Caracterização genética de rinovírus humano em amostras de
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Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe Caracterização genética de rinovírus humano em amostras de populações distintas do Estado de São Paulo Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências. São Paulo 2011 Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe Caracterização genética de rinovírus humano em amostras de populações distintas do Estado de São Paulo Orientadora: Profa. Dra. Nancy Cristina Junqueira Bellei Co-orientador: Prof. Dr. Emerson Carraro São Paulo 2011 Watanabe, Aripuanã Sakurada Aranha Caracterização genética de rinovírus humano em amostras de populações distintas do Estado de São Paulo. Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe -- São Paulo/SP – Brasil, 2011. ixx, 132f. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação Ciências Básicas em Infectologia. Título em inglês: Human rhinovirus genotyping in samples of distinct populations of São Paulo State, SP, Brazil. 1. Human rhinovirus species, 2. Genotyping, 3. Risk groups. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MEDICINA DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA Chefe do Departamento: Dr. Reinaldo Salomão Chefe da Disciplina: Dr. Eduardo Alexandrino Servolo de Medeiros Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Dr. Ricardo Sobhie Diaz Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe Caracterização genética de rinovírus humano em amostras de populações distintas do Estado de São Paulo Presidente da Banca: Profa. Dra. Nancy Cristina Junqueira Bellei BANCA EXAMINADORA Titulares: Prof. Dr. Eurico de arruda Neto – Universidade de São Paulo – USP –Ribeirão Preto Prof. Dr. João Manuel Grisi Candeias – Universidade Estadual Paulista – UNESP - Botucatu Prof. Dr. Luciano Matsumiya Thomazelli - Universidade de São Paulo – USP Prof. Dr. Otelo Rigato - Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP Suplente: Profa. Dra. Shirley Komninakis - Universidade Federal de São Paulo- UNIFESP Prof. Dr. José Luis Proença-Módena - Universidade de São Paulo – USP –Ribeirão Preto DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais Oswaldo e Misão por toda a paciência, compreensão, e apoio nesta jornada. Sem vocês nada disso seria possível. Ao meu irmão Arapoty, sua esposa Elethéia e minha sobrinha Esther, mesmo a distância o apoio de vocês meu deu forças. AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Agradeço a minha orientadora Dr. Nancy Bellei pela oportunidade, pela paciência em ensinar sempre, e por todo apoio dado em todos os momentos. Por toda confiança em mim depositada, dedicação e ensinamentos valiosos. Por me ensinar a trilhar os caminhos nessa profissão com ética e amor ao trabalho. E finalmente por ser um exemplo de entusiasmo com a pesquisa, para mim e todos os orientados. Eu não tenho palavras para agradecer tudo o que a Sra. fez por mim. Ao Prof. Celso Granato pela oportunidade, ajuda, paciência em ensinar e bom senso em todos os momentos. E também pelas conversas científicas nas manhãs de todos os dias. Ao Amigo e co-orientador Emerson Carraro por toda a ajuda antes, durante e depois da realização deste trabalho. Por toda disponibilidade, prontidão em ajudar e opiniões importantes. AGRADECIMENTOS Aos colegas e amigos do Laboratório de Virologia Clínica. O convívio com vocês foi extremamente enriquecedor. O clima descontraído que foi criado no laboratório foi muito importante para o andamento do trabalho. À amiga Sandra Guatura, por todos os ensinamentos, ajuda, conversas, conselhos e principalmente pela amizade incondicional, apesar de todas as diversidades. Muito Obrigado Sandrinha. À amiga Cristina (Amarula) pela amizade, pelas conversas no almoço, pelas opiniões sensatas, e por todo ajuda. Às amigas, em especial a Luciana, Juliana, Thaís, Ellen, Elaine Lima, Elaine Caccia, Andréia, Sheila e Miriam. Espero levar a amizade de vocês por muito tempo. Ao amigo Inarei, pelas conversas divertidas e pelas happy hours. As “meninas do Dr. Celso”, pelas conversas sobre vida profissional. Ao pessoal mais “antigo”, Vivi, Aline, Natália, Shinai, por toda a ajuda no meu começo no laboratório. Sem vocês o começo seria muito mais duro. Ao pessoal da Imunologia, Madá, Milena, Sidnéia, Giovana, Selma, Amanda, Antonia, enfim, todo o lado “A”. Pela amizade, pela prontidão em ajudar, pelos conselhos e pelo ambiente criado por vocês nesses anos todos de convívio. Ao Dr. Reinaldo Salomão. Por toda a ajuda prestada. Ao amigo Charlys por toda a ajuda prestada. Por me receber tão bem logo que cheguei ao laboratório. Pelos reagentes, tubos, e enzimas emprestadas no início do meu trabalho. E principalmente pela amizade em todos esses anos. Aos pacientes, pois sem eles não haveria esse trabalho. À Maria da limpeza, por manter nosso laboratório sempre limpo e pelas conversas nas manhãs de sexta. Aos meus antigos professores da graduação e meu ex-orientador por me ensinar tudo o que era preciso para seguir nessa carreira. Ao Prof. João Pessoa, por todas as broncas dadas, que muito me ensiram no mestrado. Eu não tinha idéia de quanto isso era importante antes de sair de Botucatu. E principalmente pela amizade apesar da distância. Às recém chegadas Ana Maria, pela ajuda estatística e discussões científicas e Ana perosa. À todos que direta ou indiretamente auxiliaram para que esse trabalho fosse realizado. Ao CNPq pelo apoio financeiro sem o qual eu não poderia ter me dedicado a este trabalho. À FAPESP pelo auxílio financeiro para a realização deste trabalho, e por apoiar a disseminação e a realização da ciência no Estado e São Paulo. RESUMO Infecções causadas pelos rinovírus humanos (HRV) são responsáveis por 25-50% das doenças respiratórias entre indivíduos que apresentam doença semelhante à gripe (Influenza-Like Illness - ILI). Os HRVs podem ser classificados em pelo menos três espécies: HRV A, HRV B e HRV C. O HRV C tem sido frequentemente descrito entre crianças aparentemente levando a doenças mais graves e hospitalizações, no entanto a ocorrência dessa espécie entre adultos não é bem conhecida. O objetivo deste estudo foi avaliar a apresentação clínica e a distribuição das espécies de HRV que causam infecções em diferentes populações durante os anos de 2001 a 2005. Um total de 682 amostras foi coletado. As populações estudadas eram compostos por: 132 adultos da comunidade atendidos em pronto socorro e 198 adultos profissionais de saúde (2001-2003); 242 pacientes transplantados renais (2002-2004); 61 crianças portadoras de cardiopatia congênita (2005) e 49 idosos da cidade de Botucatu, São Paulo, Brasil (2003-2004). A amplificação dos genes do HRV foi realizada através da Reação em Cadeia da Polimerase precedida de Transcrição Reversa (RT-PCR), seguida de sequenciamenteo genético e análise filogenética. O HRV foi detectado em 24.05% das amostras (164/682), 15.2% (20/132) em adultos da comunidade, 29.8% (59/198) em profissionais da área da saúde, 23.6% (57/242) em transplantados renais, 22.9% (14/61) em crianças portadoras de cardiopatia congênita e 28.6% (14/49) em idosos. Um total de 85.5% (137/164) das amostras positivas foi seqüenciado, e 79.9% (131/164) foram analisadas através de filogenia. Foram identificadas 80 (61%) das amostras pertencentes à espécie A, 22 (16.8%) a espécie B e 29 (22.2%) pertencentes à espécie C. Foi encontrada uma alta taxa de ILI (38.9%) em pacientes infectados pelo HRV. A regressão logística mostrou um aumento de ILI de três vezes quando os indivíduos estavam infectados com HRV A em comparação ao HRV C. A infecção pelo HRV causa ILI em paciente adultos não hospitalizados. O HRV A foi associado à infecção mais intensa do que o resfriado comum. A dinâmica da infecção entre as diferentes espécies de HRV merece análise no futuro. ABSTRACT Infections caused by Human Rhinoviruses (HRVs) account for 25%-50% of respiratory illnesses among individuals presenting influenza-like illness (ILI). HRVs could be classified in at least three species: HRV-A, HRV-B, and HRV-C. The HRV-C species has frequently been described among children and apparently has led to severe illness resulting in hospitalization; however, the occurrence among adults is unknown. The aim of this study was to assess the clinical presentation and species distribution of HRV infections in different populations during 2001-2005. A total of 682 samples were collected. Subjects consisted of 132 adults from the general community and 198 health-care workers (2001-2003), 242 renaltransplanted outpatients (2002-2004), 61 children with congenital heart disease (2005) and 49 elderly persons from Botucatu city, Sao Paulo, Brazil (2003-2004). Amplification of HRV genes was performed by Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and followed by sequencing and phylogenetic analysis. HRV was detected in 24.05% of samples (164/682), 15.2% (20/132) among adults from general community, 29.8% (59/198) among health-care workers, 23.6% (57/242) among renal-transplanted outpatients, 22.9% (14/61) among children with congenital heart disease and 28.6% (14/49) among elderlies. A total of 85.5% (137/164) previously positive HRV samples were sequenced and 79.9% (131/164) were analyzed. We identified 80 isolates (61.0%) of the HRV A species, 22 (16.8%) of the HRV B species and 29 isolates (22.2%) of the HRV C species. High ILI rate (38.9%) was found among HRV infected patients. Logistic regression showed a three-fold increase in prevalence of ILI in individuals with HRV A infection compared with HRV C infected patients. HRV infections caused ILI among non-hospitalized patients. HRV specie A was associated with a disease more intense than a common cold. The dynamics of infection among different species deserve further analysis. Lista de Abreviaturas HRV = Human Rhinovirus – Rínovírus Humano ILI = Influenza-Like-Illness – doença semelhante à gripe +ssRNA = RNA de fita simples polaridade positiva ORF = Open Reading Frame – Região Aberta de Leitura VPg = Pequeno peptídeo ligado à região não codificadora 5’ do genoma do rinovírus humano NCR = Noncoding Region - região não codificadora ICAM 1 = Molécula de adesão intracelular 1 LDLR = Receptores das lipoproteínas de baixa densidade ICTV = International Committee on Taxonomy of Viruses – Comitê Internacional de Taxonomial Viral ITRI = Infecção do trato respiratório inferior DPOC = Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica WI-38 = Fibroblasto de Pulmão Fetal Humano MRC-5 = Fibroblasto de Pulmão Fetal Humano ML = Maximum Likelihood – Máxima Verossimilhança GTR = General Time Reversible - Tempo geral Reversível BLAST - Basic Local Alignment Search Tool – Ferramenta de procura de alinhamento básico local RT-PCR = Reação em cadeia da polimerase precedida por transcrição reversa DICT50 = Dose infectante em cultura de tecidos 50% NASF = Núcleo de Assistência à Saúde do Funcionário OR = Odds Ratio – Razão de chance IC 95% = Intervalo de Confiança 95% VP4/VP2 = Proteínas de capsídeo dos rinovírus humanos PS = Pronto Socorro CDC = Center for Disease Control and Prevention – Centro de Controle de Doenças VSR = Vírus Respiratório Sincicial Lista de Ilustrações Figura 01 Esquema representativo do genoma do HRV (Adaptado do site: http://www.expasy.org/viralzone/all_by_species/33.html). Figura 02 22 Teste das diluições do controle positivo. NO = controle negativo. PM = peso 48 molecular. Figura 03 Ocorrência de infecção pelo HRV em relação às diferentes populações estudadas. Os números acima de cada coluna indicam as freqüências encontradas. Adultos: adultos atendidos em pronto-socorro somados aos adultos profissionais de saúde atendidos no Núcleo de Assistência à Saúde do Funcionário; transplantados renais: adultos transplantados renais; crianças: crianças cardiopatas; idosos: idosos da cidade de Botucatu, 50 São Paulo, SP. Figura 04 Ocorrência de infecção pelo HRV em relação às amostras coletadas durante os anos estudados. Os números acima de cada coluna indicam as freqüências 50 encontradas. Figura 05 Distribuição dos casos positivos, negativos e total em relação às diferentes 52 faixas etárias nas populações estudadas. Figura 06 Análise da árvore filogenética (Maximum Likelihood - máxima verossimilhança) das regiões VP4/VP2 do genoma do HRV. Foi utilizado um valor de Bootstrap de 500 vezes. A árvore foi circularizada para melhor vizualização de todas as informações. O picornavírus Echo 11 (número de acesso do GenBank: EF634316.1) foi utilizado como outgroup. Foram obtidas 52 seqüências referência no GenBank. Ao lado das seqüências referência (Rhino A, Rhino B e Rhino C) se encontram os números de acesso do GenBank. 56 Figura 07 Número de amostras não analisadas no decorrer do estudo. 57 Figura 08 Distribuição mensal das espécies de HRV durante os anos estudados. 57 Figura 09 Freqüência das espécies de HRV em diferentes faixas etárias. Figura 10 Freqüência das espécies de HRV em diferentes faixas etárias de pacientes com idade superior a 50 anos. Figura 11 59 59 Os realces em azul mostram os quatro clusters que acumularam mais casos de ILI. 65 Lista de tabelas Tabela 01 Distribuição dos sorotipos de HRV nas diferentes espécies. M e H indicam a classificação baseada no tropismo celular (M – Monkey e H - Human). Minor group indicado por sublinhado, Major group indicado por negrito. A e B indicam classificação baseada em sensibilidade a antivirais (Adaptado de Arden et al., 2010). 24 Tabela 02 Positividade por população. 49 Tabela 03 Distribuição do gênero sexo entre os pacientes estudados. 51 Tabela 04 Idade dos pacientes estudados. 52 Tabela 05 Tempo de início dos sintomas até a coleta da amostra nos pacientes estudados. 53 Tabela 06 Sintomas apresentados pelos pacientes estudados. 53 Tabela 07 Frequencia de ILI nas populações estudadas. 54 Tabela 08 Frequencia de ILI em pacientes infectados por HRV. 54 Tabela 09 Sintomas apresentados pelos pacientes estudados. 55 Tabela 10 Distribuição das espécies de HRV nos diferentes grupos de risco. 58 Tabela 11 Gênero dos pacientes estudados em relação às espécies de rinovírus humano. Tabela 12 Tempo de início de sintomas em relação às espécies 58 de rinovírus humano. 60 Tabela 13 Sintomas apresentados pelos pacientes de acordo com espécie de HRV. 61 Tabela 14 Regressão logística de ILI em relação a presença das espécies de HRV nos Tabela 15 pacientes estudados. 62 Ocorrência das espécies em pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos. 63 Tabela 16 Regressão logística de ILI em relação ao gênero dos paciente estudados. 64 Tabela 17 Sorotipos obtidos através de análise pelo programa BLAST. 66 Sumário 1. INTRODUÇÃO................................................................................................20 1.1 Fisiologia viral..................................................................................................21 1.2 Sazonalidade.....................................................................................................25 1.3 Ocorrência nas populações...............................................................................25 1.4 Grupos de risco.................................................................................................26 1.5 Quadro clínico ..................................................................................................28 1.5 Co-detecção com outros vírus respiratórios ..................................................... 29 1.7 HRV em assintomáticos ...................................................................................30 1.8 Persistência da infecção pelo HRV .................................................................. 30 1.9 Epidemiologia molecular ................................................................................. 31 1.10 Diagnóstico.......................................................................................................33 1.11 Terapia antirinoviral e vacina........................................................................... 36 1.12 Justificativa.......................................................................................................37 2. OBJETIVOS.....................................................................................................39 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS...........................................................................41 3.1 Populações........................................................................................................41 3.2 Coleta de dados ................................................................................................42 3.3 Coleta e processamento das amostras .............................................................. 43 3.4 Extração de rna................................................................................................. 43 3.5 Detecção através de reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR)............................................................................................................43 3.6 Sequenciamento genético ................................................................................. 44 3.7 Alinhamento das sequências e análise filogenética..........................................45 3.8 Correlação com sintomas ................................................................................. 46 3.9 Análise estatística ............................................................................................. 46 4. 4.1 RESULTADOS ................................................................................................48 Limite de detecção da reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR)............................................................................................48 4.2 Detecção geral ..................................................................................................48 4.3 Detecção do HRV e gênero dos pacientes estudados....................................... 51 4.4 Detecção do HRV e idade dos pacientes estudados ......................................... 51 4.5 Detecção do HRV e tempo de início de sintomas até o momento da coleta.... 52 4.6 Detecção do HRV e sintomas........................................................................... 53 4.7 Análise filogenética.......................................................................................... 55 4.8 Número de amostras não analisadas no decorrer do estudo ............................................ 56 4.9 Sazonalidade das espécies de HRV..................................................................57 4.10 Espécies de HRV e populações ........................................................................57 4.11 Espécies de HRV e gênero ...............................................................................58 4.12 Espécies de HRV e idade .................................................................................59 4.13 Espécies de HRV e tempo de início de sintomas até o momento da coleta ..... 60 4.14 Espécies de HRV e sintomas............................................................................60 4.15 Ocorrência das espécies de HRV e ILI – pacientes adultos atendidos em prontosocorro, pacientes adultos profissionais de saúde e pacientes adultos transplantados renais............................................................................62 4.16 Espécies de HRV e estado imune.....................................................................62 4.17 Frequência de ILI em pacientes infectados pelo HRV.....................................63 4.18 Regressão logística múltipla não-condicional.................................................. 63 4.18.1 Ocorrência de HRV e ILI – população geral....................................................63 4.18.2 Ocorrência de genêros e ILI – gênero ..............................................................64 4.18.3 Ocorrência de HRV e ILI – pacientes adultos atendidos em pronto-socorro... 64 4.18.4 Ocorrência de HRV e ILI – pacientes adultos profissionais de saúde ............. 64 4.18.5 Ocorrência de HRV e ILI – pacientes adultos transplantados renais ...............65 4.19 Resultados adicionais .......................................................................................65 5. DISCUSSÃO....................................................................................................66 6. CONCLUSÕES................................................................................................84 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................86 8. ANEXOS..........................................................................................................108 8.1 Anexo 1 (Termo de consentimento livre e esclarecido adultos) ...................... 109 8.2 Anexo 2 (Termo de consentimento livre e esclarecido crianças)..................... 110 8.3 Anexo 3 (Questionário – profissionais de saúde).............................................111 8.4 Anexo 4 (Questionário – pronto socorro)......................................................... 112 8.5 Anexo 5 (Questionário – transplantados renais) .............................................. 113 8.6 Anexo 6 (Questionário – crianças cardiopatas)................................................114 8.7 Anexo 7 (Sorotipos HRV BLAST) ..................................................................115 8.8 Anexo 8 (Autorização de utilização das amostras de idosos) .......................... 119 8.9 Anexo 9 (Aprovação Comitê de Ética) ............................................................ 120 8.9 Anexo 10 (Artigo publicado Watanabe et al., 2010)........................................122 8.10 Anexo 11 (Artigo publicado Watanabe et al., 2011)........................................128 8.11 Anexo 12Artigo publicado Moreira et al., 2010) ............................................. 131 Introdução 1. INTRODUÇÃO Os rinovírus humanos são os principais causadores do chamado resfriado comum sendo o mais freqüente agente causador de infecções do trato respiratório superior. Recentemente, esses vírus têm sido relacionados com o desencadeamento de quadros clínicos respiratórios mais graves, inclusive pneumonias, exacerbação da asma e da doença pulmonar crônica obstrutiva (Mäkelä et al., 1998). Estima-se que o rinovírus seja responsável por 2550% das infecções respiratórias entre indivíduos que apresentam Influenza-Like-Illness (ILI) (Nicholson et al., 1997), um quadro clínico semelhante a gripe. 1.1 FISIOLOGIA VIRAL Os rinovírus humanos (HRVs), recentemente, foram re-classificados, passando a pertencer ao gênero Enterovirus da grande família Picornaviridae (Stanway et al., 2005). Os HRVs são vírus pequenos com um diâmetro de 25 – 30nm que possuem capsídeo icosaédrico não envelopado consistindo de 60 cópias de cada uma das quatro proteínas de capsídeo (VP1 – VP4). O genoma viral é composto por RNA de fita simples não segmentado e de polaridade positiva (+ssRNA) com aproximadamente 7.2kb de tamanho e uma única região aberta de leitura (Open Reading Frame – ORF). Típico dos picornavírus (Figura 1), o genoma começa com um pequeno peptídeo (VPg), ligado covalentemente a região não traduzida (UTR) na extremidade 5´, que é seguida pela região codificadora de proteínas do capsídeo (P1). Na seqüência vêm as regiões P2 e P3 que codificam proteínas não estruturais, que incluem duas proteases virais (2A e 3C) e a RNA polimerase RNA dependente (3D). Essas regiões são seguidas por uma pequena região não traduzida (UTR) na extremidade 3´ e pela cauda poli-A (Turner & Cough 2007). A replicação do HRV ocorre no citoplasma da célula hospedeira. Após a entrada na célula, o genoma é primeiramente traduzido e então copiado em forma de uma fita de polaridade negativa, que é uma molécula de RNA com uma seqüência de nucleotídeos complementar a fita molde positiva. Essa nova fita é usada então como molde 21 para um grande número de cópias do genoma viral, que em parte serão usados como RNAs mensageiros para síntese de novas proteínas virais, e em parte serão incorporadas às novas partículas virais (Savolainen 2003). Figura 1. Esquema representativo do genoma do HRV (Adaptado do site: http://www.expasy.org/viralzone/all_by_species/33.html). Os HRVs são classificados conforme suas características antigênicas, denominados sorotipos. Desde sua identificação em 1956 (Pelon et al., 1957), mais de 100 sorotipos já foram descritos, limitando o desenvolvimento de uma vacina, uma vez que a infecção prévia não confere imunidade cruzada aos demais sorotipos. Um novo sorotipo é determinado pela ausência de reconhecimento em uma reação de neutralização com anticorpos contra sorotipos conhecidos (Savolainen 2003). Alguns autores tentam classificar os rinovírus através de outras características, como o receptor utilizado para a entrada na célula, ou a sensibilidade a compostos antivirais. No entanto, a classificação não é completa por essas outras estratégias. Baseando-se no tipo de receptor utilizado os HRVs podem ser divididos em 3 grupos: o grupo denominado major compreende cerca de 90% dos sorotipos descritos e todos os sorotipos 22 desse grupo se ligam à molécula de adesão intracelular 1 (ICAM–1), um receptor de superfície celular da superfamília das imunoglobulinas; os rinovírus do grupo denominado minor (que compreende os 10% restantes dos sorotipos) ligam-se aos receptores das lipoproteínas de baixa densidade [LDLR; (Casasnovas et al., 2000)]. Existe também o sorotipo HRV 87, que não faz parte desta classificação, pois utiliza uma sialoproteína como receptor (Savolainen 2003). Outra classificação mais recente, através de análises moleculares, descreve 3 espécies distintas: HRV A, HRV B e HRV C (Palmenberg et al., 2009). Existem atualmente 75 sorotipos compreendidos na espécie A e 25 na espécie B (Figura 2). No final do ano de 2006, Lamson et al. descreveram uma nova espécie de rinovírus que aparentemente não havia sido classificado até o momento e que era identificado em pacientes com ILI. Essa nova espécie inicialmente recebeu diferentes denominações como: HRVA 2, HRVNY, HRVQPM e HRVX (Xiang et al, 2008; Miller et al.,2009a). A análise das seqüências do genoma completo comprovou que estes HRVs identificados pertenciam a uma nova espécie, denominada posteriormente de HRV-C, com características distintas do genoma de HRV A e HRV B (Lau et al., 2007; Mc Erlean, et al., 2008), e que não apresentavam crescimento em cultura celular (Rollinger & Schmidtke 2009). Posteriormente, HRVs geneticamente semelhantes ao HRV-C também foram identificados em mais amostras clínicas em todo o mundo, especialmente naquelas obtidas de crianças com doença respiratória (Savolainen-Kopra et al., 2009). Atualmente a espécie HRV C recebeu aprovação inicial do Comitê Executivo e aguarda ratificação pelo International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) (ICTV HRV C Proposal 2004). Em estudo que realizou o sequenciamento completo de 99 sorotipos de HRV, Palmenberg et al. (2009) descrevem também uma possível nova espécie: o HRV D. Porém 23 novos estudos devem ser realizados para confirmação dessa nova espécie e também para verificar seu verdadeiro papel como agente de infecções respiratórias. Figura 2. Distribuição dos sorotipos de HRV nas diferentes espécies. M e H indicam a classificação baseada no tropismo celular (M – Monkey e H - Human). Minor group indicado por sublinhado, Major group indicado por negrito. A e B indicam classificação baseada em sensibilidade a antivirais (Adaptado de Arden et al., 2010). Os HRVs são transmitidos através de contato direto ou indireto com secreções respiratórias contaminadas e inoculação das mucosas. O período de incubação é de 8 a 12 horas e o sítio primário de replicação é a nasofaringe, pois a temperatura ideal de replicação dos HRVs é de 33 a 35°C (Gwaltney et al., 1995). Os sintomas aparecem logo após o primeiro ciclo de replicação viral e estão presentes em 70 a 90% das infecções por HRV, sendo que a síndrome clínica típica é o resfriado. A infecção da mucosa nasal resulta em vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular, responsáveis pela coriza e obstrução, que são os sintomas mais freqüentes. Outros sintomas respiratórios como tosse e dor de 24 garganta também são freqüentes e podem estar presentes em associação com sintomas gerais como febre, cefaléia e mialgia (Gwaltney et al., 2002; Savolainen et al., 2003). As grandes variações na expressão clínica podem estar mais relacionadas aos mediadores inflamatórios, liberados como conseqüência da infecção, do que ao efeito citopático do vírus (Hendley et al., 1998; Turner et al., 1998). 1.2 SAZONALIDADE Em regiões de clima temperado, o padrão sazonal das infecções por HRV é bem conhecido, apresentando circulação em praticamente todos os meses do ano e picos de circulação no outono e primavera (Gwaltney et al., 1995). No hemisfério norte, essa variação sazonal está relacionada às atividades escolares, que resultam na aglomeração de crianças durante os meses de outono, facilitando a sua transmissão. Além das crianças em idade escolar, altas taxas de infecção por HRVs são observadas em casas de repouso para idosos, creches e hospitais, por serem locais de grande concentração de pessoas suscetíveis (Jennings et al., 2008; Pierangeli et al., 2009; Miller et al., 2011, Watanabe et al., 2011, Arruda et al., 1991). Trabalhos realizados no Brasil descrevem um padrão sazonal de HRV, circulando praticamente o ano todo com um aumento de casos nos meses de inverno (Bellei et al., 2007; Bellei et al., 2008, Watanabe et al., 2011). 1.3 OCORRÊNCIA NAS POPULAÇÕES A maioria dos estudos sobre HRV foram realizados em crianças e sua importância nessa população é bem conhecida (Jennings et al., 2008; Pierangeli et al., 2009; Miller et al., 2011), enquanto que trabalhos envolvendo adultos são escassos (Arruda et al., 1997; Lau et al., 2009; Gerna et al., 2009; Watanabe et al., 2010). O primeiro estudo brasileiro que pesquisou HRV foi desenvolvido por Arruda et al. (1991), no qual o rinovírus foi descrito infectando 45.6% das crianças sintomáticas em uma favela de Fortaleza - CE. Outro estudo 25 realizado em Salvador - BA também apresentou alta prevalência de HRV em crianças de creches, sendo que em 48.3% das amostras positivas o HRV foi o único agente etiológico identificado (Souza et al., 2003). Existem poucos estudos sobre HRV em pacientes adultos, Arruda et al. (1997) realizaram um dos primeiros estudos com adultos nos Estados Unidos, descrevendo uma taxa global de 82% de infecção pelo HRV, por meio de diferentes metodologias. Outro estudo brasileiro realizado por Bellei et al. (2007), descreve uma ocorrência de HRV de 37.7% em pacientes adultos não hospitalizados. Em dissertação de mestrado apresentada à Universidade Federal de São Paulo, Perosa (2004) analisou a ocorrência de rinovírus durante três períodos consecutivos (2001 – 2003) e encontrou uma freqüência bem distribuída ao longo dos anos, com uma maior concentração nos meses de inverno. No mesmo estudo foi descrito que 49% das amostras positivas para HRV tinham manifestações clínicas compatíveis com a infecção causada pelo vírus Influenza, descrita como Influenza-LikeIllness (ILI), indicando que o HRV causou infecção mais grave que o simples quadro de resfriado em uma população de adultos de São Paulo. A grande maioria dos estudos de epidemiologia e epidemiologia molecular realizados utiliza pacientes hospitalizados tanto adultos como crianças (Gerna et al., 2009; Lau et al., 2009; Fry et al., 2011; Piralla et al., 2009; Jin et al., 2009). A realização de estudos com pacientes hospitalizados pode incorrer em um viés de seleção, uma vez que estes pacientes normalmente já se encontram com sintomas mais graves ou mais intensos, além do fato de tal observação não refletir necessariamente a circulação real dos vírus respiratórios na comunidade. 1.4 GRUPOS DE RISCO Os profissionais da área de saúde são uma população de risco para aquisição de infecções respiratórias virais e também podem servir de fonte de infecção para pacientes de 26 alto risco (Bellei et al. 2007; Bellei et al., 2008; Watanabe et al., 2010; Salgado et al., 2002). Em trabalho realizado com profissionais de saúde de um hospital terciário da cidade de São Paulo, Bellei et al. (2007) descrevem uma taxa de infecção por HRV de 37.7% em amostras negativas para o vírus influenza. A vigilância dos vírus respiratórios é de suma importância nesta população, pois pode evitar surtos dentro de unidades de risco e também diminuir os dias de trabalho perdidos. Outra população de risco são os pacientes imunossuprimidos, entre eles transplantados de órgãos sólidos (López-Medrano et al., 2007; Gerna et al., 2009). Em estudo realizado com pacientes transplantados cardíacos, hepáticos e renais, Lopéz-Medrano et al. (2007) descrevem uma taxa de infecção por picornavírus de 5%. Gerna et al. (2009) descrevem uma taxa de infecção por HRV de 25.3% em pacientes imunocomprometidos (transplantados de órgãos sólidos e transplantados de medula óssea). Estudos que verificaram a ocorrência de HRV em pacientes cardiopatas são escassos. Carrat et al. (2006) descrevem uma taxa de 7% de HRV em pacientes com cardiopatia congênita e/ou falência cardíaca. Em estudo realizado com pacientes em ventilação mecânica portadores de doenças cardiológicas uma alta taxa de HRV foi encontrada por Daubin et al. (2006). Pacientes portadores de doenças de base, ou doenças crônicas possuem risco aumentado de infecção por HRV e também de complicações causadas por essas infecções (Miller et al., 2007). Infecções por HRV são comuns em pacientes idosos, sendo responsáveis por 25-50% das doenças respiratórias em idosos institucionalizados (casas de repouso, asilos, hospitalizados) (Nicholson et al., 1997). Complicações resultantes da infecção por HRV parecem ser mais freqüentes em idosos, particularmente em serviços de home care. Em dois estudos conduzidos em casas de repouso para idosos, surtos foram descritos com taxas de 27 mortalidade variando de 6 a 21%. Em ambos os estudos, as mortes foram diretamente atribuídas à infecção aguda causada por HRV (Louie et al., 2005; Hicks et al., 2006). 1.5 QUADRO CLÍNICO Os HRVs sempre foram associados a Infecções Respiratórias Agudas (IRA) do trato respiratório superior, mas com a utilização de técnicas moleculares de diagnóstico foi possível demonstrar a associação de HRV e acometimento do trato respiratório inferior de idosos, resultando em quadros clínicos mais graves e com necessidade de hospitalização (El-Sahly et al., 2000; Falsey et al., 2002). A participação dos HRVs em infecções do trato respiratório inferior (ITRI) sempre foi sugerida, mas a comprovação de tal fato se deu com trabalho de Papadopoulos et al. (2000), com estudos realizados in vitro e in vivo, comprovando que a replicação do HRV pode ocorrer em células epiteliais do trato respiratório inferior, apesar da temperatura ideal de replicação viral ser inferior à dos pulmões. Em seguida, foram descritos ITRI causadas por HRV em pacientes imunodeprimidos. Em pacientes transplantados de células tronco-hematopoiéticas foi demonstrada a associação de HRV com doença mais grave do trato respiratório inferior, principalmente pneumonia (Ison et al., 2003). Em transplantados de medula óssea, o HRV foi descrito como responsável por um terço das infecções respiratórias, inclusive sendo associado à ocorrência de pneumonia (Greenberg et al., 2002). O impacto do HRV na morbidade é, geralmente, ignorado porque o resfriado comum é considerado auto-limitado e o seu diagnóstico é demorado e dispendioso. No entanto, além de infectar o trato respiratório superior, os rinovírus são também associados a complicações como otite média em crianças e sinusite em adultos (Pitkäranta et al., 1998; Pitkäranta et al., 1997). Em estudo realizado com pacientes asmáticos, Kistler et al. (2007) descrevem uma freqüência de HRV de 37%, possivelmente demonstrando o papel desse vírus em quadros de 28 exacerbação de asma. Miller et al. (2007) descrevem um freqüência de aproximadamente 25% de HRV em pacientes hospitalizados, com histórico prévio de asma e/ou chiado. A associação entre hospitalizações e ocorrência de HRV nesse estudo pode indicar um papel importante desse vírus na exacerbação de quadro pré-existentes de doenças respiratórias crônicas. Alguns estudos relatam altas taxas de ocorrência de HRV relacionados a quadros de pneumonia. Jennings et al., (2008) em estudo realizado na Nova Zelândia com pacientes adultos que apresentavam quadro de pneumonia adquirida na comunidade, descrevem uma ocorrência de 10% de HRV. Olsen et al., (2010) em um grande estudo que verificou a etiologia de pneumonia em pacientes hospitalizados de diferentes faixas etárias, descrevem uma ocorrência de 13.8% de infecções causadas por HRV. Nesse mesmo estudo os autores descrevem que o HRV foi o vírus mais freqüentemente associado à pneumonia em todas as faixas etárias, com exceção de crianças menores de cinco anos. Corne et al. (2002) demonstraram que indivíduos asmáticos, quando infectados por HRV, apresentam risco duas vezes maior de desenvolver doença do trato respiratório inferior do que indivíduos não asmáticos. A exacerbação aguda da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é causa freqüente de hospitalização, tendo profundo impacto na qualidade de vida do paciente. Em um estudo sobre a exacerbação desses casos, os pesquisadores descobriram que 60% dos episódios são precedidos por resfriado, principalmente causados pelo HRV (Seemungal et al., 2001). 1.6 CO-DETECÇÕES COM OUTROS VÍRUS RESPIRATÓRIOS Existem muitos trabalhos que descrevem a ocorrência de HRV em conjunto com outros vírus respiratórios (Aberle et al., 2005; Savolainen-Kopra et al., 2009; Renwick et al., 2007; Kistler et al., 2007; Louie et al., 2009). Greer et al. (2009) em um estudo realizado com 1247 pacientes, incluindo 660 pacientes positivos para pelo menos um vírus respiratório, 29 descrevem que o HRV foi estatísticamente o vírus menos propenso a estar associado a codetecções. Os autores desse estudo sugerem novas discussões acerca do papel do HRV, concluindo que estes vírus não são meros “passageiros” das infecções respiratórias. Savolainen-Kopra et al. (2009) em um estudo realizado com pacientes que apresentavam otite média aguda verificaram que a maioria das co-detecções ocorria entre diferente espécies de HRV. O papel real do HRV como agente freqüente de co-detecções ainda não está bem definido, necessitando de estudos que esclareçam essa questão. 1.7 HRV EM ASSINTOMÁTICOS Muitos estudos demonstraram a presença de HRV em 12-20% dos indivíduos assintomáticos (Peltola et al., 2008a; Jartti et al., 2004; Van Der Zalm et al., 2009). Segundo Van Der Zalm et al. (2009), em estudo realizado com crianças, de 0 a 7 anos, a presença de patógenos respiratórios ocorreu em 56% do episódios sintomáticos, em comparação com 40% dos episódios assintomáticos, onde o HRV foi o vírus predominante, sendo encontrado em 23% das crianças sintomáticas e em 22% das crianças assintomáticas. Embora muitos estudos investiguem a prevalência de patógenos respiratórios durante episódios sintomáticos, pouco se sabe sobre sua prevalência em crianças assintomáticas. O papel do HRV nesses pacientes ainda não está claro. Jartti et al. (2004) descreve uma detecção de excreção viral mais prolongada em pacientes imunocomprometidos. Dependendo da dinâmica de infecção e circulação do HRV os profissionais de saúde infectados assintomáticos poderiam ser potenciais fontes de transmissão para os pacientes, a exemplo do que já foi demonstrado para outros vírus respiratórios (Salgado 2002). 1.8 PERSISTÊNCIA DA INFECÇÃO PELO HRV Não são comuns a descrições de positividade do HRV por longos períodos de tempo (> 2-3 semanas [Jartti et al., 2004; Winther et al., 2006)]. Devido à crescente utilização de métodos de biologia molecular (em especial a reação em cadeia da polimerase em tempo real 30 – PCR em tempo real), tem sido crescente também a identificação de HRV por maiores períodos de tempo (Arden et al., 2010). O RNA do HRV têm sido detectado dias antes do início dos sintomas até cinco ou mais semanas após o término da infecção (Pitkäranta et al., 2005; Winther et al., 2006). Estudos com genotipagem de HRV indicam que a excreção viral normalmente cessa dentro de 11-21 dias (Gern et al., 2000; Lu et al., 2008). A percepção de persistência é mais do que o resultado de uma série de infecções ou co-deteção simultânea de vírus. A verdadeira persistência pode ser vista em estudo de Kaiser et al. (2006), que verificaram a infecção somente pelo HRV em pacientes com imunossupressão de base ou disfunções imunes. Outro estudo de Piralla et al. (2009) descrevem que foi encontrado infecção pelo HRV C por três vezes mais tempo em pacientes imunocomprometidos do que em pacientes imunocompetentes, com uma média, em dias, de 52 versus 16 respectivamente. 1.9 EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR A diversidade genética entre as diferentes linhagens virais tem se mostrado grande, sugerindo circulações simultâneas de diferentes sorotipos durante uma mesma estação epidêmica. Alguns sorotipos, de determinados agrupamentos genéticos, têm sido isolados durante epidemias consecutivas, sugerindo tanto a persistência quanto o re-aparecimento de linhagens epidêmicas (Savolainen et al., 2003). Em estudo recente, incluindo criança cardiopata, o HRV C foi detectado duas vezes intercalado por detecção de rinovírus A em um intervalo de três meses. Este dado demonstra a grande variabilidade genética do HRV C, a circulação de vários sorotipos num mesmo período e a susceptibilidade de um grupo de risco (Lau et al., 2009). Os rinovírus A e C têm a maior prevalência entre os HRVs, embora diferentes estudos descrevam maior ocorrência de HRV A ou HRV C (Piotrowska, et al., 2009; Dominguez et al., 2008; Renwick et al., 2007; Briese et al., 2008). Já o rinovírus B é considerado menos frequente, constituindo aproximadamente 7% da detecção de HRV em geral (Renwick et al., 31 2007; Miller et al., 2009b). Estudos demonstram que o HRV C não tem uma sazonalidade definida. Foi identificado em todos os meses em regiões tropicais, subtropicais e semi-áridas (Linsuwanon et al., 2009; Huang et al., 2009; Dominguez et al., 2008). Lau et al. (2009), em estudo realizado em Hong Kong, avaliaram amostras de crianças hospitalizadas em 2004 e 2005 e o diagnóstico mais comum foi infecção respiratória superior, em 47% dos casos positivos identificou-se o HRV C. A maior detecção foi nas crianças de um a quatro anos de idade. O HRV C foi relacionado com co-detecções de outros vírus respiratórios em crianças causando doença do trato respiratório inferior em um estudo em Pequim (Xiang et al., 2008). No entanto, alguns estudos não descrevem a associação entre HRV C e doença mais grave. Jin et al. (2009) descrevem que o HRV A/B causaram mais dias de hospitalizações quando comparado ao HRV C. Xiang et al. (2010b) descrevem que tanto o HRV A quanto o HRV C desempenham um papel importante na etiologia de pneumonia adquirida na comunidade. Arden et al. (2010), em estudo realizado com crianças, descrevem que o HRV A estava associado à piora dos sintomas de asma e tosse, além de um tempo prolongado desses sintomas. Em estudo realizado pelo grupo de vírus respiratórios (Laboratório de Virologia Clínica) da Universidade Federal de São Paulo, Moreira et al., (2011) descrevem uma freqüência alta de HRV, incluindo HRV C, em pacientes pediátricos provenientes de crecheescola na cidade de São Paulo. O HRV C foi encontrado em 60.7% das crianças que apresentavam chiado e 69.5% das crianças que não apresentavam chiado, porém não foi encontrada diferença estatística na ocorrência de HRV C nestes dois grupos de pacientes. Os resultados deste estudo indicam que, na população estudada, o HRV não estava associado ao quadro de chiado. 32 O papel do HRV C ainda não está claro, principalmente quanto à gravidade do quadro respiratório causado por este vírus. Estudos de seguimento de adultos e crianças da comunidade associado à epidemiologia molecular e avaliação clínica podem colaborar no esclarecimento desta questão. 1.10 DIAGNÓSTICO No diagnóstico de HRV os métodos sorológicos em amostras clínicas têm aplicação limitada pela diversidade de sorotipos. Inicialmente a detecção dos HRVs era dependente do isolamento viral em cultura de células humanas e algumas linhagens de células de primatas. Uma das limitações deste método é a especificidade dos HRVs a algumas linhagens celulares, o que está relacionado com a presença de receptores específicos na superfície das células. Dessa forma a sensibilidade do método varia consideravelmente de acordo com as linhagens utilizadas e os melhores resultados são obtidos com a combinação de fibroblastos embrionários humanos (WI-38 e MCR-5) e células HeLa. Devido à baixa sensibilidade, os estudos epidemiológicos que utilizam somente o isolamento viral acabam subestimando a freqüência de infecção por HRVs. Outro teste que permite diferenciar HRVs de enterovírus é o teste de sensibilidade ao ácido, pois os HRVs são resistentes ao éter, mas sensíveis ao ácido (Turner & Cough 2007). As amostras contendo secreção de nasofaringe são as mais indicadas para detecção de HRV, sendo que o lavado nasal apresenta resultado superior quando comparado ao swab nasal, lavado de orofaringe e escarro (Turner & Cough 2007). A crescente utilização da técnica de reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR) permitiu a detecção de HRV diretamente de amostras clínicas, com maior sensibilidade que a cultura viral. A maioria dos ensaios de RT-PCR para detecção de HRV amplifica uma parte da seqüência de nucleotídeos da região 5´-NCR do genoma viral, devido a essa região ser altamente conservada entre os picornavírus. Esses ensaios apresentam alta sensibilidade, porém é necessário um passo seguinte para diferenciação entre 33 enterovírus e HRVs, como por exemplo, hibridização com sondas específicas (Blomqvist 1999; Pitkäranta 1997), Nested-PCR com primers específicos para HRV (Arruda e Hayden 1993; Steininger 2001; Billaud 2003) ou sequenciamento de DNA (Mori & Clewley 1994). A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes envolvidos na caracterização antigênica viral permite também determinar os diferentes sorotipos de HRVs (Savolainen 2002b). Métodos moleculares, especialmente o sequenciamento parcial ou total do genoma e a comparação de informações genéticas, têm sido uma ferramenta importante no monitoramento do progresso da Iniciativa da Erradicação Global da Poliomelite. A análise filogenética das seqüências dos genomas virais tem elucidado a epidemiologia de muitas outras viroses importantes. A epidemiologia molecular tem fornecido respostas para duas questões importantes: de onde os vírus vêm e como eles se disseminam na população humana (Savolainen 2003). Outro método molecular que tem sido amplamente utilizado é a PCR em tempo real. Essa metodologia utilizada com uma abordagem quantitativa para detecção de rinovírus pode representar uma ferramenta útil na investigação do papel epidemiológico e clínico desse agente. Em pacientes imunocomprometidos, a quantificação pode esclarecer uma possível relação entre a carga viral e a gravidade ou duração da infecção, além de sua aplicação no diagnóstico de rotina de infecções do trato respiratório superior e inferior. Novas técnicas de PCR em tempo real têm permitido uma rápida detecção do vírus e quantificação viral (Kares et al., 2004). Os resultados da quantificação podem ser aplicados para avaliar a relação entre a carga viral e predição da progressão da infecção para a doença clínica. Estudos clínicos de seguimento são necessários para tentar elucidar esse assunto, uma vez que a presença de baixos níveis de acido nucléico detectados pela PCR convencional nem sempre reflete uma associação entre a produção de vírus infecciosos e transmissão ou a progressão para uma doença mais grave no paciente (Kuypers et al., 2009). 34 Tapparel et al. (2009) descrevem a padronização de uma PCR em tempo real que identifica o HRV A, o HRV B e o enterovírus humano. Os autores concluem que essa metodologia é sensível e específica, pois utiliza regiões altamente conservadas dos genes destas espécies. Para detecção de HRV C, vários estudos têm utilizado protocolos de RT-PCR que amplificam os genes das regiões VPs e 5’NCR seguido de seqüenciamento genético (Savolainen et al., 2002a; Lau et al., 2007; Xiang et al., 2008; Jin et al., 2009; SavolainenKopra et al., 2009). Outras abordagens realizam somente o sequenciamento da região 5’ NCR (Kiang et al., 2008; Calvo et al., 2009; Tapparel et al., 2009). E outros estudos ainda avaliaram outras regiões: VP4 (Lau et al., 2007; Lau et al., 2009), VP1 e VP4 (Lamson et al., 2006), VP4 e VP2 (Renwick et al., 2007). Entretanto, a maioria dos trabalhos trata apenas da identificação molecular do HRV C a partir de amostras clínicas. Nenhum estudo sistemático foi realizado para examinar a epidemiologia e características clínicas do HRV C, em comparação as espécies A e B no Brasil. Em particular, a importância do HRV C na doença respiratória do adulto ainda não é bem compreendida, tornado-se relevante o estudo em diferentes populações de adultos, tanto imunocompetentes quanto imunocomprometidos. Para os HRVs a pesquisa epidemiológica molecular está no início e muitas questões permanecem sem resposta. Métodos de sequenciamento parcial dos genes VPs e a comparação de informações genéticas já disponíveis no Genebank têm permitido a determinação das espécies de HRVs (Savolainen et al., 2002b; Laine et al., 2005, Ledford et al., 2004; Oberst et al., 1999a; Oberst et al., 1999b). Estudos de epidemiologia molecular têm sido utilizados na caracterização de HRVs obtidos em uma coorte de crianças, que apresentaram infecções respiratórias agudas (Savolainen et al., 2002a). 35 1.11 TERAPIA ANTIRINOVIRAL E VACINA Viroses respiratórias desempenham um papel importante como iniciadores de exacerbações de doenças respiratórias crônicas, como a asma e a DPOC. Os HRVs são considerados patógenos respiratórios importantes na infecção do trato respiratório superior e inferior. O papel dos HRVs na exacerbação da asma e na DPOC faz destes vírus importante alvos terapêuticos. Atualmente não existe um tratamento aprovado no combate ao HRV, e dada à experiência com o vírus influenza, a vacinação parece ser a melhor opção no controle dos vírus respiratórios (Rohde, 2011). Existem alguns problemas no desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o HRV: 1- existem mais de 100 sorotipos de HRV, possuindo alta variabilidade genética, resultando em alta variabilidade nos sítios antigênicos; 2- o conhecimento acerca da epidemiologia do HRV é limitado, e não existe vigilância como no caso do vírus influenza, sendo difícil a identificação de sorotipos clinicamente importantes para cobertura da vacina; 3 – existem três proteínas de capsídeo antigênicas, mas a evidência da importância individual de cada proteína não é suficiente para o desenvolvimento de uma vacina; 4 – modelos animais de infecção por HRV são limitados e as evidências da patofiosiologia viral nestes modelos são escassas. Edlmayr et al. (2011), em estudo publicado no European Respiratory Journal, apresenta evidências de que uma vacina contra o HRV será possível em um futuro próximo. Os autores deste trabalho demonstram que a imunização com a proteína de capsídeo VP1 completa, induz a produção de anticorpos neutralizantes melhores e em altos títulos, quando comparados aos anticorpos gerados contra peptídeos. Neste mesmo trabalho os autores também mostram neutralização cruzada de sorotipos não relacionados (HRV 14 e 89), porém essa neutralização cruzada não ocorreu em metade dos sorotipos testados. 36 1.12 JUSTIFICATIVA No Brasil, os dados anteriormente citados apontam para uma prevalência importante de rinovírus em populações distintas. No entanto, até o momento, não foram realizados estudos de epidemiologia molecular de HRV. Sendo assim, a da dinâmica da infecção pelas diferentes espécies desse agente ainda não foi investigada no contexto nacional. A importância desse tipo de estudo reside em obtermos um maior conhecimento sobre a diversidade do HRV, sua distribuição em diferentes populações, principalmente pacientes adultos não hospitalizados, e a possível implicação na apresentação clínica das infecções respiratórias, permitindo também o entendimento de possíveis associações entre espécies diferentes e patogenicidade. Nos casos de infecções respiratórias, por exemplo, o melhor entendimento do papel do vírus pode esclarecer a associação entre o HRV e quadros mais graves, como o quadro de Influenza-Like-Illness. 37 Objetivos 2. OBJETIVOS 3.1 – Objetivo geral: Realizar a caracterização genética dos rinovírus humanos em amostras de pacientes infectados sintomáticos provenientes de populações distintas do Estado de São Paulo. 3.2 - Objetivos específicos: • Avaliar a ocorrência das diferentes espécies de rinovírus humanos circulantes durante os diferentes períodos nas populações do estudo. • Investigar as possíveis associações epidemiológicas entre espécies encontradas e a dinâmica de circulação dos rinovírus humanos nas populações estudadas. • Investigar possíveis associações entre a presença de diferentes espécies de rinovírus humano em pacientes infectados e a diversidade na expressão clínica dos pacientes. 39 Casuística e Métodos 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS 3.1 POPULAÇÕES O presente estudo trata-se de um estudo transversal com análise de amostras e questionários clínicos coletados anteriormente. Os pacientes incluídos no estudo, durante os anos de 2001 a 2003, foram adultos (idade superior a 18 anos) que apresentavam suspeita de infecção aguda respiratória, com início dos sintomas até sete dias, e que foram atendidos em diferentes locais de serviço de assistência à saúde do Complexo Hospital São Paulo da Universidade Federal de São Paulo (HSP – UNIFESP). Todos os pacientes foram convidados a participar da pesquisa voluntariamente e, após o devido esclarecimento, assinaram o consentimento informativo autorizando a coleta da amostra (anexos 1 e 2). A seguir foi realizada entrevista a respeito de dados demográficos, sinais e sintomas clínicos, além de fatores associados à infecção respiratória (anexos 3, 4, 5 e 6). As amostras foram coletadas de: profissionais de saúde (Núcleo de Assistência à Saúde do Funcionário - NASF), população geral (Pronto Socorro do Hospital São Paulo) e pacientes transplantados renais (Ambulatório de Transplantados Renais do Hospital de Rim e Hipertensão). Durante o ano de 2004 foi dada continuidade na coleta das amostras somente na população de Transplantados Renais. No ano de 2005 foram coletadas amostras provenientes de pacientes pediátricos atendidos no ambulatório de cardiopatia da Pediatria do HSP – UNIFESP, com o critérios de inclusão de até 5 dias de início dos sintomas. A coleta de adultos foi realizada por pessoal treinado do Laboratório de Virologia da Disciplina de Infectologia – UNIFESP e, no caso das crianças, pelos pediatras responsáveis pelo atendimento. Em estudo anterior (Perosa 2004), foi realizada a detecção de 102 HRVs (total de 330 pacientes analisados) nas amostras coletadas entre 2001 – 2003, sendo o passo inicial para o presente estudo. No ano de 2004, foram coletadas 242 amostras de Transplantados Renais e em 2005 de 61 crianças, ambas ainda não investigadas quanto à presença de 41 rinovírus. Foram incluídas também 49 amostras coletadas durante os anos de 2003 e 2004 na cidade de Botucatu-SP, que fizeram parte de estudo anterior (Watanabe et al., 2011), no qual foram investigados o Vírus Influenza, o Vírus Respiratório Sincicial Humano (HRSV) e o Metapneumovírus Humano (hMPV) em uma população de idosos (idade acima de 59 anos) que residiam na área urbana da cidade e que apresentavam suspeita de infecção aguda respiratória com até cinco dias de início dos sintomas até a coleta das amostras. Foram obtidas todas as devidas aprovações perante o comitê de ética, da Faculdade de Medicina de Botucatu e da UNIFESP para a realização deste projeto (CEP Nº: 0257/07 – anexos 8 e 9). O critério de inclusão de início de sintomas de até sete dias pode ter sido extrapolado caso julgado necessário pelos médicos responsáveis, ou pela equipe de coleta. 3.2 COLETA DE DADOS No momento da coleta foi aplicado um questionário com dados epidemiológicos e clínicos considerados relevantes para o estudo. Em relação ao quadro clínico, foram investigados: o tempo de início do quadro respiratório; a presença de febre, sintomas respiratórios e gerais; e a presença de comorbidades como cardiopatias, pneumopatias, hipertensão arterial e diabetes. Também foi investigada a imunização prévia contra o vírus Influenza. Quanto aos possíveis fatores de risco para infecção por HRV foi investigado o contato com crianças menores de 5 anos nas três populações (2001 – 2003) e, na população de profissionais de saúde, também foi investigado o contato com paciente, definido como qualquer procedimento direto que possibilitasse a transmissão de infecções respiratórias. Na população dos transplantados renais foi investigado também o tempo decorrido entre o transplante e o aparecimento da infecção respiratória. 42 3.3 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS Para cada paciente adulto foi obtida uma amostra de lavado nasal, instilando-se 5 mL de Ringer-lactato em cada narina e posterior recuperação do lavado em recipiente coletor estéril. Para as amostras de crianças foi coletado o aspirado nasal, e no caso dos idosos foi utilizado swab de nasofaringe. Após a coleta e transporte do material em gelo até o laboratório, 1 mL do lavado foi separado e estocado em freezer –80°C até o momento da extração de ácido nucléico 3.4 EXTRAÇÃO DE RNA O RNA foi extraído, diretamente das alíquotas separadas anteriormente para o PCR, com o auxílio de Kit (RNeasy Total RNA Kit, Qiagen, EUA) seguindo as recomendações do fabricante. Após a extração, o material foi estocado em freezer -80ºC. 3.5 DETECÇÃO ATRAVÉS DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PRECEDIDA DE TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT-PCR) A RT-PCR foi realizada utilizando-se os primers: reverse 9565 e forward 9895 (9565 posição 1083-1058, 5´ GCA TCI GGY ARY TTC CAC CAC CAN CC 3´; 9895 posição 534560, 5´ GGG ACC AAC TAC TTT GGG TGT CCG TGT 3’; de acordo com Hughes et al. (1988) produzindo um fragmento de 549pb, compreendido entre a parte hipervariável da região 5´ NCR, o gene VP4 inteiro e a região terminal 5´ do gene VP2. A síntese de cDNA e a PCR foram realizadas segundo protocolo desenvolvido e padronizado por Savolainen et. al (2002a). A reação de síntese de cDNA foi realizada para um volume final de 20 µL, contendo 10 µL de RNA, 25 mM de tris-HCl (pH 8,3 a 25ºC), 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 2 mM de DTT, 0,8mM de dNTP mix (Invitrogen, EUA), 2,5 U de Moloney Murine Reverse Transcriptase (MMLV-RT; Invitrogen, EUA), 4 U de inibidor de RNAse RNaseOUT 43 (Invitrogen, EUA) e 0.5 µMol/L de primer reverse. Essa mistura foi incubada por 1 hora a 42ºC seguido de um passo a 70ºC por 15 minutos. Para a PCR o volume final de reação foi de 50 µL, contendo 5µL de tampão 10X (0,1 M de Tris-HCl, pH 8,8 a 25ºC, 0,5 M KCl, 1% de triton X-100), 3,5 µMol/L de MgCl2, 0,4 mMol/L de dNTP mix (Invitrogen, EUA), 0,4µMol/L de cada primer, 2,5U de Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen, EUA), 10 µL de cDNA e água DEPC (Invitrogen, EUA) q.s.p. 50 µL. As condições de ciclagem para essa reação foram: 5 min. a 94ºC, seguido de 40 ciclos de 45 seg. a 94ºC, 45 seg. a 61ºC e 1 min. a 72ºC e uma extensão final de 72ºC por 10 min. Em todas as reações foi utilizado um controle negativo com água Milli-Q autoclavada substituindo o ácido nucléico e um controle positivo obtido de projeto anterior (Perosa 2004). A eficiência das amplificações foi monitorada pela eletroforese do produto da PCR em gel de agarose 1,5% (Invitrogen, EUA) preparada em tampão 1x TBE (Tampão Borato/EDTA) e corado com Syber Safe (Invitrogen, EUA). O tamanho dos produtos amplificados foi comparado com padrão de 100 pares de bases (Invitrogen, EUA) e posteriormente fotografado sob transiluminação UV. 3.6 SEQUENCIAMENTO GENÉTICO Os produtos de PCR foram purificados com o Kit de purificação ChargeSwitch®PCR Clean-Up Kit (Invitrogen, EUA), seguindo as recomendações do fabricante. A seguir o DNA purificado foi quantificado em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo, utilizandose como referência o marcador Low Mass Ladder (Invitrogen, EUA). Os produtos purificados e quantificados foram armazenados a –20ºC ou foram utilizados diretamente na reação de sequenciamento (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Life Technology, EUA) com os mesmos primers utilizados na PCR, seguindo as recomendações do fabricante. O mix da reação de sequenciamento foi composto pelos seguintes reagentes: 2µL de mix de 44 sequencimento BigDye v. 3.1 (Life Technology, EUA), 3.2 µMol/L dos mesmos primers utilizados na reação de amplificação (HRVF ou HRVR), água q.s.p. 18µL e 2µL do produto de PCR purificado. Os parâmetros da reação utilizados foram os seguintes: 2 min a 95°C, seguido de 26 ciclos de 10 seg. a 95°C, 15 seg. a 50°C e 4 min. a 60°C. O sequenciamento foi realizado em sequenciador automático de DNA ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, EUA). 3.7 ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS E ANÁLISE FILOGENÉTICA Inicialmente as sequências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX (Larkin et al., 2007), então todos os locais com deleções e inserções foram excluídos com o objetivo de preservar as regiões codificadoras. Após esse processo de edição, as sequências foram manualmente alinhadas utilizando o programa SE-AL, versão 2.0 (Department of Zoology, Oxford University; http://evolve.zoo.ox.ac.uk/software/). As relações filogenéticas das sequências dos genes VP4-VP2 foram analisadas utilizando o método de máxima verossimilhança (Maximum Likelihood - ML) e o modelo GTR (General Time Reversible), por meio do programa PhyML (Guindon e Gascuel, 2003). As árvores filogenéticas foram replicadas 500 vezes com o objetivo de fornecer um valor de Bootstrap confiável para os clados. Foi utilizado o programa Topali v2.5 (Milne et al., 2004) para a análise filogenética e obtenção da árvore. Cinquenta e duas sequências de HRV publicadas previamente, compreendendo os genes VP4-VP2, foram obtidas do banco de sequências genéticas GenBank (NCBI). Essas 52 seqüências foram distribuídas da seguinte forma: 33 seqüências de HRV A, 13 seqüências de HRV B e 6 seqüências de HRV C. Como análise secundária foi realizado um alinhamento das seqüências obtidas com o auxílio do programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - NCBI) com o objetivo de determinar os sorotipos de HRV. 45 Para tal análise foram selecionadas as sequências que apresentavam os maiores valores de homologia e e-value. 3.8 CORRELAÇÃO COM SINTOMAS Após a determinação das espécies foi realizada a comparação com os sintomas. Para efeito dessa análise pacientes que apresentavam Influenza-Like-Illness (ILI) foram considerados com infecção mais grave do que o resfriado comum. O critério de ILI ainda é utilizado em todo o mundo em estudos de vigilância de gripe, e de outras viroses respiratórias (Boivin et al., 2000, Bellei et al., 2008). Nesse estudo foram considerados ILI indivíduos que apresentavam febre mais, pelo menos um sintoma respiratório (tosse, coriza ou dor de garganta) e pelo menos um sintoma constitucional (dor de cabeça, mal-estar, mialgia, calafrio ou fadiga). No caso das crianças cardiopatas sintomas como chiado e dispnéia foram considerados mais graves. 3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA Realizou-se o teste de qui-quadrado e a regressão logística múltipla não-condicional para verificar possíveis associações entre as variáveis categóricas estudadas (HRV, ILI e espécies). Os resultados foram apresentados em Odds Ratio (OR – razão de chance) com o respectivo intervalo de confiança (IC) de 95%. Para a análise de comparação das médias foi utilizado os teste T de Student e análise de variância (ANOVA). Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todos os valores de p descritos são bi-caudais. Para a análise estatística foi utilizado o programa SPSS v. 11.0 (SPSS Inc., Chigaco, EUA) 46 Resultados 4. RESULTADOS 4.1 Limite de detecção da reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR) Para definição da sensibilidade da reação de PCR foi realizado um teste com diluições do controle positivo, variando de puro a 10-6, o DICT50 (Dose Infectante de Cultura de Tecido50) inicial era de 102,75TCID50/100 uL (Figura 2). A diluição seriada foi realizada antes da extração de ácido nucléico. O Ensaio foi padronizado para detecção de 10-3,25 DICT50 do sorotipo HRV 39. Figura 2. Teste das diluições do controle positivo. NO = controle negativo. PM = peso molecular. 4.2 Detecção geral Dentre as 682 amostras estudadas 164 (24.05%) foram positivas para Rinovírus Humano e foram encontrados os seguintes resultados nas populações analisadas (Tabela 2 e Figura 3): adultos imunocompetentes – 79 amostras positivas (23.94% - 79/330); adultos transplantados renais – 57 amostras positivas (23.55% - 57/242); crianças cardiopatas– 14 amostras positivas (22.95% - 14/61) e idosos – 14 amostras positivas (28.57% - 14/49). Os adultos imunocompetentes compreendem duas populações: adultos atendidos no pronto socorro – 20 amostras positivas (15.15% - 20/132) e adultos profissionais de saúde – 59 amostras positivas (29.80% - 59/198). A análise estatística apresentou diferença de positividade significante (p < 48 0.01) entre os adultos imunocompetentes (adultos atendidos em pronto-socorro e adultos profissionais de saúde), através do teste qui-quadrado. Foi realizada a análise da ocorrência de HRV em pacientes imunocompetentes (adultos atendidos em pronto-socorro somados aos adultos profissionais de saúde – 79 HRV positivos/330 amostras – 23.94%) e imunocomprometidos (adultos transplantados renais somados aos idosos – 71 HRVpositivos/291 amostras – 24.40%) com o objetivo de avaliar se existe diferença de ocorrência nessas duas populações. A análise estatística revelou que não existe diferença estatística significante (p = 0.9685) na ocorrência de HRV entre essas populações. Tabela 2. Positividade por população. Pronto-socorro: adultos atendidos em pronto-socorro; profissionais de saúde: adultos profissionais de saúde atendidos no Núcleo de Assistência à Saúde do Funcionário; transplantados renais: adultos transplantados renais; crianças: crianças cardiopatas; idosos: idosos da cidade de Botucatu, São Paulo, SP. 49 Figura 3. Ocorrência de infecção pelo HRV em relação às diferentes populações estudadas. Os números acima de cada coluna indicam as freqüências encontradas. Adultos: adultos atendidos em pronto-socorro somados aos adultos profissionais de saúde atendidos no Núcleo de Assistência à Saúde do Funcionário; transplantados renais: adultos transplantados renais; crianças: crianças cardiopatas; idosos: idosos da cidade de Botucatu, São Paulo, SP. A análise estatística revelou que não existe diferença estatística significante (p = 0.8979) na ocorrência de HRV nas diferentes populações estudadas. A ocorrência de HRV nos diferentes anos do estudo é mostrada na Figura 4. Figura 4. Ocorrência de infecção pelo HRV em relação às amostras coletadas durante os anos estudados. Os números acima de cada coluna indicam as freqüências encontradas. 50 A análise estatística revelou que existe tendência para heterogeneidade na ocorrência de HRV nos diferentes anos do estudo (p = 0.0639). Com maior ocorrência nos anos de 2003 e 2004. 4.3 Detecção do HRV e gênero dos pacientes estudados A Tabela 3 mostra a distribuição do gênero entre os pacientes estudados com relação à presença e ausência de infecção pelo HRV. Tabela 3. Distribuição do gênero entre os pacientes estudados. HRV – Rinovírus Humano. A análise estatística não revelou diferença estatística significante (p = 0.8353) na ocorrência de HRV entre os gêneros. 4.4 Detecção do HRV e idade dos pacientes estudados A idade média de todos os pacientes estudados foi de 35.8 anos e a mediana foi de 35 anos, variando de recém nascido a 85 anos. Nos diferentes grupos a distribuição foi à seguinte: adultos imunocompetentes (profissionais de saúde + adultos atendidos no pronto socorro do Hospital São Paulo) - média: 35.03 anos e mediana: 33 anos (12-83 anos); adultos transplantados renais – média: 38.41 anos e mediana: 38.5 (5-67 anos); crianças cardiopatas – média: 7.26 anos e mediana: 2 anos (recém nascidos-14 anos) e idosos – média: 70.07 anos e mediana: 69 anos (60-85 anos). A ocorrência dos casos positivos e negativos em relação ao total de amostras estudadas por faixa etária é mostrada na Figura 5. A Tabela 4 apresenta as médias e medianas dos casos positivos e negativos nas diferentes populações estudadas. 51 Tabela 4. Idade dos pacientes estudados. * Adultos imunocompetentes – adultos pronto-socorro + adultos profissionais de saúde. RN – pacientes recém nascidos. Foi utilizado o teste T de Student para comparação das médias entre positivos e negativos em cada população. Não foi encontrada diferença estatística significante entre pacientes positivos e negativos nas populações estudadas, em relação à idade. Figura 5. Distribuição dos casos positivos, negativos e total em relação às diferentes faixas etárias nas populações estudadas. 4.5 Detecção do HRV e tempo de início de sintomas até o momento da coleta O tempo de início de sintomas até a coleta da amostra pode ser verificado na Tabela 5. 52 Tabela 5. Tempo de início dos sintomas até a coleta da amostra nos pacientes estudados. Foi utilizado o teste T de Student para comparação das médias entre positivos e negativos em cada população. Foi encontrada uma tendência para diferença estatística significante entre pacientes positivos e negativos, com relação ao tempo de início de sintomas, nas populações de adultos atendidos em pronto-socorro (p = 0.06706) e adultos transplantados renais (p = 0.07032). Quando agrupados adultos atendidos em pronto-socorro com adultos profissionais de saúde (denominados no presente estudo como adultos imunocompetentes), o tempo médio de início dos sintomas foi menor para os pacientes positivos comparados aos pacientes negativos. Esta análise de tempo de início dos sintomas apresentou diferença estatística significativa (p = 0.0010). 4.6 Detecção do HRV e sintomas Os principais sintomas referidos pelos pacientes das diferentes populações são mostrados na Tabela 6. Tabela 6. Sintomas apresentados pelos pacientes estudados. Pronto socorro: adultos atendidos no pronto socorro 53 As freqüências de ILI nas populações estudadas são mostradas na Tabela 7. Entre os pacientes positivos para HRV o quadro de ILI estava presente em 38.34% destes pacientes. Tabela 7. Frequencia de ILI nas populações estudadas. Profissionais de saúde: adultos profissionais de saúde; Pronto socorro: adultos atendidos em pronto socorro; Transplantados renais: adultos transplantados renais. A análise estatística revelou que existe diferença estatística significante de ocorrência de ILI nas diferentes populações (p < 0.0001). A freqüência de HRV nos pacientes que apresentavam ILI pode ser vista na Tabela 8. Tabela 8. Frequencia de ILI em pacientes infectados por HRV. Profissionais de saúde: adultos profissionais de saúde; Pronto socorro: adultos atendidos em pronto socorro; Transplantados renais: adultos transplantados renais. A análise estatística revelou que existe diferença estatística na população geral (p = 0.0396), com predominância de ILI em pacientes negativos para o HRV. A análise estatística também revelou que existe diferença estatística na população de adultos atendidos no pronto-socorro (p = 0.006), com predominância de ILI em pacientes negativos para o HRV. Os principais sintomas referidos pelos pacientes imunocompetentes em comparação a adultos transplantados renais e crianças cardiopatas são mostrados na Tabela 9. 54 Tabela 9. Sintomas apresentados pelos pacientes estudados. Adultos imunocompetentes – adultos atendidos no pronto-socorro somado aos adultos profissionais de saúde. A análise de regressão logística dos sintomas em relação à infecção pelo HRV em pacientes imunocompetentes (adultos atendidos no pronto-socorro somado aos adultos profissionais de saúde) apresentou os seguintes resultados: tosse (OR = 2.25, IC 95% = 1.01-4.99, p = 0.047) e coriza (OR = 2.76, IC 95% = 1.05-7.24, p = 0.040). A análise dos sintomas apresentados pelas outras populações não mostrou significância estatística. 4.7 Análise filogenética Dentre as 164 amostras positivas foi possível realizar a identificação da espécie de HRV em 131 (79.88%). Foi encontrada a seguinte distribuição: 80 HRV A (61.00% - 80/131), 22 HRV B (16.80% - 22/131) e 29 HRV C (22.20% - 29/131). A Figura 6 mostra a análise da árvore filogenética (Maximum Likelihood - máxima verossimilhança) das regiões VP4/VP2 do genoma do HRV. 55 Figura 6. Análise da árvore filogenética (Maximum Likelihood - máxima verossimilhança) das regiões VP4/VP2 do genoma do HRV. Foi utilizado um valor de Bootstrap de 500 vezes. A árvore foi circularizada para melhor vizualização de todas as informações. O picornavírus Echo 11 (número de acesso do GenBank: EF634316.1) foi utilizado como outgroup. Foram obtidas 52 seqüências referência no GenBank. Ao lado das seqüências referência (Rhino A, Rhino B e Rhino C) se encontram os números de acesso do GenBank. 4.8 Número de amostras não analisadas no decorrer do estudo A Figura 7 mostra a quantidade de amostras na qual o seqüenciamento genético não foi realizado, e a quantidade de amostras em que alguma análise genética pôde ser realizada. 56 Figura 7. Número de amostras não analisadas no decorrer do estudo. 4.9 Sazonalidade das espécies de HRV A figura 8 mostra a ocorrência das espécies de HRV durante os anos do estudo. Figura 8. Distribuição mensal das espécies de HRV durante os anos estudados. 4.10 Espécies de HRV e populações A Tabela 10 mostra a ocorrência das espécies de HRV nas diferentes populações estudadas. 57 Tabela 10. Distribuição das espécies de HRV nos diferentes grupos de risco. PS – Pronto Socorro; Profissionais saúde – profissionais da área de saúde; Transplantados renais – pacientes adultos transplantados renais; Crianças – Crianças cardiopatas. A análise estatística não revelou diferença estatística significante (p = 0.7617) na ocorrência das espécies de HRV entre as diferentes populações. 4.11 Espécies de HRV e gênero A Tabela 11 mostra a distribuição do gênero s entre os pacientes estudados com relação às espécies de HRV. Tabela 11. Gênero dos pacientes estudados em relação às espécies de rinovírus humano. HRV – Rinovírus humano. A análise estatística revelou que não existe diferença estatística significante (p = 0.4660) na ocorrência das espécies HRV nos diferentes gêneros das populações estudadas. 58 4.12 Espécies de HRV e idade A ocorrência das espécies de HRV conforme a faixa etária dos pacientes estudados é apresentada na Figura 9. Figura 9. Freqüência das espécies de HRV em diferentes faixas etárias. A análise estatística não revelou diferença estatística significante (p = 0.8111) na ocorrência de HRV nas diferentes faixas etárias das populações estudadas. A Figura 10 mostra a freqüência das espécies de HRV em diferentes faixas etárias de pacientes com idade superior a 50 anos. Figura 10. Freqüência das espécies de HRV em diferentes faixas etárias de pacientes com idade superior a 50 anos. 59 A análise estatística não revelou diferença estatística significante (p = 0.6315) na ocorrência das espécies de HRV em pacientes acima de 50 anos de idade. 4.13 Espécies de HRV e tempo de início de sintomas até o momento da coleta A Tabela 12 mostra a o tempo de início de sintomas até o momento da coleta em relação às espécies de rinovírus humano. Tabela 12. Tempo de início de sintomas em relação às espécies de rinovírus humano. HRV – Rinovírus humano. Foi utilizado análise de variância (ANOVA) para comparação das médias entre positivos e negativos em cada população. Foi encontrada diferença estatística significante (p = 0.0385) entre distribuição das espécies de HRV, com relação ao tempo de início de sintomas, na população de profissionais de saúde. Foi encontrada uma tendência para diferença estatística significante entre distribuição das espécies de HRV, com relação ao tempo de início de sintomas, na população de adultos atendidos em pronto-socorro (p = 0.0806). 4.14 Espécies de HRV e sintomas A tabela 13 mostra os sintomas apresentados pelos pacientes de acordo com espécie de HRV isolada. 60 Tabela 13. Sintomas apresentados pelos pacientes de acordo com espécie de HRV. HRV A – rinovírus humano espécie A, HRV B - rinovírus humano espécie B, HRV C - rinovírus humano espécie C. 61 4.15 Ocorrência das espécies de HRV e ILI – pacientes adultos atendidos em pronto-socorro, pacientes adultos profissionais de saúde e pacientes adultos transplantados renais. A análise de regressão logística de ILI em relação a presença das espécies de HRV nos pacientes estudados é mostrada na tabela 14. Tabela 14. Regressão logística de ILI em relação a presença das espécies de HRV nos pacientes estudados. ILI – Influenza-Like-Illness, OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança. χ2 – Teste qui-quadrado. A análise estatística revelou que não existe diferença estatística significante na ocorrência das espécies A e B em relação à presença ou ausência de ILI. A análise estatística também revelou que existe diferença estatística significante na ocorrência das espécies A e C em relação à presença ou ausência de ILI. Pacientes infectados com HRV A possuem três vezes mais chance de apresentar ILI quando comparados aos pacientes infectados com a espécie HRV C (p = 0.048/ IC 95% 1.01 – 9.163). 4.16 Espécies de HRV e estado imune Foi realizada a análise da ocorrência das espécies de HRV em pacientes imunocompetentes (adultos atendidos em pronto-socorro somados aos adultos profissionais de saúde) e imunocomprometidos (adultos transplantados renais somados aos idosos) com o objetivo de avaliar se existe uma espécie mais freqüente nessas duas populações. A Tabela 15 mostra os resultados dessa análise. 62 Tabela 15. Ocorrência das espécies em pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos. Adultos imunocompetentes = adultos atendidos no pronto socorro + adultos profissionais de saúde. Imunocomprometidos = adultos transplantados renais + idosos. A análise estatística não revelou diferença estatística significante (p = 0.7229) na ocorrência das espécies de HRV em pacientes imunocompetentes e pacientes imunocomprometidos. 4.17 Frequência de ILI em pacientes infectados pelo HRV Como descrito na Casuística e Métodos foi adotado o critério de ILI (Influenza-like-illness) para descrição de um quadro sintomático de maior gravidade. Nas populações de adultos imunocompetentes e transplantados renais foi encontrado que 38.81% dos pacientes positivos para HRV apresentavam o quadro de ILI. 4.18 Regressão logística múltipla não-condicional 4.18.1 Ocorrência de HRV e ILI – população geral Em todas as análises estatísticas realizadas em relação a ILI foram excluídos os pacientes idosos, pois não havia uma descrição completa dos sintomas; as crianças portadoras de cardiopatia congênita, pois os sintomas considerados graves nessa população são diferentes dos sintomas adotados através do critério de ILI; também foram excluídos os pacientes que foram positivos para outros vírus, pois a infecção por outro vírus pode levar a um quadro de ILI que não foi relacionado à infecção pelo HRV, não sendo também relacionado a ausência de infecção pelo HRV. A análise estatística revelou diferença estatística significante (p = 0.0425) na ocorrência global de HRV em relação à presença ou ausência de ILI. Foi encontrado um Odds ratio de 63 1.51 com intervalo de confiança de 95% variando de 1.01 - 2.24 com relação aos pacientes negativos para infecção por HRV. 4.18.2 Ocorrência de genêros e ILI – gênero A Tabela 16 descreve a ocorrência de ILI em relação ao gênero dos pacientes estudados. Tabela 16. Regressão logística de ILI em relação ao gênero dos paciente estudados. ILI – Influenza-Like-Illness. A análise estatística revelou que não existe diferença estatística significante (p = 0.9248) na ocorrência dos gêneros em relação à presença ou ausência de ILI. 4.18.3 Ocorrência de HRV e ILI – pacientes adultos atendidos em pronto-socorro A análise estatística revelou que existe diferença estatística significante (p = 0.0024) na ocorrência de HRV em relação à presença ou ausência de ILI. Foi encontrado um Odds ratio de 4.33 com intervalo de confiança de 95% variando de 1.60 - 11.74 para os pacientes negativos para infecção por HRV. 4.18.4 Ocorrência de HRV e ILI – pacientes adultos profissionais de saúde A análise estatística revelou que não existe diferença estatística significante (p = 0.9111) na ocorrência de HRV em relação à presença ou ausência de ILI, em pacientes adultos profissionais de saúde. 64 4.18.5 Ocorrência de HRV e ILI – pacientes adultos transplantados renais A análise estatística revelou que não existe diferença estatística significante (p = 0.9111) na ocorrência de HRV em relação à presença ou ausência de ILI, em pacientes adultos transplantados renais. 4.19 Resultados adicionais Foi realizado também uma análise através do programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) com o objetivo de determinar os sorotipos de HRV (anexo 7). A análise de presença de ILI baseada na classificação filogenética também foi realizada. Foram observados quatro clusters (Figura 11) que agrupavam mais amostras com presença de ILI e que havia a classificação do sorotipo pelo BLAST. Esses clusters estão descritos na Tabela 17. Figura 11.Os realces em azul mostram os quatro clusters que acumularam mais casos de ILI. 65 Tabela 17. Sorotipos obtidos através de análise pelo programa BLAST. HRV – rinovírus humano. *As seqüências de todas as amostras descritas na tabela acima foram analisadas através do programa BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) sendo que todos os pacientes, incluídos nesta análise, apresentavam Influenza-Like-Illness (ILI). 66 Discussão 5. DISCUSSÃO O presente estudo avaliou os aspectos clínicos e a epidemiologia molecular da infecção por rinovírus humano (Human Rhinovirus - HRV) entre diferentes grupos, incluindo grupos de risco, de pacientes brasileiros não hospitalizados em um intervalo de cinco anos. De um modo geral houve uma alta taxa de detecção do HRV entre as populações estudadas, fato esse já descrito por outros estudos (Arruda et al., 1997, Olsen et al., 2010; Peltola et al., 2009, Miller et al., 2007, Lau et al., 2009; Piralla et al., 2009). Os pacientes adultos profissionais de saúde foi o grupo que apresentou maior taxa de infecção por HRV no presente estudo (29.80%, página 49). Bellei et al. (2007) descrevem que trabalhadores da área de saúde são um importante grupo de risco para aquisição de infecção viral respiratória, principalmente com HRV e vírus influenza. Neste mesmo trabalho foi descrito uma freqüência de 37.7% de HRV em amostras negativas para o vírus influenza. Os profissionais da área de saúde podem servir como fonte de transmissão de vírus respiratórios. Um exemplo desse fato foi à quantidade de profissionais de saúde com infecção pelo coronavírus SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome), aproximadamente 50% dos pacientes infectados por esse novo vírus eram profissionais de saúde (CDC 2003). O fato destes trabalhadores desempenharem papel importante na transmissão de viroses respiratórias reforça a importância da vigilância epidemiológica e laboratorial nesse grupo. Nos pacientes adultos atendidos em pronto-socorro, foi encontrando uma freqüência de 15.15% (página 49) de infecção por HRV. Esse dado pode representar uma freqüência desse agente na comunidade, pois estes pacientes não eram provenientes de ambientes hospitalares. 68 Os pacientes transplantados renais representam uma população de risco incluída no presente estudo. Nesse grupo o HRV foi encontrado em 23.55% das amostras analisadas. Poucos estudos verificaram a ocorrência de HRV em populações de transplantados de órgãos sólidos. López-Medrano et al. (2007) descrevem uma freqüência de 23.53% de infecção por picornavírus em amostras de swab de nasofaringe de pacientes transplantados de órgão sólidos. Os estudos realizados em crianças cardiopatas demonstram a circulação de vírus respiratórios, alguns em taxas relativamente altas, indicando que nesta população estes agentes devem ser considerados na prática clínica e diagnóstica. Entre as crianças cardiopatas a freqüência de HRV foi de 22.95% (página 49). Poucos estudos analisaram a ocorrência de HRV neste tipo de população (Carrat et al., 2006; Daubin et al., 2006). Medrano López et al. (2010) em estudo realizado com crianças cardiopatas, verificou uma freqüência de 22.5% de vírus respiratório sincicial (VRS) e 2.9% de outros vírus respiratórios (adenovírus, vírus influenza e parainfluenza vírus). Outra população estudada, os idosos, também pode refletir a incidência de HRV na comunidade, pois esses pacientes eram atendidos em suas próprias residências (Watanabe et al., 2011). Nessa população foi encontrada uma freqüência de HRV de 28.57% (página 49). Infecções causadas por HRV são comuns em diferentes populações, incluindo os idosos, sendo responsável por 25 a 50% das doenças respiratórias em idosos não institucionalizados (Nicholson et al., 1997). A análise da etiologia viral entre os idosos vacinados mostrou que o HRV é o principal agente responsável pela demanda de serviços de saúde (Watanabe et al., 2011). A alta incidência de HRV durante os meses da temporada de influenza necessita de mais investigações no que diz respeito ao impacto da infecção causada pelo HRV nas complicações respiratórias em idosos no Brasil. 69 Foi realizada a análise de ocorrência de HRV entre paciente imunocompetentes e imunocomprometidos, revelando que não houve diferença estatística significante entre essas duas populações. Gerna et al. (2009) descrevem diferença entre a ocorrência de HRV em grupos de pacientes immunocompetentes e imunocomprometidos. Esse resultado obtido no presente estudo pode indicar uma maior frequência de HRV em pacientes com imunidade alterada, mas com a ressalva de que esse fato não necessariamente implica em doença mais intensa nessa população (resultado discutido mais adiante em pacientes transplantados renais). A distribuição do sexo nos pacientes estudados seguiu a seguinte proporção: aproximadamente um paciente do sexo masculino para cada duas pacientes do sexo feminino. Uma freqüência semelhante foi descrita por Arruda et al. (1997), também em pacientes adultos não hospitalizados. A proporção entre os sexos de pacientes infectados pelo HRV é bastante variável na literatura, variando de 30 a 70% de freqüência do sexo masculino (Miller et al., 2009a; Miller et al., 2009b; Lau et al., 2009; Xiang et al., 2010b). No presente estudo não houve associação entre gênero e infecção por HRV (p = 0.8353, página 51), possivelmente indicando que não há maior risco de infecção por HRV em um determinado sexo. Em estudo realizado com pacientes adultos chineses, Xiang et al. (2010a) também descreve que não encontrou associação entre infecção pelo HRV e gênero, concluindo que não há maior risco de infecção para nenhum dos sexos. A maioria dos pacientes estudados foi composta por adultos, que apresentaram idade média de 35.8 anos e mediana de idade de 35 anos, variando de recém nascido até 85 anos (página 51). A análise estatística não revelou diferença significante entre a infecção por HRV e a idade das populações do estudo. A análise estatística também não revelou diferença estatística significante (p = 0.8111, página 59) na ocorrência de HRV nas diferentes faixas etárias das populações estudadas. 70 Poucos estudos analisaram pacientes adultos não hospitalizados que apresentavam infecção pelo HRV. Em um dos primeiros estudos realizados com pacientes adultos não hospitalizados, que verificou a ocorrência de HRV, Arruda et al. (1997) descreve que a população incluída no estudo apresentava mediana de idade de 20 anos. Lau et al. (2009) descreve uma freqüência de 7% de amostras positivas para HRV em pacientes adultos hospitalizados. Gerna et al. (2009) descreve uma freqüência de 9.3% em pacientes adultos imunocompetentes, mas neste caso também os pacientes analisados eram hospitalizados. Vale salientar que no presente estudo as diferentes populações avaliadas eram compostas por pacientes não hospitalizados. Aparentemente a idade dos pacientes não hospitalizados incluídos no estudo não possui relação com a infecção pelo HRV. Uma hipótese a ser considerada é que com o aumento do número de amostras de crianças poderia existir diferença estatística entre as faixas etárias e presença de HRV. No presente trabalho a mediana de tempo de início de sintomas com relação à coleta nos pacientes imunocompetentes foi menor para os casos positivos de HRV do que para os casos negativos (p = 0.001, página 53), com significância estatística. A literatura descreve um pico de excreção do HRV em torno do segundo dia de infecção (Lessler et al., 2009). O tempo de incubação dos HRVs é de 8 – 12 horas, e logo após o primeiro ciclo de replicação os sintomas freqüentemente se iniciam (Gwaltney et al., 1995). Em estudo realizado por Arruda et al. (1997), com pacientes adultos, mais de 80% dos indivíduos reportaram início dos sintomas com 16 horas ou menos, antes da coleta de amostra. Outros vírus respiratórios apresentam tempos de incubação variáveis, influenza vírus: 3-4 dias (Wright et al., 2007); parainfluenzavírus: 2-8 dias (Henrickson 2003); vírus respiratório sincicial: 4-5 dias (Collins & Crowe Jr, 2007); adenovírus: 4-5 dias (Wold & Horwitz, 2007); coronavírus: 4-6 dias (Lai 71 et al., 2007); metapneumovírus: 4-5 dias (Hermos et al., 2010) e bocavírus humano: 2-3 dias (Moriyama et al., 2010). Um fator importante nas infecções respiratórias de origem viral é o tempo de início de sintomas. Poucos trabalhos descrevem o tempo de início de sintomas das infecções analisadas (Arruda et al., 1997; Bellei et al., 2007, Raboni et al., 2011). Tanto para o diagnóstico quanto para os aspectos clínicos esse fator não pode ser desprezado. Em trabalhos que verificam a freqüência de HRV o tempo de início de sintomas pode influenciar as análises das espécies circulantes, a epidemiologia molecular e os aspectos clínicos dessa infecção (Gerna et al., 2009; Franz et al., 2010). Por exemplo, a carga viral de HRV provavelmente depende do tempo médio de início de sintomas. Outro exemplo, se o tempo médio de início de sintomas for grande (> 10 dias), a freqüência de HRV pode ser subestimada ou receber uma relevância maior do que a real, pois o pico de excreção do HRV ocorre em torno do segundo dia de infecção (Lessler et al., 2009). O menor tempo de início de sintomas com relação à coleta nos pacientes infectados pelo HRV pode possuir relação com outros vírus respiratórios presentes nas amostras negativas para HRV. A análise da ocorrência de outros vírus respiratórios não foi realizada em nosso trabalho. Uma possível hipótese para tal achado é que o principal critério de inclusão foi infecção respiratória de provável etiologia viral. Assumindo que uma parte das amostras negativas para HRV possuía outros vírus respiratórios que podem eventualmente levar a um tempo de incubação maior se comparado ao HRV, os resultados para o menor tempo de início de sintomas encontrados na presente análise tornam-se compreensíveis. O pequeno tempo de incubação do HRV, o início rápido do quadro sintomático, e a presença de outros vírus em amostras negativas são coerentes com os achados dos pacientes positivos avaliados. 72 Nas populações de pacientes adultos transplantados renais e crianças cardiopatas (p = 0.8056), a mediana de tempo de início dos sintomas foi maior para os casos positivos (página 53), com tendência para diferença estatística significante entre pacientes positivos e negativos, com relação ao tempo de início de sintomas no caso dos transplantados renais (p = 0.07032). Esse resultado pode estar relacionado à menor expressão clinica devido ao uso de corticosteróides e imunossupressores (Hendley, 1998; De Santo et al., 2005; Oshansky et al., 2009), além do maior tempo de excreção viral em pacientes imunocomprometidos e pacientes com doenças de base (Kaiser et al., 2006; van Kraaij et al., 2005; Roghmann et al., 2003, Gerna et al., 2009). No presente trabalho os sintomas mais freqüentes nos pacientes, adultos imunocompetentes, infectados pelo HRV foram coriza, cefaléia e tosse (página 53). Nos transplantados renais e nas crianças cardiopatas os sintomas mais freqüentes foram coriza e tosse (página 53). Em adultos imunocompetentes os sintomas gerais como febre (60.76%), cefaléia (81.01%), mialgia (63.29%) e calafrio (49.37%) estavam presentes em mais de 50% dos pacientes positivos para HRV (página 53). Com relação aos sintomas dos pacientes idosos, não foi possível nenhuma análise, pois não havia informações suficientes. A idade, o sexo e a data da coleta estavam disponíveis. As crianças cardiopatas infectadas pelo HRV no presente estudo, não apresentaram mais sintomas que os pacientes negativos (página 53). O quadro de doença mais grave em crianças não pode ser avaliado da mesma forma que nos paciente adultos, sintomas como dispnéia e chiado normalmente não estão presentes em adultos não hospitalizados. Sendo assim o critério de doença mais intensa (ILI) utilizado no estudo não pode ser aplicado nas crianças cardiopatas. Mais adiante serão discutidos os achados de nossa casuística com relação à infecção por HRV e suas espécies, e a presença de ILI. 73 A análise filogenética das seqüências do HRV obtidas das amostras positivas mostrou uma ocorrência coerente com a literatura, com grande predominância da espécie HRV A, seguida por HRV C e HRV B [página 58; (Kiang et al., 2008; Lau et al., 2009; Piralla et al., 2009)]. Outros estudos descrevem maior prevalência de HRV A seguido de HRV B e HRV C (Xiang et al., 2010b, Kistler et al., 2007; Fry et al. 2011). No caso das crianças cardiopatas analisadas no presente trabalho o HRV B não foi encontrado sendo que uma possível razão para este resultado pode ser o pequeno número de amostras positivas. Arden et al. (2010) descrevem que não houve ocorrência de HRV B em pacientes não hospitalizados, em estudo realizado na Austrália. Foi detectada infecção por HRV C em uma amostra coletada de um paciente no ano de 2001 (amostra EPM034, ver árvore filogenética, página 56), sugerindo que esta “nova espécie” de HRV na realidade tem circulado antes de sua primeira descrição (Lamson et al., 2006) e mesmo de suas mais recentes descrições, sendo que, esse achado está em acordo com outros autores (Lau et al., 2007; Kistler et al., 2007; Miller et al., 2009). No presente estudo as três espécies de HRV circularam praticamente durante o ano inteiro (página 57), mas aparentemente demonstra um padrão sazonal, com maior freqüência observada nos meses de inverno, coincidindo com a temporada de influenza no Brasil (Bellei et al., 2007). Essa observação pode ser considerada um fator confundidor com a verdadeira infecção pelo vírus influenza, devido à similaridade dos sintomas (por isso o termo InfluenzaLike-Illness - ILI) que ocorre em quase a metade das infecções causadas por HRV descritas anteriormente. Outros estudos descrevem a ocorrência das espécies de HRV durante todo ano, com aumento de ocorrência nos meses de inverno (Linsuwanon et al., 2009; Miller et al., 2008; Piotrowska et al., 2009; Maffey et al., 2008). O aumento da circulação das espécies de HRV nos meses de inverno pode contribuir com aumento da demanda por serviços de saúde, 74 principalmente em populações de idosos e crianças (Jennings et al., 2006; Pierangeli et al., 2009; Miller et al., 2011, Watanabe et al., 2011). Estudos realizados durante a pandemia do vírus influenza A H1N1 2009 demonstraram a circulação concomitante de vários outros vírus, incluindo o HRV (Casaleno et al., 2010; Follin et al., 2009). Em estudo, aceito para publicação, realizado pelo grupo de vírus respiratórios (Laboratório de Virologia Clínica) da Universidade Federal de São Paulo foi encontrada uma freqüência alta de HRV, que também circulava com o vírus pandêmico. Neste estudo o HRV foi a segunda maior causa de internação, por síndrome respiratória aguda grave, no Hospital São Paulo durante a pandemia no ano de 2009 Com relação à distribuição das espécies entre os gêneros também não foi encontrada associação (página 58). Aparentemente as espécies de HRV não infectam preferencialmente nenhum dos sexos dos pacientes. Doering et al. (2006) descrevem que crianças do sexo masculino menores de 1 possuem um risco de 2.8 vezes maior de se infectar com o vírus sincicial respiratório (VSR) quando comparadas as crianças do sexo feminino. Corselo et al. (2008) descrevem que em indivíduos do sexo feminino maiores de 6 meses de idade existe um menor chance de infecção por VSR quando comparadas a indivíduos do sexo masculino. Estes estudos demonstram que aparentemente existe uma maior chance de infecção por VSR em indivíduos do sexo masculino, o que não parecer ocorrer no caso do HRV. A distribuição das espécies de HRV nas diferentes faixas etárias dos pacientes estudados seguiu a mesma distribuição encontrada populações (HRV A > HRV C > HRV B, página 59). Esta distribuição está de acordo com dados da literatura (Xiang et al., 2010b; Fry et al., 2011; Lau et al., 2009). No presente estudo não houve associação (p=0.8111) entre idade e infecção por qualquer espécie de HRV. 75 Muitos estudos têm abordado a epidemiologia molecular e os aspectos clínicos das espécies de HRV em crianças, destacando o papel de HRV C nessa população (Lau et al., 2009; Fry et al., 2011; Piralla et al., 2009; Moreira et al., 2011; Jin et al., 2009). A quantidade de estudos com essa nova espécie reflete a preocupação em entender a epidemiologia e patogênese da doença causada pelo HRV C. Destacando-se a distribuição das espécies de HRV nas diferentes faixas etárias, um grupo em especial (pacientes idosos maiores de 50 anos de idade), que freqüentemente apresentam maior risco de aquisição de infecção viral (Miller 1996; Nicholson et al., 1997; Graat et al., 2002), demonstrou ser o segundo grupo com maior ocorrência das espécies de HRV, depois dos adultos imunocompetentes. Uma análise mais detalhada (página 59) demonstrou uma distribuição semelhante à encontrada em outras idades. Apesar do fato de pacientes idosos serem um grupo de risco para complicações (Falsey & Walsh, 2006; Nicholson et al.,1996), o HRV C não foi à espécie mais freqüente. A análise das espécies de HRV nas diferentes populações com relação ao tempo de início de sintomas e a demanda por atendimento médico, apresentou diferença estatística significativa no grupo de adultos profissionais de saúde (página 60). Os pacientes infectados pelas espécies A e C apresentaram tempo de início de sintomas até a coleta da amostra menor quando comparadas a espécie B. Embora não significativa (p = 0.0806, página 60), houve uma tendência a um maior tempo de início de sintomas até a coleta no caso do HRV C em relação às outras espécies, em pacientes adultos atendidos no pronto-socorro. Nessa população a espécie C apresentou maior tempo de início de sintomas quando comparada as outras espécies (página 60). Uma provável hipótese é de que talvez o maior tempo de início de sintomas esteja relacionado ao fato de os pacientes infectados por HRV C nessa população apresentarem sintomas menos intensos (página 60). 76 Foi realizada uma análise com relação ao estado imunológico dos pacientes e a ocorrências das espécies de HRV. Com tal objetivo os pacientes foram divididos em dois grupos: pacientes immunocompetentes na qual foram incluídas as populações de adultos atendidos em pronto-socorro e adultos profissionais de saúde e imunocomprometidos na qual foram incluídos idosos e pacientes transplantados renais. Nesta análise não foi encontrada nenhuma associação (p=0.7229). Poucos estudos analisaram a ocorrência das espécies de HRV em pacientes immunocomprometidos e imucompetentes. Gerna et al. (2009) descrevem uma freqüência de HRV de 9.3% em pacientes adultos imunocompetentes e 25.3% em pacientes imunocomprometidos, porém neste estudo não foi realizada a análise estatística para verificar a existência de diferença entre essas duas populações. Na presente avaliação não houve diferença entre as ocorrências em pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos (página 62). Como citado anteriormente, consideramos quadro respiratório mais grave, quando comparado a quadros leves, pacientes que preenchiam o critério de Influenza-Like-Illness (ILI). Esse critério é adotado internacionalmente em estudos de vigilância de gripe, e de outras viroses respiratórias (Boivin et al., 2000, Bellei et al., 2008). Nesse estudo foi considerado paciente com presença de ILI indivíduos que apresentavam febre e pelo menos um sintoma respiratório (tosse, coriza ou dor de garganta) e pelo menos um sintoma geral (dor de cabeça, mal-estar, mialgia, calafrio ou fadiga). O presente estudo avaliou a presença das diferentes espécies de HRV em pacientes não hospitalizados e buscou averiguar possíveis associações entre espécies de HRV e diferentes expressões clínicas, como quadros mais leves ou similares a quadros gripais mais intensos. Nos pacientes que apresentavam infecção por HRV 38. 8% referiram ILI, e por 77 outro lado o HRV foi responsável pela infecção em pelo menos 21% (Tabelas 7 e 8, página 54) de todas as populações de pacientes com ILI. Em um estudo realizado por Bellei et al. (2007), os autores descrevem que 50% da população estudada apresentava associação entre ILI e infecção por HRV. Pierangeli et al. (2010) descreve que 35.3% dos paciente infectados por HRV apresentavam quadro clinico de ILI. Razanajatovo et al. (2011) descrevem que o HRV foi o segundo vírus mais freqüente associado à ILI, sendo o influenza vírus o primeiro. O mesmo autor também descreve que ocorre um aumento dos casos de ILI nos meses de maior ocorrência de HRV. Bellei et al. (2008) em estudo realizado com pacientes adultos, descrevem uma freqüência de 46.9% de ILI em pacientes infectados pelo HRV, por outro lado, 69.1% dos casos de ILI era causado por outros vírus respiratórios que não o vírus influenza. Este estudo mostrou a importância do papel de outros vírus respiratórios, incluindo o HRV, na etiologia de ILI. A associação entre ILI e pacientes não infectados pelo HRV, no presente trabalho pode ser devida a presença de outros vírus respiratórios nestas amostras negativas para presença de HRV. Infelizmente a análise para presença de outros vírus respiratórios não foi realizada, não sendo possível comprovar esta hipótese. Estudos que descrevem a presença de outros vírus respiratórios, que não o vírus influenza, em pacientes que apresentam ILI pode suportar essa idéia (Thrusky et al., 2003; Navarro-Mari et al., 2005, Bellei et al., 2008). Até uma década atrás o consenso geral era de que o HRV causava somente um infecção auto-limitada com resolução espontânea em menos de sete dias, o chamado resfriado comum (Andrewes 1961). Esse conceito começou a mudar em meados do ano 2000, quando Papadopoulos et al. (2000) confirmaram a replicação do HRV no trato respiratório inferior. No ano de 2006 Lamson et al. descreveram uma possível nova espécie de HRV, que 78 posteriormente foi denominada de HRV C. A partir dessa descrição muitos estudos foram focados nessa nova espécie de HRV, principalmente pelo fato de aparentemente o HRV C causar doença mais grave em crianças (Lau et al., 2009, Fry et al., 2011, Piralla et al., 2009; Jin et al., 2009). Sempre que uma nova espécie de vírus respiratório é descrita uma onda de novos estudos aparecem. É o caso do metapneumovírus humano (van den Hoogen et al., 2001), do bocavírus (Allander et al., 2005) e dos poliomavírus WU e KI (Allander et al., 2007; Gaynor et al., 2007). Após alguns anos com diferentes estudos realizados em diferentes populações, os novos vírus podem ter seu potencial patogênico comprovado. Muitos estudos foram realizados em pacientes pediátricos com infecção pelo HRV C (Lau et al., 2009; Fry et al., 2011; Piralla et al., 2009; Moreira et al., 2011; Jin et al., 2009), mas poucos estudos foram realizados em pacientes adultos (Lau et al., 2009; Gerna et al., 2009, Piralla et al., 2009, Xiang et al., 2010a). No entanto a grande maioria desses estudos, tanto em crianças quanto em adultos, foi realizada com pacientes internados (Lau et al., 2009, Fry et al., 2011, Piralla et al., 2009; Gerna et al., 2009; Xiang et al., 2010a). A população de adultos profissionais de saúde, teoricamente, é mais sujeita às infecções devido sua permanência em ambientes hospitalar (Bellei et al., 2007, Bellei et al., 2008). Este grupo apresentou mais chance de infecção pelo HRV, porém houve menos associação com ILI. Uma possível explicação para tal fato é a facilidade de acesso ao serviço de saúde criado especialmente para este grupo na Universidade Federal de São Paulo, permitindo assim, atendimento de maior número de casos, incluindo casos menos intensos Vale salientar que muitas vezes a preocupação destes funcionários com seus estados de saúde, principalmente trabalhadores de unidades de risco, pode levar a procura de serviços 79 médicos precocemente, resultando em algumas ocasiões em casos menos intensos sendo diagnosticados. A população de adultos atendidos em pronto-socorro foi a que apresentou maior freqüência de quadro clínico compatível com ILI entre as populações estudadas, porém a análise estatística mostrou associação significativa entre presença de ILI e teste negativo para HRV (página 63). Esse fato como já descrito anteriormente pode ser devido outros vírus respiratórios em amostras negativas para o HRV. De fato os adultos atendidos em pronto socorro foi o grupo que apresentou menor freqüência de HRV, o que pode significar uma taxa maior de outros vírus respiratórios. Não existem, até o momento, estudos descrevendo infecção pelo HRV em pacientes transplantados renais. São raros também estudos que descrevem infecções respiratórias virais nesse tipo de população. (López-Medrano et al., 2007; Nishi et al., 2010). No presente estudo o HRV foi detectado em pacientes transplantados renais, em uma taxa semelhante às outras populações estudadas. Com relação aos sintomas apresentados por esses pacientes, não houve maior freqüência de ILI, e também associação com presença de HRV (página 64). Garbino et al. (2009) descrevem um frequência de ILI de 10.8% em pacientes transplantados de órgão sólidos. Os pacientes transplantados renais são, em algum grau, imunossuprimidos o que pode afetar a apresentação clínica desses pacientes. Principalmente devido o uso de drogas imunossupressoras e corticosteróides (Hendley, 1998; De Santo et al., 2005; Oshansky et al., 2009). Considerando os pacientes apresentando-se clinicamente com sintomas de ILI as espécies A e B foram encontradas com maior freqüência e por outro lado, estes adultos não hospitalizados, infectados pelo HRV C foram menos sintomáticos. Este resultado difere da dinâmica observada em estudos anteriores, que descrevem associação entre infecção por HRV 80
