi igual a 0,3% em comunidades do
Pantanal semelhante ao que foi observado em indivíduos de comunidades
remanescentes dos quilombos localizados no Mato Grosso do Sul (0,2%) (Reis
et al., 2008). Na região Sudeste, a prevalência de anti-HCV em SSPF foi igual
a 0% no Estado do Rio de Janeiro, valor menor do que observado entre
crianças do mesmo Estado (0,1%) (Villar et al., 2014).
O grupo II foi representado por profissionais de beleza e usuários de
drogas não injetáveis, e a prevalência de anti-HCV foi igual a 0,8% em soro e
0,7% em SSPF. No Brasil, a prevalência de anti-HCV em usuários de drogas
não injetáveis varia de 1,25 a 36,9% empregando amostras de soro (Santos
Cruz et al., 2013, Pacheco et al., 2013) e em profissionais de beleza varia de
0,8% a 2% (Villar et al., 2014, Oliveira e Focaccia, 2010). No Rio de Janeiro, a
prevalência de anti-HCV encontrada em SSPF foi um pouco menor (0,4%) do
que aquela observada em estudos realizados com usuários de crack (1,25%) e
profissionais de beleza (0.8%) (Santos Cruz et al., 2013, Villar et al., 2014).
Para analisar as possíveis rotas de transmissão dos casos positivos de
hepatite C e as características demográficas das populações incluídas em
nosso estudo, divididas em 3 grupos (I, II e III), foi realizada a análise descritiva
das respostas obtidas pelos questionários aplicados, onde foram reportadas as
práticas associadas às possíveis fontes de aquisição do HCV e as
características epidemiológicas. O HCV é transmitido essencialmente por via
parental, principalmente através do sangue contaminado, e em proporção mais
baixa através de outros fluídos corporais (Clark et al., 2006). Embora a
incidência de infecção por HCV esteja aparentemente em declínio, os serviços
64
de saúde continuam a registrar novos casos da hepatite C com frequência
considerável, mas com vias de transmissão indefinidas (Rosa et al., 2014). A
Transmissão parenteral (uso de drogas intravenosas, exposição ocupacional),
hemodiálise, transmissão intradomiciliar, e, com uma proporção menor,
transmissão sexual e vertical, contabilizam cerca de 60-80 % das infecções ao
redor do mundo. No entanto, a causa da infecção não pode ser determinada
em 20-40% dos pacientes, principalmente nos países em desenvolvimento.
(Karmochkine et al., 2006).
Neste estudo houve maior participação do sexo feminino nos três
grupos analisados. No grupo II (n=491), composto por profissionais de beleza e
usuários crack, embora o predomínio geral tenha sido maior do sexo feminino,
ao analisarmos os dois subgrupos separados, verificamos alta proporção de
homens entre os usuários de crack, como também foi reportado por Sá e
colaboradores (2013) em um estudo realizado no estado do Piauí (84%), assim
como também demonstrado em estudo realizado no Rio de Janeiro (67%) e em
Salvador (89%) (Santos-Cruz et al., 2013). Em relação às médias de idade, o
grupo III (n=253), composto por pacientes atendidos nos ambulatórios,
apresentou a maior média de idade de 54,7 anos o que se justifica pela alta
prevalência de anti-HCV neste grupo. No Brasil, o teste sorológico para
identificar a infecção pelo HCV em bancos de sangue é obrigatório desde 10 de
novembro de 1993, de acordo com a lei 137614, logo, esta média de idade,
poderia explicar o fato da maioria ter possivelmente contraído o vírus por
transfusão de sangue.
Os comportamentos de risco mais frequentes entre os participantes do
grupo I foram relato de histórico de tratamento dentário (23,2%), seguido pela
prática de manicure (15%). Entre os 7 indivíduos com sorologia reativa para
anti-HCV no soro, a transfusão de sangue e compartilhamento intradomiciliar
de lâminas também foram citados. As práticas de tratamento dentário e
manicure têm sido reportadas na literatura como uma importante via de
transmissão do HCV (Mahboobi et al., 2014; Villar et al., 2014) em função da
possível exposição ao sangue contaminado durante estes procedimentos,
assim como o compartilhamento intradomiciliar de lâminas de barbear
(Cavalheiro et al., 2009) A transfusão de sangue e hemoderivados
65
provenientes de casos positivos para HCV era uma forma importante de
transmissão antes da introdução de testes de triagem nos bancos de sangue a
partir de 1994 (Martins et al., 2013).
No grupo II composto pelos profissionais de beleza e os usuários de
crack, 5 indivíduos foram anti-HCV reagentes no soro onde 4 deles possuem
histórico de cirurgia e 1 reportou ter realizado transfusão de sangue antes de
1994. Neste grupo os comportamentos de risco mais frequentes foram: uso de
drogas ilícitas, cirurgia, tratamento dentário, prática de manicure, tatuagem e
pedicure. O uso de drogas ilícitas é sabidamente reconhecido como fator de
risco para aquisição de HCV devido ao compartilhamento de materiais e baixas
condições higiênicas (Martins et al., 2011; Santos-Cruz 2013). A prática de
manicure,
tatuagem
e
pedicure
também
têm
sido
relatadas
como
comportamentos de risco, visto que muitas vezes o material utilizado não é
descartável (Nishioka et al., 2002; Carney et al., 2013) ou os profissionais não
utilizam equipamentos de proteção individual, que além de conferir proteção
pessoal, reduz significativamente o risco de disseminação da doença, evitando
exposição ao sangue e outros fluidos corporais (Garbaccio et al., 2012).
No Grupo III, os comportamentos de risco mais frequentes foram
tratamento dentário, uso de medicamento por via intravenosa, ida a manicure e
transfusão sanguínea. Sabe-se que procedimentos odontológicos oferecem
grande risco de aquisição de doenças transmitidas pelo sangue, como o HCV,
não só para os pacientes como para os profissionais, em especial quando não
há esterilização adequada de instrumentos cirúrgicos e falta de biossegurança
nos atendimentos (Mahboobi et al., 2014; Garbin et al., 2014). O uso de
medicamentos por via intravenosa, por sua vez, envolve não só a questão da
utilização de materiais descartáveis, como também a prática segura do manejo
dos pacientes por parte dos profissionais de saúde (Hauri et al., 2004). Outro
fator de risco relatado neste grupo foi a transfusão sanguínea, que constitui
uma das mais importantes vias de transmissão do HCV, principalmente para
aqueles indivíduos que foram submetidos ao procedimento antes de 1994, visto
que a triagem sorológica para anti-HCV não era realizada neste período. De
Paula e colaboradores em 2005, demonstraram prevalência de anti-HCV de
16,7% em pacientes multi-transfundidos de diferentes regiões do Brasil.
66
A análise bivariada dos fatores de risco dos fatores de risco associados
à prevalência de anti-HCV foi realizada somente no grupo III devido a maior
prevalência de anti-HCV. Ao avaliar a presença de anti-HCV em SSPF,
verificamos que a idade e compartilhamento de escova de dentes foram
estatisticamente significantes do mesmo modo que observado em
estudos
anteriores que mostram maior prevalência de anti-HCV em indivíduos em
faixas etárias mais elevadas (Metts et al., 2014) e que 25% de casais
infectados pelo HCV tinham como fator de risco o compartilhamento de escova
de dente (Cavalheiro et al. 2012) também verificou que.
Os resultados deste estudo demonstram que as amostras de SSPF
podem ser úteis no diagnóstico e estudo de prevalência da infecção pelo antiHCV, em especial em grupos com maior prevalência desta infecção. Este tipo
de amostra pode ser utilizado para triagem de casos de hepatite C em
unidades de atendimento e esclarecimento diagnóstico, visto que neste grupo
foram observados altos valores de sensibilidade e especificidade.
67
7. CONCLUSÕES
 Considerando
a
população
total
estudada,
a
detecção
de
marcadores anti-HCV em soro e sangue seco em papel de filtro apresentou
ótima sensibilidade (89,58%), especificidade (98,4%) e estatística kappa
(0,930) indicando um teste com excelente desempenho;
 Na população de baixa endemicidade (Grupo I), a sensibilidade do
teste foi igual a 57,1% e a especificidade de 100%, porém a estatística
kappa foi de 0,726 indicando um bom desempenho do teste neste grupo;
 Na população com maior vulnerabilidade para aquisição da infecção
pelo HCV (Grupo II), a detecção de marcadores anti-HCV apresentou
sensibilidade igual a 40%, especificidade igual a 99,8% e estatística kappa
foi igual a 0,496 demonstrando um desempenho fraco do teste neste grupo,
provavelmente devido ao baixo número de indivíduos anti-HCV reagentes;
 Na população de alta endemicidade para o HCV (Grupo III), o teste
apresentou boa sensibilidade (91,7%), especificidade (92,3%) e grande
quantidade de resultados verdadeiro positivos (91,6%) e negativos (98,2%)
Estes resultados demonstram que o teste possui excelente desempenho
em populações de alta prevalência de anti-HCV;
 A prevalência de anticorpos anti-HCV em amostras de soro e SSPF
no Grupo I, foi de 0,4% e 0%, respectivamente. No grupo II, a prevalência
de anti-HCV no soro foi igual a 1,02% e com SSPF foi igual a 0,4%. No
grupo III, verificamos que a prevalência de anti-HCV foi igual a 90%
empregando o soro e 83,3% empregando o SSPF. Estes resultados
demonstram que o SSPF possui boa concordância com os resultados
encontrados no soro, sendo útil para estudos de prevalência do anti-HCV,
principalmente em populações de alta endemicidade;
68

A concordância entre a detecção de anti-HCV no SSPF e a
detecção do HCV RNA no soro, foi igual a 94,3%. Entretanto o anti-HCV
também foi detectado na maioria das amostras de SSPF cujo soro não
apresentava RNA do HCV, demonstrando a aplicabilidade do método
independente da detecção do HCV RNA no soro;


A variável idade apresentou associação em relação à presença de
anti-HCV em SSPF corroborando estudos anteriores que demonstram
maior prevalência de anti-HCV em indivíduos com idade mais avançada.
8. Referências Bibliográficas
69
Aach R D, Szmuness W, Mosley JW, Hollinger FB, Kahn RA, Stevens CE.
Serum alanine aminotransferase of donors in relation to the risk of non-A, non-B
hepatitis in recipients: the transfusion-transmitted viruses study. N Engl J Med.
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de
Nossa
Senhora
de
Nazaré,
PI
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79
Anexo A
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
Laboratório de Hepatites Virais
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Instituição: Laboratório de Hepatites Virais do Instituto Oswaldo Cruz - Fiocruz
Projeto de Pesquisa: Avaliação de Marcadores do vírus da hepatite B e C obtidos em papel de filtro
armazenados em diferentes condições ambientais
Pesquisador: Dra. Lia Laura Lewis-Ximenez e Livia Melo Villar
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Como voluntário, o (a) Sr. (a) está sendo convidado a participar de uma pesquisa realizada pelo
Laboratório de Hepatites Virais do Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz sob a coordenação da Dra. Lívia Melo
Villar. O objetivo da pesquisa é padronizar o diagnóstico da infecção pelos vírus das hepatites B e C
através de testes realizados em sangue em papel de filtro.
Este documento pretende fornecer a (o) Sr. (a) informações sobre o problema de saúde em estudo,
detalhando os procedimentos, exames, benefícios, inconvenientes e riscos potenciais. O (a) Sr.(a) possui
a liberdade de recusar a participar da pesquisa ou retirar seu consentimento, em qualquer fase da
pesquisa, sem penalização e sem prejuízo ao seu cuidado.
Os investigadores se obrigam a não revelar sua identidade em qualquer publicação resultante de
informações obtidas durante o estudo. Os exames e procedimentos aplicados são gratuitos. O (a) Sr. (a)
receberá todos os cuidados médicos adequados para o controle dos efeitos colaterais que possam
ocorrer em consequência de sua participação na pesquisa.
Antes de assinar este termo, o Sr.(a) será informado plenamente sobre a pesquisa, não
hesitando em formular perguntas sobre qualquer aspecto que julgar conveniente esclarecer. É importante
estar ciente das seguintes condições:
Exames e procedimentos que serão realizados: o voluntário será submetido à coleta de
sangue. Serão coletados 8 ml de sangue por punção venosa periférica pelos técnicos especializados do
Grupo de Atendimento para Hepatites Virais (IOC/FIOCRUZ). Também serão coletadas amostras de
sangue em papel de filtro que serão coletadas por punção digital com lanceta e aplicadas em papel de
filtro Whatmann 903. Alternativamente, as amostras de sangue total obtidas por punção venosa serão
aplicadas em papel de filtro Whatmann 903.
Benefícios: Obter resultado de exames laboratoriais para Hepatite B e C que serão entregues
acompanhados de esclarecimentos sobre o significado dos resultados de maneira confidencial. O (a) Sr.
(a) também será encaminhado para unidades de saúde do Estado do Rio de Janeiro, nos casos em que o
tratamento da hepatite se fizer necessário. Esta pesquisa poderá não trazer benefícios imediatos para o
meu acompanhamento clínico, mas poderá auxiliar no desenvolvimento de métodos inovadores para o
diagnóstico da infecção pelos vírus das hepatites B e C.
Inconvenientes: Caso seja necessário, o (a) Sr. (a) será contatado por um dos membros da
pesquisa que irá perguntar se o (a) Sr. (a) está disposto a doar nova amostra de sangue. O (a) Sr. (a)
estará livre para recusar esta solicitação.
Riscos potenciais conhecidos até o dia de hoje: Os possíveis riscos e desconfortos são
aqueles relacionados com a retirada rotineira de sangue, dor ou rouxidão no local que serão controladas
por uma coleta de sangue realizada dentro das normas de biossegurança.
Garantia de esclarecimentos: Todos os esclarecimentos sobre a metodologia da pesquisa
antes e durante o desenvolvimento da mesma serão realizados pela equipe da Pesquisa.
Utilização para estudos futuros: O material biológico coletado, após exames, será estocado,
podendo ser usado posteriormente, em outras pesquisas com fins semelhantes, mas somente após a
avaliação, pelo Comitê de Ética em Pesquisa, que poderá dispensar a assinatura de um novo Termo de
Consentimento, todavia mantendo sempre a identidade do doador em sigilo;
Eu,_____________________________________________________________________ (nome
do(a) paciente), abaixo identificado(a) e firmado(a), declaro ter sido informado(a) claramente sobre todas
as indicações e riscos relacionados à coleta de sangue e saliva.
Os termos médicos foram explicados e todas as minhas dúvidas foram esclarecidas pelo
pesquisador __________________ ________________________________(nome do pesquisador).
Expresso também minha concordância e espontânea vontade em submeter-me ao referido
procedimento (coleta de sangue e saliva).
80
Entendi que minhas informações pessoais poderão ser revistas por pessoas devidamente
autorizadas para conduzir a pesquisa, porém serão estritamente CONFIDENCIAIS e, de forma alguma,
poderão tornar-se públicas.
Assim, declaro que:
- Fui claramente informado a respeito dos benefícios que a pesquisa pode trazer na avaliação
dos resultados dos exames usados no diagnóstico das hepatites virais.
- Fui também claramente informado a respeito dos potenciais riscos relacionados a coleta de
sangue para a realização desses exames.
( ) Autorizo a coleta, o depósito, o armazenamento e a utilização do material biológico coletado.
( ) Não autorizo o armazenamento da minha amostra para estudos futuros.
Os novos exames que podem ser realizados levarão mais informações sobre as hepatites virais e
aspectos relacionados. Além disto, o Sr. (a) tem o direito de receber os resultados destes novos exames,
caso tenha interesse, pedimos que deixe um telefone de contato:____________________________
Toda nova pesquisa a ser realizada com o material armazenado será submetida para aprovação do
Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) institucional e, quando for o caso, da Comissão Nacional de Ética em
Pesquisa (CONEP);
Paciente: _______________________________________________RG do paciente: ___________
Sexo do paciente:
( ) Masculino ( ) Idade: ______ Telefone: ( ) _______________________
Feminino
Endereço: ______________________________________________ Cidade: __________________ CEP:
_______-____
Responsável legal (quando for o caso): _______________________________________
RG do responsável legal: __________________________________________________
Assinatura do paciente ou do responsável legal: ________________________________
Pesquisador Responsável: Livia Melo Villar
RG:11403613-0/IFP
Caso tenha alguma dúvida ou necessite de qualquer esclarecimento sobre o estudo você pode entrar em
contato com o pesquisador relacionados acima:
Laboratório de Hepatites Virais, fone 2562-1918.
____________________________________
(local e data)
Testemunha:_________________________________________ (nome completo)
____________________________________(assinatura)
___________________________________________
Assinatura do pesquisador responsável.
81
ANEXO B
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
LABORATÓRIO DE HEPATITES VIRAIS
Rua Leopoldo Bulhões, nº 1480, CEP: 21041-210
Pav. Hélio e Peggy Pereira, Bloco A (Térreo), Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ
P1)
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P20)
P21)
P22)
P22)
Data de Nascimento:___/___/___ P2) Profissão:______________
P3)Idade:
Sexo: ( ) 1.Masculino ( ) 2.Feminino
Estado Civil: ( ) 1.Casado ( ) 2. Solteiro ( ) 3. União estável
Cor: ( ) 1.Branco ( ) 2.Negro ( ) 3.Asiático
Escolaridade
( ) 1.Analfabeto
( ) 2.Educação Infantil
( ) 3.EF(1°grau)completo
( )4.EF(1°grau) incompleto
( )5.EM(2°grau)completo
( ) 6.EM(2°grau) incompleto
( ) 7.ES completo
( ) 8.ES incompleto
( ) 9.Curso de Pós-Graduação completo
( ) 10. Curso de Pós-Graduação incompleto
Altura (cm):
Massa (Kg):
Pressão Arterial:
Cincunferencia Abdominal:
A renda de sua família está em torno de quantos salários mínimos (salário mínimo = R$
510,00)?
( )1.Nenhum ( )2. Menos de 1 ( )3. 1 a 3 ( )4. 4 a 6 ( )5. 7 a 9 ( )6. 10 a 12 ( )7. Mais de 12
Você alguma vez já ficou com a pele e os olhos amarelos e/ou urina muito escura ( cor
de ‘cha preto’ ou ‘coca-cola’ ou teve hepatite confirmada por exame de sangue?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não se lembra
No caso de ter hepatite, já fez ou faz uso de algum medicamento para hepatite?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já foi vacinado contra Hepatite B ? ( )
1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
No caso de ter sido vacinado, quantas doses tomou?
( )1. 3 doses ( )2. 2 doses ( )3. 1 dose ( )4. Não quis responder ( )5. Não sabe ( )6. Não foi
vacinado
Você já foi submetido(a) a transfusão de sangue ou plasma?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Foi transfundido antes de 1994?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já fez hemodiálise?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você tem alguma tatuagem no corpo?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você tem algum piercing no corpo?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já furou a orelha para colocar brincos?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já furou a orelha para colocar brincos?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
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P23)
P24)
P25)
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P32)
P33)
Você já fez acupuntura?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já cuidou das unhas na manicure?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Usou o seu próprio alicate?
( ) 1. Sim, usou ( ) 2. Não, não usou ( ) 3. Não freqüenta manicure
O alicate que usava era esterilizado?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Já fez depilação em salão de beleza?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Os materiais eram descartáveis ou esterilizados?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já compartilhou laminas ou gilete com outra pessoa?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já compartilhou escova de dentes com outra pessoa?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já fez algum tipo de tratamento dentário (extração, canal, cirurgia gengival,
implante)?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já foi atendido, por qualquer motivo, em alguma unidade de emergência ou
urgência e mantido com acesso venoso ou recebeu medicamento(s) injetável(is)?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já fez uso de algum tipo de droga ilícita injetável ou inalatória?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
P34)
P35)
P36)
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P38)
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P41)
P42)
P43)
P44)
P45)
P46)
P47)
P48)
Com que freqüência faz uso de drogas?
( ) 1. Frequentemente ( ) 2. Raramente ( ) 3. Não sabe ( )4. Não quis responder
( ) 5. De vez em quando
Qual o tipo de droga?
( ) 1. Cocaína ( ) 2.Heroína ( ) 3.Crack ( ) 4. Êxtase ( ) 5. Outra ( ) 6. Não sabe
()
7.Não quis responder
Já compartilhou agulha, seringa, canudo ou outro objeto com outra pessoa?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Qual a sua orientação sexual?
( )1.Heterossexual ( ) 2.Homossexual ( ) 3.Bissexual ( ) 4.Não sabe ( )5.Não quis responder
Você já teve relação sexual com alguém?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Qual o numero de parceiros (as) por ano?
( ) 1.Menos de 5 ( ) 2.entre 6-10 ( ) 3. Mais de 10 ( ) 4. Fixo ( ) 5. Não sabe
( ) 6. Não quis responder
Com que freqüência faz uso de camisinha?
( ) 1. Sempre ( ) 2. Nunca ( ) 3. Raramente ( ) 4. De vez em quando ( ) 5. Frequentemente
( ) 6. Não sabe ( ) 7. Não quis responder
Você já fez sexo oral? ( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Você já fez sexo anal? ( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Qual foi o tipo de sexo anal?
( ) 1. Insertivo ( ) 2. Receptivo ( ) 3.Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Houve sangramento durante?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Houve ejaculação?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder ( ) 5. Não se aplica
Você já teve relação sexual com parceiro (a) com hepatite viral ou AIDS?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
De que tipo?___________________________
Você já teve contato dentro de casa com alguém com hepatite viral ou AIDS?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
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P49)
P50)
P51)
P52)
P53)
P54)
Você já teve alguma doença sexualmente transmissível ou venerea?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Qual? ____________________
Voce ingere bebida alcoólica?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Com que freqüência ingere bebida alcoólica?
( ) 1. 1x semana ( ) 2. 2x semana ( ) 3. 3x semana ( ) 4. 4x semana ( ) 5.5x ou
mais/semana
Toma algum medicamento regularmente?
( ) 1. Sim ( ) 2. Não ( ) 3. Não sabe ( ) 4. Não quis responder
Qual medicamento?________________________
84
ANEXO C
85