ic2009-0093 - vírus da paralisia aguda em abelha apis mellifera no

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VÍRUS DA PARALISIA AGUDA EM ABELHA Apis mellifera NO
ESTADO DE MINAS GERAIS
Fernando Corrêa de Almeida¹, Isabel Rodrigues Marques Amaral¹, Carlos Ueira Vieira¹,
Warwick Estevam Kerr¹, Ana Maria Bonetti¹
1 Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, Universidade Federal de
Uberlândia, Uberllândia-MG, Av. Pará, 1720 - Campus Umuarama - Uberlândia-MG Cep:
38400-902
Resumo: A mortalidade de abelhas Apis mellifera é um dos vários problemas que os
apicultores têm enfrentado no mundo todo. Vários fatores contribuem para esse fato, tais
como a presença de Varroa destructor (ácaro), Nosema apis (protozoário) e exposição à
inseticidas usados na agricultura. A mortalidade é agravada pela presença de retrovírus
que infectam abelhas provocando deformações indesejáveis. Com objetivo de investigar
episódio de morte de abelhas A. mellifera relatada por apicultor da região do Triângulo
Mineiro, foi realizada a presente análise, que descreve a primeira detecção molecular de
vírus em abelhas no estado de Minas Gerais. Foi feita a RT-PCR com primers específicos
para os vírus Acute Bee Paralisys Virus (ABPV), Deformed Wing Virus (DWV) e Black
Queen Cell Virus (BQCV) em pool de 15 abelhas retiradas de 2 colméias (15 abelhas de
cada) de um apiário na região do Triângulo Mineiro (MG). A análise por eletroforese em
gel de agarose 1,5% revelou fragmentos correspondentes aos vírus DWV e ABPV. Esse
último foi confirmado por sequênciamento em MegaBace e alinhamento por BLAST,
mostrando homologia do gene sequenciado com o Acute bee paralysis virus (gene
codificador da proteína do capsideo). Nas amostras de A. mellifera analisadas não foi
detectada a presença do vírus BQCV, porém não foi descartada a circulação desse vírus
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no Estado de Minas Gerais; a não detecção pode ser devida ao limitado número de
amostras (30 abelhas no total). Os resultados desse trabalho sugerem que a circulação
desses vírus nas colônias possa estar relacionada com o desaparecimento e morte
inesperada de abelhas A. mellifera, relatadas por apicultor da região do Triângulo
Mineiro (MG). Essa análise faz parte de um Programa de Estudo de Epidemiologia
Molecular de vírus em abelhas no Brasil.
Palavras-chave:
vírus,
Apis
mellifera,
epidemiologia
molecular,
RT-PCR,
desaparecimentos
ACUTE BEE PARALISYS VIRUS IN HONEYBEE Apis mellifera IN
MINAS GERAIS STATE
Fernando Corrêa de Almeida¹, Isabel Rodrigues Marques Amaral¹, Carlos Ueira Vieira¹,
Warwick Estevam Kerr¹, Ana Maria Bonetti¹
1 Institute of Genetics and Biochemistry, Genetics Laboratory, University Federal of
Uberlândia, Uberllândia-MG, Av. Pará, 1720 - Campus Umuarama - Uberlândia-MG Cep:
38400-902
Abstract: The mortality of Apis mellifera is one of the several problems that beekeepers are
confront around the world. Divers factors contribute to this fact, like as the presence of
Varroa destructor (mite) and Nosema apis (protozoan) and exposure to pesticides used in
agriculture. Mortality is aggravated by the presence of retroviruses that infect bees,
causing undesirable deformations. With the objective to investigate the death episode of
honeybees reported by beekeepers in the Triangulo Mineiro region, was performed this
analysis, which describes the first molecular detection of viruses in bees in Minas Gerais
State. Made RT-PCR with primers specific for the virus Acute Bee Paralisys Virus (ABPV),
Deformed Wing Virus (DWV) and Black Queen Cell Virus (BQCV), in pool 15 bees derived
from 2 hives (15 bees each) in a apiary of the Triangulo Mineiro (MG). Analysis by
electrophoresis in agarose gel 1.5% indicated fragments corresponding to the DWV and
ABPV. The latter was confirmed by sequencing on MegaBACE and alignment with BLAST,
showing homology of this gene with the Acute bee paralysis virus (gene encoding the
capsid protein). The samples of A. mellifera analysis wasn’t detected the presence of the
virus BQCV, but wasn’t put away of circulation in Minas Gerais State, the failure detection
maybe was to limited number N-amostrals samples (30 bees in total). The resulted suggest
that circulation of theses viruses in colonies maybe was associated to the disappearance
and unexpected death of honeybees, reported by beekeepers in regions of Triangulo
Mineiro (MG). This analyse is part of a new Program for the Study of Molecular
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Epidemiology of viruses bees in Brazil.
Keywords: viruses, Apis mellifera, molecular epidemiology, RT-PCR, disappearances
INTRODUÇÃO
Abelhas representam um grupo já bastante estudado entre os insetos com grande
importância ecológica e agrícola (MARTIN, 2001; WINSTON, 1987). Dentre elas, as
africanizadas refletem décadas de miscigenação entre abelhas européias da subespécie Apis
mellifera mellifera e Apis mellifera ligustica, importadas durante o século 17 e da
subespécie africana Apis mellifera scutellata, introduzida no Brasil em 1956 (VANDAME
et al., 2002). As abelhas africanizadas representam o tipo predominante em áreas tropicais e
subtropicais das regiões da América do Sul, América Central e em algumas regiões da
América do Norte (ROSENKRANZ et al., 2000). Um fator para o sucesso adaptativo
parece ser um elevado nível de resistência para ácaros e patógenos (AUMEIER, 2001;
GUZMÁN - NOVOA et al., 1999; MONDRAGÓN et al., 2005; MORETTO; MELLO,
1999; MORETTO; MELLO, 2001; ROSENKRANZ, 1999; VANDAME et al., 2002).
Após longos anos de baixa presença de doenças em populações de abelhas em
grandes partes do Brasil, registrou-se um aumento de mortes inesperadas nos últimos cinco
anos, deixando impactos econômicos prejudiciais a vários apicultores. Recentemente, a
mortalidade de colônias nos Estados Unidos da América devido à Colony Collapse
Disorder ou CCD (COX-FOSTER et al., 2007) chamou a atenção de vários órgãos
governamentais desse país.
Abelhas Apis mellifera e Melipona scutellaris são alvos de agentes patogénicos,
incluindo vírus, bactérias, fungos, protozoários, parasitas ácaros e nematóides (BAILEY;
BALL, 1991; MUNN; ELLIS, 2005). Os vírus têm emergido como um dos vários
candidatos para as perdas de colônias e conseqüente prejuízo econômico para o produtor,
ambiental e para as flores que dependem de polinização.
A grande diversidade dos vírus isolados a partir de abelhas e as dificuldades
envolvidas com a utilização de métodos sorológicos para a sua identificação devido à baixa
sensibilidade, baixa especificidade e incapacidade para detectar infecções latentes (CHEN
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et al., 2004) alem da falta de especificidade de sinais clínicos e da disponibilidade limitada
de ferramentas para rápido diagnóstico em larga escala (TENTCHEVA et al.,2004) são,
parcialmente, responsáveis pela falta de ação eficiente no combate às doenças e rápida
recuperação do plantel.
Problemas com vírus de abelhas são reais e requerem mais estudos. Grupos de
Pesquisa, como o BRAVE (Bee Research and Virology in Europe) concentram-se em
técnicas dependentes da Genética Molecular para aperfeiçoar a investigação sobre viroses
em abelhas.
Construído a partir de iniciativas de europeus, o projeto BRAVE teve como objetivo
a transferência de conhecimentos entre especialistas em virologia de insetos e os cientistas
envolvidos na investigação sobre as abelhas e outras espécies relacionadas. Além disso, o
objetivo do projeto foi debater sobre os conhecimentos necessários para proteger as abelhas
e insetos polinizadores afins, dos vírus e propor um quadro para futuros programas de
investigação. Mais de 60 especialistas integraram a reunião, em Sophia-Antipolis (França),
em abril de 2005, onde foram explorados temas sobre: taxonomia dos vírus de abelhas;
técnicas de diagnóstico e sua adequação; genética, fisiologia e comportamento das abelhas
em relação a sua resistência às infecções pelo vírus; associações de infecções com o vírus e
parasitas, como Varroa destructor ou Nosema apis; e da possível depressão das abelhas
devido à exposição delas a doses sub-letais de pesticidas (AUBERT et al., 2007).
Dentre os 18 vírus já caracterizados no mundo (ALLEN and BALL, 1996), o
presente trabalho investigou a presença de 3 no Estado de Minas Gerais, Acute Bee
Paralysis Virus (ABPV), Black Queen Cell Virus (BQCV) and Deformed Wing Virus
(DWV) utilizando método de multiplex PCR (TEIXEIRA et al., 2008), técnicas de genética
molecular e viroses de abelhas, objetivando apresentar um método de diagnóstico rápido
para prevenção e presença de doenças em colônias de abelhas Apis mellifera, no Município
de Uberlândia-MG e região, com vista a salvar as abelhas e recuperar o comércio de
produtos derivados das abelhas e, também, a polinização de plantas cultivadas e silvestres.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas Apis mellifera (abelhas africanizadas) adultas, 10 a 15 indivíduos,
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coletadas nas entradas de cada colméia em apiários da região do Município de UberlândiaMG.
2.1 Coleta do Material Biológico
Foram utilizadas abelhas africanizadas adultas, 10 a 15 indivíduos, coletadas nas
entradas de cada colônia (colméia) aparentemente acometidas por vírus, em apiários da
região do Município de Uberlândia.
2.2 Analise e interpretação das amostras
2.2.1 Extração de RNA
O material recebido no laboratório de Genética da Universidade Federal de
Uberlândia foi imediatamente processado para extração de RNA utilizando o reagente
Trizol e diluído em 50 L de água livre de RNAse, segundo recomendações do fabricante.
O RNA foi quantificado em espectofotômetro Nanodrop (GE) e armazenado em
ultrafreezer -80ºC até o momento do uso.
2.2.2 Síntese de cDNA
O RNA proveniente das amostras das abelhas foi utilizado como molde para
a síntese do cDNA por transcrição reversa (50ng RNA) utilizando a enzima SuperScript II
Reverse Transcriptase (INVITROGEN) seguindo recomendações do fabricante. O cDNA
obtido foi testado quanto à qualidade com o gene codificador da proteína ribossomal 49
(RP49).
2.2.3 PCR para diagnóstico viral
Fragmentos do genoma viral foram amplificados por PCR para investigação da
presença dos vírus. Foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores para cada tipo de vírus
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para amplificação de fragmentos de tamanhos diferentes, facilitando a identificação de
vários vírus em uma reação de PCR multiplex. O controle negativo foi feito com todos os
reagentes da reação de PCR, sem adição de DNA molde.
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose (1,5%),
visualizados sob luz UV e identificados em comparação com a migração de Marcador de
Peso Molecular de 100 bp (INVITROGEN).
2.2.4 Clonagem e seqüenciamento
Os produtos de RT-PCR foram purificados utilizando o kit de extração de
géis QIAquick Gel Extration Kit (QIAGEN) e clonados em pGemT-Easy (PROMEGA).
Os clones contendo insertos foram submetidos ao seqüenciamento automático em
MagaBace (Pharmacia).
2.2.5 Análises de Bioinformática
As seqüências obtidas para cada vírus foram alinhadas utilizando Clustal W
para analise de homologia. As seqüências foram alinhadas com outras disponíveis em
bancos de dados (BLAST e outras ferramentas disponíveis na web) para comparação.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após processamento do material biológico (duas colônias (A e B), 15 abelhas de
cada) os produtos de RT-PCR foram submetidos à eletroforese em gel de Agarose (1,5%)
corado com brometo de etídio. Resultados de presença ou não de vírus nas colônias,
conforme Figura 1, mostram que ocorrem dois tipos de vírus em colônias de Apis mellifera
na região do Triângulo MIneiro, a saber, o Deformed wing virus (DWV) e Acute bee
paralysis vírus (ABPV), amplificados em 129pb e 500pb respectivamente.
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Figura 1. Produtos do multiplex PCR, para detecção dos vírus Deformed Wing
Virus (DWV), Acute Bee Paralysis Virus (ABPV) e Black Queen Cell Virus (BQCV) em
Apis Mellifera (2 colônias). Fragmentos correspondentes aos vírus DWV, 129pb (x) e do
vírus ABPV, 500pb (y). Colunas do gel: M, marcador (100pb); 1 e 2, DWV; 3, controle
negativo para DWV; 4 e 6, ABPV; 7, controle negativo para ABPV; 8 e 9, BQCV; 10,
controle negativo para BQCV.
Foram pesquisados três diferentes tipos de vírus, Deformed Wing Virus (DWV),
Acute Bee Paralysis Virus (ABPV) e Black Queen Cell Virus (BQCV). O ABPV foi
purificado do gel e clonado em pGemT-Easy (PROMEGA). Os clones contendo insertos
foram submetidos ao seqüenciamento automático em MegaBace (Pharmacia). As
seqüências obtidas do vírus foram alinhadas utilizando o banco de dados BLAST
(Figura 2). O resultado apontou alta similaridade (96%) com a seqüência correspondente
ao ABPV publicada (GenBank Adesão No.AY763414) e E-value de 0,0, confirmando a
presença desse vírus em Apis mellifera no Estado de Minas Gerais. A metodologia de
RT-PCR utilizada para detecção molecular dos vírus mostrou-se adequada.
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Figura 2. Alinhamento por BLAST mostra a homologia desse gene com o do Acute Bee
Paralysis Virus isolado do gene do capsídeo F6 em Apis mellifera (Figura 1). 96% de
similaridade entre os genes, confirmando a presença do mesmo.
Essa foi a primeira investigação, para a presença de vírus em colônias de abelhas
Apis mellifera realizada em Minas Gerais e a segunda no Brasil (TEIXEIRA et al., 2008 )
A presença do vírus ABPV pode estar relacionada com as mortes e desaparecimentos de A.
mellifera relatadas por apicultor da região do Triângulo Mineiro e pode estar emergindo
como uma região de foco para esse vírus. O fenômeno de desaparecimento sem causa
determinada de Apis mellifera, em vários paises, vem sendo chamado de “Colony Colpase
Disorder” e está começando a ser verificado em apiários brasileiros, como o presente
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estudo. Não foi descartada a existência do vírus BQCV nos apiários, a ausência pode ser
devido ao baixo número de amostras coletadas (15 por colônia).
4. CONCLUSÃO
A presença do vírus Acute Bee Paralysis Vírus (ABPV) e Deformed Wing Virus
(DWV) é positiva para o Estado de Minas Gerais, assim como o método empregado para
detecção é completamente vantajoso e de rápido diagnóstico.
5. AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi sustentado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG).
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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