Deteccção de Sequências Específicas de DNA

Detecção de Seqüências Específicas de DNA
Parte 1. Procurando um gene
Imagine que você é um cientista e acabou de extrair um DNA. Você precisa saber se
este DNA contém o gene para fibrose cística. Você sabe pouco sobre o gene da
fibrose cística, então, como você pode dizer se o tem em sua amostra?
Quando um cientista procura por um determinado segmento de DNA, ele pode utilizar
um DNA especial denominado sonda (probe).
Normalmente uma sonda é um
fragmento de DNA de fita simples. Se um pedaço de DNA de fita simples encontra
outro segmento de DNA também de fita simples e com exatamente a mesma
seqüência de bases, eles vão se parear formando um DNA de dupla hélice.
Os
cientistas utilizam um termo especial para o pareamento de duas fitas simples de DNA
para constituir uma fita dupla: hibridação (Figura 1).
Sonda
Complementaridade de
bases
Gene de interesse
Figura 1. Hibridação de uma sonda com uma seqüência dentro do DNA de fita simples.
Para saber se um gene está presente na amostra de DNA, os cientistas utilizam uma
sonda com a mesma seqüência de uma parte do gene. Ela é adicionada à amostra de
DNA para saber se vai hibridar em algum local. Como eles sabem quando a sonda
hibridou? Se a sonda hibridar com a amostra, irá “grudar” com o DNA da amostra. Se
não, a sonda pode ser “retirada” facilmente.
Após a “lavagem” da amostra, os
cientistas conseguem saber se a sonda hibridou com a amostra ou não. Se ocorrer a
hibridação é porque a seqüência de DNA da sonda está presente na amostra. Se a
sonda é um pequeno segmento do gene, então, provavelmente o gene está presente
na amostra.
Atividade
No Anexo 1 você tem uma longa seqüência de DNA representando a sua amostra.
Você também tem uma seqüência curta que é uma sonda para o gene da fibrose
cística. Você vai utilizar a sonda para determinar se o gene da fibrose cística está em
sua amostra de DNA.
A amostra de DNA dada é de fita simples. Para saber se a sonda vai hibridar com a
amostra, é necessário separar as fitas de DNA de modo que a sonda possa encontrar
a seqüência de bases complementar.
1. Recorte as sondas.
2. Verifique a seqüência de DNA para ver se a sonda vai hibridar com a sua amostra.
3. O gene da fibrose cística está presente em sua amostra de DNA?
Se você
encontrou uma seqüência onde a sonda poderia se hibridar, marque-a na
seqüência de DNA.
Questões
1. O que é hibridação?
2. Como você pode utilizar a hibridação para saber se uma certa seqüência de DNA
está presente em sua amostra de DNA?
3. Determine uma sonda com 10 pares de bases (pb) que poderia se hibridar com a
seqüência de DNA a seguir.
5'
AATGCAGGCCCTATATGCCTTAACGGCATATGCAATGTACAATGCAAGTCCAACCGG
3'
Anexo 1. Sequência de DNA de fita simples e sonda.
Sonda:
3' GGATGCTACCATAGC 5'
3' GGATGCTACCATAGC 5'
Amostra de DNA (a sequência está escrita no sentido 5'  3'):
1
GGATCAGACTTCTAGCAGGCTCTTGACCAATGATCACAGCTTCCGATCTAG
2
AGCTCGATCTCTTGATCTCGATCTCGTGTCGGAATCTAGCCCGGGTCAGC
3
TATCGCTAAGATAGACCGGAATCGAGAATTCCGGATCGATCGATTGTGCGA
4
CCGCGATTATTCGATCGTTTGCCCGGGATCTAGCTTTCCGATCTAGCTGTG
5
TCAAGCTAGTGGAATCGAATTCGGAACTCGGCCCGATCTTGATCTCCCGGG
6
ACAATTGTCGATCTGATGCTAGCTGAATCGATGTGCCTAAGTGCTAGCCCGG
7
GCGATCTGGGATCGATTCCCGGGATCTAGGCCTACGATGGTATCGTTAGC
8
TAGCTCTCTAGCTTAGCTCTCAAGTGATCTACCCGGGTAGATCTAGTATATTG
9
TATCGATATTTTCGCTTAGCTAGCCCGGGCTAGCTCTCTCTAGCTAATAGATAG
10
TCTAGCTAGCTAGCTAGCTGTGTCTAGTCGATCGTTTGTCGATCTTCGATC
Detecção de Seqüências Específicas de DNA
Parte 2. Combinando a análise de restrição e a hibridação
A análise de hibridação que você aprendeu em ‘Procurando um gene’ pode indicar se
uma dada seqüência de DNA está presente em sua amostra. Algumas vezes, este
simples "pedaço" de informação é tudo o que é necessário. Contudo, um teste de
hibridação positiva não dá nenhuma informação sobre onde a seqüência de interesse
está localizada na molécula de DNA de sua amostra.
Para se ter informação sobre a presença e a localização de uma determinada
seqüência de DNA, os pesquisadores combinam a análise de restrição com a de
hibridação. Basicamente, a amostra de DNA é digerida com uma (ou mais) enzima de
restrição e os fragmentos são separados por eletroforese.
Após a eletroforese é
realizada a hibridação nestes fragmentos. Apenas o fragmento (ou os fragmentos)
nos quais a sonda se hibridar será detectado (Figura 1).
Gel corado
Resultado da análise de hibridação
Figura 1. A análise de hibridação mostra quais fragmentos de restrição hibridaram com a
sonda.
Há alguns detalhes técnicos importantes sobre este processo.
Primeiro que a
eficiência não é boa se você simplesmente colocar a agarose em contado com a
solução de sonda.
Em 1975, um cientista chamado Southern desenvolveu um
procedimento para transferir os fragmentos de DNA de um gel diretamente para uma
membrana, de forma que a disposição dos fragmentos no gel fosse preservada. Após
os fragmentos terem sido transferidos para a membrana, eles poderiam ser testados
na análise de hibridação com a sonda. Este método de transferência é chamado de
Southern blotting; e a combinação de análise de restrição, transferência para uma
membrana e hibridação com uma sonda é chamado de "Análise de hibridação por
Southern".
Atividade
1. Recorte a seqüência de DNA da atividade anterior ao longo das linhas
pontilhadas. Cole a fita 1 na fita 2 e esta na fita 3 sucessivamente até a fita 10,
formando uma molécula longa e linear.
Esta molécula poderia ser um
cromossomo como um dos nossos.
2. Agora simule a atividade da enzima de restrição SmaI. Esta enzima corta o DNA
nas seqüências 5' CCCGGG 3' entre a C e a G no meio da seqüência. Corte a
sua seqüência em todos os sítios de restrição SmaI. (Os seus fragmentos estão
em fita simples antecipadamente para facilitar a hibridação.
Na realidade, a
digestão e a eletroforese são realizadas com o DNA em fita dupla; apenas após a
eletroforese e a transferência para a membrana é que os fragmentos serão
separados ou desnaturados).
3. Agora, simule a eletroforese dos seus fragmentos. Distribua-os por ordem de
tamanho e disponha-os em sua mesa como se eles estivessem em um gel.
4. Utilize o esquema dado no Anexo 1 e desenhe a disposição dos seus fragmentos
no gel.
5. Marque com um asterisco a(s) banda(s) onde houve hibridação com a sonda.
6. Lembre-se de que o padrão de fragmentos de DNA no seu gel será transferido
exatamente da mesma forma para a membrana. Na membrana, os fragmentos
serão testados para a hibridação com a sonda e apenas o(s) fragmento(s) que
hibridou com a sonda será detectado (como foi demonstrado na Figura 1).
Desenhe o que será detectado após a hibridação no quadro marcado "Resultado
da análise de hibridação".
Questão
1. É possível recortar uma banda de um gel de eletroforese, purificar o DNA que
estiver nesta banda e clonar este DNA. Suponha que você tem uma sonda para
um gene viral que você gostaria de clonar, mas você não sabe onde ele se
encontra no cromossomo de 40.000 pb do vírus. Como a análise de hibridação
poderia ajudá-lo a clonar este gene?
Anexo 1. Esquemas para a eletroforese em gel e para o resultado da análise de
hibridação.
Gel de eletroforese corado
Resutado da análise de
hibridação
Tamanho dos
fragm entos
(pb)
Amostra
Tamanho dos
fragmentos
(pb)
100
100
90
90
80
80
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
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Parte 3. Hibridação por Southern
Problema A
Você está analisando o DNA de um vírus recém-descoberto. Você já construiu um
mapa de restrição com 26.500 pb, demonstrado no Anexo 1.
Já que você está
interessado em enzimas DNA polimerases, você conduziu a análise de hibridação do
DNA do vírus X utilizando um gene de DNA polimerase de outro vírus como sonda.
Você acredita que esta seqüência é relacionada com o vírus X. Para sua alegria, a
sonda hibridou com o DNA do vírus X. Você acredita que a seqüência de DNA do
vírus X na qual a sonda hibridou seja o gene da DNA polimerase do vírus X.
Agora você gostaria de determinar a localização do gene da DNA polimerase do vírus
X e, para isto, realizou a análise de hibridação por Southern. Você digeriu o DNA viral
com EcoRI e BamHI separadamente, separou os fragmentos em um gel, transferiu-os
para uma membrana e realizou a hibridação utilizando a mesma sonda do gene da
DNA polimerase.
No Anexo 1 há uma figura dos fragmentos no gel de eletroforese e o padrão obtido
após a hibridação com a sonda na membrana.
Questões
1. Marque os fragmentos no gel com os seus respectivos tamanhos em pares de
bases.
2. Indique, nos mapas de restrição, a região do DNA do vírus X na qual está
localizado o gene da DNA polimerase.
3. A que distância da esquerda o gene poderia estar, em termos de sítios de
restrição? E a que distância da direita?
4. Porque o gene da DNA polimerase de um outro vírus poderia hibridar com
fragmentos de DNA do vírus X?
Problema B
No Anexo 2 você encontra um mapa de restrição do Bacteriófago lambda. Você
digeriu uma amostra de DNA do fago  com as enzimas BamHI e HindIII
separadamente e submeteu os fragmentos digeridos à eletroforese.
Agora você transferiu os fragmentos para uma membrana e realizou a análise de
hibridação utilizando um fragmento de 4.878 pb do lambda digerido com EcoRI
(referido no mapa) como uma sonda.
1. Desenhe o resultado do gel de eletroforese no esquema dado no Anexo 2 (os dois
fragmentos menores da HindIII vão correr para fora do gel).
2. Indique quais fragmentos vão hibridar com a sonda de 4.878 pb (A hibridação vai
ocorrer mesmo que ocorra uma complementaridade apenas parcial da sonda com
o fragmento de restrição).
3. No segundo quadro, desenhe o que poderia ser visto após a detecção da sonda
na membrana.
Anexo 1. Mapas de restrição e análise de hibridação do vírus X para a detecção de
seqüências específicas do DNA – Parte 3.
O mapa de restrição superior mostra os sítios de restrição EcoRI e o inferior mostra os
sítios de restrição BamHI. Os tamanhos dos fragmentos são dados em pares de
bases. O gel de eletroforese corado mostra os fragmentos EcoRI e BamHI do vírus. A
análise de hibridação mostra quais as bandas que hibridaram com a sonda.
Mapa de restrição EcoRI
9.000
5.500
4.000
2.000
6.000
Mapa de restrição BamHI
3.000
7.500
10.500
Gel corado
EcoRI
Tamanho, pb
10.000
8.000
4.000
2.000
BamHI
5.500
Resultado da análise de hibridação
EcoRI
BamHI
Anexo 2. Mapas de restrição e análise de hibridação do bacteriófago lambda para a
detecção de seqüências específicas do DNA – Parte 3.
Os sítios de restrição do bacteriófago lambda para as enzimas BamHI, HindIII e EcoRI
estão demonstrados abaixo. Os tamanhos dos fragmentos são dados em pares de
bases. Os esquemas do gel e da análise de hibridação são fornecidos para o seu uso.
Mapa de restrição BamHI
5.505
16.841
5.626
Mapa de restrição HindIII
6.527
7.233
6.770
2.027 2.322
23.130
9.416
6.557
4.361
564
125
Mapa de restrição EcoRI
21.226
4.878
5.643
7.421
5.804
3.530
Gel corado
EcoRI
Tamanho, pb
10.000
8.000
4.000
2.000
BamHI
Resultado da análise de hibridação
EcoRI
BamHI