Resumo e Comunicação - Instituto de Investigação Científica Tropical

Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Investigação de plantas medicinais anti-maláricas usadas na medicina tradicional de S.Tomé e Príncipe
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INVESTIGAÇÃO DE PLANTAS MEDICINAIS ANTIMALÁRICAS USADAS NA
MEDICINA TRADICIONAL DE S. TOMÉ E PRÍNCIPE
Maria do Céu de Madureira
Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz,
Monte da Caparica, Portugal
[email protected]
Resumo
Tendo em conta o elevado número de casos de malária por P. falciparum resistente à cloroquina em São Tomé e
Príncipe (STP), pretendemos dar o nosso contributo para a melhoria das condições de saúde da população,
através da Investigação da Actividade Antimalárica de plantas medicinais usadas na Medicina Tradicional, e
através do desenvolvimento de novos compostos que possam ser usados para o controlo da malária,
nomeadamente compostos activos contra Plasmodium falciparum resistente à cloroquina.
Levou-se a cabo um estudo etnofarmacológico de 13 plantas medicinais usadas pelos terapeutas tradicionais de
STP no tratamento de malária e/ou febres. Este estudo corroborou o uso tradicional da maioria das plantas medicinais,
e a sua actividade farmacológica foi comprovada laboratorialmente. Foram igualmente realizados estudos fitoquímicos
biodireccionados e ensaios de toxicidade nas plantas que apresentaram melhores resultados de actividade antimalárica.
A planta Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray foi submetida a Ensaios Fitoquímicos, por ser a que apresentou os
melhores resultados de actividade antimalárica e simultaneamente apresentar garantias de inocuidade, relativamente
aos resultados de toxicidade, pelo que poderá servir de base para um futuro desenvolvimento de novos fármacos
antimaláricos.
Palavras-chave: Plantas Medicinais; Malária; Medicina Tradicional; Tithonia diversifolia.
1. INTRODUÇÃO
A malária é a mais importante doença parasitária das regiões tropicais. Nas últimas
décadas tem-se vindo a assistir a um aumento e a uma disseminação alargada da resistência
aos fármacos antimaláricos mais comuns, o que se torna ainda mais grave devido ao custo
proibitivo de fármacos mais eficazes, para a grande maioria das populações destas áreas.
Há uma necessidade urgente de novos compostos terapêuticos, facilmente acessíveis e
de baixos custos (WHO, 2005). Uma das possíveis fontes destes tratamentos mais acessíveis
poderá advir do estudo e desenvolvimento de medicamentos à base de plantas, utilizados
localmente na medicina tradicional. De facto, o uso de plantas para o tratamento de malária é
uma prática que se estende ainda actualmente, em pelo menos três continentes, estando
registado o uso de mais de 1200 espécies de plantas para o tratamento de malária e/ou febres
(WILLCOX & BODEKER, & RASOANAIVO, 2004). No entanto, há ainda poucos dados
que documentem o uso destes preparados tradicionais nos sistemas de saúde destes países, e
que comprovem a eficácia e segurança dos mesmos. O reconhecimento e a validação de
práticas de medicina tradicional e a procura de agentes terapêuticos derivados de plantas,
pode levar ao estabelecimento de novas estratégias no controlo da malária. Uma vez que
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alguns dos principais fármacos antimaláricos actuais, tal como o quinino e a artemisinina, são
moléculas obtidas a partir de plantas, torna-se essencial que se investiguem outras plantas
medicinais utilizadas tradicionalmente como antimaláricas, de modo a comprovar a sua
eficácia e segurança e a determinar as suas potencialidades como novos fármacos
antimaláricos (GESSLER et al., 1994). De forma a ultrapassar os problemas mais comuns
nesta área de investigação, tais como a identificação correcta do material vegetal e a possível
variabilidade da composição química de remédios tradicionais, propusemo-nos avaliar a
actividade antimalárica de algumas das plantas medicinais usadas pelos terapeutas
tradicionais de S. Tomé e Príncipe, país onde mais de dois terços da população vive em
regiões onde a malária é endémica (LOUREIRO et al., 1996).
2. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE PLANTAS USADAS COMO ANTIMALÁRICOS NA
MEDICINA TRADICIONAL DE S. T. P.
Como foi referido anteriormente, a existência de uma situação problemática no
controlo da malária em São Tomé e Príncipe, e o uso elevado de plantas medicinais por parte
da população local, determinou a necessidade de avaliar cientificamente os medicamentos
usados
como
antimaláricos,
na
medicina
tradicional
destas
ilhas
(Projecto
PRAXIS/PSAU/P/SAU/38/96). Pretendeu-se avaliar a actividade antimalárica e a toxicidade
de extractos das plantas medicinais mais utilizadas pelos terapeutas tradicionais de S. Tomé e
Príncipe, para o tratamento da malária e febres, de forma a identificar as plantas mais eficazes
para estudos fitoquímicos posteriores.
Para o estudo da actividade antimalárica de extractos de plantas, a escolha recaiu sobre
o uso de testes in vitro com P. falciparum (estirpes sensíveis e estirpes resistentes à
cloroquina) e de testes in vivo com o modelo roedor Balb C / P. berghei, no que se refere à
fase sanguínea do ciclo de vida do parasita, tendo-se usado testes in vitro com esquizontes
hepáticos de P. berghei ANKA desenvolvidos em células Hep G2, relativamente à fase
hepática ou exoeritrocitária.
Para os testes de toxicidade utilizaram-se metodologias que estão de acordo com o que
se encontra preconizado pela Organização Mundial de Saúde, para este tipo de extractos de
plantas (WHO, 1996; 2000).
Com a verificação e o reconhecimento da actividade farmacológica das plantas
medicinais poder-se-á também contribuir para uma melhoria da eficácia do sistema actual de
saúde através da integração de algumas destas plantas no sistema médico das ilhas, em
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particular no que diz respeito aos cuidados de saúde primários e ao controlo da malária. Este
objectivo, vem ao encontro de propostas da OMS (WHO, 1997) que tem vindo a recomendar
aos governos de países em vias de desenvolvimento para que seja dada prioridade na
utilização da medicina tradicional e na integração de medicamentos tradicionais validados nas
regulamentações e nos sistemas nacionais de saúde.
2.1. PLANTAS SELECCIONADAS PARA O ESTUDO
Das 325 espécies de plantas recolhidas da flora da São Tomé e Príncipe foram
escolhidas 13 para pesquisa de actividade antimalárica (MADUREIRA et al., 2002a). A
selecção foi feita com base no facto de estas plantas serem utilizadas pelos terapeutas
tradicionais locais para o tratamento de quadros clínicos de paludismo (febres, cefaleias),
tendo também sido efectuada de acordo com dados obtidos na literatura e foram ainda tidas
em consideração características químicas e biológicas de espécies aparentadas. A
identificação científica de cada uma foi realizada no Instituto Botânico da Universidade de
Coimbra (COI).
Tabela 1 - Lista das plantas seleccionadas para o estudo de actividade antimalárica
ExtractoN
.º
Nome da planta (Família)
Nome Vernáculo
1
Struchium sparganophora (Asteraceae)
2
Vernonia amygdalinaa (Asteraceae)
3
Vernonia amygdalinab (Asteraceae)
4
Ageratum conyzoides (Asteraceae)
5
Cinchona succirubra (Rubiaceae)
6
Aloe humilis (Aloeaceae)
7
Tithonia diversifolia (Asteraceae)
8
Cedrela odorata (Meliaceae)
9
Premna angolensis (Verbenaceae)
10
Pycnanthus angolensis (Myristicaceae)
11a
Morinda lucida (Rubiaceae)
11b
Morinda lucida (Rubiaceae)
12
Cestrum laevigatum (Solanaceae)
13
Canna indica (Cannaceae)
Nota: Vernonia amygdalinaa,b – Plantas distintas para os
sendo a mesma espécie.
Partes utilizadas
Nº Voucher
(COI)
Libô-d’áua
Parte aérea
MM 125
Libô-qué
Folhas
MM 114
Libo-mucambu
Folhas
MM 21
Fiá-malé-muálá
Parte aérea
MM 28
Pó-quina
Casca
MM 25
Áliba-babosa
Suco da folha
MM 354
Girassol
Caule
MM 625
Cidlela
Casca
MM 321
Pó-ama
Casca
MM 619
Pó-cassom
Casca
MM 426
Gligô
Casca
MM 26
Gligô
Folhas
MM 26
Coedano
Folhas
MM 102
Salaconta
Raízes
MM 14
Terapeutas Tradicionais, mas identificadas como
2.2. PREPARAÇÃO DOS EXTRACTOS E FRACCIONAMENTO
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O material vegetal foi seco, sendo posteriormente pulverizado e submetido a uma
extracção com etanol a 70%, seguido de evaporação e liofilização. Os materiais frescos foram
homogeneizados e macerados posteriormente em etanol a 70%, tendo sido também
evaporados e liofilizados (extractos nº7 e nº13). Esta primeira extracção foi denominada de
extracto bruto (EB).
Para conseguir uma separação prévia de grupos de constituintes bioactivos, recorreu-se à
técnica de partição líquido-líquido, tendo o extracto bruto de cada amostra vegetal sido
inicialmente dissolvido em metanol:água (1:2), extraído com solventes de diferentes
polaridades, tendo-se obtido quatro fracções: éter de petróleo (EP), diclorometano (DM),
acetato de etilo (AE) e metanol/água (MA). Todas as fracções foram evaporadas num
evaporador rotativo, liofilizadas e congeladas a - 20ºC.
Foram preparadas soluções stock, de cada uma das fracções (EB, EP, DM, AE e MA),
com uma concentração final de 5 mg/ml em RPMI 1640 (Gibco BRL, ref. 51800-035) e 1%
etanol (Merck, ref. 1.00983.2511).
2.3. ENSAIOS DE DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTI-MALÁRICA
Três tipos diferentes de ensaios foram utilizados: ensaios in vitro com Plasmodium
falciparum para estudo da actividade antimalárica esquizonticida para parasitas na fase de
desenvolvimento eritrocitário (TRAGER & JENSEN, 1976; VASCONCELOS and
ROSÁRIO, 1983; FISK et al, 1989; CARVALHO and KRETTLI, 1991; JURG et al, 1991;
COUTO et al, 1993;), ensaios in vitro para estudo da actividade antimalárica durante o ciclo
hepático, utilizando Plasmodium berghei ANKA (CALVO-CALLE et al, 1994;
HOLLINGDALE et al, 1983a,b; SINDEN et al, 1990, 1991; HULIER and RENIA, 1996;
KARNASUTA, 1995; MILLET et al., 1986, 1988) e, finalmente, ensaios in vivo em modelo
de Plasmodium berghei ANKA infectando murganhos Balb C, também para a fase eritrocitária
(CARVALHO and KRETTLI, 1991; PETERS, 1987; PHILLIPSON, 1991).
2.3.1. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados dos testes in vitro sobre a actividade destes extractos contra a estirpe de
P. falciparum resistente à cloroquina (Dd2) são apresentados na tabela 2 (MADUREIRA et
al., 2002b). Foi calculada a concentração capaz de inibir o crescimento de 50% dos parasitas
(IC50) na fase sanguínea, em comparação com os controlos.
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Os extractos de Aloe humilis (AE), Cedrela odorata (DM), Cestrum laevigatum (DM)
e Canna bidentata (DM) demonstraram possuir uma actividade antiplasmódica moderada,
com valores de IC50 ≤ 50 μg/ml. Seis outros dos extractos em estudo apresentaram uma
evidente actividade antiplasmódica contra o P. falciparum resistente à cloroquina, com
valores de IC50 ≤ 10 μg/ml: Struchium sparganophorum (EP), Vernonia amygdalinab (AE),
Cinchona succirubra (EB e todas as fracções), Tithonia diversifolia (EP, DM), Pycnanthus
angolensis (EB) e Morinda lucida (EB).
Comparando os valores obtidos para este grupo de plantas com os valores de IC50
obtidos para a Artemisia annua (3,9 μg/ml) e para a Azadirachta indica (10 μg/ml), estamos
perante resultados bastante promissores (PHILLIPSON and O’NEIL, 1986). No entanto, é
preciso não esquecer que, muito frequentemente, plantas que são utilizadas tradicionalmente
como antimaláricos em diversos países, não apresentam actividades elevadas nos testes in
vitro. Estes casos podem ser parcialmente explicados, devido ao facto de, muitas das plantas
usadas tradicionalmente no tratamento da malária, poderem ter outras acções terapêuticas, que
não a actividade sobre o parasita, tais como acção antipirética ou imunomoduladora.
Tabela 2 – Actividade antimalárica in vitro de extractos de plantas (P. falciparum, Dd2)
Nome Botânico
Valores médios de IC50 (μg/ml)
Nº
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11a
11b
12
13
Struchium sparganophorum
Vernonia amygdalinaa
Vernonia amygdalinab
Ageratum conyzoides
Cinchona succirubra
Aloe humilis
Tithonia diversifolia
Cedrela odorata
Premna angolensis
Pycnanthus angolensis
Morinda lucida casca)
Morinda lucida (folhas)
Cestrum laevigatum
Canna bidentata
EB
180
120
340
150
<10
260
15
190
180
<5
<10
10
100
500
EP
<10
170
200
110
<10
150
<10
110
250
100
50
130
100
130
DM
100
235
80
55
<10
150
<10
50
250
100
50
60
50
25
AE
100
500
10
220
<10
25
140
n.d.
250
100
100
500
150
245
MA
240
n.d.
n.d.
n.d.
<10
500
500
n.d.
n.d.
n.d.
500
125
135
500
EB-extracto bruto etanólico; EP – fracção éter de petróleo; DM – fracção diclorometano; AE – fracção acetato
de etilo; MA – fracção remanescente metanol e água; n.d. – não determinado.
IC50 (cloroquina) = 0.094 μg/ml
Nota: a, b – Plantas distintas para os Terapeutas Tradicionais, mas identificadas como sendo a mesma espécie.
Em duas das plantas medicinais (Pycnanthus angolensis e Morinda lucida) os
extractos brutos apresentaram uma elevada actividade contra o parasita, mas as fracções têm
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todas muito menor actividade. Uma explicação simples para esta situação, pode dever-se ao facto
de existirem possíveis sinergismos entre os diferentes compostos presentes na complexa mistura dos
extractos brutos, sinergismo esse que se perderá no decorrer do fraccionamento. Uma outra hipótese
é a possível instabilidade das moléculas fraccionadas ou purificadas, que nos extractos brutos
poderão estar protegidas por outros compostos.
Relativamente aos ensaios in vitro de actividade antimalárica, na fase hepática do
Plasmodium berghei (HepG2 cells), e aos testes de viabilidade celular (hepatotoxicidade) dos
extractos de plantas, os resultados encontram-se descritos na Tabela 3 (GOMES, 1999;
MADUREIRA et al., 2002b). Onze dos extractos e fracções em estudo revelaram actividade
esquizonticida na fase hepática do ciclo de vida do parasita, em concentrações abaixo dos
respectivos valores de MLD (Dose Mínima Letal – que inibe 30% do desenvolvimento celular
dos hepatócitos): Struchium sparganophorum (EB e MA), Aloe humilis (AE), Tithonia
diversifolia (EP e AE), Cedrela odorata (EB), Pycnanthus angolensis (EP e AE), Morinda
lucida – casca (EB e EP) e Morinda lucida – folhas (EP). De entre estas, quatro plantas
demonstraram possuir uma elevada actividade esquizonticida com valores de IC50 entre 5 a 34
μg/ml: Struchium sparganophorum, Tithonia diversifolia, Pycnanthus angolensis e Morinda
lucida (casca).
Tabela 3 – Actividade antimalárica exoeritrocítica e citotoxicidade de extractos de plantas
contra Plasmodium berghei in vitro (Hep G2)
Extracto
Nº
1
1EP
1DM
1AE
1MA
2
3
4
5
6
6EP
6DM
6AE
6MA
7
7EP
7DM
7AE
7MA
Nome Botânico
Struchium sparganophorum
Struchium sparganophorum
Struchium sparganophorum
Struchium sparganophorum
Struchium sparganophorum
Vernonia amygdalinaa
Vernonia amygdalinab
Ageratum conyzoides
Cinchona succirubra
Aloe humilis
Aloe humilis
Aloe humilis
Aloe humilis
Aloe humilis
Tithonia diversifolia
Tithonia diversifolia
Tithonia diversifolia
Tithonia diversifolia
Tithonia diversifolia
Citotoxicidade
MLD (μg/ml)
Concentrações
testadas
(μg/ml)
Actividade
esquizonticida
IC50 (μg/ml)
50
100
25
50
500
250
250
100
250
500
100
10
500
100
100
50
10
250
500
50 / 25
100 / 50
25 / 10
50 / 25
500 / 250
250 / 100
250 / 100
100 / 50
250 / 100
500 / 250
100 / 50
10 / 1
500 / 250
100 / 50
100 / 50
50 / 25
10 / 1
250 / 100
500 / 250
24
n.d.
35
78
482
n.a.
305
135
n.a.
n.a.
n.a.
19
354
344
287
18
n.a.
117
n.a.
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Extracto
Nº
Nome Botânico
Citotoxicidade
MLD (μg/ml)
Concentrações
testadas
(μg/ml)
Actividade
esquizonticida
IC50 (μg/ml)
8
Cedrela odorata
250
250 / 100
158
9
Premna angolensis
500
500 / 250
n.a.
Pycnanthus angolensis
250
250 / 100
n.a.
10
Pycnanthus angolensis
100
100 / 50
34
10EP
Pycnanthus angolensis
500
500 / 250
n.a.
10DM
Pycnanthus angolensis
25
25 /10
22
10AE
Morinda lucida (casca)
500
500 / 250
415
11a
Morinda lucida (casca)
10
10 / 1
5
11aEP
10
10 / 1
n.d.
11aDM Morinda lucida (casca)
Morinda lucida (casca)
50
50 / 25
137
11aAE
Morinda lucida (casca)
500
500 / 250
n.a.
11aMA
Morinda lucida (folhas)
50
50 / 25
76
11b
Morinda lucida (folhas)
250
250 / 100
103
11bEP
100
100 / 50
167
11bDM Morinda lucida (folhas)
Morinda lucida (folhas)
500
500 / 250
n.a.
11bAE
12
Cestrum laevigatum
250
250 / 100
n.a.
13
Canna bidentata
500
500 / 250
n.a.
MLD (Dose mínima letal) – dose que inibie 30% do crescimento celular; EB-extracto bruto etanólico; EP – fracção
éter de petróleo; DM – fracção diclorometano; AE – fracção acetato de etilo; MA – fracção remanescente metanol e
água; n.d. – não determinado; n.a. – não activo. IC50 (primaquina) = 0.003 μg/ml. MLD (primaquina) = 0.1 μg/ml.
Nota: a, b – Plantas distintas p/Terapeutas Tradicionais, mas identificadas como sendo a mesma espécie.
Os extractos e as fracções das plantas que apresentaram uma actividade significativa nos
ensaios in vitro, foram seleccionadas para os ensaios in vivo de actividade antimalárica
(Struchium sparganophorum, Cinchona succirubra, Tithonia diversifolia, Cedrela odorata e
Pycnanthus angolensis). No entanto, esta selecção não exclui a possibilidade de outros
extractos, aparentemente menos activos in vitro, poderem ser agentes terapêuticos eficazes,
quando administrados por via oral, em ensaios in vivo.
De uma forma geral, os extractos testados apresentaram uma actividade parcial contra o
parasita da malária de roedores, tendo os extractos de Cinchona sido os únicos que
demonstraram uma quimiosupressão total da parasitémia de murganhos infectados com P.
berghei. No entanto, ressaltamos ainda os resultados obtidos com dois extractos brutos
(Struchium sparganophorum e Cedrela odorata), que evidenciaram uma inibição significativa
(P <0,05) do desenvolvimento do parasita (85% e 73%, respectivamente), numa concentração
de 1000 mg/Kg/dia.
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A parasitémia (média ± desvio-padrão) do grupo controlo infectado, no final do dia 4 era
de 10,34% ± 2,11%; no caso dos ratos tratados com Struchium sparganophorum a parasitémia
era de 1,54% ± 1,38% e para o grupo tratado com Cedrela odorata a parasitémia era de
2,84% ± 0,99%. Foi calculado o tempo médio de sobrevivência dos animais infectados e
tratados, comparativamente ao grupo de controlo (23 ± 3 dias), tendo uma das plantas
aumentado este valor em 35% (Cedrela odorata) – ver Fig 1.
3 5 ,0
3 0 ,0
T (days)
2 5 ,0
2 0 ,0
1 5 ,0
1 0 ,0
5 ,0
0 ,0
K i
1E P I
1 E P II
5 II
7D M I
7 D M II
8I
8 II
10I
1 0 II
P la n t e x tr a c t s
Ki (ratos infectados, não tratados)
I – (1000 mg/Kg/dia)
8II (Cedrella odorata);
II – (500 mg/ Kg/ia)
5II (Cinchona )
Fig. 1 – Taxa de sobrevivência dos murganhos (MADUREIRA et al., 1998a,b)
2.4. ESTUDOS DE TOXICIDADE
De forma a poderem ser desenvolvidas as formulações mais apropriadas para a
produção local de medicamentos à base de plantas, não interessa só comprovar
cientificamente a sua eficácia, mas também demonstrar a sua total segurança. Segundo as
directivas da OMS, o passo seguinte para validar um medicamento à base de plantas, neste
caso um antimalárico, baseado na medicina tradicional, será o de determinar os respectivos
níveis de segurança através de estudos toxicológicos (WHO, 1998).
Foram efectuados dois tipos de ensaios de toxicidade de curta duração: testes de
genotoxicidade in vitro – Teste de Ames (MORTELMANS et al., 2000) e testes de toxicidade
aguda in vivo (TOLEDO et al., 2000; MARKOUK et al. 2000; ALEXANDRE-MOREIRA et
al., 1999; CYTED, 1995). O primeiro foi realizado numa parceria do Centro de Malária e
Outras Doenças Tropicais com o Centro de Investigação de Genética Humana da Faculdade
de Ciências Médicas da Universidade Nova de Lisboa, e o segundo, com a colaboração do
Biotério do Instituto de Higiene e Medicina Tropical. Estes testes encontram-se entre as
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primeiras opções nos protocolos da Organização Mundial de Saúde e da RITAM (Research
Iniciative on Tradicional Antimalarials) para a validação de plantas medicinais como
medicamentos tradicionais à base de plantas (WHO, 1996; BODEKER & WILLCOX, 2000).
2.4.1. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir de ensaios de Genotoxicidade in vitro, realizados com a estirpe de Salmonella
tiphimurium TA98, foi feito um primeiro rastreio quanto à mutagenicidade de extractos de
plantas usados como antimaláricos em São Tomé e Príncipe (SANTOS, 2001).
Os extractos/fracções EB, EP e DM, das plantas Tithonia diversifolia e Pycnathus
angolensis não apresentam sinais de genotoxicidade, para a estirpe TA98, nos ensaios com e
sem biotransformação. O mesmo acontece, na fracção AE das duas plantas, no ensaio sem
biotransformação. Verifica-se no entanto, que a fracção AE, de ambas as plantas, apresenta
uma fraca mutagenicidade, para a estirpe TA98, no ensaio com biotransformação. Uma vez
que a estirpe TA98 é sensível a mutagéneos de desfasamento (frame-shift), pode-se concluir
que a fracção de acetato de etilo (AE) das plantas Tithonia diversifolia e Pycnathus angolensis
contêm na sua composição compostos que podem induzir este tipo de mutação. Por outro lado,
o facto desta actividade mutagénica não se apresentar no extracto bruto das plantas parece
sugerir que existem sinergismos entre os diversos componentes, que anulam a potencial
mutagenicidade, ou provavelmente que os compostos obtidos na fracção de acetato de etilo, e
que são responsáveis pela mutagenicidade, encontram-se em concentrações baixas no extracto
bruto, não sendo estas suficientes para apresentar sinais de mutagenicidade.
Assim sendo, a partir deste estudo, fica confirmada a mutagenicidade da fracção de
acetato de etilo da planta Tithonia diversifolia e a fraca mutagenicidade da mesma fracção para
a planta Pycnathus angolensis.
Os resultados dos ensaios de Toxicidade Aguda in vivo, efectuados em roedores,
comprovaram a inocuidade dos extractos/fracções EB e EP de Struchium sparganophora, EB
de Tithonia diversifolia, AE de Pycnanthus angolensis, com DL50 > 15.000 (mg/Kg); foram
considerados ligeiramente tóxicas as fracções de diclorometano de Struchium sparganophora e
de Tithonia diversifolia, com DL50 de 3.501 e 4.453mg/Kg, respectivamente; os restantes
extractos/fracções não apresentam indícios de toxicidade até à concentração testada.
O facto de existirem fracções que apresentam alguma toxicidade (fracção DM de
Struchium sparganophora e DM de Tithonia diversifolia), e de os respectivos extractos brutos
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não apresentarem toxicidade aguda, poderá indicar a existência de sinergismos/antagonismos
entre compostos, que possam estar presentes no extracto bruto e que inibam a referida
toxicidade.
Com estes resultados, pode-se comprovar a relativa inocuidade dos extractos brutos de
todas as plantas ensaiadas, sendo estes a forma mais aproximada, em termos de composição
relativamente aos medicamentos tradicionais usados pelos curandeiros da República de São
Tomé e Príncipe.
Relacionando estes resultados obtidos nos testes de genotoxicidade, in vitro e os testes
de toxicidade aguda, in vivo, com os resultados obtidos anteriormente nos estudos de
actividade antimalárica (ver tabela 4), pode-se verificar que nas plantas estudadas (Struchium
sparganophora, Tithonia diversifolia, Cedrela odorata, Pycnathus angolensis e Morinda
lucida (casca)), os extractos e fracções mais activos, foram de uma forma geral os extractos
bruto e as fracções de éter de petróleo, com valores de IC50 < 10 μg/ml (na fase eritrocitária), e
na fase hepática com valores de DL50 para os esquizontes, inferiores à dose letal tóxica (na fase
hepática).
No entanto, é importante referir que, de uma foma geral, nos extractos/fracções que
demonstraram uma actividade antimalárica elevada, as concentrações activas são
consideravelmente mais baixas que os valores de concentrações que revelam alguma
toxicidade, nos diversos ensaios de toxicidade efectuados.
Assim, e a partir de todos os resultados disponíveis até ao momento, pode-se concluir
que os extractos brutos e as fracções de éter de petróleo das plantas Tithonia diversifolia e
Pycnathus angolensis, são os que apresentam os melhores resultados de actividade
antimalárica (na fase sanguínea e fase hepática) e simultaneamente apresentam garantias de
inocuidade, relativamente aos resultados de toxicidade, pelo que poderão servir de base para
um futuro desenvolvimento de novos fármacos antimaláricos, devendo ser as espécies a
seleccionar para a realização de estudos fitoquímicos que permitam o isolamento e a
identificação do(s) composto(s) responsáveis pela actividade antimalárica da planta.
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Tabela 4 – Resultados dos ensaios de toxicidade versus actividade antimalárica
de Plantas de STP
Espécie de
planta
Extracto/fracção
Mutagenicidade
Estirpe TA98
Toxicidade
Actividade
Actividade
aguda, in Esquizontocida Esquizontocida Hepatotoxicidade
vivo
eritrocitária
hepática
IC50 (μg/ml)
MLD (μg/ml)
IC50 (μg/ml)
n.d
180
EB
R.I.
24
50
n.d
n.d
EP
R.I.
<10
100
DM
n.d
L.T.
100
35
25
100
78
50
AE
n.d
R.I.*
EB
n.d
R.I.*
260
s.a
500
EP
n.d
n.d
150
s.a
100
Aloe humilis
DM
n.d
n.d
150
19
10
n.d
25
354
500
AE
R.I.*
287
EB
N.M.
R.I.
15
100
Tithonia
EP
N.M.
R.I.*
<10
18
50
diversifolia
L.T.
s.a.
DM
N.M.
<10
10
140
M.
117
250
AE
R.I.*
n.d
190
250
EB
R.I.*
158
EP
n.d
R.I.*
110
n.d
n.d
Cedrela odorata
50
n.d
n.d
DM
n.d
R.I.*
n.d
n.d
n.d
AE
n.d
R.I.*
s.a.
<5
250
EB
N.M.
R.I.*
Pycnanthus
100
EP
N.M.
R.I.*
34
100
angolensis
100
s.a.
500
DM
N.M.
R.I.*
F.M
100
22
AE
R.I.
25
415
n.d
<10
500
EB
R.I.*
n.d
R.I.*
Morinda lucida
50
EP
5
10
(casca)
DM
n.d
n.d
50
n.d
10
AE
n.d
n.d
100
137
50
CI – concentrações inibitória; DLM – dose letal mínima; DL – dose letal; n.d.- não determinado; s.a – sem actividade
esquizontocida; M. – mutagénico; N.M. – não mutagénica para a estirpe TA98; F.M.- fracamente mutagénica; R.I. –
relativamente inócuo; R.I.* - relativamente inócuo até a concentração testada. L.T. – ligeiramente tóxico
Struchium
sparganophora
3. ESTUDO FITOQUÍMICO
Efectuou-se uma pesquisa bibliográfica aprofundada sobre as 2 espécies mais
promissoras para permitir reunir todos os dados existentes sobre os estudos realizados até ao
momento por outros investigadores. Desta pesquisa, resultou a selecção final da espécie
Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray. (Asteraceae), uma vez que não existiam quaisquer
registos sobre o seu uso tradicional como antimalárico, e o seu estudo fitoquímico iria
permitir identificar pela primeira vez o(s) composto(s) responsáveis pela actividade
antimalárica, por nós já comprovada.
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Fig. 2 – Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray
3.1. ISOLAMENTO DOS CONSTITUINTES ACTIVOS
3.1.1. COLHEITA, IDENTIFICAÇÃO E PREPARAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL
O material vegetal da planta seleccionada (caules, folhas e flores de Tithonia
diversifolia) foi colhido em Monte Café – S. Tomé, e seco à sombra, tendo sido depositado
um exemplar de herbário no Instituto Botânico da Universidade de Coimbra (Madureira &
Martins 626 (COI)).
As partes aéreas secas da planta foram pulverizadas e foram preparados dois extractos
brutos, um com éter dietílico e outro com metanol. A planta pulverizada foi macerada
separadamente nos dois solventes (120 g / 1 L), à temperatura ambiente, durante 18 horas,
sendo os solventes evaporados à secura num rotavapor, a uma temperatura inferior a 40ºC.
Foi igualmente preparada uma decocção da planta, de forma similar a uma das preparações
utilizadas pelos terapeutas tradicionais; esta decocção foi liofilizada. É de salientar o facto
desta planta também ser usada em fresco, ingerindo-se o suco das folhas mais jovens, que são
mastigadas. No entanto, na preparação dos extractos apenas foi utilizado material seco.
3.1.2. ISOLAMENTO BIODIRECCIONADO
Isolamento de compostos activos
Todos os extractos foram testados contra duas estirpes de Plasmodium falciparum
(FCA 20 Ghana, sensível à cloroquina e FCB1- Colômbia, resistente à cloroquina), de acordo
com a metodologia descrita anteriormente, e os resultados da actividade antiplasmódica
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serviram de guia para o fraccionamento e isolamento subsequente dos constituintes activos da
planta em estudo.
Assim, e tendo em conta os resultados obtidos com estes ensaios (Tabela 5),
seleccionou-se o extracto de éter dietílico para continuar os estudos fitoquímicos, uma vez
que este extracto foi o que apresentou a melhor actividade contra as estirpes de P. falciparum
(FCA - IC50: 0,75 µg/ml e FCB1 - 0,83 µg/ml).
Tabela 5 – Actividade antimalárica de extractos de Tithonia diversiolia
Extracto
IC50 (µg/ml)
FCA
IC50 (µg/ml)
FCB1
Éter Dietílico
Metanol
Decocção H2O
Cloroquina
0,75
2,16
57
0,01
0,83
4,36
79
0,07
Cromatografia líquido-sólido
O extracto etéreo evaporado (obtiveram-se 2,88 g a partir de 120 g de material vegetal
seco) foi separado numa coluna de cromatografia de sílica gel 60 (Si60 Merck), e foi usado
um gradiente de eluição com hexano / acetato de etilo (100:0; 95:5; 90:10; 86:14; 82:18;
80:20; 78:22; 76:24; 74:26; 72:28; 70:30; 68:32; 66:34; 64:36; 62:38; 60:40; 55:45; 50:50;
45:55; 40:60; 35:65; 30:70; 20:80; 10:90; 0:100); metanol e metanol 50%, tendo-se utilizado
alíquotas de 250 ml de cada eluente.
Com esta técnica pretendemos eluir e separar os vários componentes do extracto, em
função da sua polaridade crescente.
Cromatografia em Camada Fina (CCF e CPCF)
As fracções eluídas foram submetidas a CCF (placa de silica gel; hexano / acetato
etilo 80:20 e 40:60), e examinadas para verificar similaridades e diferenças do seu perfil
cromatográfico. Desta forma, combinaram-se os eluatos em 30 fracções conforme a sua
semelhança de perfil cromatográfico (Fracção I a XXX).
Efectuaram-se testes de actividade antiplasmódica nas 30 fracções, tendo-se verificado uma
maior actividade nas fracções XVI a XX, correspondentes à fase móvel hexano / acetato de etilo
70:30), com IC50 entre 0,37 µg/ml a 0,63 µg/ml na estirpe FCA.
A fracção mais activa (XVII, IC50: 0,37 µg/ml) foi purificada através de
Cromatografia Preparativa de Camada Fina (sílica gel; hexano / acetato de etilo 40:60),
13
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tendo-se obtido 80 mg de um composto maioritário (Rf 0,39; silica gel; hexano / acetato etilo
40:60). Este composto também estava presente nas fracções XVI a XX.
O composto assim obtido possui uma boa actividade antiplasmódica, tendo sido
determinado um IC50 de 0,33 µg/ml (0,95 µM) na estirpe sensível à cloroquina (FCA) e IC50
de 0,24 µg/ml (0,69 µM) e 0,25 µg/ml (0,72 µM) respectivamente, nas estirpes resistentes à
cloroquina FCB1 e W2.
Estes resultados parecem comprovar que este é o composto maioritariamente
responsável pela actividade antimalárica da planta Tithonia diversifolia.
3.1.3. IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DO COMPOSTO ACTIVO
A estrutura do composto activo, a lactona sesquiterpénica tagitinina C, foi
determinada recorrendo a métodos espectroscópicos e espectrofotométricos (UV, IV, MS e
RMN), tendo sido feita a comparação dos espectros obtidos com dados da literatura, uma vez
que esse composto já havia sido descrito anteriormente como fazendo parte da composição da
Tithonia tagitiflora Desf. (PAL R. et al., 1977) e da Tithonia diversifolia (BARUAH N.C. et
al., 1979).
Espectrometria UV – Visível
Os espectros de ultravioleta (UV) foram traçados em metanol, com um
espectrofotómetro HITACHI U-3300. A selecção desta solução baseou-se no trabalho de
BARUAH N.C. et al. (1979).
O composto activo isolado apresentava uma forte fluorescência a 254 nm nas placas de
cromatografia em camada fina com indicador de fluorescência. Por este motivo, iniciámos a
respectiva identificação começando por traçar o seu espectro UV (Fig. 3):
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Fig. 3 – Espectro UV do composto activo isolado
Podemos observar claramente no espectro obtido a existência de dois máximos de
absorção: um a 207 nm, clássico para lactonas sesquiterpénicas com um metileno exocíclico,
e um outro a 248 nm.
ε (207 nm) =
ε (248 nm) =
1,63 x 348
1 x 0,063
1,26 x 348
1 x 0,063
= 10554,3
= 8158,5
Este espectro não nos permite avançar muito relativamente à estrutura exacta do
composto. Podemos unicamente deduzir, dos dados obtidos, que o composto possui sistemas
de duplas ligações conjugadas, e que se trata muito provavelmente de uma lactona
sesquiterpénica com um metileno exocíclico.
Espectrometria de Infravermelho
Os espectros de infravermelho (IV) foram realizados no CERM (Centre de Recherche
sur les Macromolecules da Universidade de Liège) e foram traçados com um
espectrofotómetro PERKIN ELMER Spectrum GX
®
FT-IR, equipado com um detector
MIRTGS. As soluções foram feitas em éter dietílico e em tetracloroetileno (C2Cl4).
Os espectros e os dados obtidos (Fig. 4) foram tratados com o programa informático
Spectrum V2.00 da Perkin-Elmer.
As informações mais marcantes e interessantes deste espectro são as 3 bandas intensas
observadas entre 1650 e 1800 cm-1, isto é, na região de vibração das duplas ligações dos
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carbonilos. Podemos igualmente observar algumas bandas na região de vibração de
alongamento das ligaçõe Csp2-H, típicas dos alcenos e um sinal a 3610 cm-1, correspondente
provavelmente à vibração de alongamento da ligação O-H.
De acordo com os dados existentes na literatura, uma molécula já descrita em
Tithonia diversifolia (BARUAH et al., 1979), e em Tithonia tagetiflora (PAL et al., 1977), a
lactona sesquiterpénica Tagitinina C, possui três grupos carbonilo com valores relativamente
próximos dos valores por nós observados, o que nos indica que o nosso composto activo
poderá ser esta mesma lactona sesquiterpénica.
Fig. 4 – Espectro IV do composto activo isolado
Espectrometria de Massa por impacto electrónico
Os espectros de massa foram obtidos no modo positivo e realizados no MS Lab
(Laboratório de Espectrometria de Massa da Universidade de Liége) e obtidos com um
aparelho FINNIGAN Polaris Q (GC-MS – EI/CI).
A espectrometria de massa permitiu-nos obter algumas informações mais e os
resultados obtidos corroboram perfeitamente a hipótese da presença de Tagitinina C, como
sendo o composto activo por nós isolado.
[M+Na]+
16
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[M-(HOOCCH(CH3)2+H]+
Fig. 5 – Espectro de Massa do composto isolado
Assim, e apesar de algumas diferenças detectadas no espectro obtido (Fig. 5),
comparativamente aos dados existentes na literatura, podemos constatar o seguinte:
- a massa da tagitinina C é de 348; no entanto, o espectro de massa apresenta um sinal
importante a 371 m/z; detectaram-se vestígios de Na (23) fixados à molécula, pelo que
podemos admitir a hipótese de estar na presença de um aducto de sódio sobre a molécula da
tagitinina C (348 + 23 = 371);
- observando os iões-filhos do sinal 371 (obtidos por MS/MS), detecta-se que se situam a 301
e a 283 m/z. Subtraindo o valor da massa do sódio (23), estes sinais situar-se-iam a 278 e 260
m/z, duas massas mencionadas na literatura (PAL et al., 1977) como sendo fragmentos da
tagitinina C; estes fragmentos são obtidos respectivamente pela perda de um COCH(CH3)2 e
de um HOOCCH(CH3)2;
- no espectro apresentado na figura 5, observam-se igualmente outros sinais a 261 e a 243
m/z. Trata-se de dois fragmentos da molécula da tagitinina C, que correspondem
respectivamente a uma perda de HOOCCH(CH3)2 do grupo éster e de HOOCCH(CH3)2- H2O
do grupo alifático da molécula.
Através da análise dos resultados obtidos com o espectro de massa, ficou ainda mais
fortalecida a hipótese do nosso composto activo isolado ser a tagitinina C.
Ressonância Magnética Nuclear (13C-RMN e 1H-RMN)
Os espectros de ressonância magnética nuclear foram realizados no CREMAN
(Centre de Résonance Magnétique Nucléaire da Universidade de Liége) e foram traçados em
solução de CDCl3, usando o TMS com padrão interno, a 400 MHz (1H-RMN) e 100 MHz
(13C-RMN) num aparelho BRUCKER Avance DRX 400. Para melhor elucidação estrutural
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recorreu-se também a espectros bidimensionais de correlação homonuclear de protão (2D 1H1
H – COSY).
A técnica que melhor nos permite identificar a molécula isolada é incontestavelmente
a RMN. De facto, a análise conjunta dos espectros 1H,
13
C e de espectros 2D, deixa muito
poucas dúvidas acerca da identidade da molécula.
Assim, pudemos constatar, por comparação com os valores obtidos por BARUAH et
al., em 1979 (coluna Tg C), que os espectros de protão e de carbono por nós obtidos
apresentam valores de deslocamentos químicos quase idênticos aos descritos anteriormente
na literatura para a tagitinina C (Tabelas 6 e 7):
Tabela 6 – Comparação dos deslocamentos químicos em RMN 1H (ppm)
Posição
1
2
5
6
7
8
9ª
9b
13ª
13b
14
15
2’
3’
4’
Composto Isolado
(em CDCl3)
6,92
6,24
5,86
5,40
3,54
5,35
2,45
1,99
6,34
5,80
1,53
1,95
2,42
1,07
1,05
Tg C*
(em CDCl3)
6,94
6,26
5,88
5,42
3,55
5,33
≈ 2,40
≈ 2,00
6,36
5,81
1,56
1,97
2,44
1,10
1,08
Δ
- 0,02
- 0,02
- 0,02
- 0,02
- 0,01
+ 0,02
≈ + 0,05
≈ - 0,01
- 0,02
- 0,01
- 0,03
- 0,02
- 0,02
- 0,03
- 0,03
Tabela 7 – Comparação dos deslocamentos químicos em RMN 13C (ppm)
Posição
Composto Isolado
(em CDCl3)
Tg C*
(em CDCl3)
Δ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
159,95
128,98
196,78
138,95
≈ 137,78**
≈ 75,50**
47,40
≈ 73,80**
48,50
72,06
136,00
169,65
≈ 124,50**
≈ 28,50**
≈ 19,00**
160,49
129,57
196,85
188,84
137,14
76,05
47,05
74,11
48,37
71,91
136,11
169,75
124,43
28,88
19,65
- 0,54
- 0,59
- 0,07
+ 0,11
≈ + 0,54
≈ - 0,55
+ 0,35
≈ -0,31
+ 0,13
+ 0,13
- 0,11
- 0,10
≈ + 0,07
≈ - 0,38
≈ - 0,65
18
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Tg C*
Δ
Composto Isolado
(em CDCl3)
(em CDCl3)
1’
176,16
176,18
- 0,02
2’
34,45
34,06
+ 0,39
3’
18,80
18,80
0,00
4’
18,65
18,64
+ 0,01
* Valores descritos na literatura para a tagitinina C (BARUAH et al., 1979)
** Alguns sinais confundem-se com o ruído de fundo, sendo difícil determinar o
seu deslocamento com precisão
Posição
O espectro H1-H1 2D COSY (figura 6), que permite observar as correlações entre os protões
dos carbonos vizinhos, apresenta todas as correlações (anotadas pelos números dos
respectivos protões) correspondentes à estrutura da tagitinina-C.
Fig. 6 – Espectro H1-H1 2D COSY do composto isolado
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Em conclusão, a análise conjunta de todos os dados obtidos (UV, IV, MS-EI, 1HRMN e
13
C-RMN) permitiu-nos confirmar definitivamente a estrutura da lactona
sesquiterpénica por nós isolada, e identificar deste modo a tagitinina-C, como sendo o
composto activo responsável pela actividade antimalárica da planta Tithonia diversifolia
(GOFFIN et al., 2002).
3.2. OUTROS ESTUDOS
Após a identificação da tagitinina C como sendo o composto maioritariamente
responsável pela actividade animalárica da planta medicinal Tithonia diversifolia, foram
posteriormente desenvolvidos por outros investigadores métodos laboratoriais que permitem
uma rápida quantificação deste composto activo em extractos obtidos com as partes aéreas da
referida planta (GOFFIN et al., 2003).
De acordo com dados existentes na literatura, a presença de tagitinina C varia bastante
consoante a origem do material vegetal. Assim, temos a presença de tagitinina C descrita para
plantas provenintes da Índia (BARUAH et al., 1979; BORDOLOI et al., 1996) e para a
espécie de África por nós estudada (GOFFIN et al., 2002), não estando esta lactona
sesquiterpénica descrita para a mesma espécie, em plantas originárias do Brasil (PEREIRA et
al., 1997), Costa Rica (SCHUSTER et al., 1992) e Taiwan (KUO & CHEN, 1998).
Quantificação da Tagitinina C por Cromatografia Líquida de Alta Resolução
(HPLC) em Fase Reversa (GOFFIN et al., 2003)
O sistema de HPLC utilizado consistiu numa bomba de gradiente LKB (Bromma,
Sweden) 2249-010 LC, um detector de Photodiodo-array Hewlett Packard (Palo Alto, CA,
USA), modelo 1040 M-série 2 (a operar a 254 nm), uma coluna Lichrospher 60 RP 18 Selet
B (250 x 4 mm; dimensão de partículas de 5 µM; VWR International).
A fase móvel usada foi acetonitrilo (solvente A) e sol. aquosa de acetato de sódio (0.1
M), ajustado a pH 4.8 com ácido acético a 10% (solvente B). A eluição foi isocrática com
A:B (45:55), e com um fluxo de 1.0 mL/min. Com estas condições cromatográficas, a
tagitinina C pura eluiu neste sistema aos 5.8 minutos.
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Fig. 7 – Cromatograma da tagitinina C em HPLC-fase reversa (254 nm)
Foram preparadas várias soluções-padrão com concentrações conhecidas de tagitinina
C (0,4; 0,2; 0,1 e 0,01 mg/ml), sendo estas injectadas em triplicado, e usadas para estabelecer
a curva de calibração, a 254 nm.
Foram analisadas diversas amostras, correspondentes a diferentes extractos preparados
com as partes aéreas da planta Tithonia diversifolia (500 mg de material vegetal em éter dietílico,
em diclorometano, em metanol e numa decocção aquosa), tendo os resíduos secos (8 mg de cada)
sido solubilizados numa mistura de 9 mL de acetonitrilo e 11 mL de tampão de acetato (pH 4.8) e
as soluções filtradas através de uma membrana HVLP de 45 µm.
Para cada amostra foi injectada no HPLC uma alíquota de 20 µL, tendo a área do pico
associado à tagitinina C sido integrada e usada para calcular a quantidade de tagitinina C
existente em cada amostra. Todo o procedimento foi realizado em triplicado.
Na tabela 8 são apresentados os valores calculados de tagitinina C existentes em cada
extracto analisado, com as correspondentes percentagens existentes nas diversas partes da
planta utilizada (partes aéreas, flores, folhas e caules).
Tabela 8 – Quantificação da tagitinina C por HPLC-fase reversa em vários extractos de
Tithonia diversifolia
Parte da
Planta
Partes aéreas
Partes aéreas
Partes aéreas
Partes aéreas
Flores
Folhas
Caules
Extracto (solvente)
Diclorometano
Metanol
Água (decocção)
Éter dietílico
Éter dietílico
Éter dietílico
Éter dietílico
Peso Extracto
(mg)
13.2
151.0
91.5
12.5
12.5
18.6
2.9
Tagitinina C no
extracto (%)a
0.492 ± 0.015
1.987 ± 0.012
0.492 ± 0.015
30.53 ± 0.65
5.080 ± 0.030
30.85 ± 0.31
0.060 ± 0.005
Tagitinina C na
Amostra (%)a
(0.013 ± 0.001)*
(0.600 ± 0.004)*
(0.090 ± 0.003)*
0.763 ± 0.016
0.127 ± 0.001
1.145 ± 0.012
0.00035±0 .00003
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a
Média Valores (n=3) ± desvio-padrão; Valores em percentagem (m/m)
* Valores não comparáveis, uma vez que foram usados solventes diferentes para extrair a tagitinina C
Como se pode observar pelos valores apresentados na tabela 8, é o solvente éter
dietílico que melhor extrai a tagitinina C da planta, obtendo-se um extracto com cerca de 30%
deste composto, quer através das partes aéreas secas, quer através das folhas secas.
Os restantes extractos preparados com os outros solventes (diclorometano, metanol e
a decocção em água) apresentam valores muito inferiores de tagitinina C.
As folhas apresentam a maior quantidade do composto activo, com um conteúdo
médio de tagitinina C de cerca de 1,15%, devendo ser o material da planta a ser utilizado
preferencialmente na preparação de medicamentos tradicionais.
Em S. Tomé e Príncipe, as formas tradicionais de preparação do medicamento
antimalárico à base de Tithonia diversifolia são a decocção em água das partes aéreas ou das
folhas secas, e as folhas frescas mastigadas.
De acordo com os resultados apresentados por estes investigadores, o uso da decocção
das partes aéreas secas da planta deveria ser desaconselhado, por ter um conteúdo muito
baixo do composto activo (0,492%), comparativamente com os 30,5% que se conseguem
extrair com éter dietílico, devendo por isso ser recomendado principalmente o uso tradicional
das folhas frescas mastigadas.
Estes resultados estão concordantes com a análise efectuada aos vários extractos da
planta para determinação da sua actividade antimalárica (tabela 5), em que a decocção em
água apresentava o valor mais baixo de actividade antiplasmódica contra o P. falciparum
(com um IC50 de 57 µg/ml), contra um valor de IC50 de 0,75 µg/ml para o extracto etéreo. No
entanto, não podemos deixar de salientar que estes são resultados de testes in vitro que,
independentemente da sua validade como técnica laboratorial, não podem ser directamente
extrapolados para o organismo humano. Um extracto bruto, tal como o é a decocão em água
desta planta, é uma mistura altamente complexa de compostos, que podem interagir entre si,
provocando sinergismos ou antagonismos, quer a nível da actividade terapêutica, quer a nível
da toxicidade de um composto.
Interessa ainda referir, a título de exemplo, e com todas as implicações daí
decorrentes, que foi identificado um composto análogo do ácido artemisínico em caules de
uma espécie indiana de Tithonia diversifolia (BORDOLOI et al., 1996).
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Nos ensaios de toxicidade realizados até ao momento no extracto bruto da planta
Tithonia diversifolia e em fracções deste extracto bruto, ficou confirmada apenas uma fraca
mutagenicidade de algumas fracções (acetato de etilo) e simultaneamente pode-se comprovar
a relativa inocuidade do extracto bruto da mesma planta, sendo este extracto (etanol 60%) a
forma mais aproximada, em termos de composição relativamente aos medicamentos
tradicionais usados pelos curandeiros de São Tomé e Príncipe (decocção em água). Estes
resultados podem indiciar, por um lado, a existência de sinergismos/antagonismos entre
compostos, que possam estar presentes unicamente no extracto bruto e que inibam a referida
toxicidade, e por outro lado, a maior concentração da tagitinina C nas fracções, uma vez que
este composto apresenta alguma citotoxicidade (IC 50 HTC-116: 0,706 μg/ml).
Face aos resultados dos ensaios de actividade antiplasmódica e de toxicidade
realizados, não podemos desaconselhar totalmente o uso da decocção como preparação
tradicional, uma vez que se desconhecem ainda os restantes compostos presentes na sua
composição e as respectivas funções.
Por outro lado, há que ter em conta que estes medicamentos tradicionais são utilizados
por diferentes sectores etários da população, podendo talvez recomendar aos terapeutas
tradicionais que continuem a usar a decocção para tratamento de crianças e de outros grupos
de risco (grávidas e idosos), mantendo a utilização das folhas frescas para adultos.
4. CONCLUSÕES
A resistência do P. falciparum à cloroquina e à maioria dos actuais fármacos
disponíveis, é actualmente um problema muitíssimo grave em S. Tomé e Príncipe, tal como
em muitos outros locais em África, o que intensifica a urgência de se desenvolverem novos
anti-maláricos.
Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam uma forte correlação entre o uso
tradicional de diversas plantas medicinais, utilizadas pelos terapeutas tradicionais de S. Tomé
e Príncipe no tratamento de febres e/ou malária, e a sua actividade farmacológica
comprovada laboratorialmente. A planta Tithonia diversifolia possui uma elevada actividade
antiplasmódica quer na fase eritrocitária do P. falciparum, resistente à cloroquina, quer na
fase hepática do desenvolvimento do parasita. A lactona sesquiterpénica tagitinina C foi
isolada e identificada como sendo o principal composto responsável pelo efeito anti-malárico,
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demonstrando uma boa actividade antiplasmódica (IC50: 0,33μg/ml), mas possuindo alguma
citotoxicidade (IC 50 HTC-116: 0,706 μg/ml).
Foram posteriormente desenvolvidas por outros investigadores metodologias que
permitem a rápida quantificação do composto activo (tagitinina C) em extractos etéreos de T.
diversifolia (GOFFIN et al., 2003). De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir
que a decocção em água parece ser o método menos adequado à preparação de um
medicamento tradicional, pois apresenta uma menor concentração de tagitinina C e uma
menor actividade antimalárica, in vitro.
As folhas apresentam a maior quantidade do composto activo, com um conteúdo
médio de tagitinina C de cerca de 1,15%, devendo ser o material da planta a ser utilizado
preferencialmente na preparação de medicamentos tradicionais.
Por último, parece-nos oportuno referir a importância que poderá ter uma investigação
genética da planta, uma vez que será útil determinar quais as causas das variações existentes
na presença ou ausência do composto activo, a tagitinina C, em espécies de origens
geográficas diferentes. Sobre este aspecto, muito poderá ainda ser feito, com vista à obtenção
de espécies mais adequadas quer a um uso tradicional, quer a um uso industrial.
Com efeito, apontamos um exemplo da interligação da investigação fitoquímica com a
biologia aplicada, na investigação levada a cabo por outros autores (MAGALHÃES, 1996;
DELABAYS, 1997), em que se conseguiu seleccionar uma espécie de Artemisia annua capaz
de produzir artemisinina em quantidade suficiente, para que possa ser utilizada com um nível
de eficácia adequada, numa forma de preparação tradicional (infusão), utilizada em vários
países do continente Asiático.
A T. diversifolia é certamente uma planta para continuar a estudar no futuro, quer no
que diz respeito à selecção da variedade mais adequada, quer no que concerne à determinação
de dosagens adequadas para um bom resultado terapêutico, e que garantam uma boa relação
eficácia / segurança de um extracto padronizado, de forma a permitir a produção local de um
antimalárico facilmente acessível e de baixos custos.
Os resultados obtidos até ao momento são promissores e constituem um exemplo de
como a etnofarmacologia pode indicar o caminho para novas terapêuticas e para o
desenvolvimento de novos fármacos.
Todos os resultados obtidos foram apresentados ao Ministério da Saúde da RDSTP,
antes da sua publicação ou apresentação em Congressos Internacionais, de forma a permitir
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uma futura utilização de medicamentos eficazes, seguros e economicamente viáveis, e
tentando garantir deste modo que os benefícios resultantes desta investigação possam ser
aproveitados e usufruídos pela população e pelos terapeutas tradicionais que forneceram os
conhecimentos tradicionais que serviram de base a este estudo.
Agradecimentos
Este trabalho foi feito em parceria com a Doutora Ana Paula Martins, e não teria sido possível
sem a colaboração do Ministério da Saúde de S. Tomé e Príncipe e dos terapeutas tradicionais
locais, entre os quais destacamos Sum Pontes e Sum Gino, a quem agradecemos a sua
generosidade e os seus preciosos ensinamentos.
Agradece-se igualmente a todas as instituições e respectivos investigadores que participaram
directamente na realização deste estudo: Prof. Jorge Paiva do Instituto Botânico da
Universidade de Coimbra; Prof. António Proença da Cunha e Prof. Lígia Salgueiro do
Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra; Prof.
Doutor Virgílio do Rosário, Drª Miléne Gomes e Dr. Filipe Santos, do Centro de Malária e
outras Doenças Tropicais e do Departamento de Genética do Instituto de Higiene e Medicina
Tropical da Universidade Nova de Lisboa; Prof. Doutor Luc Angenot e Dr. Eric Goffin do
Laboratory of Pharmacognosy and Structural Chemistry, Natural and Synthetic Drugs
Research Centre University of Liège, Bélgica.
Nota: Este trabalho foi realizado no âmbito do Projecto “Validação de Medicamentos usados
como Antimaláricos na Medicina Tradicional de S. Tomé e Príncipe”, financiado pela
Fundação para a Ciência e Tecnologia (PRAXIS/PSAU/P/SAL/38/96).
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