Alterações metabólicas promovidas pelo Papaya ringspot vírus

UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
ALTERAÇÕES METABÓLICAS PROMOVIDAS PELO
Papaya ringspot virus – type W EM PLANTAS DE
MELANCIA
FRANCINI BINOTTO MISSIURA
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Agronomia da
Faculdade de Agronomia e Medicina
Veterinária da Universidade de Passo
Fundo, para obtenção do título de Mestre
em Agronomia – área de concentração
em Fitopatologia.
Passo Fundo, setembro de 2005
UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
ALTERAÇÕES METABÓLICAS PROMOVIDAS PELO
Papaya ringspot virus – type W EM PLANTAS DE
MELANCIA
FRANCINI BINOTTO MISSIURA
Bióloga
Orientadora: Profa . Dra . Jurema Schons
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Agronomia da Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinária da
Universidade de Passo Fundo, para obtenção
do título de Mestre em Agronomia – Área de
concentração em Fitopatologia.
Passo Fundo, setembro de 2005
AGRADECIMENTOS
À Universidade de Passo Fundo, pela oportunidade de realizar
o curso.
À Professora e orientadora Drª Jurema Schons, pela amizade e
sinceridade ao longo desses anos de convivência, apoio,
incentivo, pela orientação e disponibilidade nos momentos de
dificuldade e principalmente pelo exemplo de pessoa humana e
profissional que sempre estará presente comigo.
Ao
Coordenador
do
Programa
de
pós-graduação
em
Agronomia Prof. Dr. Alexandre A. Nienow pela competência,
profissionalismo e amizade.
À FAMV pelo suporte de laboratórios e demais instalações
utilizadas para o êxito do trabalho.
Aos professores do curso de Mestrado em Agronomia, pelo
ensinamento, atenção, disponibilidade em todas as atividades
desenvolvidas.
Aos funcionários do Laboratório de Fitopatologia, Recursos
Computacionais, do setor de Horticultura, do CEPAGRO e da
Secretaria pela atenção e apoio sempre necessário.
À Banca Examinadora pela disponibilidade em revisar e
contribuir para melhorar a redação do presente trabalho.
Ao Dr. Jorge Alberto Rezende (ESALQ) e ao Dr. André Dusi
pelo fornecimento do anti-soro;
A todos os colegas que tornaram-se grandes amigos, em
especial a Daniela Boscardin, pelo convívio, consideração
apoio e amizade.
Às amigas e colegas do Laboratório de Virologia Vegetal, em
especial a Fernanda Nicolini Teixeira, pela ajuda nos trabalhos
práticos, mas acima de tudo pela verdadeira amizade
conquistada.
Aos meus avós, Erna e Dorival, pelo apoio e incentivo em todos
os momentos;
Aos meus pais Jovino e Fátima, verdadeiros mestres, pelo
esforço, amparo, amor, dedicação, confiança; pelo exemplo de
luta, perseverança e por acreditarem em mais este passo de
minha vida, agradeço;
A minha irmã Cristina, meu cunhado Alexandre e meu afilhado
Alexandre pela força e apoio em todos os momentos;
Ao meu marido, Sandro, pelo amor incondicional, paciência,
carinho e compreensão em todos os momentos. Te amo;
À todos que de uma forma ou de outra contribuíram para a
realização deste trabalho;
E principalmente a Deus, pela vida, pela saúde, pela minha
família, pela força, coragem e persistência, dons que agradeço
muito por ter recebido e pretendo cultivar para sempre.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS..........................................................
viii
LISTA DE FIGURAS..........................................................
ix
RESUMO...........................................................................
1
SUMMARY........................................................................
3
1 INTRODUÇÃO...............................................................
5
2 REVISÃO DE LITERATURA..........................................
7
2.1 A cultura da melancia...............................................
7
2.1.1 Importância econômica ......................................
7
2.2 Características dos vírus.........................................
9
2.3 Família Potyviridae..................................................
10
2.4 Papaya ringspot virus – type W (PRSV-W)..............
14
2.4.1. Sintomas...........................................................
15
2.4.2 Controle.............................................................
17
2.5. Interações metabólicas (patógeno X hospedeiro)...
20
2.5.1 Proteínas...........................................................
21
2.5.2 Proteínas relacionadas à patogênese...............
23
2.5.3. -1,3 glucanase................................................
27
2.5.4 Peroxidase.........................................................
32
2.5.5 Açúcares totais.................................................
34
3 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................
35
3.1 Local de execução...................................................
35
3.2 Material vegetal.......................................................
35
3.3 Delineamento experimental......................................
35
3.4 Obtenção de inóculo e inoculação de PRSV-W em
plantas de melancia...........................................................
35
3.5 Condução do experimento.......................................
36
3.6. Determinações........................................................
36
3.6.1. Teores de proteínas solúveis............................
36
3.6.2. Atividade da -1,3 glucanase...........................
37
3.6.3. Atividade da peroxidade ...................................
38
3.6.4 Teores de açúcares totais.................................
39
3.6.5 Tratamento dos dados e análise estatística.......
39
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES...................................
40
5 CONCLUSÕES..............................................................
49
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................
50
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................
51
LISTA DE TABELAS
Tabela
Página
1 Teores de proteínas solúveis em folhas de
melancia
infectadas
com
o
PRSV-W
e
respectivos controles sadios.............................
2 Atividade da
melancia
1,3- glucanase em folhas de
infectadas
com
o
PRSV-W
e
respectivos controles sadios.............................
3 Atividade
melancia
da
40
peroxidase
infectadas
com
em
folhas
de
o
PRSV-W
e
respectivos controles sadios.............................
43
45
4 Teores de açúcares totais em folhas de
melancia
infectadas
pelo
PRSV-W
e
respectivos controles sadios.............................
47
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página
1 Sintoma do PRSV-W, em e formação de “ilhas
verdes” causadas pelo PRSV-W, em melancia.
16
2 Representação esquemática da ação de PRs
em plantas atacadas por patógenos ................
25
ALTERAÇÕES METABÓLICAS PROMOVIDAS PELO
Papaya ringspot vírus - type W EM PLANTAS DE
MELANCIA
Francini Binotto Missiura1; Jurema Schons2
RESUMO - O Papaya ringspot virus – type W (PRSV-W) é o
vírus mais freqüentemente encontrado infectando a cultura da
melancia (Citullus lanatus Schrad). Com o objetivo de avaliar o
efeito do PRSV-W sobre a atividade da
-1,3 glucanase e
peroxidase e, teores de proteínas solúveis e de açúcares totais,
conduziu-se o presente estudo, utilizando quatro cultivares de
melancia infectadas com o PRSV-W e respectivos controles
sadios. Em experimentos conduzidos em condições semicontroladas na Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária
da Universidade de Passo Fundo realizou-se o teste de Elisa e
determinou-se os aspectos bioquímicos nas plantas após trinta
e cinco dias da inoculação do vírus. Os dados foram
submetidos à análise de variância, comparando-se as médias
pelo teste de Tukey (5%). Os teores de proteínas solúveis e de
açúcares totais apresentaram maior concentração em plantas
sadias quando comparados às infectadas em todos os
cultivares
analisados.
Houve
maior
atividade
da
-1,3
glucanase e de peroxidase em plantas infectadas pelo PRSVW, em comparação às plantas sadias em todos os cultivares. A
maior atividade da
1
2
-1,3 glucanase, foi observada no cultivar
Bióloga, Mestranda do Programa de Pós-graduação em Agronomia
(PPGAgro)da Universidade de Passo Fundo, área de concentração em
Fitopatologia.
Orientadora, Bióloga, Doutora em Ciências Biológicas, professora do
PPGAgro e do Instituto de Ciências Biológicos/ UPF.
Charleston gray (suscetível), no qual a atividade da enzima foi
o dobro em relação ao cultivar resistente Vidasul congo. A
atividade da peroxidase em todos os cultivares foi em torno de
cinco vezes mais elevada em plantas infectadas em relação às
sadias, indicando que ocorre grande acúmulo de H2O2 nos
tecidos de plantas de melancia infectadas pelo PRSV-W. Isso
indica que a planta pode aumentar a atividade da peroxidase
afim de decompor o H2O2 acumulado e manter assim, a
integridade dos tecidos. A maior atividade desta enzima foi
observada no cultivar Charleston gray que apresentou o dobro
da atividade em comparação com o cultivar Vidasul congo,
resistente ao vírus. Os resultados encontrados indicaram
claramente alterações no metabolismo dos quatro cultivares de
melancia infectados pelo PRSV-W.
Palavras-chave:
proteínas solúveis.
-1,3
glucanase,
peroxidase,
PRSV-W,
METABOLIC ALTERATIONS CAUSED BY Papaya ringspot
virus - type W, IN WATER-MELON PLANTS
Francini Binotto Missiura1;Jurema Schons 2
SUMMARY - Papaya ringspot virus – type W (PRSV-W) is the
more frequently found virus that infects the water-melon culture
(Citullus lanatus Schrad). With the objective of evaluate the
efect of PRSV-W on the
-1,3 glucanase and peroxidase
activity and, the soluble protein contents and total sugar, the
present study was carried out, using four water-melon cultivars
infected with PRSV-W and its respective healthy controls. In
experiments led in semi-controlled conditions in the College of
Agronomy and Veterinary Science at the University of Passo
Fundo was carried out the Elisa test and biochemical aspects
were determined in plants, after thirty five days from the virus’
inoculation. The data were submitted to variable analysis,
comparing averages by the Tukey test at 5%. The soluble
protein contents and total sugar showed greater concentration
on healthy plants when compared to the infected ones in all
cultivars. There was greater activity of the -1,3 glucanase and
of the peroxidase in the plants infected by PRSV-W, in
comparison to healthy plants in all analysed cultivars. The
greatest activity of the
-1,3 glucanase was observed in
Charleston gray cultivar (susceptible), in which the enzyme
activity was the double in relation to the Vidasul congo resistant
1
2
Bióloga, Mestranda do Programa de Pós-graduação em Agronomia
(PPGAgro)da Universidade de Passo Fundo, área de concentração em
Fitopatologia.
Orientadora, Bióloga, Doutora em Ciências Biológicas, professora
PPGAgro e do Instituto de Ciências Biológicos/ UPF.
cultivar. The peroxidase activity in all cultivars was about five
times higher in infected plants in relation to the healthy plants,
indicating that occurs great accumulation of H2O2 in the tissues
of water-melon plants infected by PRSV-W. This indicates that
the plant can increase the peroxidase activity in order to break
down the accumulated H2O2 and to keep the integrity of the
tissues. The greatest activity of this enzyme was observed in
the Charleston gray cultivar that showed the double of the
enzyme activity when compared to the Vidasul congo cultivar,
resistant to the virus. The finding results clearly indicated
alterations in the metabolism of the four water-melon cultivars
infected by PRSV-W.
Key words:
proteins
-1,3 glucanase, peroxidase, PRSV-W, soluble
1 INTRODUÇÃO
A melancia (Citrullus lanatus Schrad) pertence à família
cucurbitáceae
e
tem
origem
no
continente
africano.
Atualmente, é cultivada em todos os continentes e seus frutos
são
apreciados
por
consumidores
de
todo
o
mundo,
principalmente em regiões quentes (Santos et al., 2005).
O maior produtor mundial de melancia é a China,
seguindo-se a Turquia e os Estados Unidos. No Brasil, é
considerada a quarta olerícola mais plantada, com o mercado
em franca expansão e produção anual de 600.000 toneladas,
colhidas em área de 79.000 ha (Santos et al., 2005).
Entre os estados maiores produtores estão, Rio Grande
do Sul, São Paulo, Goiás, Bahia, Tocantins e Minas Gerais.
Além de ser uma atividade agrícola rentável, o cultivo da
melancia tem grande importância social, pois fixa o homem no
campo, em razão da ampla necessidade de mão-de-obra para
a realização das diversas práticas culturais (Santos et al.,
2005).
As plantas de melancia, assim como a maioria das
culturas, podem ser infectadas por dezenas de patógenos, que
causam os mais diversos sintomas. Além das doenças bióticas,
existem as abióticas, que também podem causar destruição
total da cultura, caso não sejam adotadas medidas preventivas
(Santos et al., 2005).
As perdas na produção causadas pelo vírus da mancha
anelar do mamoeiro-estirpe melancia (Papaya ringspot virus –
type W - PRSV-W) já foram estimadas na cultura nos principais
países produtores de melancia, podendo ser fator limitante
para a produção de diversas cucurbitáceas, principalmente
quando a infecção ocorre no início do ciclo, de ocorrência mais
comum em regiões tropicais (Bedendo,1995).
O presente estudo teve como objetivo estudar e
determinar a interação patógeno/hospedeiro do PRSV-W, com
plantas de melancia dos cultivares Fair fax, Charleston gray,
Crimson
sweet
e
Vidasul
determinação da atividade
congo
(Preta),
mediante
a
-1,3 glucanase e da peroxidase,
teores de proteínas solúveis e açúcares totais. Os sintomas
causados pelo PRSV-W foram avaliados visualmente e a
presença do vírus foi confirmada através do teste de Elisa.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A cultura da melancia
A família curcubitaceae abrange importantes espécies
de hortaliças, tais como abóboras de moita ou abóbora italiana,
abóbora-rasteira, melão, melancia e pepino. Essas hortaliças
são trepadoras ou rastejantes, exceto a abóbora de moita
(Camargo, 1992).
A melancia é uma planta anual, originária da África;
rasteira, com ramificação sarmentosas que chegam a alcançar
três metros. É uma planta monóica, o transporte de pólen de
flores masculinas para as femininas é feito especialmente por
vespas e abelhas. O pólen forma uma massa pegajosa que
não se desprende pela ação do vento. Sem fecundação do
ovário a flor murcha e cai. Há fácil cruzamento entre plantas de
mesmo cultivar (Camargo, 1992).
Os cultivares comerciais variam na forma e cor. Fatores
importantes para a escolha dos cultivares, estão relacionados a
produtividade, resistência a moléstias, cor da polpa (sendo o
ideal vermelha-forte), agradável paladar e boa resistência da
casca ao transporte. Os cultivares mais cultivados são Fair Fax,
Charleston Gray e Yamato Sato (Camargo, 1992).
2.1.1 Importância econômica
A melancia, como as demais espécies da família
Cucurbitaceae, está sujeita a doenças causadas por vírus, que
podem reduzir substancialmente a sua produtividade. Cerca de
50 vírus já foram relatados em cucurbitáceas; mais de 30
infectam naturalmente plantas dessa família (Lima et al., 1999).
Segundo Rezende & Giampan (2005), dos vírus mais
freqüentes em cucurbitáceas, oito foram encontrados no Brasil
até 1995: o vírus do mosaico da abóbora (Squash mosaic virus
– SqMV), do mosaico do pepino (Cucumber mosaic virus –
CMV), do mosaico do mamoeiro – estirpe melancia (Papaya
ringspot virus - type watermelon - PRSV-W), da clorose letal da
abobrinha-de-moita (Zucchini lethal chlorosis virus - ZLCV) da
necrose da abóbora (um provável Necrovirus) , do mosaico-2
da melancia (Watermelon mosaic virus - WMV-2), um possível
Rhabdovirus e o vírus do mosaico da abobrinha–de-moita
Zucchini yellow mosaic virus – ZYMV.
Poucos são os dados disponíveis sobre a incidência
desses vírus nas diferentes regiões produtoras de melancia no
Brasil, porém os dados existentes mostram a predominância
dos vírus do gênero Potyvirus. No Estado de São Paulo,
avaliações sobre a ocorrência de viroses em melancia
indicaram a predominância do PRSV-W (68,7%), seguido pelo
ZYMV (18,7%); WMV-2 (6,6%); CMV (4,2%); e ZLCV (3,1%)
(Yuki et al., 2000). Em áreas de cultivo de melancia no
submédio
São
Francisco,
também
foi
constatada
a
predominância do PRSV-W (49,1%), seguido pelo WMV-2
(13%) e CMV (1,9%) (Lima et al., 1999). Alguns anos depois,
nessa mesma região, foi verificado que WMV-2 tornou-se
predominante seguido do PRSV-W, com incidências de 68,7%
e 31,3%, respectivamente (Cruz et al., 1999), mostrando que a
incidência de viroses não é um processo estático. No estado do
Maranhão, em amostras coletadas em campos de melancia,
foram identificado apenas o PRSV-W (60%) e o WMV-2
(26,7%) (Moura et al., 2001).
2.2 Características dos vírus
Os vírus são nucleoproteínas que têm capacidade de
causar doenças. Replicam-se somente em células vivas, sendo
parasitas celulares obrigatórios. Induzem as células do
hospedeiro a realizar sua replicação (Agrios, 1997). Ao
causarem doenças, os vírus não consomem nem destroem os
constituintes celulares com toxinas (como ocorre com fungos e
bactérias), porém causam danos pela utilização de substâncias
celulares durante a replicação, ocupando espaços nas células
e causando distúrbios nos processos celulares (Bedendo,
1995).
A
replicação
de
uma
partícula
viral
consiste
basicamente de quatro etapas distintas: a penetração na célula
hospedeira, a liberação ou desnudamento do ácido nucléico, a
síntese de ácido nucléico e proteínas, e a maturação ou
acoplamento desses dois componentes, dando origem a uma
nova partícula viral (Bedendo, 1995).
Os genomas virais são compostos por RNA ou DNA,
de fita dupla ou simples, dependendo do vírus. Tais patógenos
não
possuem
membrana
plasmática,
citoplasma
com
ribossomos e enzimas necessárias para a síntese de proteína e
produção de energia. Os genes virais, no entanto, codificam a
informação para a produção de enzimas envolvidas na
replicação do ácido nucléico e na síntese de proteínas (Raven
et al., 2001).
As doenças virais na sua maioria são transmitidas de
planta para planta por insetos. Dentro da célula hospedeira, os
vírus podem se movimentar de célula a célula, através dos
plasmodesmos, ou por meio do floema por maiores distâncias
(Bedendo, 1995).
Sabe-se que pelo menos 2000 doenças diferentes de
plantas são causadas por mais de 600 diferentes fitovírus de
espécies já identificadas. Doenças virais podem reduzir a
produtividade em muitas culturas, variando de 1 à 100%
dependendo do cultivar, da estirpe do vírus, e das condições
ambientais (Raven et al., 2001).
2.3 Família Potyviridae
Da família Potyviridae, o gênero Potyvirus é o que
forma
o
grupo
mais
numeroso
de
fitovírus,
contendo
aproximadamente 20% dos fitovírus descritos. Coletivamente,
em razão de seu grande número, os potyvírus formam o gênero
mais importante do ponto de vista econômico. Individualmente,
alguns potyvírus são igualmente importantes, como por
exemplo o vírus do mosaico comum do fejoeiro (Bean common
mosaic virus – BCMV),vírus do mosaico da alface (Lettuce
mosaic virus – LMV), o vírus do empedramento da ameixa
(Plum pox virus – PPV), o Papaya ringspot virus-papaya type P
- PRSV-P, e o mosaico amarelo da abobrinha-de-moita
(Zucchini yellow mosaic vírus - ZYMV), entre outros (Zerbini &
Zambolim, 1999).
A família Potyviridae é subdividida em seis gêneros,
que diferem no organização de seu genoma e na espécie de
vetor. O gênero mais numeroso é o Potyvirus, cujos vetores
são afídeos, e o genoma é composto de uma única molécula
de RNA de fita simples, senso positivo, com aproximadamente
10.000 nucleotídeos. O RNA viral produz uma proteína
codificada pelo próprio vírus (VPg), ligada covalentemente a
sua extremidade 5'
, e a seqüência poli-A na extremidade 3'
ligada covalentemente a sua extremidade 5' (Zerbini &
Zambolim, 1999).
Os genomas de diversos potyvírus já foram totalmente
seqüenciados. Em todos os potivírus seqüenciados até então,
o genoma contém uma única fronteira abera de leitura (ORFOpen reading frame) com capacidade para codificar uma
proteína de mais de 340 kDa (Zerbini & Zambolim, 1999).
Entretanto, ao analisar as proteínas produzidas in vivo
a partir do RNA de um potyvírus, observa-se mais de doze
proteínas, cuja soma dos pesos moleculares ultrapassa 600
kDa. A quantidade relativa de cada uma dessas proteínas varia
ao longo do tempo. Uma análise mais detalhada das proteínas
virais revela que, na verdade, a ORF é traduzida como uma
única proteína, que sofre autoproteólise, gerando cada uma
das proteínas virais (Zerbini & Zambolim,1999).
A
principal
conseqüência
desse
mecanismo
de
expressão genética é que todas as proteínas virais são
produzidas em quantidades estequiometricamente idênticas,
independente da necessidade de cada proteína específica pelo
vírus. Dessa forma, assumindo-se que a proteína capsidial é
aquela da qual mais cópias são necessárias (os potyvírus
possuem 2200-2600 cópias da proteína capsidial por partícula
viral), para cada partícula viral gerada durante a infecção,
deverão ser produzidas o mesmo número de cópias para todas
as outras proteínas virais (replicases, proteínas de movimento
célula-a-célula, etc.) (Zerbini & Zambolim, 1999).
Como o vírus não necessita de tal quantidade dessas
proteínas (por exemplo, apenas uma cópia da replicase pode
produzir centenas de cópias do genoma viral), elas se
acumulam na célula infectada na forma de inclusões (Zerbini &
Zambolim, 1999).
É razoável supor que a estratégia de replicação e
expressão do genoma dos potyvírus é extremamente danosa
para a célula hospedeira, que não apenas tem que fornecer
metabólitos para produção das proteínas virais, mas ainda
necessita fornecer parte desses metabólitos, que são na
prática desperdiçados pelo vírus. Não deve surpreender,
portanto, que as infecções por potyvírus sejam frequentemente
severas,
com
sintomas
características
de
mosaico
e
deformações foliares no hospedeiro (Zerbini & Zambolim,
1999).
A maioria das proteínas virais tem pelo menos uma
função estabelecida. Na verdade, muitas dessas proteínas têm
mais de uma função. As proteínas P1, HC-Pro, P3, CI, 6K2,
VPg-Pro (NIa) NIb de inclusão nuclear estão envolvidas na
replicação do RNA. P1, HC-Pro e P3 não são essenciais, mas
aumentam significativamente a taxa de replicação, sendo assim
consideradas fatores de amplificação do genoma viral (Zerbini
& Zambolim, 1999).
Uma característica marcante de proteínas produzidas
por potyvírus é sua natureza multifuncional. Todas as proteínas
possuem pelo menos duas funções, sendo que algumas têm
até quatro funções definidas. HC-Pro, por exemplo, está
envolvida na clivagem de poliproteínas, na transmissão por
afídeos, no movimento célula-a-célula e a longa distância e na
replicação do RNA. Para tanto, HC-Pro deve interagir com
diversas outras proteínas virais e do hospedeiro. Por, exemplo,
para a transmissão por afídeos, existem evidências diretas de
interação com a capa proteica. Para a replicação viral, devem
existir interações com as proteínas CI, VPg-Pro e NIb, e assim
por diante (Zerbini & Zambolim, 1999).
Um aspecto interessante das infecções por potyvírus
são os inúmeros relatos de interações sinergisticas entre
diferentes potyvírus, e também entre potyvírus e outros
gêneros ou famílias. Assim, vírus que normalmente não são
capazes de infectar determinados hospedeiros, ou que
infectam certos hospedeiros sem produção de sintomas
macroscópicos (por exemplo, PVX em batata, causando
infecção latente), passam a causar sintomas severos quando
são infectam simultaneamente com um potyvírus (PVX mais
PVY, causando mosaico rugoso em batata). Uma possível
explicação para esse fenômeno é a evidência recente de que a
proteína HC-Pro é responsável pela supressão da resposta da
planta à infecção por potyvírus, por mecanismos ainda não
esclarecidos.
Essa
disseminação
do
supressão facilitaria
vírus
na
planta.
A
a
replicação
proteína
e
HC-Pro
provavelmente atua inibindo um mecanismo geral de defesa da
planta, permitindo assim a infecção por outros agentes
semelhantes aos potyvírus (Zerbini & Zambolim, 1999).
2.4 Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W)
O PRSV-W é o vírus mais importante e também o mais
freqüente em cucurbitáceas no Brasil, podendo ser fator
limitante à produção. Infecta apenas espécies da família
Cucurbitáceae, sendo 40 espécies em 11 gêneros, além de
duas espécies da família Chenopodiaceae (Bedendo ,1995).
O PRSV-W está classificado na família Potyviridae,
gênero Potyvirus. Esse vírus é o agente causal do mosaico da
melancia Watermelon mosaic virus 1 (WVM-1), reclassificado
como uma estirpe do vírus da mancha anelar do mamoeiro
(Papaya ringspot virus - type Watermelon PRSV-W) (Bedendo,
1995).
Possui duas estirpes: estirpe P (Papaya ringspot virus),
que causa doenças isoladas em mamão e em algumas
cucurbitáceas e a estirpe W (Watermelon mosaic virus 1), que
causa uma
doença
importante
em
melancia e
outras
cucurbitáceas, mas não infecta o mamoeiro (Bedendo, 1995).
Os Potyvirus possuem RNA de fita simples e
apresentam partículas alongadas e flexuosas de 780 nm de
comprimento por 12 nm de diâmetro. O ácido nucléico é
constituído por uma fita simples positiva de RNA. Induz a
formação de inclusões citoplasmáticas e amorfas do tipo “catavento”. O vírus é transmitido de maneira não persistente por 24
espécies de afídeos, pertecentes a 15 gêneros. Não há
evidências de transmissão por sementes (Bedendo, 1995).
Entre os afídeos vetores encontram-se pulgões das
espécies Aphis gossypii e Myzus persicae que são, em geral,
consideradas as mais eficientes vetoras desses potyvírus.
Entretanto, dessas espécies, apenas a Aphis gossypii é
considerada praga de cucurbitáceas, colonizando plantas
dessa família, inclusive a melancia. Não há relatos de
transmissão de potyvírus por sementes de melancia. Entretanto
podem
ser
transmitidos
mecanicamente,
por
meio
de
instrumentos de corte (Rezende & Giampan, 2005).
Os isolados brasileiros do PRSV-W estão restritos às
espécies da família Cucurbitaceae. Embora experimentalmente
pode
causar
amaranticolor e
infecções
localizadas
em
Chenopodium
Chenopodium quinoa (Chenopodiaceae),
constituindo-se em excelentes indexadoras biológicas, porém
estas não funcionam como fonte de inóculo do vírus no campo
(Rezende & Giampan, 2005).
2.4.1 Sintomas
O PRSV-W pode infectar todas as cucurbitáceas e os
sintomas iniciais aparecem de sete a dez dias após a
inoculação.
Nas
primeiras
folhas
infectadas,
ocorre
o
amarelecimento entre as nervuras. Mais tarde, aparecem
sintomas de mosaico e de deformação de folhas. Plantas
infectadas
apresentam-se
atrofiadas,
os
frutos
podem
apresentar deformações e mudança de cor. Os sintomas
variam de acordo com a patogenicidade do isolado e com a
suscetibilidade do hospedeiro (Rezende & Giampan, 2005).
Em melancia, em cultivares suscetíveis os sintomas
são de mosaico, variando de verde claro a escuro, formando
bolhas (denominadas ilhas verdes) nas regiões onde há o
crescimento do limbo foliar sadio cercado por tecido foliar
infectado pelo PRSV-W (Figura 1).
Figura 1 Sintoma de mosaico e formação de “ilhas
verdes” causadas pelo PRSV-W, em melancia.
Os frutos, além de atrofiados, pequenos e em menor
número,
também
apresentam
bolhas
verdes
escuras
semelhantes às observadas nas folhas.
Em
variedades
de
abóbora
rasteira
(Cucurbita
moschata), os sintomas são menos evidentes e algumas vezes
passam despercebidos (Bedendo, 1995).
2.4.2 Controle
O manejo de viroses causadas por potyvírus em
plantios de melancia é muito difícil por causa da falta de
medidas eficazes de controle. A resistência ou tolerância
genética é considerada a melhor e mais eficiente forma de
controle de viroses em geral. Avaliações de germoplasmas de
melancia em relação a resistência genética à viroses têm
apresentado resultados promissores. (Azevedo et al., 1998;
Lima et al.,1999) relataram um acesso, PI 595201, com
significativo nível de tolerância ao mosaico causado pelo
PRSV-W. Hojo et al., (1991), avaliando 20 cultivares e híbridos
de melancia, identificaram apenas uma variedade selvagem, de
fruto amargo, denominada BT 8501, originária da África, com
tolerância ao mosaico causado pelo PRSV-W. Segundo Sittolin
(1998), esse acesso é também tolerante aos mosaicos
causados pelo ZYMV e WMV-2. A tolerância desse acesso aos
mosaicos causados por esses três potyvírus é conferido por
dois pares de genes recessivos. Também Strange et al.,
(2002), avaliaram a reação de 1.275 acessos de melancia
inoculados com o PRSV-W e constataram que as introduções
PI 244017, PI 244018, PI 482342, PI 234287 e PI 482303
foram as que apresentaram melhores níveis de tolerância.
Além desses, alguns acessos que possuíam comprovada
resistência aos outros potyvírus (ZYMV e WMV-2) também
apresentaram tolerância ao PRSV-W. Nesse caso, encontramse os acessos PI 482299, PI 482261, PI 595203, PI 255137
resistentes ao ZYMV; e PI 244018 e PI 244019 resistentes ao
WMV-2.
Apesar
desses
estudos,
até
o
momento,
aparentemente todos os cultivares de melancia disponíveis no
mercado brasileiro são suscetíveis a esses potyvírus e têm
pouca tolerância às doenças por eles causadas (Rezende &
Giampan, 2005).
Plantas transgênicas resistentes a vírus constituem
uma alternativa de controle de fitoviroses e têm apresentado
resultados promissores em cucurbitáceas. Entretanto, até o
momento, apenas o cultivar denominado Freedom II de C.
pepo transgênico resistente ao WMV-2 e ao ZYMV, produzido
pela
companhia
de
semente
Asgrow,
foi
liberado
comercialmente nos Estados Unidos. Diversas linhagens
transgênicas com resistência tripla (CZW-3), dupla (ZW-20) ou
simples (C-14, Z-33 e W-164) ao CMV, ZYMV e WMV-2
também foram desenvolvidas, porém não há relatos do seu uso
comercial. Também não há informações sobre melancias
transgênicas resistentes a qualquer um desses potyvírus.
Investigações
para
obtenção
de
melancia
transgênica
resistente ao PRSV-W encontram-se em andamento (Rezende
& Giampan, 2005)
O controle químico dos afídeos vetores, por meio de
pulverizações com inseticidas ou óleos minerais, para reduzir a
incidência dos mosaicos causados pelos potyvírus, não traz
bons resultados. De maneira geral, a eficiência dos inseticidas
na redução da incidência de vírus de relação não-persistente
com o vetor é baixa ou quase nula. Isso se deve provavelmente
ao fato de os inseticidas existentes não serem suficientemente
rápidos na eliminação dos afídeos antes da inoculação do vírus
na planta. Em alguns casos, a aplicação de inseticidas pode
até aumentar a incidência dos vírus de relação não-persistente,
devido à excitação causada pelos produtos durante as picadas
de prova dos afídeos A pulverização com óleo mineral também
não oferece a proteção desejada, podendo inclusive causar
fitotoxidez nas plantas (Rezende & Giampan, 2005)
A premunização das plantas com estirpes fracas do
vírus passou a ser considerada uma medida importante no
controle de viroses em cucurbitáceas a partir dos trabalhos com
o mosaico amarelo em abobrinha-de-moita (ZYMV) na França,
em Taiwan e na Inglaterra, e em melão nos EUA. Seu uso
comercial em abobrinha-de-moita já é conhecido no Havaí e
em Israel para o controle desse mosaico. No Brasil, essa
técnica mostrou-se eficiente para o controle do mosaico
causado pelo PRSV-W em abobrinha-de-moita (Cucúrbita pepo
cv. Caserta), em abóbora-rasteira (C. moschata cv. Menina
brasileira) e em abóbora híbrida do tipo Tetsukabuto (C.
máxima X C. moschata) (Rezende & Giampan, 2005).
Recentemente, com a seleção de uma estirpe fraca do
ZYMV (ZYMV-M), esta foi utilizada concomitantemente com
uma estirpe fraca de PRSV-W, para avaliar a eficiência da
dupla premunização para o controle dos mosaicos comum e
amarelo em abobrinha-de-moita em campo. Os resultados
foram satisfatórios, tanto no controle destas duas viroses em
abobrinha-de-moita como na produção de frutos comerciais
(Rezende & Giampan, 2005).
A premunização para o controle dos mosaicos
causados pelo PRSV-W e ZYMV em plantas de melancia
também foi investigada por Dias & Rezende (2000) e Giampan
(2003), porém os resultados não foram tão satisfatórios como
os descritos em outras cucurbitáceas. Apesar de as estirpes
fracas terem protegido as plantas contra as estirpes severas,
foi constatada uma certa dificuldade em infectar mudas de
melancia, especialmente com as estirpes fracas do PRSV-W.
Além disso, as plantas premunizadas apresentaram ligeira
redução na produção em relação àquelas que permaneceram
sadias em campo. Há necessidade de estudos adicionais para
viabilizar a premunização para o controle dos mosaicos comum
e amarelo em melancia (Rezende & Giampan, 2005).
2.5 Interação metabólicas (patógeno X hospedeiro)
As plantas e os patógenos evoluíram juntos. Os
patógenos desenvolveram mecanismos para atacar plantas e
essas desenvolveram defesa contra eles. Cada conjunto de
mecanismos usa informações do outro (Purves et al., 2002).
Os patógenos desenvolveram estratégias específicas
para explorar determinados hospedeiros. Alguns deles mantêm
um alto grau de intimidade com o hospedeiro e conseguem
desviar o metabolismo da célula em benefício próprio. O
exemplo clássico é observado nas viroses, onde as partículas
virais passam a controlar totalmente o metabolismo da célula
afetada (Pascholati & Leite, 1995).
Várias
enzimas
(quitinase,
glucanase,
glicosidase,
NADPH, oxidase e fenilalanina amonialiase) têm a produção
e/ou atividade alteradas nas plantas em resposta à presença
de patógenos. A participação da enzima num processo de
resistência deve ser vista com certa precaução. As mudanças
que ocorrem na reação de hipersensibilidade são similares às
reações em plantas não infectadas submetidas a um processo
de envelhecimento artificial (Pascholati & Leite, 1995).
2.5.1 Proteínas
As proteínas estão envolvidas em vários processos
metabólicos da planta, tais como no suporte estrutural, na
proteção, na catálise, no transporte, na defesa, na regulação e
no movimento. Entre as funções das moléculas listadas
anteriormente, somente o armazenamento de energia e a
hereditariedade
não
são,
normalmente
realizados
pelas
proteínas (Purves et al., 2002).
De particular importância são as enzimas, que
aumentam a velocidade das reações químicas nas células,
uma função conhecida como catálise (Purves et al., 2002).
Toda enzima possui um centro ativo, local onde se
processam as reações com determinados substratos. Esse
centro ativo é geralmente constituído de alguns resíduos de
aminoácido da cadeia de proteína e um grupo não protéico
sendo responsável pela atividade biológica da enzima. Enzimas
são, portanto na sua grande maioria, proteínas que catalisam
com grande eficiência as reações biológicas (Fatibello - Filho &
Vieira – Cruz, 2002).
Em muitos casos, os mecanismos de proteção
envolvem a indução de mecanismos de defesa, tais como o
acúmulo de fitoalexinas ou construção de barreiras estruturais.
As plantas portadoras de falha nestes mecanismos, acabam
sendo suscetíveis a diversos agentes patogênicos, incluindo os
vírus. A indução das reações de defesa das plantas é
presumivelmente mediada por um processo natural de
reconhecimento inicial entre a planta e o patógeno (Schons,
1997).
Schons et al. (1995) encontraram redução dos níveis
de proteínas em plantas de melancia infectadas com PRSV-W.
Schons et al. (2000) estudaram os níveis de proteínas
solúveis em diferentes cultivares de trigo infectados com o Soilborne
wheat
concentração
mosaic
maior
virus
em
(SBWMV)
plantas
e
observaram
sadias.
Resultados
semelhantes foram encontrados por Souza et al. (2005)
também em plantas de trigo infectadas pelo SBWMV.
Em diversas espécies de vegetais a infecção por vírus
é acompanhada pela síntese de várias proteínas, conhecidas
como proteínas relacionadas à patogêneses (“pathogenesis
related proteins – proteínas-PR”), codificadas pela planta
hospedeira.
A
indução
das
proteínas-PR,
ou
seja,
a
estimulação de sua síntese não é exclusividade dos vírus,
podendo ser causada por fungos ou bactérias e uma grande
diversidade de compostos químicos (Van Loon, citado por
Vega, 1991).
Na resposta da planta à infecção pelo patógeno podem
estar envolvidos muitos mecanismos de defesa, tanto estruturais
quanto
bioquímicos,
ambos
constitutivos
ou
induzidos
(Pascholati & Leite, 1995). As proteínas relacionadas à
patogênese, como a -1,3 glucanase e quitinase, são alguns dos
fatores bioquímicos de defesa que podem inibir ou prevenir o
desenvolvimento do patógeno nos tecidos dos hospedeiros
através de hidrólise das hifas invasoras (ação fungicida ou ação
antimicrobiana direta), com a conseqüente liberação de elicitores
oligossacarídicos a partir das paredes celulares fúngicas. Esses
elicitores podem também levar à ativação de outros mecanismos
locais ou sistêmicos de resistência nas plantas, caracterizando a
ação antimicrobiana indireta (Stangarlin & Pascholati, 2000).
Segundo Antoniw et al. (1980), estas proteínas são
denominadas proteínas-PR e são induzidas em várias espécies
de plantas infectadas por patógenos diversos. A indução dessa
proteína está associada com a resistência à multiplicação do
vírus e sua função no mecanismo de defesa ao patógeno tem
sido proposta (Schons, 1997).
2.5.2 Proteínas relacionadas à patogênese
A resistência de plantas à doenças está associada a
um conjunto de respostas de defesa ativadas, envolvendo vias
de transdução de sinal integradas. A ativação dessas respostas
em plantas depende da habilidade do hospedeiro em
reconhecer o patógeno e iniciar, subseqüentemente, o
mecanismo de defesa que limita a infecção. A resistência se
manifesta
freqüentemente
como
uma
resposta
de
hipersensibilidade, que resulta na morte celular localizada no
sítio de penetração do patógeno. Nesse processo, as células
da planta ao redor do sítio de infecção sofrem necrose rápida,
sendo que esta resposta esta associada a um conjunto
coordenado e integrado de alterações metabólicas que visam
impedir o desenvolvimento do patógeno (Van Loon & Van
Strien, 1999).
A alteração do fluxo de íons através da membrana
celular vegetal, a produção de espécies ativas de oxigênio,
mudanças no estado de fosforilação de proteínas reguladoras e
ativação da transcrição de sistemas de defesa das plantas
culminam na morte celular no sítio de infecção em alterações
estruturais e na produção ampla e variada de moléculas de
defesa, tais como fitoalexinas e proteínas antimicrobianas.
Novas proteínas, codificadas pelo hospedeiro são sintetizadas
e se acumulam nos tecidos vegetais infectados e são
induzidas, também, sistemicamente, sendo referidas como
proteínas relacionadas á patogênese (PRs) (Van Loon & Van
Strien, 1999).
As PRs são definidas como proteínas codificadas pela
planta hospedeira e induzidas especificamente em um estado
patológico ou em situações correlatas. Entende-se por relações
correlatas a processos infecciosos, os estados induzidos em
plantas por agentes químicos ou físicos que simulam o efeito
de patógenos. De fato, o acúmulo de proteínas-PR em plantas
tem sido observado não apenas após o ataque de patógenos
ou parasitos como nematóides ou insetos fitófagos e
herbívoros, como também em resposta ao tratamento com
compostos químicos ou estresse abiótico (Van Loon et al.,
1994).
A indução de proteínas-PR tem sido observada em
várias espécies de plantas pertencentes a diferentes famílias,
sugerindo um papel geral para essas proteínas na adaptação
às condições de estresse biótico ou abiótico (Van Loon & Van
Strien, 1999), (Figura 2).
Várias PRs apresentam atividades antimicrobiana in
vitro e/ou in vivo, e freqüentemente tem sido sugerido que o
conjunto total de PRs pode ser efetivo em inibir o crescimento,
multiplicação de patógenos e/ou desenvolvimento nos tecidos
vegetais (Van Loon, 1997).
Figura 2 Representação esquemática da ação de PRs em
plantas atacados por patógenos (Purves, 2002).
As PRs não estão necessariamente presentes durante
todos os estágios da patogênese e nem todas possuem um
papel efetivo na defesa das plantas. Em contraste com a
maioria de outras proteínas de estresse, as PRs se acumulam
em tecidos vegetais em níveis altos, representando a maior
parte da alteração quantitativa das proteínas solúveis que
ocorre
no
processo
de
defesa,
podendo
alcançar
individualmente até 1% da concentração das proteínas totais
solúveis em folhas (Van Loon, 1997).
As PRs foram descritas inicialmente em folhas de fumo
(Nicotiana tabacum) infectadas com o Tobacco mosaic virus
(TMV) (Van Loon & Van Kammen, 1970), sendo definidas como
proteínas ácidas, de baixo peso molecular, resistentes à
proteases, solúveis em ácido e localizadas no espaço caráter
básico. A maioria das proteínas-PR são acumulada no espaço
intercelular ou no vacúolo. Embora em plantas de fumo as PRs
ácidas sejam geralmente extracelulares e as básicas se
encontrem no vacúolo, este fato não é verdadeiro para todas
as espécies de plantas. As PRs do vacúolo parecem exercer
um
efeito
nas
reações
descompartimentalização
da
de
célula,
defesa
enquanto
após
a
que
as
intercelulares estariam em contato direto com o patógeno após
sua penetração nos tecidos vegetais (Sticher et al.,1997).
A maioria das PRs possuem peptídeos-sinal na região
N-terminal, responsável por sua translocação através da
membrana do retículo endoplasmático para o vacúolo ou para
o espaço intercelular (Guzzo, 2003).
Pode ocorrer também a expressão constitutiva de
várias PRs, especialmente básicas, as quais têm sido
encontradas em tecidos sadios e em determinados órgãos da
planta ou em estádios específicos do desenvolvimento vegetal.
Altos níveis de algumas PRs encontrados em raízes, folhas em
senescência e durante o florescimento, sugerem que a
produção é também regulada nos processos normais do
desenvolvimento vegetal (Guzzo, 2003).
Van Loon et al. (1994) propuseram uma nomenclatura
unificada
para
a
classificação
das
proteínas-PR,
compreendendo 11 famílias de proteínas. Atualmente, são
conhecidas 17 famílias de PRs detectadas em diferentes
espécies vegetais. Os vários membros de uma família possuem
atividades
biológicas
substancialmente
em
similares,
outras
mas
podem,
propriedades,
tais
diferir
como,
especificidade de substrato, propriedades físico-químicas ou
localização na célula vegetal (Fritig et al.,1998).
2.5.3
A
-1,3 glucanase
-1,3 glucanase se classifica na família PR-2 e é
constituída por endo
-1,3 glucanases, que apresentam
atividade enzimática in vitro hidrolisando
-1,3 glucanas. São
agrupadas em pelo menos três classes distintas, baseando-se
nas seqüências de aminoácidos de suas estruturas primárias:
as glucanases da classe I são proteínas básicas de cerca de
33 kDa e estão localizadas no vacúolo da célula vegetal,
especialmente na epiderme das folhas inferiores e nas raízes
de plantas sadias, ao passo que as classes II e III incluem,
principalmente,
as
proteínas
ácidas
extracelulares
(Selitrennikoff, 2001).
As proteínas da classe I apresentam uma diferença
estrutural principal em relação às demais, necessitando ser
previamente processadas, incluindo a remoção de uma
extensão carboxiterminal, para apresentar atividade enzimática.
As proteínas da família PR-2 têm sido encontradas em uma
ampla
variedade
de
plantas
incluindo
fumo,
tomate
(Lycopersicom esculentum Mill), trigo (Triticum aestivum),
cevada (Hordeum vulgare), ervilha (Pisum sativum), pimentão
(Capsicum annuum L.), feijão (Phaseolus vulgars L.), café
(Coffea arabica) e Arabidopsis thaliana (Guzzo & Martins, 1996;
Sticher et al., 1997; Fritig et al., 1998, Stangarlin & Pascholati,
2000).
Proteínas da família PR-2 foram bem caracterizadas
em plantas de fumo e tomate. Cinco
-1,3-glucanases
pertencentes às classes I, II ou III foram isoladas de fumo e
designadas PR-2a, -b, -c, -d, -e, sendo na sua maioria ácidas,
excetuando-se
a PR-2e que apresenta caráter
básico.
Possuem massa molecular de 31 a 35 kDa, sendo que a PR-2a
de N. tabacum foi considerada como membro representativo
das proteínas PR-2 (Antoniw et al., 1980; Van Loon et al.,
1994).
As
-1,3 glucanases apresentam atividade antifúngica
amplamente demonstrada por ensaios in vitro e in vivo,
sugerindo uma função na defesa de plantas contra doenças
(Sticher et al., 1997; Fritig et al., 1998). A atividade
antimicrobiana destas enzimas, presentes em plantas, é
decorrente, possivelmente, de sua ação catalítica na hidrólise
do polímero
-1,3 glucana, componente estrutural da parede
celular de muitos fungos. Sua ação catalítica, particularmente
na extremidade de hifas onde a glucana está mais exposta,
acarreta um enfraquecimento da parede, resultando na lise e
morte celular de fitopatógenos (Fritig et al., 1998; Selitrennikoff,
2001).
Foi demonstrada a ação hidrolítica in vitro de
glucanases
nas
paredes
celulares
de
alguns
-1,3
fungos
fitopatogênicos (Madamanchi & Kuc, 1991). Young & Pegg
(1982) verificaram que -1,3 glucanase, isoladas de tomateiro,
degradaram in vitro a parede celular de Verticillium albo-atrum,
sendo que a ação hidrolítica foi estimulada sinergisticamente
por quitinases. Foi verificado, também, que uma
-1,3-
glucanase básica (34 kDa), isolada de caule de pimentão após
indução pelo tratamento com cloreto de mercúrio, inibiu o
crescimento das hifas do fungo Phytophthora capsici, que não
contém quitina (Kim & Hwang, 1997). Entretanto, não mostrou
atividade antifúngica contra fungos que contém quitina como,
Alternaria mali, Colletotrichum gloeosporioides, Magnaporthe
grisea e Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum.
Concentrações mais elevadas da
-1,3 glucanase,
homóloga a PR-2b de tomate, provocaram a lise de células da
hifa e de zoósporos de P. capsici. Além disso, foi constatada
uma ação sinergística da
-1,3 glucanase na inibição do
crescimento da hifa de F.oxysporum f.sp. cucumerinum e P.
capsici, quando combinada com uma quitinase básica isolada
de pimentão (32 kDa) (Kim & Hwang, 1997). Kang &
Buchenauer (2002), utilizando técnicas imunológicas de
marcação com partículas de ouro, observaram um acúmulo
maior de -1,3 glucanase e quitinase em tecidos de espigas de
trigo de um cultivar resistente inoculados com Fusarium
culmorum, quando comparado com uma interação compatível.
Nos tecidos infectados do cultivar resistente de trigo, foi
observado um aumento na deposição dessas PRs junto à
parede celular das hifas do patógeno e entre a parede celular
do hospedeiro e as células das hifas, sugerindo que o acúmulo
de
-1,3
glucanase
e
quitinase
pode
estar
envolvido
diretamente na resistência contra F. culmorum (Kang &
Buchenauer, 2002). Por outro lado, as -1,3 glucanases podem
apresentar uma ação indireta contra fitopatógenos, através da
digestão parcial de polissacarídeos da parede celular de fungos
e
do
hospedeiro
com
a
conseqüente
liberação
de
oligossacarídeos, que agem como elicitores capazes de
desencadear outras respostas de defesa em plantas (Chang &
Handwiger, 1992; Zhu et al., 1994; Hahn, 1996).
O acúmulo e a síntese de -1,3 glucanases em tecidos
vegetais têm sido freqüentemente associados aos mecanismos
de defesa de plantas contra doenças, uma vez que podem ser
desencadeados por patógenos, metabolitos provenientes de
microrganismos ou substâncias químicas que agem como
indutores de resistência (Kombrink & Hahlbrock, 1986; Roulin &
Buchala, 1995).
Stangarlin & Pascholati (2000) descreveram que em
fejoeiro, os valores da atividade enzimática para a 2° folha
trifoliolada
(testemunha
não
infectada
por
não-inoculada),
constitutivamente,
o
cultivar
foi
Uromyces
possível
Carioca
appendiculatus
observar
que,
(moderadamente
suscetível) apresentou valores 15% e 9% maiores de
-1,3
glucanase e quitinase, respectivamente em relação o cultivar
Rosinha (altamente suscetível). Aparentemente, no cultivar
Rosinha, a indução dessas enzimas só ocorre quando a
colonização do fungo é intensa, uma situação na qual poderia
haver liberação de elicitores que, nesse cultivar, seriam
requeridos em alta concentração para induzir a síntese das
hidrolases.
Em plantas de melancia, Binotto-Missiura et al. (2004)
observaram que a cultivar Fair fax (moderadamente suscetível
ao PRSV-W), quando inoculada com o PRSV-W, apresentou
atividade da -1,3 glucanase, seis vezes mais elevada quando
comparada a cultivar resistente.
Plantas de pepino (Cucumis sativus) infectadas com
Cladosporium cucumerinum a atividade da
-1,3 glucanase
aumentada significativamente, formando uma deposição de
lignina aumentando a barreira física contra a infecção pelo
patógeno (Zhao et al., 2005).
Beffa et al. (1996) destacam que as lesões locais
causadas pelo TMV, em fumo cv. Havana 425 formam uma
barreira física para a replicação viral e aumento da atividade da
-1,3 glucanase, sugerindo este trabalho que a suscetibilidade
do cultivar ao vírus resulta em aumento da atividade enzimática
intensificando a resposta de defesa à infecção .
2.5.4 Peroxidase
Peroxidases são enzimas de ocorrência natural em
plantas e suas funções podem ser variadas. São compostas de
aproximadamente 25% de carboidrato, que as protegem da
degradação proteolítica e estabilizam a conformação protéica
(Schons, 1997).
Siegel (1993) relatou que, em condições de estresse,
as plantas produzem elevadas quantidades de peroxidase,
sendo esta uma das primeiras enzimas a alterar a sua
atividade, sem restrição de substratos utilizados ou do tipo de
estresse aplicado. A causa exata deste aumento da atividade é
ainda desconhecido, porém existem evidencias, que em alguns
casos ocorra síntese “de novo”do metabolismo secundário.
Em condições adversas, a planta responde com a
elevação imediata na atividade da peroxidase, sendo uma das
primeiras enzimas a ser ativada, por isso, em muitos casos é
utilizada como um indicador de estresse (Andreeva, 1989).
Segundo Campa (1991), a peroxidase catalisa a
oxidação pelo peróxido de hidrogênio de alguns substratos
como mono e difenóis, polifenóis, aminofenóis, entre outros. É
conhecida como a enzima termoestável que pode ter atividade
regenerada após tratamento térmico. Diversas são as fontes
dessa
enzima
como
pêssego,
tomate,
soja,
rabanete,
abobrinha, nabo e aspargo (Fatibello-Filho & Vieira-Cruz,
2002).
O aumento na permeabilidade da membrana durante a
infecção viral é acompanhada pelo aumento de radicais livres e
ativação de diversas enzimas, entre elas a peroxidase
(Andreeva, 1989).
Em
folhas
de
batata
(Solanum
tuberosum
L.),
infectadas pelo Potato virus X (PVX), houve aumento na
atividade específica da peroxidase (Melik-Sarkisov et al., 1991).
Fato semelhante havia sido observado por Loebenstein &
Linsey, citado por Schons (1997), em folhas de fumo infectadas
com o PVX e TMV.
O efeito da infecção com o Bean common mosaic virus
(BCMV), sobre a atividade enzimática do feijão (Phaseolus
vulgaris L.) foi analisado por Suresh et al. (1988). Os autores
observaram que a atividade da peroxidase e polifenol oxidase
foi sensivelmente maior em plantas infectadas com o vírus
quando comparadas às plantas sadias.
Conforme Schons (1997), plantas de batata dos
cultivares Achat, Duvira e Bintje infectadas com o Potato leafroll
virus (PLRV), apresentaram maior atividade da enzima quando
comparadas às sadias. O que também foi observado em
plantas de trigo (Schons et al., 2000) infectadas com SBWMV
Souza et al. (2005), também observaram que em quatro
cultivares de trigo (BRS 194, BRS179, BRS GUABIHU, BR23)
e a linhagem PF 980524, infectados com o SBWMV, a
atividade da peroxidase aumentou em função da doença.
Em plantas de soja (Glicyne max M.) submetidas a
diferentes temperaturas e infectadas com o Soybean mosaic
virus (SMV), Vega (1991) observou aumento na atividade da
peroxidase, independente da temperatura.
Em uma variedade de tomate (Lycopersicum esculentum
M.) suscetível ao Potato virus Y (PVY), não foram observadas
variações significativas na atividade da peroxidase, enquanto
que na variedade resistente a atividade da enzima aumentou
gradativamente atingindo valores máximos aos 40 dias após a
inoculação (Behl & Chowfla, citados por Schons,1997).
2.5.5 Açúcares totais
Do ponto de vista fisiológico, uma infecção viral de
forma sistêmica pode diminuir a concentração de clorofila na
maioria dos casos (Leal & Lastra,1984). A diminuição da clorofila
parece estar relacionada com a destruição dos cloroplastos em
plantas infectadas por vírus (Ayandru & Sharma, 1982). Também
tem sido observado o decréscimo na fixação de CO2 e,
conseqüentemente, da taxa fotossintética em plantas com
infecção viral (Leopardi & Pérez-de-Acosta, 1992). Por outro
lado, dependendo da relação estabelecida entre o patógeno e o
hospedeiro a infecção viral pode provocar o aumento na
concentração de açúcares nas folhas infectadas, possivelmente
pela dificuldade de translocação dos fotoassimilados para o
restante da planta (Leal & Lastra,1984).
Em uma variedade de tomate resistente ao PVY, Behl
& Chowfla (1991) não observaram alterações nos níveis de
açúcares após a infecção, entretanto na variedade suscetível ao
vírus os mesmos autores observam uma redução significativa
nos níveis de açúcares totais e redutores.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Local de execução
O experimento foi conduzido em condições semicontroladas na estufa plástica da Faculdade de Agronomia e
Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo.
3.2 Material vegetal
Foram utilizados quatro cultivares de melancia, sendo
Vidasul congo (resistente - R), Fair fax (moderadamente
resistente - MR), Crimson sweet (moderadamente sucetível MS), e Charleston gray (sucetível - S).
3.3 Delineamento experimental
O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado,
modelo fatorial 3x5x2, utilizando-se dois tratamentos (plantas)
sadias e infectadas com o PRSV-W) com cinco repetições,
sendo que cada vaso com duas plantas foi considerado uma
repetição em três cultivares de melancia.
3.4 Obtenção do inóculo de PRSV-W e inoculação em
plantas de melancia
Para a obtenção do PRSV-W foi coletado material
vegetal (folhas) de plantas de abóbora caserta com sintomas
severos da virose, as quais foram testadas por Elisa e
posteriormente maceradas e usadas como fonte de inóculo
para o experimento.
As folhas cotiledonares das plantas de melancia foram
polvilhadas com abrasivo (carburundum, 600 meshes) e
friccionadas com um cotonete contendo o extrato vegetal
infectado.
3.5 Condução do experimento
As sementes foram distribuídas em vasos de polietileno
com capacidade de 4 kg de substrato, constituído de solo
peneirado e adubado de acordo com a recomendação para a
cultura.
3.6 Determinações
Aos trinta e cinco dias após a inoculação do vírus
coletaram-se 500 mg de tecido foliar por vaso e determinaramse os níveis de infecção (Abs 405 nm) pelo PRSV-W através do
teste de Elisa Indireto com o objetivo de confirmar a eficiência
da inoculação e procedeu-se as demais análises bioquímicas.
3.6.1 Teores de proteínas solúveis
A quantidade de proteínas solúveis foi determinada no
extrato enzimático, descrito para a Peroxidase, de acordo com
o método de Bradford (1976).
O meio de reação continha 0,1 mL de estrato
enzimático, 0,5 mL do reativo de Bradford, seguido de repouso
por 5 minutos. As leituras de absorbância foram efetuadas em
espectrofotômetro a 595 nm, as quais foram comparadas com
a curva padrão de caseína.
3.6.2. Atividade da -1,3 glucanase
Para determinar a atividade de
utilizou-se o método descrito por
-1,3 glucanase,
Stangarling & Pascholati,
2000, conforme descrito a seguir.
Amostras de 500 mg de tecido foliar, foram maceradas
em 4 mL de tampão acetato de sódio 100 mM (pH 5,0)
colocados em tubos de ensaio. O extrato foi centrifugado a
10.000 g-1 (25 min, 4 ºC). O sobrenadante foi utilizado para
determinar a atividade da -1,3 glucanase e também os teores
de proteínas solúveis.
A atividade da
-1,3 glucanase foi determinada pela
quantidade colorimétrica de glicose liberada da laminarina,
através
do
uso
da
HAPHB
(hidrazida
do
ácido
p-
hidroxibenzóico). A mistura da reação, foi incubada a 40 ºC por
1 h, contendo 50
L de laminarina (4,0 mg/mL). Após esse
período, foram acrescentados 1,5 mL de solução HAPHB (0,5 g
dissolvidas em 10 mL de HCl 0,5 M, acrescidos de 40 mL de
NaOH 0,5 M), sendo em seguida essa mistura aquecida a 100
ºC por 5 min.
Após o resfriamento em gelo, procedeu-se a leitura em
espectrofotômetro (absorbância a 405 nm). As leituras de
absorbância foram comparadas com a curva padrão de glicose
e os resultados expressos em Katal (Kat)/mg de proteína, no
qual 1 kat é definido como a quatidade de enzima capaz de
liberar 1 Mol equivalente de Glicose/ segundo de incubação,
sob as condições experimentais.
3.6.3 Atividade da peroxidade
Para determinação da atividade da peroxidase foi
utilizada uma adaptação do método de Allain et al.(1974), feita
por Schons (1997).
O
extrato
enzimático
foi
obtido
através
da
homogeneização de 400 mg de tecido foliar fresco em 4 mL de
tampão PO4, 0,2 M, pH 6.7 (gelado), seguido de centrifugação
por 5min a 5600 g-1, a 4 ºC.
O sistema de reação continha 0,1 mL de extrato
enzimático, 0,9 mL de tampão; 0,5 mL de solução de Peróxido
de Hidrogênio (H2O2) a 30%, 0,5 mL de solução de diclorofenol
e aminoantipirina (163mg de diclofenol + 81,3 mg de
aminoantipirina em 100 mL de água destilada). Os tubos de
ensaio contendo o sistema de reação foram mantidos em
banho-maria a 30 °C por 5 minutos, sendo a reação
interrompida pela adição de 2 mL de etanol absoluto. A leitura
de
absorbância
foi
realizada
imediatamente,
em
espectrofotômetro a 505 nm. Para encontrar o valor da
atividade específica da peroxidase (PO) o valor foi dividido pela
proteína correspondente Mol de H2O2 decomposto/min.mg de
proteínas, utilizando-se a fórmula proposta por Schons, 1995:
Po = L x VT / 6,58 x T
Sendo:
Po = unidade da atividade da peroxidade
L = leitura (em absorbância)
VT = volume total da reação (2mL)
T = tempo da reação
6,58= absortividade molar do composto colorido
3.6.4 Teores de açúcares totais
Os açúcares totais foram determinados por uma
adaptação do método descrito por Dubois et al. (1956).
Retiraram 500 mg do material vegetal macerado em tampão
PO4 , 0,2 M, pH 6,7. O meio de reação continha 0,1 mL de
estrato aquoso, 0,4 mL de tampão PO4, 0,2 M, pH 6,7, 0,5 mL
de fenol a 5% e após agitação adiciono-se 2,5 mL de ácido
sulfúrico concentrado. Após 20 min procedeu-se a leitura de
absorbância (espectrofotômetro a 490 nm), sendo que os
resultados foram comparados com a curva padrão de glicose.
3.6.5 Tratamento dos dados e análise estatística
A análise dos dados foi feita através do teste f (SAS) e
para as médias com diferenças significativas aplicou-se o teste
de Tukey (5%).
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na Tabela 1, observa-se que nos quatro cultivares de
melancia, as plantas sadias, apresentaram teores de proteínas
significativamente mais elevadas quando comparadas às
infectadas pelo PRSV-W. Estes resultados confirmam os
encontrados por Schons et al. (1995), também em plantas de
melancia e ainda em diferentes cultivares de trigo infectados
com o SBWMV Schons et al., (2000)
Tabela 1 - Teores de proteínas solúveis em folhas de melancia
infectadas com o PRSV-W e respectivos controles
sadios.
Teores de proteínas solúveis
Cultivares
(mg de proteína / g de massa fresca)
Infectada
Sadia
Médias
Vidasul congo (R)
B 8,18 a
A 15,07 a
11,62
Fair fax (MR)
B 5,91 b
A 12,86 a
9,38
Crimson sweet (MS)
B 5,03 b
A 12,27 b
8,65
Charleston gray (S)
B 3,96 b
A 9,35 c
6,65
5,77
12,38
Médias
C.V.(%)
14,15
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e
precedidas de mesma letra maiúscula na linha, não diferem
entre si pelo teste de Tukey a 5%.
Resultados semelhantes foram encontrados por Leal &
Lastra (1984) em plantas de tomate infectadas por PVY, e por
Souza et al. (2005) em plantas de trigo infectadas por SBWMV.
Contrariando esses resultados Schons (1997) observou
aumento nos teores de proteínas em plantas de batata
infectadas pelo PLRV e também Abu-Jawdah & Kummert
(1983) em plantas de feijão infectadas pelo vírus do mosaico
da alfafa. Van Loon & Van Kammer (1970) observaram
aumento nos teores de proteínas em plantas de fumo
infectadas com o TMV em um cultivar com reação de
hipersensibilidade ao vírus.
Os
resultados
encontrados
no
presente
estudo
mostram que o cultivar Vidasul congo (R) foi o que apresentou
maiores teores de proteínas tanto nas plantas infectadas
quanto nas sadias, embora haja diferença significativa quando
comparadas as duas condições, sendo que os teores de
proteínas mais elevados são observados nas plantas sadias.
Por outro lado, o cultivar Charleston gray (S) foi o que
apresentou os menores teores de proteínas, inclusive nas
plantas sadias embora a diferença significativa entre as plantas
sadias e infectadas sejam mantidas. Nos cultivares Fair fax
(MR) e Crimson sweet (MS), os valores foram intermediários,
mantendo, entretanto, a mesma tendência.
Teores mais elevados de proteínas em plantas sadias e
maior
concentração
nos
cultivares
resistentes
e
moderadamente resistentes sugerem que as proteínas estão
efetivamente envolvidas nos mecanismos de defesa da planta
contra o ataque de patógenos, no caso, o vírus, mas que é
dependente
da
relação
patógeno
X
hospedeiro.
Esta
observação justifica a diferença nos resultados encontrados por
outros autores, tendo em vista que os vírus de translocação
rápida pelo floema parecem ter relação inversa aos níveis de
translocação lenta, de célula-célula como é o caso dos
potyvírus.
O fato de os teores de proteínas apresentarem-se mais
elevados no cultivar resistente, mesmo nas plantas sadias e
por outro lado teores reduzidos de proteínas no cultivar
suscetível, nas mesmas condições, sugere que a determinação
dos teores de proteínas solúveis pode constituir-se em uma
ferramenta interessante para a determinação de resistência ou
suscetibilidade,
após
conhecer
a
relação
patógeno
X
hospedeiro.
Os resultados apresentados na Tabela 2 sugerem que
-1,3 glucanase está ligada a função de defesa de plantas
contra doenças, inclusive virais como a causada pelo PRSV-W.
Os quatro cultivares de melancia infectados com o PRSV-W,
apresentaram alta atividade da
-1,3 glucanase, quando
comparadas às plantas sadias.
A maior atividade da -1,3 glucanase foi observada no
cultivar Charleston gray, suscetível ao PRSV-W seguido de
Crimson sweet, moderadamente suscetível. A menor atividade
da enzima foi o cultivar resistente Vidasul congo. A tendência
se manteve em relação às plantas sadias, entretanto, quanto
mais suscetível o cultivar maior foi a diferença na atividade da
-1,3 glucanase entre plantas sadias e infectadas. Sendo a 1,3 glucanase uma enzima relacionada com os mecanismos de
defesa das plantas, ficou clara a maior ativação da enzima no
cultivar suscetível e moderadamente suscetível em relação aos
cultivares resistentes e moderadamente resistentes e também
em relação às plantas sadias.
No caso do ataque de fungos como Cladosporium
cucumerinum em plantas de pepino,
observaram que a atividade da
significativamente,
formando
Zhao et al. (2005)
-1,3 glucanase aumenta
uma
deposição
de
lignina
aumentando a barreira física contra a infecção pelo patógeno.
Tabela 2 - Atividade da
1,3 - glucanase em folhas de
melancia infectadas com o PRSV-W e respectivos
controles sadios.
Atividade da 1,3- Glucanase (Kat)/mg
de proteínas
Cultivares
Infectadas
Sadias
Médias
Vidasul congo (R)
A 3,3 b
B 1,8 b
2,5
Fair fax (MR)
A 4,9 b
B 2,1 b
3,5
Crimson sweet (MS)
A 5,7 a
B 2,2 b
3,9
Charleston gray (S)
A 7,1 a
B 2,9 a
5,0
5,2
2,2
Médias
C.V.(%)
23,9
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e
precedidas de mesma letra maiúscula na linha, não diferem
entre si pelo teste de Tukey a 5%.
Também Stangarlin & Pascholati (2000), em plantas de
feijão infestadas com o fungo Uromyces appendicufatus,
observaram incremento na atividade da
-1,3 glucanase em
relação às plantas sadias, sugerindo que a
-1,3 glucanase,
classificada como uma PR-Proteínas, atua no mecanismo de
defesa das plantas em função da infecção por patógenos
diversos.
Os resultados encontrados no presentes estudo estão
de acordo com os encontrados por Beffa et al. (1996), os quais
observaram aumento na atividade da
-1,3 glucanase em
plantas de fumo (cultivar com reação de hipersensibilidade)
infectadas pelo TMV, indicando que quanto maior o grau de
suscetibilidade da planta ao patógeno maior será a atividade da
enzima em função da doença.
Poucos trabalhos foram encontrados estudando a
relação da atividade da
-1,3 glucanase com infecções
causadas por vírus em plantas. Entretanto, após a realização
do presente estudo, é possível inferir também as doenças de
etiologia viral a afirmação de Kombrink & Hahlbrock, (1986);
Roulin & Buchala (1995), de que o acúmulo e a síntese de 1,3 glucanase em tecidos vegetais têm sido freqüentemente
associado aos mecanismos de defesa de plantas contra
doenças.
A atividade da peroxidase foi aproximadamente cinco
vezes mais elevada nas plantas infectadas pelo PRSV-W, em
todos os cultivares quando comparadas às sadias (Tabela 3). O
cultivar Charlenston gray (sucetível) foi o que apresentou maior
atividade da enzima, diferindo significativamente dos demais
cultivares, sendo que neste cultivar a atividade da peroxidase
foi o dobro em relação ao cultivar resistente Vidasul congo.
Esses resultados indicam o forte estresse sofrido pelas
plantas de melancia em função da infecção pelo PRSV-W,
tendo em vista que, de acordo com Andreeva (1989), a
peroxidase é uma das primeiras enzimas a ser ativada na
interação.
Tabela 3 - Atividade da peroxidase em folhas de melancia
infectadas com o PRSV-W e respectivos controles
sadios
Atividade da peroxidase ( Mol H2O2
decomposto por min/mg de proteínas)
Cultivares
Infectadas
Sadias
Vidasul congo (R)
A 27,48 b
B 6,01 b
16,74
Fair fax (MR)
A 24,31 b
B 5,44 b
14,87
Crimson sweet (MS)
A 23,65 b
B 4,75 b
14,20
Charleston gray (S)
A 56,76 a
B 10,21 a
33,48
33,05
6,60
Médias
C.V.(%)
Médias
24,38
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e
precedidas de mesma letra maiúscula na linha, não diferem
entre si pelo teste de Tukey a 5%.
O fato de haver maior atividade da peroxidase nas
plantas infectadas indica também que ocorreu um grande
acúmulo de H2O2 nos tecidos das plantas de melancia
infectadas pelo PRSV-W, induzindo a planta a aumentar a
atividade da enzima, a fim de decompor a H2O2 acumulada e
manter a integridade dos tecidos. Quanto mais suscetível é o
cultivar ao ataque do patógeno maiores serão os danos por ele
causados, e entre estes danos ficou evidente que o acúmulo de
H2O2 ,em altos níveis, é tóxico para a planta, motivo pelo qual a
peroxidase
tem
sua
atividade
aumentada,
minimizar o impacto da doença sobre a cultura.
objetivando
Confirmando os resultados encontrados no presente
estudo, Suresh et al. (1988) observaram aumento na atividade
da Peroxidase em plantas de feijão infectadas pelo Bean
common mosaic virus (BCMV).
Também Schons (1997) observou que plantas de
batata infectada pelo PLRV apresentaram maior atividade da
enzima quando comparadas às sadias. Em outro trabalho,
Schons et al. (2000) e Souza et al. (2005), mostraram que
plantas de trigo infectadas com o SBWMV apresentaram maior
atividade da peroxidase quando comparadas às sadias.
Em plantas de soja (Glicyne max M.) submetidas a
diferentes temperaturas e infectadas com o Soybean mosaic
virus (SMV), Vega (1991) observou aumento na atividade da
peroxidase, independente da temperatura, indicando que o
fator de infecção viral foi preponderante.
Os níveis de açúcares totais foram de maneira geral
mais elevados nas plantas sadias quando comparadas às
infectadas pelo PRSV-W (Tabela 4), sendo que dos quatro
cultivares estudados apenas o cv. Crimson sweet (MS) não
apresentou diferenças significativas entre plantas sadias e
infectadas. A menor concentração de açúcares totais foi
observada no cultivar Vidasul congo (R) tanto nas plantas
sadias quanto nas infectadas indicando que a cultivar
resistente é mais eficiente na translocação de fotoassimilados
para o restante da planta, minimizando o acúmulo nas folhas.
De acordo com os relatos de Schons (1997), também em
plantas de batata foram observados níveis menores de
açúcares totais no cultivar resistente ao PLRV. Os resultados,
entretanto, não deixam claro a relação de teores de açúcares
com níveis de resistência.
Tabela 4 – Teores de açúcares totais em folhas de melancia
infectadas pelo PRSV-W e respectivos controles
sadios.
Açúcares totais (mg de glicose/ g de
MF)
Cultivares
Infectadas
Sadias
Médias
Vidasul Congo (R)
B 1157 b
A 1432 b
1294,5
Fair fax (MS)
B 1443 a
A 1716 a
1579,5
Crimson sweet (MR)
A 1571 a
A 1864 a
1717.5
Charleston gray (S)
B 1275 b
A 1627 a
1451.5
1361,5
1659,7
Médias
C.V.(%)
11,5
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e
precedidas de mesma letra maiúscula na linha, não diferem
entre si pelo teste de Tukey a 5%.
De acordo com os dados obtidos pode-se constatar
maior acúmulo de açúcares nas plantas de melancia sadias
quando comparadas às infectadas pelo PRSV-W, tendo em
vista que neste caso, nas plantas infectadas ocorre formação
de mosaico nas folhas, caracterizado pela destruição dos
cloroplastos, conforme descreveram Ayandru & Sharma (1982).
Com a conseqüente redução da taxa fotossintética é coerente
inferir que a disponibilidade de fotoassimilados é menor nas
plantas infectadas quando comparadas às sadias, razão pela
qual também os teores de açúcares totais são menores.
5 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram
concluir que:
•
Os teores de proteínas solúveis e a atividade da
-1,3
glucanase podem ser utilizados como indicadores
bioquímicos de resistência e ou suscetibilidade ao
PRSV-W em plantas de melancia;
•
A atividade da peroxidase é uma indicadora do estresse
oxidativo sofrido pela planta em função da infecção viral;
•
Embora, tenha sido observado teores maiores de
açúcares nas plantas sadias em relação às infectadas
pelo PRSV-W não ficou evidenciado a relação desta
variável com os níveis de resistência e ou suscetibilidade
de plantas de melancia ao PRSV-W.
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
•
Os testes bioquímicos são pouco utilizados no estudo da
interação
àqueles
patógeno
utilizados
X
hospedeiro,
para
a
especialmente
etiologia
viral,
sendo,
entretanto, constituídos de métodos rápidos, seguros e
de baixo custo que merecem maior atenção por parte
dos pesquisadores de maneira geral;
•
As
proteínas
relacionadas
à
patogênese
são
minimamente estudadas na virologia vegetal, embora, os
resultados encontrados no presente estudo com a 1,3
glucanase
sejam
animadores
no
sentido
de
identificar fontes de resistência ao PRSW-W em plantas
de melancia;
•
Ainda, relacionado a -1,3 glucanase, estudos adicionais
utilizando outros modelos (patógeno e hospedeiro)
tornam-se
necessários
para
ampliar
o
uso
conhecimentos gerados através deste trabalho.
dos
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABU-JAWDAH, Y.; KUMMERT, J. Effect of aliette on AMV
infection of bean leaves and on the resultant alterations in the
patterns of proteins and peroxidase. Phytopathology.- v. 108,
p. 294-303, 1983.
AGRIOS, G. N. Plant diseases caused by virose. In: Plant
Pathology, 4 ed. Califórnia: Academic Press, 1997. p. 479-508.
ALLAIN, C. C.; POON, L .C.; CHAN, C. S. G.; RICHMOND,
W.; FU, P. C. Enzimatic determination of total serum
cholesterol. Clinical. Chemistry., v. 20, p. 470-475, 1974.
ANDREEVA, I. V. Membrane permeability and peroxidase
activity in soy cultivars differing in resistance to mosaic virus.
Fiziologia. v. 36, n. 4, p. 810-817, 1989.
ANTONIW, J. F.; RITTER, C. E.; PIERPOINT, W. S.; VAN
LOON, L. C. Comparison of three pathogenesis-related
proteins from plants of two cultivars of tabacco infected with
TMV. Jounal. General. Virology, v. 47, p. 79-87, 1980.
AYANDRU, D. K.; SHARMA, V. C. Effects of cassava mosaic
desease on certain leaf parameters of field-grown cassava
clones. Phytopathology, v. 78, n. 8, p. 1057-1059, 1982.
AZEVEDO, S. M.; MALUF, W. R.; OLIVEIRA, A. C. B.;
FREITAS, J. A.; SILVEIRA, M. A.; GOMES, L. A. A.;
MORETTO, P. Triagem de cultivares, híbridos e introdução de
melancia quanto à reação de resistência ao vírus da mancha
anelar do manoeiro-estirpe melancia (PRSV-W). In: Congresso
Brasileiro Olericultura, v. 38, p. 27, 1998.
BEDENDO, I. P. Vírus. In: BERGAMIN-FILHO, A.; KIMATI, H.;
AMORIM, L. Manual de fitopatologia- princípios e conceitos. 3
ed. São Paulo: Agronômica Ceres, v. 2, 1995, p. 137-142.
BEFFA R. S.; HOFER R. M.;. THOMAS, M.; MEINS-JUNIOR,
F. Decreased susceptibility to viral disease of [beta]-1,3glucanase-deficient
plants
generated
by
antisense
transformation. Plant Cell, v. 8, n. 6, p. 1001-1011, 1996.
BEHL, M. K.; CHOWFLA, S. C. Alteration in metabolism
induced by necrotic strain of potato virus “Y” in tomato
cultivars. Indian J. Mycol. Plant Pathol., v. 2, p. 205-207, 1991.
BINOTTO-MISSIURA, F.; SCHONS. J.; NICOLINI-TEIXEIRA,
F. Atividade da
-1,3 glucanase e teores de proteínas em
plantas de melancia, como resposta a infecção pelo PRSV-W.
Fitopatologia Brasileira, v. 29., p. 292, 2004.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the
qualification of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye-binding. Anal. Biochem., v. 72, p. 248254, 1976.
CAMARGO, L. As hortaliças e seu cultivo. 3 ed. Revista
atualizada, Fundação Cargil, Campinas – SP, 1992. pp. 252.
CAMPA, A. Biological roles of plant peroxidases: Know and
potential
function.
In:
EVERSE,
K;
GRISHAM,
M.
B,
Peroxidase in chemistry and biology; New York: CRC Press, v.
2, 1991, p. 25.
CHANG, M.; HANDWIGER, L. A. D. Molecular characterization
of a pea ß-1,3 glucanase induced by fusarium solani nd
chitosan challenge. Plant Mol. Biol., v. 20, p. 609-618, 1992.
CRUZ, E. S.; PAZ, C. D.; PIO-RIBEIRO, G.; BATISTA, D. C.;
PEREIRA-FILHO, G. G.; ANDRADE, G. P. Levantamento de
viroses em melancia e melão no submédio São Franscisco.
Summa Phytopatologica, v. 25, p. 21, 1999.
DIAS, P. R. P.; REZENDE, J. A. Premunização de abóbora
híbrida Tetsukabuto para o controle do mosaico causado pelo
Papaya ringspot vírus- type W. Summa Phytopathologica, v.
26, p. 390-398, 2000.
DUBOIS, M.; GILLES, K. A.; HALMITON, J. K.; REBERS, P.
A.; SMITH, F. Colorimetric method for determination of sugars
and related substances. Anal. Chem., v. 28, p. 350-356, 1956.
FATIBELLO-FILHO, O.; VIEIRA CRUZ da I. Uso analítico de
tecidos e extratos brutos vegetais como fonte de enzimática.
Química Nova, v. 25, n. 3, p. 455-464, 2002.
FRITIG, B.; HEITZ, T.; LEGRAND, M. Antimicrobial proteins in
induced plant defense. Current Opinion in Immunology, v. 10,
p. 16-22, 1998.
GIAMPAN, J. S. Infectividade e proteção de três estirpes
fracas do Papaya ringspot virus em plantas de melancias.
2003.Dissertação (Mestrado em Fitossanidade) - Escola
Superior de Agricultura “Luiz Queiroz”, Universidade de São
Paulo, Piracicaba, 2003, p. 63.
GUZZO S.D. Proteínas relacionadas à patogênese. Revisão
Anual de Patologia de Plantas. v. 11, p 283-332, 2003.
GUZZO, S. D.; MARTINS, E. M. F. Local and systemic
induction of
-1,3 glucanase end chitinase in coffe leaves
protected against Helimeleia vastatrix by Bacillus thuringiensis.
J. Phytopathol, v. 144, p. 449-454, 1996.
HAHN, M. G. Microbial elicitors and their receptors in plants.
Annu. Rev. Phytopathol, v. 34, p. 387-412, 1996.
HOJO, H.; SILVA, N. de; PAVAN, M. A. Triagem de cultivares
e híbridos de melancia para a resistência ao vírus do mosaico
do
mamoeiro
estirpe
melancia
(VMM-M).
Summa
Phytopathologica, v. 17, p. 113-118, 1991.
KANG,
Z.;
localization of
BUCHENAUER,
H.
Immunocytochemical
-1,3 glucanase and chitinase in Fusarium
culmorum infected wheat spikes. Physiol. Mol. Plant Pathol., v.
60, p. 141-153, 2002.
KIM, Y. J.; HWANG, B. K. Isolation of a basic 34 KiloDalton 1,3-glucanase with inhibitory activity against Phytophthora
capsici from pepper stems. Physiol. Mol. Plant Pathol., v. 50, p.
103-115, 1997.
KOMBRINK, E.; HAHLBROCK, K. Responses of cultured
parsley cells to elicitors from phytopathogenic fungi. Timing
and dose dependency of elicitor-induced reactions. Plant
Physiology, v. 81, p. 216-221, 1986.
LEAL, N.; LASTRA, R. Altered metabolism of tomato plants
infected with tomato yellow virus. Physiol. Plant Pathol., p.1-7,
1984.
LEOPARDI, F.; PÉRES DE ACOSTA, D. Efectos del vírus del
mosaico de la Cana de Azúcar Raza/B em el solgo. II.
Aspectos metabólicos. Turrialba, v. 42, p. 459-65, 1992.
LIMA, M. F.; BARBOSA,L. F.; DE ÀVILA, A. C. Levantamento
de viroses na cultura de melancia na região do submédio do
vale São Franscisco. Fitopatologia Brasileira, v. 22, p. 337,
1999.
MELIK-SARKISOV, O. S.; TSOGLIN, L. N.; VITOL, I. S.;
ANDREENKO, T. I.; ROZANOV, V. V. Activity of peroxidase
from healty and potato X virus infected potato leaves. Dok.
Vses. Ordena Lenina, v. 95, p. 14-20, 1991.
MOURA, M. C. C. L.; LIMA, J. A. A.; OLIVEIRA, V. B.;
GONÇALVES, M. F. B. Identificação sorológica de espécie de
vírus que infectam cucurbitáceas em áreas produtoras do
maranhão. Fitopatologia Brasileira, v. 26, p. 90-92, 2001.
PASCHOLATI, S. F; LEITE, B. Hospedeiro: Alterações
fisiológicas induzidas por fitopatógenos. In: BERGAMIN-
FILHO, A.; KIMATI, H.; AMORIM, L. Manual de Fitopatologiaprincípios e conceitos. 3 ed. São Paulo: Ed. Agronômica
Ceres, 1995. p.137-142.
PURVES, K. W.; SADAVA, D.; ORIANS, H. G.; HELLER, C. H.
Vida – a ciência da biologia. 6 ed. Local: Artmed, 2002. 1126p.
RAVEN, P.; EVERT, F. R.; EICHHORN, E. S. Biologia Vegetal,
6° ed.Local: Guanabara, 2001. p. 17-40.
REZENDE, J. A. M.; GIAMPAN, J. S. Manejo Integrado de
viroses da melancia. In: SANTOS, G. R.; ZAMBOLIM, L.;
REZENDE, J. A. M.; COSTA, H. Manejo integrado de doenças
da melancia.Viçosa: UFV, DFP, 2005. p.53-70.
ROULIN, S.; BUCHALA, A. J. The induction of -1,3-glucanase
and other enzymes in groundnut leaves infected with
Cercospora arachidicola. Physiol. Mol. Plant Pathol., v. 46, p.
471-489, 1995.
SANTOS, G. R.; ZAMBOLIN, L.; COSTA, H. Manejo integrado
de doenças fúngicas, bacterianas e abióticas da melancia. In:
SANTOS, G. R.; ZAMBOLIM, L.; REZENDE, J. A. M.; COSTA,
H. Manejo integrado de doenças da melancia.Viçosa: UFV;
DFP; 2005. p.1-62.
SCHONS, J. Aspectos bioquímicos da embriogênese somática
em cenoura (Daucus carota L.). 1995. Dissertação (Mestre em
Ciências Biológicas)- Instituto de Biociências, Universidade
Estadual Paulista, Botucatu, 1995. 71p.
SCHONS, J. Efeito do vírus do enrolamento da folha da batata
sobre os teores de poliaminas, proteínas, açúcares e atividade
da peroxidase em cultivares de batata. (Solanum tuberosun L.)
com diferentes níveis de resistência. 1997. Tese (Doutorado
em
Ciências
Biológicas)
-
Instituto
de
Biociências,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 1997.100p.
SCHONS, J.; DALBOSCO, M.; PANISSON, E.; BOLLER, W.;
SOUZA, R. Danos causados pelo Barley yellow dwarf virus em
Trigo. Fitopatologia Brasileira, v. 25, p. 448, 2000.
SCHONS, J.; PAVAN, M. A.; BRASIL, O. G. Efeito do PRSV-W
sobre os níveis de proteínas solúveis e atividade da
peroxidase em melancia (Citrullus lanatus (Thusb Mansf.).
Fitopatologia Brasileira, v. 20, p. 302, 1995.
SELITRENNIKOFF, C. P. Antifungal proteins. Appl. Environm.
Microbiol., v. 67, p 2883-2894, 2001.
SIEGEL, B. Z. Plant peroxidases on organic perspective. Plant
Growth Regul, v. 12, p. 303-312, 1993.
SITTOLIN, I. M. Tolerância de melancia aos vírus do mosaico
amarelo da abobrinha-de-moita e do mosaico da melancia-2.
1998.. Tese de Doutorado em Proteção de plantas. Faculdade
de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista,
Botucatu. 1998. 72p.
SOUZA, R.; SCHONS, J.; BRAMMER, S. P.; PRESTES, A. M.;
SCHEEREN, P.L.; NICOLINI-TEIXEIRA, F.; CECCHETTI, D.;
LANZARINI, A. C. Efeito do Soil-borne wheat mosaic vírus
sobre o metabolismo de cinco genótipos de trigo com
diferentes níveis de resistência à doença. Fitopatologia
Brasileira, v. 30, n. 4, p. 400-403, 2005.
STANGARLIN. J.; PASCHOLATI, S. Atividade de ribulose 1,5bifosfato carboxilase-oxigenase (rubisco), clorofilase,
-1,3
glucanase e quitinase e conteúdo de clorofila em cultivares de
feijoeiro (Phaseolus vulgaris) infectados com Uromyces
appendiculatus. Summa Phytophathologica, v. 26, p. 34-42,
2000.
STICHER, L.; MAUCH-MANI, B.; MÉTRAUX, J-P. Systemic
acquired resistance. Annu. Rev. Phytopathol. v. 35, p. 235270, 1997.
STRANGE, E. B.; GUNER, N.; PESIC-VANESBROECK, Z.;
WEHNER, T. C. Screening the watermelon germplasm
collection for resistance to Papaya ringspot virus-type W. Crop
Science. v. 42, p. 1324-1330, 2002.
SURESH, G. L.; RAO, N. G.; SING, B. G. Effect of bean
common mosaic virus infection of enzymatic activity in french
bean. J. Res., v. 16, p. 117-20, 1988.
VAN LOON, L. C.; GERRISTSEN, Y. A. M. Protease activity
and pathogenesis-related proteins in virus infected Samsun NN
tabacco leaves. Plant Science, v. 63, p. 141-150, 1989.
VAN LOON, L. C.; VAN KAMMEN, A. Polycrylamide disc
electrophoresis of the soluble leaf proteins from Nicotiana
tabacum var. “Samsun” and “Samsun N N”. Changes in protein
constitution after infection with tabacco mosaic virus. Virology,
v. 40, p. 199-211, 1970.
VAN LOON, L. C.; VAN STRIEN, E. The families of
patogénesis-related proteins, and comparative analysis, PR-1
type proteins. Physiol. Mol. Plant Pathol.,v. 55, p. 85-97, 1999.
VAN LOON, L. C. Induced resistance in plants and the role of
phagenenisis-related proteins. Jounal. Phant Pathology, v.
103, p. 753-65, 1997.
VAN LOON, L. C.; PIERPOINT, W. S.; BOLLER, T.;
CONEJERO,
V.
Recommendations
for
naming
plant
pathogenesis-related proteins. Plant Molecular. Biolology.
Rep., v.12, p. 245-64, 1994.
VEGA, J. Mecanismo de resistência ao vírus do mosaico da
soja da variedade IAC-2. Campinas: Campinas, 1991, 92 p.
Tese (Doutorado em Biologia vegetal), Instituto de Biologia,
Universidade de Campinas), 1991.
YOUNG, D. H.; PEGG, G. F. The action of tomato and
Verticillium albo-atrum glycosidases on the hyphal wall of V.
albo atrum. Physiology. Plant Pathology, v. 21, p. 411-423,
1982.
YUKI, V. A.; REZENDE, J. A. M.; KITAJIMA, E. W.;
BARROSO, P. A. V.; KUNIYUKI, H.; GROPPO, G. A.; PAVAN,
M. A. Occurrence, distribution and relative incidence of viruse
infecting cucurbits in the State of São Paulo, Brazil. Plant
Disease, v. 84, p. 516-520, 2000.
ZERBINI, F. M.; MACIEL-ZAMBOLIM, E. A família Potyviridaeparte I. Revisão Anual de Patologia de Plantas. v. 7, p 1-50
1999.
ZHAO, H.; ZHAO, H.; WANG, J.; WANG, B.; WANG, Y. Stress
stimulation induced resistance of plant. Elsevier, v. 43, p.174178, 2005.
ZHU, Q.; MAHER, E. A.; MASOUD, S.; DIXON, R. A.; LAMB,
C. J. Enhanced protection against fungal attack by constitutive
co-expression of chitinasa and glucanase genes in transgenic
tobacco. Bio. Technology, v. 12, p. 807-812, 1994.