Anna Christina Higino Rocha Alterações morfométricas na retina de
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Anna Christina Higino Rocha Alterações morfométricas na retina de camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplasma gondii e pesquisa de apoptose. Belo Horizonte Faculdade de Medicina da UFMG 2009 Anna Christina Higino Rocha Alterações morfométricas na retina de camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplasma gondii e pesquisa de apoptose. Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor. Área de concentração: Oftalmologia Orientador: Prof. Dr. Fernando Oréfice Co-orientador: Prof. Dr. Anilton César Vasconcelos Belo Horizonte Faculdade de Medicina da UFMG 2009 R672a Rocha, Anna Christina Higino. Alterações morfométrica na retina de camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplama gondii e pesquisa de apoptose [manuscrito]. / Anna Christina Higino Rocha. - - Belo Horizonte: 2009. 96f.: il. Orientador: Fernando Oréfice. Co-orientador: Anilton César Vasconcelos. Área de concentração: Oftalmologia. Tese (doutorado): Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina. 1. Toxoplasmose Ocular. 2. Toxoplasma. 3. Apoptose. 4. Dissertações Acadêmicas. I. Oréfice, Fernando. II. Vasconcelos, Anilton César. III. Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina. IV. Título NLM: WW 160 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Magnífico Reitor Prof. Ronaldo Tadêu Pena Pró-Reitor de Pós Graduação Prof. Jaime Arturo Ramirez Pró-Reitor de Pesquisa Prof. Carlos Alberto Pereira Tavares Diretor da Faculdade de Medicina Prof. Francisco José Pena Coordenador do Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina Prof. Carlos Faria Santos Amaral Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Cirurgia e à Oftalmologia Prof. Edson Samesima Tatsuo Chefe do Departamento de Oftalmologia, Fonoaudiologia Profa. Ana Rosa Pimentel de Figueiredo Otorrinolaringologia e Membros do colegiado do Curso de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Cirurgia e à Oftalmologia Prof. Edson Samesima Tatsuo Prof. Marcelo Dias Sanches Prof. Alcino Lázaro da Silva Prof. Márcio Bittar Nehemy Prof. Marco Aurélio Lana Peixoto Prof. Tarcizo Afonso Nunes Representante discente: Denny Fabrício Magalhães Veloso A Comissão Examinadora que assina abaixo___________________ a tese intitulada "Alterações morfométricas na retina de camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplasma gondii e pesquisa de apoptose", apresentada e defendida, em sessão pública, por Anna Christina Higino Rocha, para obtenção do Grau de Doutor em Medicina, pelo Programa de Pós-Graduação em Oftalmologia de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais. ____________________________ Prof. Fernando Oréfice Orientador Universidade Federal de Minas Gerais _____________________________ Prof.Anilton César Vasconcelos Co-orientador Universidade Federal de Minas Gerais _____________________________ Dr. Roberto Carlos Tedesco Instituto Oswaldo Cruz /Fundação Oswaldo Cruz _____________________________ Prof. Carlos Eduardo Hirata Universidade de São Paulo _____________________________ Prof. Wesley Ribeiro Campos Universidade Federal de Minas Gerais _____________________________ Dra. Cynthia Azeredo Cordeiro Suplentes: __________________________ Dra. Célia Aparecida de Andrade Araújo __________________________ Dr. Roberto Martins Gonçalves Belo Horizonte, de 28 de agosto de 2009 "O começo de todas as ciências é o espanto de as coisas serem o que são". Aristóteles Aos meus pais, Nice e João, exemplos que norteiam a minha vida. Aos meus irmãos, pela força e companheirismo. Ao meu marido, George, minha eterna fonte de motivação e incentivos. E aos meus filhos, Igor, Samuel e Livia, que fazem tudo valer à pena. AGRADECIMENTOS À equipe do IOC/FIOCRUZ – Dra. Kátia Calabrese, Dra. Celeste, Dr. Luiz, Dai, Meriele, Leandro, Mari, Lu, Alan – pela fundamental contribuição e pelo carinho com que me receberam. Em especial ao Dr. Roberto Carlos Tedesco, uma pessoa amiga, sempre pronta a ajudar, um cientista brilhante, um exemplo a ser seguido. Sem sua iluminada presença esse trabalho não seria possível. À equipe do Laboratório de Apoptose, Profa. Luciana, Laís, Francisco, Núbia, Rafael, Camila, Eloísa. Em especial ao Prof. Anilton, meu co-orientador, pelo carinho, apoio e paciência, Bárbara Laurice Araújo Verçosa e Soraia Silva pela ajuda inestimável. Ao meu orientador Prof. Fernando Oréfice pela dedicação e competência. Ao Dr. Miguel Houri Neto pela inestimável ajuda com a análise estatística dos dados. Especial também é o meu agradecimento ao Prof. Wesley Ribeiro Campos e à Dra. Danuza de Oliveira Machado, que além de profissionais excepcionais, se mostraram muito generosos e amigos ao me ajudarem com o projeto. À querida Maria Bernadete S. Inocêncio, a Bê, pelo valioso apoio nas horas de angústia. Também à Adriana e à Denimara, sempre presentes e solícitas. À Alda, Flávia, Thaís, Dra. Célia, Dr. Sidney, Dra. Silvana, Daniel Victor, Mário, Fernanda, Adriana, Gustavo, Roberto, Leandro, Dra. Alba e todos os colegas do setor de uveítes e do São Geraldo. Ao Dr. Breno Lino, um exemplo de cultura e dedicação. À Rosemary, pela presença constante e amiga. A toda minha família, amigos e colegas de trabalho que tornaram essa pesquisa possível. A todos vocês muito obrigada. RESUMO Objetivos. Demonstrar a utilidade da morfometria digital e analizar a apoptose em retina de camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplasma gondii. Métodos. Vinte camundongos C57BL/6 fêmeas foram divididos em: grupo 1 (n= 8) infectado intraperitonealmente com 30 cistos da cepa ME 49 de T.gondii e grupo 2 (n= 12), o controle, foi submetido a injeção de solução salina 0,9% intraperitonealmente. Os olhos dos animais dos dois grupos foram enucleados no sexagésimo dia após a infecção, fixados e processados para microscopia de luz. Mudanças na espessura da retina e na razão perímetro/área (P/A) das camadas da retina foram analizadas através da morfometria digital. Resultados. Em camundongos infectados, a retina mostrou aumento de espessura (167,8 ± 24,9 μm versus 121.1 ± 15.4 μm, nos controles) e espessura retiniana aumentada nos focos de retinite (187.7 ± 16.6 µm versus 147.9 ± 12.2 µm fora dos focos de retinite). Foi observada diferença estatisticamente significativa entre a P/A da retina de infectados e não infectados, bem como nas camadas de fotoreceptores, plexiforme externa, nuclear interna e células glanglionares + fibras nervosas (consideradas como camada única). A reação de TUNEL mostrou células marcadas no corpo vítreo, na interface vitreorretiniana e nas várias camadas da retina neurossensorial dos animais infectados, mas principalmente na região perivascular, coincidindo com a localização das células inflamatórias. No grupo controle não foram observadas células marcadas pela reação de TUNEL. Conclusão. Morfometria pode ser usada para demonstrar diferença entre retina de animais infectados e não infectados. Apoptose foi encontrada na retina de camundongos infectados. ABSTRACT Purpose. To demonstrate the usefulness of digital morphometry and analyze apoptosis in retina of C57BL/6 mice infected with Toxoplasma gondii. Methods. Twenty C57BL/6 female mice were divided in two groups. Group 1 (n=8), was intraperitoneally infected with 30 cysts of T. gondii ME 49 strain and group 2 (n=12), the control, was subjected to injection of saline 0.9% intraperitoneally. The eyes of mices of both groups were enucleated on the 60th day after infection, fixed and processed for light microscopy. Changes in retinal thickness and the perimeter/area ratio (P/A) of the retinal layers were analyzed by digital morphometry. The TUNEL reaction was performed to research apoptosis. Results. In infected mice, retina showed increased thickness (167.8 ± 24.9 µm versus 121.1 ± 15.4 µm, in controls) and increased retina thickness within the retinitis foci (187.7 ± 16.6 µm versus 147.9 ± 12.2 µm out of the retinitis foci). A statistically significant difference in P/A was observed between infected and uninfected mice retina as well as was observed in photoreceptor layer, outer plexiform layer, inner nuclear layer and ganglionar + nerve fiber layer. In infected mice, apoptotic cells were detected by TUNEL in the vitreous, vitreous-retina interface and various neurosensorial retina layers, but especially in perivascular region, the same place where inflammatory cells were found. In the control group, apoptotic cells were not observed by TUNEL. Conclusions. Retinal measurements may be used to demonstrate differences between infected and uninfected mice retina. Apoptosis was found in infected mouse retina. LISTAS DE FIGURAS Figura 1 – Morfologia da apoptose ............................................................................43 Figura 2 – Espessura da retina no foco de retinite.....................................................56 Figura 3 – Relação P/A..............................................................................................57 Figura 4 – Olho normal...............................................................................................61 Figura 5 – Cisto de Toxoplasma gondii......................................................................62 Figura 6 – Vasculite retiniana e retinite......................................................................62 Figura 7 – Migração de células pigmentadas.............................................................63 Figura 8 – Desorganização da arquitetura da retina..................................................63 Figura 9 – Desenho experimental da análise estatística dos dados da relação P/A da retina e suas camadas...................................................................69 Figura 10 – Análise de variância dos dados de anfractuosidade da retina e suas camadas....................................................................................................69 Figura 11 – Retina de animais não infectados submetida à reação de TUNEL.........70 Figura 12 – Retina de animais infectados marcada por TUNEL ...............................71 LISTA DE TABELAS 1 – Estatística simples para a variável contínua espessura da retina........................64 2 – Estatística simples para a variável espessura da retina em animais infectados para cada posição..............................................................................64 3 – Comparação entre as médias da variável espessura da retina para cada posição em animais infectados e não infectados.................................................65 4 – Médias da espessura da retina de animais infectados para cada posição e considerando se a medida foi feita em um foco de retinite ou não.......................65 5 – Correlações paramétricas de Pearson para espessura da retina em cada posição de medida.............................................................................................................65 6 – Comparação entre as médias de espessura em cada posição de medida em animais não infectados.........................................................................................66 7 – Comparação entre as médias de espessura medida no foco e fora do foco de retinite em animais infectados...............................................................................66 8 – Comparação entre as médias de espessura em cada posição de medida em Indivíduos infectados............................................................................................66 9 – Estatística simples para a variável P/A da retina e suas camadas......................67 10 – Estatística com quebras para a variável P/A, quebra: infecção.........................68 11 – Testes de normalidade e homocedasticidade da P/A da retina por inteiro........68 12 – Comparação entre o status de infecção para o mesmo local de medida da P/A......................................................................................................................70 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Apaf-1 Apoptosis activating factor 1 – fator ativador de apoptose 1 APC Antigen-presenting cell – célula apresentadora de antígenos CASPASE Cysteine aspartate cleaving enzime – proteases cisteínicas de ácido aspártico CETEA Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais da Fundação Oswaldo Cruz CECAL Centro de Criação de Animais de Laboratório do Instituto Oswaldo Cruz CFR Camada de fotorreceptores CGFN Camada de células ganglionares e de fibras nervosas CMV Citomegalovírus CNE Camada nuclear externa CNI Camada nuclear interna CPE Camada plexiforme externa CPI Camada plexiforme interna CTL Célula T CD8+ efetora citotóxica ou citolítica DAB Diaminobenzidina DNA Deoxyribonucleic Acid – Ácido Desoxirribonucleico DR Descolamento de retina EPR Epitélio pigmentar da retina FADD Fas-associated death domain – domínio de morte associado ao Fas Fas APO1 ou CD95 (Cluster differentiation 95) Fas L Ligante do receptor Fas FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz FR Fotorreceptores GM-CSF granulocyte-colony-stimulating fator – fator estimulador de colônia de Granulócito HE Hematoxilina e eosina HLA Human leucocyte antigens – antígenos leucocitários humanos H2O2 Peróxido de hidrogênio ICB/UFMG Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais Ig Imunoglobulina IL Interleucina INF-γ Interferon gama iNOS Enzima óxido nítrico sintetase IP Intraperitoneal NK Natural-killer cell – células natural killers PARP Poly (ADP-ribose) polymerase RCST Retinocoroidite supostamente toxoplásmica PBS Phosphate Buffered Saline – tampão de salina fosfatada SAEG Sistema de Análise Estatística, versão 9.1, 2007, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG SAS Statistical Analysis System, versão 8.0, SAS Institute, Cary, NC, EUA STATA/SE Statistics/Data Analysis, versão 10.0, College Station, Texas, EUA TCPN Toxoplasmose congênita pós natal TCR T Cell Receptor – receptor de célula T TdT Terminal deoxynucleotidyl Transferase – transferase terminal de Desoxinucleotídeo Th Linfócitos T auxiliares (helper), ou padrão de resposta imunológica TNF-α Tumor Necrosis Factor-α – fator de necrose tumoral alfa TRADD TNF receptor apoptotic death domine – receptor TNF-α de morte por apoptose TRAIL TNF related apoptosis inducer ligand - ligante indutor da apoptose relacionado ao TNF TUNEL Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End Labeling – Marcação in situ da fragmentação do genoma com transferase terminal de desoxinucleotídeo SUMÁRIO INTRODUÇÃO...........................................................................................................19 REVISÃO DA LITERATURA......................................................................................23 1 Histórico...........................................................................................................24 2 O Toxoplasma gondii.......................................................................................25 3 A Toxoplasmose..............................................................................................28 3.1 Epidemiologia........................................................................................28 3.2 Resposta imune ao Toxoplasma gondii................................................30 3.2.1 Imunidade Inata.................................................................................30 3.2.2 Imunidade Celular..............................................................................30 3.2.3 Imunidade Humoral............................................................................32 3.3 Apresentação clínica.............................................................................33 3.4 Patologia...............................................................................................35 3.4.1 Toxoplasmose ocular.........................................................................36 3.4.2 Toxoplasmose ocular no modelo experimental..................................38 4 Apoptose..........................................................................................................41 4.1 Apoptose na toxoplasmose...................................................................47 4.2 Apoptose na toxoplasmose ocular........................................................49 OBJETIVOS...............................................................................................................50 MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................................52 1 Animais............................................................................................................53 2 Parasitas..........................................................................................................53 2.1 Isolamento e purificação dos cistos......................................................53 3 Infecção...........................................................................................................54 4 Processamento das amostras.........................................................................54 5 Morfometria......................................................................................................55 5.1 Mensuração da espessura da retina.....................................................55 5.2 Relação perímetro/área da retina..........................................................56 5.3 Análise estatística.................................................................................57 6 Reação de TUNEL...........................................................................................58 RESULTADOS...........................................................................................................60 1 Descrição da morfologia do olho normal (grupo controle)...............................61 2 Análise dos olhos dos camundongos infectados pelo T.gondii.......................61 3 Morfometria......................................................................................................64 3.1 Espessura da retina..............................................................................64 3.2 Relação perímetro/área da retina e suas camadas..............................67 4 Pesquisa de Apoptose.....................................................................................70 DISCUSSÃO..............................................................................................................73 CONCLUSÕES..........................................................................................................78 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................80 ANEXOS.....................................................................................................................94 INTRODUÇÃO 20 O Toxoplasma gondii é um dos mais bem sucedidos parasitas protozoários, estabelecendo infecções agudas e crônicas em praticamente todos os animais de sangue quente (TENTER et al., 2000). Em humanos saudáveis, a infecção é assintomática em 70% dos casos. Em contraste, em indivíduos imunossuprimidos, tais como portadores da SIDA e pacientes em uso de quimioterápicos ou imunossupressores, a toxoplasmose aguda causa uma infecção potencialmente letal (REMINGTON & McLEOD, 1992; TENTER et al., 2000). Além disso, a toxoplasmose congênita pode causar dano fetal grave, podendo culminar em aborto espontâneo (PETERSEN et al., 2001). O T. gondii é um parasita intracelular obrigatório e por isso é totalmente depende da formação de um nicho dentro da célula infectada onde possa replicarse, adquirir nutrientes e neutralizar as defesas do hospedeiro (SINAI e JOINER, 1997). Apesar da relativa eficiência da imunidade celular, essencial na atividade antiparasitária, o hospedeiro não é capaz de se livrar da infecção. Vários fatores contribuem para a habilidade do parasita em estabelecer e manter uma infecção persistente em hospedeiros imunocompetentes, incluindo alterações na apoptose de populações específicas de células hospedeiras (HEUSSLER et al., 2001). A apoptose exerce, além do seu papel essencial durante o desenvolvimento e homeostase de organismos multicelulares, um papel crítico na regulação da resposta hospedeira durante infecção por vírus, bactérias e protozoários intracelulares (WILLIAMS, 1994; LILES, 1997). A fim de facilitar sua disseminação ou sobrevivência, os patógenos intracelulares desenvolvem diversas estratégias para induzir ou inibir a apoptose de células parasitadas e não parasitadas e modular a resposta imune do hospedeiro (LÜDER et al., 2001). Populações específicas de células imunológicas não parasitadas são induzidas à apoptose pelo T. gondii (LÜDER & GROSS, 2005). A apoptose das células do sistema imune leva à redução da resposta imunológica e da atividade antiparasitária beneficiando o parasita. Essa modulação na imunidade leva também a diminuição da resposta inflamatória e consequentemente a diminuição do dano tecidual, beneficiando também o hospedeiro. 21 Já nas células parasitadas, o T. gondii inibe a apoptose (GOEBEL et al., 1998; NASH et al., 1998; GOEBEL et al., 1999; GOEBEL et al., 2001), o que evita sua destruição junto com a célula parasitada. Essa inibição parece ser importante tanto na fase aguda quanto na fase crônica da toxoplasmose (HEUSSLER et al., 2001). Apesar de vários estudos mostrarem a importância da apoptose no estabelecimento da interação parasita-hospedeiro, pouco se sabe a respeito da apoptose no olho durante a infecção pelo T. gondii. SHEN et al. (2001) demonstraram que os olhos de camundongos tipo selvagem não infectados expressam constitucionalmente níveis mais altos de moléculas pró-apoptóticas que o cérebro e que a apoptose é mais frequente no olho que no cérebro durante a infecção via intraperitoneal. Nesse trabalho, os autores também sugerem que a apoptose no olho não é dependente do Fas e seu ligante. O Fas, também conhecido como APO1 ou CD95 (Cluster differentiation 95), é um receptor frequentemente expresso na membrana de células do sistema imune e relaciona-se com a deflagração da apoptose quando se liga ao Fas-L (ligante do Fas). Apesar de demonstrarem também aumento da frequência de apoptose no olho durante a toxoplasmose, HU et al. (1999) sugeriram que Fas e Fas-L poderiam ser importantes na deflagração da apoptose no olho durante a infecção intracameral pelo T. gondii, resultado que pode ter sido influenciado pelo trauma ocular provocado pela via de infecção utilizada. Os dois trabalhos estudaram o olho em fases precoces da infecção (do primeiro ao 14o dia após a infecção), diferente desta tese que estuda a fase crônica (60º dia após infecção). Como observado em outras doenças parasitárias, a patologia da infecção pelo T. gondii resulta da interação entre parasita e hospedeiro. Uma vez que os modelos experimentais geralmente são diferentes, com variações na cepa do animal, na via de infecção, na cepa do Toxoplasma utilizada para a infecção, nas condições da cultura e mesmo no número de passagens do parasita (ZENNER et al., 1998), os resultados obtidos por diferentes laboratórios não são facilmente comparáveis. E, ainda que as condições do experimento sejam similares, as descrições da histopatologia da toxoplasmose fornecem dados subjetivos, que podem variar entre os examinadores. A morfometria digital permite a obtenção de 22 dados objetivos (numéricos) virtualmente eliminando a variabilidade entre examinadores e facilitando a comparação entre os diversos trabalhos na área. A retinocoroidite supostamente toxoplásmica (RCST) é a mais importante causa de uveíte posterior em humanos em várias partes do mundo (HOLLAND, 2003) e o padrão ouro para seu diagnóstico é a presença de placa de retinocoroidite satélite a uma cicatriz (sinal de recidiva), ocorrências da fase crônica da infecção. Em virtude do exposto, o foco deste trabalho é a fase crônica da infecção (60º dia após a inoculação) e teve como objetivos pesquisar a apoptose e descrever as alterações morfométricas na retina de intraperitonealmente pelo Toxoplasma gondii. camundongos C57BL/6 infectados 23 REVISÃO DA LITERATURA 24 1 Histórico do Toxoplasma gondii O Toxoplasma gondii foi descoberto no Brasil por ALPHONSO SPLENDORE (1908), ao estudar a morte de coelhos por paralisia. O autor necropsiou vários animais e encontrou corpúsculos parasitários císticos, que inoculados em cães reproduziram a doença. O parasita recebeu o nome de Toxoplasma cuniculi, na ocasião. Simultaneamente, NICOLLE e MANCEAUX (1908) em Tunis, identificaram o parasita num roedor (Ctenodactylus gondii) originário do norte da África, identificando-o como Leishmania gondii. Em 1909, estes autores constataram que se tratava de novo protozoário e modificaram o nome para Toxoplasma, derivado do grego toxon, que significa “arco”, uma alusão à forma do parasita (revisto em Oréfice e Bahia, 2005). O primeiro caso humano da toxoplasmose foi descrito pelo oftalmologista JANKU (1923), na Tchecoslováquia, ao necropsiar uma criança falecida em decorrência de uma doença disseminada grave, com hidrocefalia, microftalmia e coloboma na região macular. O oftalmologista evidenciou os parasitas na retina da criança, mas não os reconheceu como Toxoplasma gondii, o que foi feito retrospectivamente por LEVADITI em 1928. Segundo ORÉFICE e BAHIA-OLIVEIRA (2005), o primeiro caso de toxoplasmose no Brasil foi descrito por MAGARINOS TORRES (1927) que descreveu o parasita em necrópsia de um paciente com meningoencefalite, miocardite e miosite. O primeiro registro fotográfico foi realizado por BELFORT MATTOS em 1933. Em 1937 a toxoplasmose ganhou impacto na medicina com o trabalho de WOLF e COWEN que reconheceram o T. gondii como um agente de encefalite em recém-nascidos. Dois anos depois foi descrito um caso fatal de um lactente com encefalite granulomatosa (WOLF et al., 1939). Estes autores também realizaram a primeira transmissão experimental da toxoplasmose do humano para animais. HUTCHISON (1965) foi o primeiro a descrever o papel do gato no ciclo evolutivo do parasita e a mostrar que este animal elimina o T. gondii pelas fezes. A verdadeira origem do parasita, entretanto, só foi esclarecida quando FRENKEL et al. (1970), nos EUA, descreveram a fase assexuada do T. gondii no intestino delgado 25 do gato doméstico. A descoberta de que o gato é o hospedeiro definitivo do T. gondii proporcionou a oportunidade de se estabelecer estratégias de prevenção da infecção, especialmente em mulheres grávidas. PINKERTON e WEINMAN (1940) descreveram um caso fatal da doença adquirida, mostrando que o T. gondii pode ser causa de doença adquirida no adulto. Em 1942, após a análise de um caso de toxoplasmose infantil, PAIGE et al. descreveram a transmissão vertical do T. gondii. Somente após a introdução de um teste utilizando azul de metileno (dye test), para a detecção de anticorpos anti-T. gondii em humanos, por SABIN e FELDMAN (1948), foi possível diagnosticar a doença laboratorialmente e possibilitou a realização de investigações epidemiológicas. A associação do T. gondii com a retinocoroidite em humanos foi feita por WILDER em 1952. WEIMANN e CHANDLER (1954) levantaram a hipótese de que a transmissão horizontal em humanos poderia ocorrer através da presença de cistos em carne mal cozida. 2 O Toxoplasma gondii Classificação taxonômica: Reino: Protista; Subreino: Protozoa; Filo: Apicomplexa; Classe: Sporozoa; Subclasse: Coccidia; Ordem: Eucoccidia; Subordem: Eumeriina; Família: Sarcocystidae; Subfamília: Toxoplasmatine; Gênero: Toxoplasma. O Filo Apicomplexa engloba os parasitas intracelulares obrigatórios que infectam quase todos os animais homeotérmicos. O gênero Toxoplasma é formado pela única espécie T. gondii. Esse parasita apresenta três formas: esporozoíta, taquizoíta e bradizoíta, todas elas infectivas tanto para o hospedeiro intermediário quanto para o definitivo. 26 Taquizoíta (tachys = rápido) é a forma que se multiplica rapidamente (FRENKEL, 1973a), capaz de invadir ativamente qualquer célula nucleada do hospedeiro e de multiplicar-se em vacuólos citoplasmáticos (vacúolos parasitóforos). Foi a primeira a ser descrita e sua forma de arco deu nome ao gênero. É intracelular obrigatória e mede cerca de 6 µm de comprimento por 2 m de largura. (DUBEY et al., 1998). É a principal forma na fase aguda da infecção, mas pode ser encontrada na reativação da fase crônica (LUFT, 1989). Multiplica-se por endodiogenia, um processo através do qual duas células filhas se desenvolvem dentro de uma célula mãe (FRENKEL, 1973b). A célula hospedeira rompe-se em determinado momento, liberando os parasitas que alcançarão os diversos órgãos, transportados por macrófagos, linfócitos e granulócitos. As formas taquizoítas são frágeis e não sobrevivem ao suco gástrico (LUFT, 1989; revisto em DUBEY et al., 1998). Bradizoíta (brady = lento) é a forma de multiplicação lenta (FRENKEL, 1973a). É mais delgada e mede cerca de 7 µm de comprimento por 1.5 m de largura. O bradizoíta pode ser encontrado no interior dos cistos teciduais, cujo tamanho varia de 10-100 µm. Cistos grandes podem conter até 3000 bradizoítas que se dividem lentamente por endodiogenia (revisto em DUBEY et al., 1998). Os cistos teciduais são característicos da fase crônica da toxoplasmose, mas podem ocasionalmente ser encontrados na fase inicial da infecção (começam a se formar entre o sexto e o oitavo dia de infecção). Em estados de imunossupressão, os cistos teciduais se rompem e os parasitas se proliferam rapidamente. Os cistos teciduais representam uma importante forma de transmissão da toxoplasmose já que persistem ao longo da vida nos tecidos dos animais infectados e podem ser ingeridos por carnívoros, incluindo os humanos. Esta forma é resistente à digestão péptica e sobrevive várias horas após a exposição às enzimas digestivas (DUBEY et al.,1998). Após a ingestão, a parede do cisto é rompida liberando bradizoítas viáveis, capazes de invadir o trato digestivo do hospedeiro (revisto em ORÉFICE & BAHIA, 2005). O esporozoíta mede cerca de 8 m de comprimento por 2 m de largura. São encontrados no interior dos oocistos maduros. Os oocistos são ovóides, com aproximadamente 10 a 12 µm de diâmetro e formados somente nos intestinos dos felinos, de onde são eliminados com as fezes, ainda imaturos. Tornam-se 27 esporulados entre o segundo e o vigésimo primeiro dia após a eliminação, dependendo da cepa e das condições do ambiente. O oocisto esporulado contém oito esporozoítas e é a forma madura e infectante do oocisto, que sob condições favoráveis, pode permanecer infectivo por mais de um ano (revisto em ORÉFICE & BAHIA, 2005). A ingestão de alimentos ou água contaminados com oocistos é provavelmente uma das principais formas de infecção dos herbívoros e humanos. O T. gondii é um parasita com um ciclo de vida heteroxênico facultativo, que tem sido isolado de animais herbívoros, carnívoros e onívoros. Entretanto, somente nos felídeos (hospedeiros definitivos) o parasita pode completar seu ciclo de vida e produzir oocistos. Os gatos podem ser considerados hospedeiros completos desse parasita já que apresentam o ciclo extra-intestinal ou tecidual (fase assexuada) e o enteroepitelial (fase sexuada). Os demais animais mantêm apenas a fase assexuada (LUFT, 1989; TENTER et al., 2000). A fase sexuada é iniciada quando um felídeo ingere oocistos ou tecidos infectados com cisto. Após a digestão gástrica, os parasitas (esporozoítas ou bradizoítas) invadem as células epiteliais do intestino delgado e inciam o ciclo enteroepitelial (DUBEY et al., 1970; FRENKEL, 1973b) culminando na eliminação de oocistos nas fezes. A fase assexuada inicia-se quando o hospedeiro suscetível ingere oocisto ou cisto tecidual, a partir dos quais os parasitas são liberados no estômago. No epitélio intestinal, os parasitas (esporozoítas ou bradizoítas) diferenciam-se em taquizoítas e multiplicam-se rapidamente. Após uma infecção aguda caracterizada pela disseminação dos parasitas pelo corpo, cistos teciduais são formados como resultado da diferenciação das formas taquizoítas em bradizoítas. As fases sexuadas e assexuadas do ciclo de vida são potencialmente independentes. Particularmente, a fase assexuada pode circular infinitamente entre os hospedeiros intermediários. A infecção pelo parasita pode ocorrer: 1- através da ingestão água e alimentos contaminados com oocistos (transmissão horizontal) (BENESON et al., 1982; BOWIE et al., 1997); 2- através da ingestão de cistos presentes em carne mal 28 cozida (transmissão horizontal) (DUBEY,1989); ou 3- através da transmissão transplacentária de formas taquizoítas (transmissão vertical) (DESMONTS,1985). Outras formas de infecção têm sido descritas, tais como através do leite materno, transfusões de sangue e hemoderivados; acidentes de laboratório e transplantes de órgãos (SACKS et al., 1982). Além disso, moscas, formigas, baratas e minhocas podem servir de meio de disseminação (DUBEY, 1998; BUXTON, 1990). 3 A toxoplasmose Apesar de a infecção ser muito comum, a doença é rara em humanos, já que no indivíduo imunocompetente a infecção é geralmente assintomática (REMINGTON et al., 2001). A infecção pelo T. gondii varia de acordo com a forma de infecção, com a cepa do parasita, com a espécie do hospedeiro e, entre os indivíduos da mesma espécie, com os fatores genéticos e imunológicos (OLLE, 1994; SUZUKI et al., 1995; SIBLEY & HOWE, 1996; WILLIAMS et al., 1978). Os hospedeiros podem ser classificados em sensíveis ou resistentes. Fazem parte dos resistentes os humanos e ratos, enquanto que os camundongos, hamsters e cobaios podem desenvolver uma toxoplasmose aguda fatal, pertencendo ao grupo dos sensíveis (DARCY & ZENNER, 1993). 3.1 Epidemiologia A toxoplasmose é amplamente difundida pelo mundo. Estima-se que a infecção ocorre em 13% a 50% da população mundial (JONES et al., 2001). A prevalência da soropositividade para a toxoplasmose varia amplamente no mundo, dependendo dos hábitos alimentares, higiene e clima (RHOTOVA, 2003). Assim, alta soropositividade para T. gondii é encontrada em países como a França, onde comer carne crua ou mal cozida é comum e em áreas tropicais da América Latina, onde os 29 gatos são abundantes e o clima favorece a sobrevivência de oocistos (JONES et al., 2001). Nos EUA, a soropositividade encontrada pelo terceiro National Health Nutrition Examination Survey, realizado entre 1988-1994, foi de 23% do total de 17658 pessoas avaliadas (RHOTOVA, 2003). No Brasil, os estudos mostram a prevalência sorológica para o T. gondii variando entre 50 e 83% da população. Mas no município de Erechim-RS, SILVEIRA et al. (1988) encontraram soropositividade em aproximadamente 98% das crianças de 10 a 15 anos de idade. Em relação ao acometimento ocular, a toxoplasmose é considerada a causa mais comum de uveíte posterior em várias partes do mundo, incluindo América do Norte, América do Sul e Europa (HOLLAND, 2003). No Brasil, FERNANDES e ORÉFICE (1996) em um estudo realizado em Belo Horizonte (MG), no período de 1970 a 1993, descreveram que a toxoplasmose foi considerada a principal causa de uveíte, correspodendo a 43,1% dos 7680 casos estudados. Esses mesmos autores demonstraram ainda que a retinocoroidite supostamente toxoplásmica (RCST) representou 72% de um total de 1955 uveítes posteriores. A prevalência do envolvimento ocular na toxoplasmose adquirida não está bem estabelecida, mas estudos sugerem que o envolvimento ocular raramente ocorre (ROTHOVA et al., 1986). FERNANDES e ORÉFICE (1996) descreveram que de um total de 405 pacientes com retinocoroidite ativa, 5,4% apresentavam IgM positivo para toxoplasmose. NOGUEIRA et al. (1996) encontraram retinocoroidite unilateral em 1 a 2% dos casos humanos da toxoplasmose adquirida. Todavia, tem sido observado que a incidência de toxoplasmose ocular adquirida pode ser alta, dependendo da área geográfica de ocorrência da doença. Segundo SILVEIRA et al. (1987), de 75 famílias estudadas na cidade de Erechim (RS), 15 (20%) apresentavam mais de um irmão não gêmeo acometido, sendo que em uma das famílias oito irmãos apresentavam doença ocular. Acredita-se que nessa população a RCST decorrente da infecção adquirida seja tão frequente quanto a manifestação ocular tardia da toxoplasmose congênita (MARTINS et al., 1990). PETERSEN et al. (2001) também estudaram essa prevalência atípica da toxoplasmose ocular no sul do Brasil. 30 3.2 Resposta Imune ao Toxoplasma Gondii 3.2.1 Imunidade Inata A ativação das células natural-killer (NK), dos macrófagos e das células dendríticas pelo T. gondii é importante para a resistência inespecífica que representa a primeira linha de defesa contra a replicação irrestrita do parasita. Além da atividade antiparasitária, essas células são importantes para ativação da imunidade específica através da apresentação de antígenos e da produção de interleucinas e citocinas. As células dendríticas são as mais eficientes apresentadoras de antígenos (APC: antigen-presenting cell), expressando moléculas dos antígenos leucocitários humanos (HLA: human leucocyte antigens) classes I e II (HART, 1997). Os macrófagos apresentam apenas HLA classe II, mas secretam mediadores pró-inflamatórios como interferon-gama (INF-), fator de necrose tumoral alfa (TNF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interleucina-12 (IL-12) e interleucina-15 (IL-15). As células NK, que derivam da linhagem linfocitária e tem função citotóxica, secretam citocinas (especialmente o INF-) ajudando a unir as respostas inata e antígeno-específica (BLIS et al., 1999). Antes da ativação da imunidade adaptativa, as células NK são muito importantes para a contenção da infecção, exercendo função efetora independente de células T (SHER, 1993; HUNTER et al., 1994). 3.2.2 Imunidade celular A imunidade mediada por células é essencial para a atividade antiparasitária (GAZZINELLI et al., 1993). Assim, a transferência de soro de camundongos 31 cronicamente infectados pelo T.gondii não protege outros camundongos não infectados de uma infecção primária. Além disso, camundongos com supressão na produção de linfócitos B, responsáveis pela imunidade humoral, conseguem controlar a infecção primária pelo parasita (REYES & FRENKEL, 1987). Experimentalmente foi observado que camundongos atímicos (que não possuem células T) não são capazes de desenvolver uma resistência contra o T. gondii. Entretanto, após a transferência dessas células, uma imunidade protetora contra essa infecção foi observada (FRENKEL & TAYLOR, 1982). As células T originadas no timo são responsáveis pela imunidade celular com a função de destruição e lise das células parasitadas (HAYNES & HEINLY, 1995). Infecções experimentais em camundongos mostram que células T CD4+ e CD8+ são necessárias para evitar a multiplicação parasitária descontrolada (SUZUKI & REMINGTON, 1988; GAZZINELLI et al., 1992). Os linfócitos T CD4+ h (auxiliares ou helper) são necessários para a geração de células T CD8+ efetoras citotóxicas (CTL) capazes de lisar células-alvo infectadas (GAZZINELLI et al., 1991). Dessa interação formam-se células de memória, tanto para as células T CD4+ quanto para as T CD8+. Enquanto o linfócito T CD8+ parece representar a célula efetora mais importante contra o T. gondii, o linfócito T CD4+ cumpre importante função regulatória (DENKER & GAZZINELLI, 1998). O T. gondii induz rapidamente a uma resposta imune do tipo 1 mediada por linfócitos T, o que limita a infecção e garante a sobrevivência do hospedeiro (YAP & SHER, 1999). O parasita estimula os macrófagos e as células NK a produzirem IFN, um potente inibidor da diferenciação dos linfócitos T CD4+ em T CD4+ T helper 2 (Th2). Além disso, a IL-12 produzida pelos macrófagos promove a diferenciação dos linfócitos T CD4+ em T CD4+ Th1. A replicação dos taquizoítas é progressivamente restrita pela liberação de interferon gama (INF) pelos linfócitos T (PFEFFERKORN, 1984; HALONEN et al., 2001). A subpopulação de linfócitos T CD4+ Th1 é capaz de inibir, através da produção de citocinas, a diferenciação e o crescimento das células e da produção de citocinas específicas da subpopulação de linfócitos T CD4+ Th2 e vice-versa. As células T CD4+ do tipo Th são uma fonte importante na produção de IFN e IL-12, durante a infecção pelo T. gondii (DENKERS et al., 1993). A eliminação dessas 32 células leva a um aumento na multiplicação do parasita nos tecidos. Contudo, camundongos com depleção de células T CD4+ sobrevivem à infecção pelo T. gondii devido à redução da resposta inflamatória (apesar de que alguns destes camundongos sucumbem mais tarde devido a infecção), enquanto os camundongos normais não depletados podem morrer precocemente com uma inflamação hiperimune. Mais recentemente, tem sido descrito que células não-T também estão envolvidas na produção de IFN- no cérebro de camundongos (KANG & SUZUKI, 2001). O fator solúvel mais importante na regulação da resposta imune na toxoplasmose é o IFN-. Sua produção após a infecção pelo taquizoíta pode resultar na imunossupressão transitória do hospedeiro, permitindo que o parasita se estabeleça durante a infecção aguda (CHANNON & KASPER, 1996). Para limitar a replicação dos taquizoítas, a resposta imune do hospedeiro age paradoxalmente promovendo a sobrevivência do T. gondii através da indução da diferenciação de formas taquizoítas para bradizoítas, as quais podem persistir por toda a vida do hospedeiro. O T. gondii desenvolve várias estratégias para escapar do sistema imune do hospedeiro: 1) invade, persiste e cresce em diferentes tipos celulares, incluindo macrófagos não ativados; 2) suprime as defesas do hospedeiro através da regulação da produção de fatores solúveis como o IFN-; 3) desfaz a ligação de imunoglobulinas da sua superfície (LUFT, 1989; CHANNON & KASPER, 1996; ROZENFELD et al., 2003) e 4) interfere nos mecanismos de apoptose das células hospedeiras infectadas e não infectadas (LÜDER et al., 2001; HEUSSLER et al., 2001). 3.2.3 Imunidade humoral O T. gondii também induz a uma imunidade humoral nos indivíduos infectados (SHER et al., 1995; TAYLOR et al., 1997; LI et al., 2000). A infecção pelo T.gondii estimula a produção de anticorpos do tipo IgM, IgG, IgA e IgE. Os anticorpos atuam nos taquizoítas extracelulares liberados após a lise de uma célula infectada. Esses 33 anticorpos limitam a replicação do parasita, promovendo a lise do taquizoíta através da ativação da via do complemento e também através da opsonização dos parasitas e do aumento da ação fagocitária dos macrofágos (FILISETTI & CANDOLFI, 2004). Esses mecanismos não oferecem proteção contra parasitas intracelulares, mas anticorpos como IgA secretor podem interferir com a interação inicial do parasita com as células hospedeiras das mucosas (ROBERTS & MCLEOD, 1999). Na prática clínica, a presença de anticorpos do tipo IgM é considerada como marcador da fase aguda, pois são os primeiros a serem secretados (já na primeira semana de infecção), atingindo níveis elevados em poucas semanas e então reduzindo-se bruscamente até desaparecer. No entanto, em virtude da melhora na sensibilidade dos testes laboratoriais, é relativamente frequente que baixos níveis de IgM residual sejam detectados após a fase aguda. Os níveis de IgG surgem ao final da primeira semana de infecção, ascendem rapidamente e persistem ao longo da vida. Em gestantes com IgM positivo, nas quais é imprescindível que seja determinado se a infecção é recente, com o objetivo de avaliar o risco de infecção fetal, podem ser usados o teste de avidez do IgG, pesquisa de IgA e IgE. (revisto em ORÉFICE & BAHIA, 2005). 3.3 Apresentação clínica A infecção pelo T. gondii pode ser dividida nas fases aguda, subaguda e crônica (PINKERTON et al., 1940; KRICK et al., 1989). A toxoplasmose aguda se caracteriza pela rápida multiplicação do parasita e sua disseminação por via hematogênica ou linfática e ocorre nos primeiros 8 a 12 dias pós-infecção. A fase aguda é geralmente subclínica no adulto imunocompetente (70% dos casos), manifestando-se de forma semelhante a um estado gripal, frequentemente não valorizado e não relatado pelo paciente. Em 30% dos casos é sintomática, manifestando-se com linfadenopatia, pneumonia, encefalite e doença ocular. Esta fase raramente é diagnosticada pela detecção do parasita nos fluídos corpóreos, tecidos ou secreções. O método mais comum de diagnóstico é a 34 detecção de anticorpos IgM. Sua presença é considerada como marcador da fase aguda. A transmissão do T. gondii da mãe para o feto ocorre em 30 a 40 % dos casos e varia de acordo com a idade gestacional em que acontece a infecção aguda (DESMONTS et al., 1985). Quanto maior a idade gestacional, maior a chance de infecção fetal, porém menor a gravidade da doença congênita. A infecção congênita pode apresentar-se no recém nato como: 1) infecção subclínica com cicatrizes de retinocoroidite, calcificações intracranianas e outros sinais que podem passar despercebidos; 2) doença neonatal que apresenta sinais clínicos bem evidentes ao nascimento como icterícia, exatema, petéquias, equimoses, febre ou hipotermia e sinais neurológicos como a tétrade de Sabin: hidrocefalia e/ou microcefalia, calcificações intracranianas, retinocoroidite e retardo mental, ou 3) doença pós-natal em que a criança nasce aparentemente saudável e desenvolve sintomas dias, meses ou anos após o nascimento. A fase subaguda é mais frequente na forma congênita. Uma vez diagnosticada toxoplasmose aguda em gestante, é imprescindível a identificação da infecção intrauterina pelo T. gondii. O teste de polimerase em cadeia (PCR) do líquido aminiótico tem sido utilizado por ser mais sensível, mais seguro e com resultados mais rápidos do que os exames feitos com o sangue do feto. Entretanto, resultados falso-positivos ou falso-negativos também podem ocorrer no PCR (GUY ET al., 1996; FOULON et al., 1999). O início da fase crônica é marcado pelo aparecimento dos bradizoítas, momento em que o parasita passa a se replicar lentamente. Cistos teciduais parecem ser “invisíveis” para o hospedeiro uma vez que existe pouca ou nenhuma evidência de processo inflamatório ao redor do cisto (STRITTMATTER et al., 1992). Nesse estágio o parasita mantém a infecção ao longo da vida do hospedeiro. A manifestação clínica mais comum na fase crônica é a retinocoroidite, que ocorre em 70% a 90% das crianças infectadas verticalmente e em 2 a 30% dos pacientes infectados horizontalmente (GILBERT & STANFORD, 2000). A retinocoroidite supostamente toxoplásmica (RCST) tem um caráter recidivante, sendo a recorrência mais frequente no primeiro ano após o episódio inicial (HOLLAND, 2003a). Estudo recente demonstrou que 79% dos pacientes acompanhados por mais de cinco anos tiveram recorrência da doença, e esta foi mais frequente no olho acometido previamente. (BOSCH-DRIESSEN et al., 2002). 35 3.4 Patologia A liberação dos taquizoítas resulta em destruição tecidual, decorrente da ruptura das células parasitadas. As células infectadas também sofrem a ação da resposta inflamatória do hospedeiro. Tais eventos compõem a patologia observada nos tecidos (KIERSZENBAUM, 1994; HOFF & CARRUTHERS, 2002). Não se sabe ainda se o T. gondii produz toxinas citolíticas. Contudo, a destruição tecidual também não parece ser decorrente da apoptose, uma vez que o parasita induz a célula parasitada a um estado anti-apoptótico (GOEBEL et al., 1998) e inibe a apoptose de células do sistema imune, o que diminui a inflamação. Como observado em outras doenças parasitárias, a patologia da infecção pelo T. gondii resulta da interação entre fatores do parasita (cepa, tamanho do inóculo, via de infecção, etc) e do hospedeiro (idade, estado nutricional e imunológico, fatores genéticos, etc). Isso explica o amplo espectro da patogenicidade, desde uma infecção inaparente até uma doença aguda fatal, com muitas situações intermediárias (DARCY & ZENNER, 1993). A infecção pelo T. gondii em humanos é muito comum. Em pacientes imunocompetentes é geralmente assintomática, resultado de uma imunidade duradoura contra a doença. Na fase crônica da toxoplasmose apenas a presença de anticorpos é notada e os cistos persistem ao longo da vida do hospedeiro em diferentes tecidos, na maioria das vezes sem provocar sintomas (DARCY & ZENNER, 1993). Torna-se sintomática apenas naqueles pacientes que apresentam RCST. A toxoplasmose ganhou maior destaque na medicina como uma das mais importantes infecções oportunistas após o surgimento da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA). A encefalite causada pelo T. gondii era observada em 40% dos pacientes com SIDA (antes do advento do tratamento antirretroviral) e era fatal em 10-30% dos casos (LUFT & REMINGTON, 1988; LUFT & REMINGTON 1992; LUFT & CHUA, 2000). A encefalite toxoplásmica e a 36 toxoplasmose disseminada têm sido observadas em pacientes com imunodeficiências por várias causas, tais como doença de Hodgkin ou terapia imunossupressiva para outras doenças (HO-YEN, 1992). 3.4.1 Toxoplasmose ocular A retinicoroidite supostamente toxoplásmica (RCST) é a causa mais comum de uveíte posterior em várias partes do mundo, incluindo regiões da Europa e Américas do Norte e do Sul (HOLLAND, 2003). A prevalência da doença ocular em pacientes infectados pelo T. gondii ainda não está bem estabelecida, mas sabe-se que o envolvimento ocular é mais frequente e mais grave em neonatos e adultos imunocomprometidos (BOSCH-DRIESSEN et al., 2002; SMITH & CUNNINGHAM, 2002; HOVAKIMYAN & CUNNINGHAM, 2002). A transmissão transplacentária ou congênita da toxoplasmose foi a primeira a ser conhecida como causadora das lesões em humanos. Entretanto, a importância da toxoplasmose congênita como causa da doença ocular passou a ser reconhecida a partir dos trabalhos de WILDER (1952) e PERKINS (1973). Estes autores mostraram que 70% das infecções congênitas levarão à formação de cicatrizes corioretinianas, dados confirmados por METS et al. (1997). A prevalência da doença ocular na toxoplasmose adquirida é incerta (WILSON et al., 1980; KOPPE & ROTHOVA, 1989) devido a dificuldade do diagnóstico diferencial com a toxoplasmose congênita pós-natal de aparecimento tardio (TCPN). A RCST é encontrada em 2 a 30% dos pacientes com toxoplasmose adquirida segundo GILBERT & STANFORDT (2000). GLASNER et al. (1992), estudando uma população do sul do Brasil, observaram prevalência pouco usual de toxoplasmose ocular e sugeriram que a inflamação congênita é uma improvável causa para a alta prevalência. A manifestação ocular típica da toxoplasmose consiste em uma retinocoroidite focal necrosante, acompanhada de reação vítrea, frequentemente associada a uma lesão satélite (sinal de recorrência). As lesões satélites foram observadas em 80% dos casos em uma série de 154 pacientes (BOSCH-DRIESSEN et al., 2002). 37 Manifestações atípicas incluem lesões extensas, eventualmente múltiplas e/ou bilaterais, forma punctata externa, neurorretinite, neurite, forma pseudomúltipla, esclerite e vitreíte sem lesão focal aparente (ORÉFICE &BAHIA, 2005; BOSCHDRIESSEN et al., 2002; SMITH & CUNNINGHAM, 2002; HOVAKIMYAN & CUNNINGHAM, 2002; LABALLETTE et al., 2002). A toxoplasmose ocular ativa apresenta-se como um foco bem definido de necrose coagulativa na retina, com a presença de um infiltrado inflamatório difuso na retina e na coróide. A resposta imune à infecção pelo T. gondii no olho é menos conhecida. Essa resposta tende a ser mediada por linfócitos T CD8+ e freqüentemente por uma classe do linfócito T CD4+ Th1. A indução dessa resposta imune depende de fatores que incluem a expressão intraocular do ligante do Fas (Fas L) ou CD-95, membro da família TNF, que pode promover a depleção de linfócitos T ativados no olho. Isto ocorre por apoptose após a interação das moléculas de Fas das células do infiltrado com moléculas de Fas L expressas nas células do parênquima do olho. Além disso, mesmo em circunstâncias normais, o fluido intraocular contém citocinas como o fator de crescimento e transformação beta (TGF) e outros mediadores que têm propriedades imunossupressivas (ROBERTS & McLEOD, 1999). Lesões oculares graves, extensas e bilaterais caracterizam-se por edema da retina e diversos graus de inflamação envolvendo as áreas necrosadas. A coróide apresenta alterações vasculares, hemorragias, infiltrados inflamatórios e edema. Pode ocorrer neurite óptica. Células mononucleares contendo parasitas são abundantes na retina e as zonas cicatriciais aparecem como áreas bem delimitadas de atrofia da coróide e da retina (HUTCHINSON et al., 1982). As lesões cicatrizam de forma centrípeta e as bordas desta cicatriz, que podem apresentar cistos, às vezes se apresentam hiperpigmentadas (ROBERTS & McLEOD, 1999). Também podem ocorrer microftalmo, nistagmo, estrabismo, irite e/ou atrofia óptica (HUTCHINSON et al., 1982). Várias teorias têm sido levantadas sobre a patogênese da toxoplasmose ocular recorrente, tais como: 1) rompimento dos cistos com liberação dos organismos vivos, que poderão infectar novas células; 2) rompimento de cistos com liberação de antígenos de Toxoplasma, resultando numa reação de 38 hipersensibilidade e 3) rompimento de cistos com liberação de organismos invasivos e antígenos. A aparência das lesões oculares nos pacientes com SIDA (frequentemente extensas, graves e algumas vezes multifocais e/ou bilaterais) pode ser confundida com retinite necrosante viral causada por herpes simples, varicela zoster ou citomegalovírus (CMV). O diagnóstico diferencial é feito, às vezes, através de prova terapêutica, sendo que a toxoplasmose ocular responde rapidamente às terapias com perimetamina e sulfadiazina ou outras terapias antiparasitárias alternativas (HOLLAND, 1988), enquanto a retinite viral responde às medicações antivirais. 3.4.2 Toxoplasmose ocular no modelo experimental O modelo experimental é muito importante para estudar aspectos da doença que por motivos éticos seriam impossíveis de serem estudados em humanos, além de apresentar a vantagem da possibilidade de controle das condições do experimento (linhagem do hospedeiro, cepa do parasita, tamanho do inóculo, via de infecção e outras), o que não ocorre na infecção natural. Como observado em outras doenças parasitárias, a patologia da infecção pelo T. gondii resulta da interação entre fatores do parasita e do hospedeiro. Assim, os resultados obtidos por diferentes laboratórios dificilmente são comparáveis, uma vez que os modelos experimentais geralmente não são idênticos, já que há variações do animal hospedeiro, via de infecção, cepa do Toxoplasma utilizada para a infecção, condições da cultura, e mesmo no número de passagens do parasita (ZENNER et al., 1998). O primeiro a produzir um modelo experimental de toxoplasmose foi HOGAN (1951) usando coelhos infectados com taquizoítas inoculados na carótida causando uma retinocoroidite aguda. FRENKEL (1953) infectou hamsters por via intraperitoneal com a cepa EK (sublimado da cepa RH) de T. gondii e demonstrou o desenvolvimento de retinite e irite, caracterizadas pela necrose e exsudato mononuclear, durante a fase crônica da infecção. JACOBS et al. (1954) e 39 BEVERLEY et al. (1954) descreveram independentemente o surgimento da toxoplasmose ocular após uma injeção de parasitas na câmara anterior dos olhos de coelhos. BEVERLEY (1961) mostrou infiltração coroidiana e presença de cistos de Toxoplasma em todos os tecidos da úvea de coelhos inoculados com T. gondii na câmara anterior. GARWEG (1998), utilizando a inoculação intravítrea de taquizoítas da cepa BK (avirulenta) em coelhos, observou o desenvolvimento de retinocoroidite e infiltrado inflamatório no vítreo, além de descolamento de retina e catarata que foram consideradas como complicações da via intravítrea. O coelho é freqüentemente escolhido como modelo experimental por se tratar de animal susceptível e com olhos grandes o suficiente para uma boa oftalmoscopia, diferente de animais de menor porte (NOZIK & O’CONNOR, 1971). Um estudo sobre oftalmite toxoplásmica em animais concluíu que a ocorrência do T. gondii é mais comum na coróide e no corpo ciliar do que na retina, na maioria dos animais, inclusive nos gatos (PIPER et al., 1970). Os componentes celulares das lesões intraoculares consistiam principalmente de macrófagos, linfócitos e alguns plasmócitos, observados principalmente ao redor dos vasos. PAVESIO et al. (1995) utilizaram o hamster inoculado via intraperitoneal com cistos da cepa ME 49 de T. gondii e encontraram retinocoroidite em ambos os olhos de todos os animais em fotografias do fundo de olho. O exame histopatológico dos olhos mostrou cistos e lesões na retina. Um modelo animal de pequeno porte é necessário para estudos controlados e de larga escala, para pesquisa do desenvolvimento, progressão e resolução da toxoplasmose ocular em resposta aos vários tratamentos. Estudos no modelo murino têm sido amplamente utilizados devido a maior facilidade de obtenção dos animais, especialmente quando são utilizados animais mutantes, o que ocorre frequentemente em experimentos na área de imunologia. O olho do camundongo, bem como do humano, é composto por três túnicas: túnica externa (esclera, limbo e córnea), túnica média ou úvea (íris, corpo ciliar e coróide) e túnica interna (retina) A retina é composta por 10 camadas paralelas: 1) epitélio pigmentar da retina (EPR), composto por uma camada de células cubóides, densamente pigmentadas 40 (melanina); 2) camada de fotorreceptores, que contém o segmento externo dos fotorreceptores (FR) sensível à luz; 3) membrana limitante externa, uma linha tênue, acelular, de coloração rósea à coloração por HE e que separa as camadas de FR e a camada nuclear externa; 4) camada nuclear externa, formada pelos núcleos dos FR; 5) camada plexiforme externa, onde ocorrem as sinapses entre os FR e as células bipolares e horizontais; 6) camada nuclear interna, composta pelas células bipolares, horizontais, amácrinas e células gliais de Müller; 7) camada plexiforme interna, região onde ocorrem as sinapses entre as células bipolares, as ganglionares e as amácrinas; 8) camada de células ganglionares; 9) camada de fibras nervosas e 10) membrana limitante interna, que não é vista neste cortes. Nas camadas internas (de 6 a 10) estão localizados os vasos da retina, formados por endotélio tênue. DUTTON & HAY (1983) evidenciaram em olhos de camundongos congênitamente infectados uma destruição tecidual que variou de pequena a total com calcificação distrófica. Entretanto, alguns camundongos não apresentaram nenhuma anormalidade. TEDESCO et al. (2005) demonstraram que camundongos C57BL/6 submetidos à instilação conjuntival de 5 x 103 bradizoítas da cepa ME 49 de T. gondii desenvolvem toxoplasmose ocular progressiva semelhante a que ocorre nos camundongos infectados por injeção intra-vítrea, porém sem as lesões no cristalino e retina decorrentes desta última via de inoculação. Experimentos com o modelo murino indicam o INF como a citocina crucial para resistência contra o T. gondii (GAZZINELLI et al., 1994; GRAVILESCU & DENKERS, 2001). Estudos mostram que o TNF-α exerce ação sinérgica com o INF na defesa contra o T. gondii (GAZZINELLI et al., 1994). IL-10 age regulando negativamente a produção de INF em camundongos C57BL/6 e BALB/c, sendo importante para o equilíbrio entre a imunidade protetora e o controle da inflamação (SUZUKI et al., 2000). MARX-CHEMLA et al. (1993) demonstraram que parasitas passam para a câmara anterior através da circulação do humor aquoso onde também são encontrados anticorpos anti-T. gondii. Infecções experimentais em camundongos mostram que células T CD8+ e CD4+ são necessários para evitar a multiplicação parasitária irrestrita, demonstrando a importância da imunidade celular no controle da infecção (GAZINELLI et al., 1992). CALABRESE et al. (2007) 41 compararam o nível sérico e na câmara anterior de diversas citocinas durante a infecção pelo T. gondii em camundongos C57BL/6. Apesar dos muitos estudos na área, os mecanismos imunes que controlam a toxoplasmose ocular ainda não estão totalmente claros. 4 Apoptose Do ponto de vista morfológico e bioquímico, a apoptose é uma forma distinta de morte celular, geneticamente programada, que elimina células indesejadas (supérfluas ou defeituosas) (LÜDER et al., 2001). É filogeneticamente antiga, presente em todos os organismos multicelulares (GAVRILESCU LC & DENKERS, 2003a). É um processo ativo, dependente de energia, com controle intrínseco, influenciado por fatores externos. KERR et al. (1972), foi quem primeiro descreveu a apoptose como forma distinta de morte celular, e propôs o termo apoptosis (originado do grego) para denominá-la. O termo significa “queda” ou “separação” e foi utilizado em analogia à queda das folhas das árvores no outono, uma alusão ao papel da apoptose como reguladora da população celular (CUMMINGS et al., 1997). Vários aspectos diferenciam a apoptose da necrose: 1) a apoptose é um processo ativo, que necessita de energia e é caracterizada por uma cascata de eventos bioquímicos decorrente da ativação e expressão de genes específicos e síntese de proteínas; 2) na apoptose não há extravazamento de conteúdo celular para o interstício e consequentemente não há inflamação e danos às células vizinhas e 3) enquanto a necrose envolve grupos de células, a apoptose é um processo que afeta a célula individualmente (WILLIE et al., 1980; SEARLE et al., 1982). WILLIE et al. (1980) descreveram morfologicamente a apoptose. Inicialmente a célula em apoptose perde o contato com as células vizinhas (anoiquia – FIG 1A) deixando um halo ao seu redor, o núcleo apresenta condensação da cromatina junto da membrana nuclear formando figuras crescentes (FIG 1C), ocorre condensação do 42 citoplasma e aparecem protuberâncias na superfície externa da célula (zeiose – FIG 1B, C e D). As organelas tornam-se compactas, mas permanecem estruturalmente intactas. Ocorre a fragmentação nuclear (FIG 1E) e a formação dos corpos apoptóticos a partir das protuberâncias na superfície celular (FIG 1F). Alguns corpos apoptóticos contêm mais de um fragmento nuclear enquanto que outros contêm apenas elementos citoplasmáticos (SEARLE et al., 1982). Os corpos apoptóticos são rapidamente fagocitados por células vizinhas (FIG 1G), bem como por macrófagos, monócitos, células epiteliais, endotélio vascular e células tumorais. A apoptose é um processo que está continuamente acontecendo, mas é raramente observada em animais saudáveis, pois as células apoptóticas são potentes gatilhos da fagocitose e, deste modo, são rapidamente removidas do meio. A eversão da fosfatidilserina (um fosfolípide presente na supefície interna da membrana celular de vertebrados) através da ação das flipases é um importante sinalizador para que corpos apoptóticos e/ou células em apoptose sejam fagocitadas (MARTIN et al., 1995; HACKER, 2000). Outros receptores moleculares, dentre estes moléculas da família das citoadesinas, estão também relacionados com a sinalização para fagocitose específica da apoptose. A apoptose pode ser desencadeada por meio de três vias principais em resposta a estímulos externos ou internos: 1) junção de um ligante ao seu receptor de morte na superfície da célula – via do receptor de morte (TIBBETTS et al.; 2003); 2) liberação do citocromo C da mitocôndria para o citosol – via mitocondrial (GREEN & REED, 1998) ou 3) liberação de granzima por células NK e CTL – via grânulosdependente (LIEBERMAN, 2003). 43 FIGURA 1 – Morfologia da apoptose: A) Anoiquia; B) Zeiose; C) Condensação da cromatina, formando crescentes; D) Condensação da cromatina, formando o “buraco negro”; E) Fragmentação do núcleo; F) Corpúsculos apoptóticos; G) Canibalismo celular. Na via extrínseca, ocorre a sinalização do meio extracelular para o intracelular através de receptores de morte na superfície, como o Fas produzido pelas células do sistema imune que se liga à molécula ligante Fas L. Pode acontecer também pela ativação da super família dos receptores do fator de necrose tumoral alfa (TNF R1, TNF R2), pelo seu ligante TNF-α ou pela ligação dos receptores do ligante indutor da apoptose relacionado ao TNF (TRAIL R1, TRAIL R2) ao seu ligante TRAIL. O receptor, após ser ativado pelo seu ligante, trimeriza-se e sua porção citoplasmática se liga a uma proteína adaptada. Essa proteína pode ser a TRADD (TNF receptor apoptotic death domine) no caso do TNF-α, ou a FADD (Fas-associated death domain) no caso do Fas (GAVRILESCU & DENKERS, 2003a). Ocorre então a ativação da cascata enzimática intracelular envolvendo “proteases de cisteína aspartato-específicas” ou “cisteíno-proteases” conhecidas como caspases. As caspases são encontradas como proenzimas em células não estimuladas. Durante a ativação, um prodomínio N-terminal de 3 a 24 kDa é clivado, e a enzima remanescente é dividida em uma subunidade maior (17 a 21 kDa) e uma menor (10 a 13 kDa), que juntas formam a molécula ativa. Inicialmente são ativadas as caspases iniciadoras (caspases 8 e 10) que irão por sua vez clivar a procaspase 3 transformando-a em sua forma ativa, a caspase 3. A caspase 3 (caspase efetora) irá promover os eventos que culminarão com a morte celular (NICHOLSON, 1999). A via intrínseca da apoptose ou a via mitocondrial ocorre devido ao aumento da permealidade da membrana mitocondrial ao citocromo C, induzido por irradiação 44 gama ou ultravioleta, agentes tóxicos, estresse celular, radicais livres ou falta de fator de crescimento (GREEN & REED, 1998). O citocromo C é normalmente encontrado no espaço entre as membranas externa e interna da mitocôndria, e quando liberado para o citoplasma liga-se a Apaf-1 (apoptosis activating factor 1) que na presença de ATP ativa a caspase iniciadora 9 (GREEN & REED, 1998). A caspase iniciadora 9 ativa a caspase 3 e toda a via a jusante desencadeando a apoptose. A mudança de potencial da membrana mitocondrial e a liberação do citocromo C são regulados pelas proteínas da família Bcl-2 encontradas na membrana externa da mitocôndria, algumas com função anti-apoptótica (Bcl-2, Bcl-xl ou Mcl-1) e outras pró-apoptótica (Bax, Bak ou Bik), são encontradas na membrana externa da mitocôndria (ADAMS & CORY, 1998). Segundo JOZA (2001), a via mitocondrial pode ocorrer também através da ativação do fator indutor da apoptose (AIF), que localiza-se entre as membranas interna e externa da mitocôndria e é liberado para o citoplasma após os sinais de morte. O AIF age independentemente das caspases, uma vez que alcança o núcleo e interage diretamente com o DNA, causando condensação e fragmentação deste, através da ativação de endonucleases (GESKE & GERSCHENSON, 2001). A via grânulo-dependente é o meio efetor através do qual linfócitos T citotóxicos (CTL) e células NK eliminam células-alvo infectadas. O mecanismo envolve a introdução de granzima produzida pelas CTL e células NK, através de uma proteína com função de poro, a perfurina. As granzimas saltam o esquema convencional de ativação da cascata das caspases e ativa diretamente as caspases iniciadora 10 e efetoras 3 e 7 (THORNBERRY et al., 1997). A granzima pode também clivar diretamente fatores intranucleares, resultando em apoptose caspaseindependente. Além disso, pode levar a liberação do citocromo C, ativando a via mitocondrial. As três vias convergem para a ativação da caspase 3, que por sua vez ativa as caspases efetoras 6 e 7. A ativação das caspases efetoras 3, 6 e 7 resulta na clivagem de várias proteínas-alvo com função estrutural e regulatória no citosol e no núcleo, deste modo resultando em desmantelamento celular (THORNBERRY & LAZEBNIK, 1998). A poli (ADP-ribose) polimerase – PARP – é uma proteína nuclear envolvida nos mecanismos de reparo do DNA, sobrevivência celular, proliferação e diferenciação. A PARP representa um dos alvos principais das caspases efetoras 3, 45 6 e 7. A detecção através do Western Blot, de fragmentos da PARP é amplamente utilizada para revelar a apoptose em células, tecidos e órgãos (GOEBEL et al., 2001). Outras enzimas importantes participam da apoptose: 1) a endonuclease endógena, presente no núcleo celular, é ativada pelos íons cálcio e magnésio e atua promovendo a fragmentação internucleossômica do DNA formando fragmentos de 180 a 200 pares de bases (ARENDS et al., 1991); 2) a transglutaminase promove a ligação cruzada entre proteínas citoplasmáticas e membrana celular, tendo como principal finalidade manter a integridade da membrana celular durante a formação dos corpos apoptóticos, impedindo a liberação do conteúdo intracelular para o interstício (ARENDS et al., 1991); 3) a enzima flipase fornece energia e promove a eversão da fosfatidilserina, facilitando o reconhecimento dos corpos apoptóticos pelos fagócitos. As caspases também atuam na eversão da fosfatidilserina (MARTIN, 1995; HACKER, 2000). A apoptose participa de processos fisiológicos e patológicos. Dentre os primeiros, podemos destacar sua participação: 1) na embriogênese onde é utilizada como forma de suprimir estruturas embrionárias vestigiais (como na involução genital durante a diferenciação sexual de mamíferos) ou como meio de alcançar a forma adulta futura do organismo (como na formação dos dedos da mão humana onde as células que estão nos espaços interdigitais sofrem apoptose); 2) na renovação celular onde atua eliminando células indesejadas abrindo espaço para as células novas, assim promove o controle da população celular, ação contrária a da mitose (MEIER et al., 2000); 3) na regulação e funcionamento do sistema imune onde atua eliminando os linfócitos auto-reativos durante a diferenciação linfocitária e descartando os linfócitos antígenos-específicos no final de uma resposta imune (BAUMANN et al., 2002) e 4) como mecanismo efetor através do qual linfócitos T e células NK eliminam células-alvo infectadas na imunidade inata e adaptativa contra patógenos intracelulares (WILLIAMS, 1994; LILES, 1997). A apoptose pode ser considerada como importante marcador de resolução de inflamação e parece ser um dos principais responsáveis pelo privilégio imunológico no olho, cérebro e gônadas (FERGUSON & GRIFFITH, 2007). 46 Dentre os estados patológicos podemos destacar aqueles decorrentes do aumento da apoptose, como as doenças degenerativas, ou da diminuição da apoptose, como as doenças expansivas ((GAVRILESCU LC & DENKERS, 2003 a). A apoptose exerce também um papel crítico na regulação da resposta hospedeira durante infecção por vírus, bactérias e protozoários intracelulares (WILLIAMS, 1994; LILES, 1997). A apoptose também está envolvida na patogenia de várias doenças oculares tais como retinose pigmentar, glaucoma, uveítes, catarata e doenças da retina (FERGUSON & GRIFFITH, 2007). No cristalino, normalmente a diferenciação celular é acompanhada de degeneração nuclear (MODAK et al., 1969, MODAK et al., 1970), similar à degradação oligonucleossomal (APPLEBY & MODAK, 1977) frequentemente descrita na apoptose (WILLIE et al., 1980). Apesar das mudanças, as células do cristalino persistem ao longo da vida do indivíduo, enquanto que as células apoptóticas são, normalmente, potentes gatilhos para fagocitose. Diferentemente também do que ocorre nas células apoptóticas que morrem randomicamente, a diferenciação das fibras cristalinianas seguem um padrão altamente ordenado de progressão temporal. Nos pacientes com catarata, no entanto, o sistema de defesa contra o estresse oxidativo e os raios ultravioleta parece ser deficiente o que leva a apoptose nas células epiteliais do cristalino e subseqüente opacificação lenticular (LI et al., 1995). O papel central da hipertensão intraocular na fisiopatologia do glaucoma vem sendo questionada desde que alguns pacientes apresentam perda progressiva de células ganglionares apesar da normalização da pressão ocular (BRUBAKER, 1996), além do que, um sexto dos pacientes que fazem lesão glaucomatosa não apresenta hipertensão ocular (LISEGANG, 1997). Existem evidências histológicas e eletrofisiológicas que demonstram que as células ganglionares são as únicas células acometidas. Vários fatores têm sido implicados na morte das células ganglionares, dentre eles a apoptose (KAUSHIK et al., 2009). Esta nova visão sobre o glaucoma tem levado a esforços em busca de uma terapêutica objetivando neuroproteção, além da tradicional terapia hipotensora. A retinose pigmentar, um grupo de condições hereditárias envolvendo a morte de fotorreceptores, representa a causa mais prevalente de baixa acuidade visual na 47 população ativa de países desenvolvidos. A retinose pigmentar está relacionada com a perda de função e viabilidade dos bastonetes. A despeito da grande heterogeneidade de alterações genéticas que podem causar a retinose pigmentar, estudos em modelos experimentais em animais de pequeno porte indicam que a apoptose é uma via final comum de morte de células fotorreceptoras (PORTERACAILLIAU et al, 1994). RAO et al. (2008) demonstraram não haver evidências de apoptose em fotorreceptores nas fases iniciais da uveíte autoimune experimental (EAU – experimental autoimmune uveitis), apesar de a liberação de citocromo C para o citosol estar aumentada. O estudo mostrou também que o nível de alfa A-cristalin aumenta trinta e três vezes no segmento externo dos fotorreceptores e parece proteger estas células contra a apoptose induzida pelo estresse oxidativo da mitocôndria. Células imunocompetentes ativadas são deletadas por apoptose após a fase aguda da inflamação em diversas doenças, mas na doença de Behçet a inflamação persiste. NAKAMURA et al (1996) mostraram que nesta doença os pacientes com uveorretinite ativa apresentam expressão diminuída de Fas em células T CD4+ e alta expressão nas células T CD8+ se comparados aos pacientes sem uveorretinite ativa e aos controles sem a doença, o que sugere que células T CD4+ ativadas com expressão deficiente de Fas, ou seja que não são deletadas por apoptose, podem ser as responsáveis pela inflamação crônica severa. 4.1 Apoptose na toxoplasmose A célula em processo de apoptose direciona toda sua reserva energética para sistematicamente desmanchar a célula no lugar de se envolver em atividades biossintéticas, deste modo se torna um provedor pobre para um patógeno intracelular. Além disso, a apoptose exerce um papel crucial no controle da resposta imune (BAUMANN et al., 2002) como um mecanismo efetor através do qual células NK e linfócitos T citotóxicos eliminam células-alvo infectadas (LIEBERMAN, 2003) e 48 como resposta inata das células infectadas por parasitas intracelulares (WILLIAMS, 1994). Assim, o T. gondii como parasita intracelular obrigatório tem duas razões igualmente importantes para interferir na apoptose das células do hospedeiro. Curiosamente, o T. gondii inibe e induz apoptose nas células do hospedeiro. Inibir a apoptose da célula hospedeira é uma estratégia que permite o desenvolvimento e a sobrevivência intracelular do parasita e a induzir a apoptose das células do sistema imune leva a uma imunossupressão relativa permitindo a sua evasão imune. WEI et al. ( 2002) demonstraram que células dendríticas humanas infectadas pelo T. gondii são resistentes à apoptose, mas deflagram a apoptose contato-dependente em células T citotóxicas. A infecção aguda pelo T. gondii, tanto em humanos quanto em camundongos leva a uma imunossupressão transitória determinada pela diminuição de anticorpos e de resposta de células T a antígenos homólogos e heterólogos (WING et al., 1983; LUFT et al., 1984; YANO et al., 1987). Dentre outros fatores, a apoptose de linfócitos T desencadeada pelo T. gondii inibe a resposta imune contra o parasita (WEI et al., 2002). Altos níveis de apoptose em esplenócitos têm sido associados com multiplicação parasitária irrestrita o que leva a altas cargas parasitárias em vários tecidos (GRAVILESCU & DENKERS, 2001). A apoptose no baço não se restringe a populações específicas, mas foi detectada em linfócitos T CD4+ e CD8+, linfócitos B, células NK e granulócitos (GRAVILESCU & DENKERS, 2003b). Estudos sugerem que a interação Fas-Fas L é crucial para a apoptose desencadeada pelo T. gondii. A infecção pelo parasita aumenta a expressão de Fas na placa de Peyer (LIESENFELD et al., 1997), nos esplenócitos e nos olhos (HU et al., 1999). Além disso, nos camundongos mutantes sem o sistema Fas-Fas L a apoptose induzida pelo T. gondii é abolida (LIESENFELD et al., 1997; GRAVILESCU & DENKERS, 2003b). A expressão de Fas-Fas L e a apoptose mediada por Fas-Fas L em camundongos infectados com o T. gondii parecem ser reguladas pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, IL-12 e INF-, e podem ser contrabalançadas pela ativação do NF-κB2 (CAAMANO et al., 2000). A inibição da apoptose nas células parasitadas é descrita em diversos trabalhos (NASH et al., 1998; GOEBEL et al., 1999; CHANNON et al., 2002; PAYNE et al., 2003). A resistência à apoptose foi observada em células parasitadas de 49 humanos e de camundongos tratadas com diversos indutores de apoptose, incluindo citotoxicidade mediada por CTL, irradiação e abstinência de fator de crescimento (HISAEDA et al., 1997; CHANNON et al., 2002). 4.1.1 Apoptose na toxoplasmose ocular Apesar de vários estudos mostrarem a importância da apoptose no estabelecimento da interação parasita-hospedeiro, pouco se sabe a respeito da apoptose no olho durante a infecção pelo T. gondii. SHEN et al. (2001) demonstraram que os olhos de camundongos selvagens não infectados expressam constitucionalmente níveis mais altos de moléculas pró-apoptóticas que o cérebro e que a apoptose é mais frequente no olho que no cérebro durante a infecção. Nesse trabalho, os autores também demonstram que não há diferenças no grau de inflamação e de apoptose nos dias 1, 14 e 28 após a infecção nos olhos de camundongos B6MRL/1pr e B6MRL/gld (com defeito na expressão de Fas e Fas L, respectivamente) se comparados aos camundongos selvagens, sugerindo que a apoptose no olho durante a infecção intraperitoneal não é dependente de Fas e Fas L. Ao contrário, HU et al., 1999, demonstraram que a intensidade da inflamação foi maior nos mutantes B6MR/1pr e B6MR/gld que nos selvagens, sugerindo que Fas e Fas L poderiam ser importantes na deflagração da apoptose no olho durante a infecção intracameral pelo T. gondii. Entretanto, este resultado pode ter sido influenciado pelo trauma ocular provocado pela via de inoculação utilizada, ao modificar a resposta inflamatória e à apoptose. CALABRESE et al. (2007) demontraram que durante a infecção pelo T. gondii em camundongos C57BL/6 o nível sérico de Fas e seu ligante reduz 20% enquanto que no humor aquoso o nível de Fas aumenta 82% e Fas L 56%. 50 OBJETIVOS 51 A presente tese teve como objetivos: 1. Analisar as alterações morfométricas na espessura e na relação perímetro/área da retina na toxoplasmose ocular no modelo murino. 2. Pesquisar apoptose em cortes de retina de animais infectados e não infectados. 52 MATERIAIS E MÉTODOS 53 1 Animais Camundongos C57BL/6 fêmeas, com peso entre 15 a 18 gramas, fornecidos pelo Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL) do Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Rio de Janeiro – RJ. 2 Parasitas Cistos tissulares da cepa ME-49 de Toxoplasma gondii isolados do cérebro de camundongos C57BL/6, com aproximadamente 30 dias de infecção foram utilizados para as inoculações intraperitoneais (i.p.). Esta cepa foi mantida através de passagens sucessivas (inoculação intraperitoneal) em camundongos da mesma linhagem. 2.1 Isolamento e purificação dos cistos Após os camundongos serem mortos em câmara de CO2, o cérebro foi retirado através de método cirúrgico em condições assépticas em fluxo laminar e cortado em pequenos fragmentos em Phosphate Buffer Saline (PBS). Seguiram-se sucessivas passagens utilizando seringa e agulhas de diferentes calibres (18G a 23G), para maceração dos tecidos. O macerado do cérebro, contendo os cistos tissulares homogeneizados em PBS, foi submetido a passagem por tela separadora de células com malha de 60 mesh (“Cell dissociation sieve-tissue grinder kit”, código CD – 1, SIGMA St. Louis USA), para a remoção de fragmentos de tecido e de debris celulares. Após esse procedimento, o macerado foi distribuído em tubos de 15 ml, ressuspenso em solução de PBS e centrifugado durante 10 minutos a 400 g. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento ressuspenso em meio Eagle, contendo 25% de Dextran 54 (SIGMA), na proporção de um cérebro para cada 2,5 ml de solução, para a remoção dos restos de tecido cerebral. Esta suspensão foi centrifugada por 10 minutos a 2200 g e o sedimento contendo os cistos foi ressuspenso em meio DMEM. Após homogeneização, nova centrifugação foi realizada durante 10 minutos a 400 g, para a retirada do Dextran. A contagem da suspensão foi realizada entre lâmina e lamínula (24 x 32 mm), na área total da lamínula, ao microscópio de luz (FREYRE, 1995 e POPIEL, 1996). A suspensão foi ajustada para chegar a 200 μl 3 Infecção Oito camundongos foram infectados com 30 cistos de T. gondii cepa ME 49 em 200 μl de meio EAGLE, intraperitonealmente (IP). No 60o dia os animais foram sacrificados em câmara de CO2 e enucleados. Os olhos foram processados para microscopia de luz. Os doze animais do grupo controle receberam intraperitonealmente 200l de PBS sem parasitas e foram sacrificados no mesmo período descrito anteriormente. 4 Processamento das amostras Após enucleação, os olhos foram seccionados sagitalmente em duas metades (medial e lateral), sendo processada para microscopia de luz. As amostras foram fixadas por um período de 12 horas em solução a 2% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em 0,1M de tampão cacodilato de sódio, pH 7,4 (KARNOVISKY, 1965 – modificado). A seguir, o material foi desidratado em série crescente de etanol, infiltrado em solução de etanol a 100% e a seguir em xilol. As amostras foram, então, processadas rotineiramente em um histotécnico e incluídas em parafina em moldes plásticos apropriados. Os cortes semi-seriados foram obtidos em micrótomo (Micron - HM360). Os cortes destinados a análise morfológica 55 e morfometria foram corados com Hematoxilina e Eosina (HE). As lâminas foram observadas em microscópio de luz Zeiss - Axioplan dos Departamentos de Ultraestrutura e Biologia Celular e de Protozoologia do IOC – FIOCRUZ. 5 Morfometria As imagens foram digitalizadas em microcâmera (JVC TK-1270/JGB) e transferidas para o analisador de imagens (Kontron Elektronics, Carl Zeiss – KS300 versão 2.0). 5.1 Mensuração da espessura da retina Para as análises foram considerados três grupos de resultados: 1) medida da espessura no foco de retinite (Fig 2), 2) medida da espessura da retina de camundongos infectados fora dos focos de retinite e 3) medida da espessura da retina nos olhos dos camundongos controles. Após a identificação do foco de retinite, foram feitas três medidas, uma passando pelo centro do foco e duas periféricas a cerca de 50 μm da medida central. O epitélio pigmentar da retina não foi incluído na medida da espessura da retina, uma vez que em algumas áreas, devido à presença de descolamento de retina, poderia haver erro nesta medida (superestimativa da espessura da retina nas áreas com descolamento). Foram feitas três medidas com distância de cerca de 50 μm entre si nos olhos dos camundongos infectados, fora dos focos de retinite e nos olhos dos camundongos controles. Foram analisados pelo menos doze secções dos olhos de cada animal. Foram feitas ao menos três réplicas de cada medida e a seguir tomada a média das réplicas para cada animal. 56 FIGURA 2 – Espessura da retina no foco de retinite 5.2 Relação perímetro/área da retina A fim de determinar a distorção provocada pela infecção na arquitetura da retina e de suas camadas foi utilizada a relação perímetro/área (FIG 3), tomada neste trabalho como medida de anfractuosidade (anfractuosidade: saliência, depressão ou sinuosidades irregulares). O desenho do perímetro a ser estudado foi feito manualmente utilizando o KS 300 (FIG 3), que forneceu o valor em micrômetros do perímetro e micrômetros2 o valor da área. A mensuração perímetro/área foi feita em cada microfotografia e a seguir foi feita a média das réplicas para cada animal. Neste trabalho, por questão técnica, consideramos seis camadas da retina: 1) camada de fotorreceptores – CFR, 2) camada nuclear externa – CNE, 3) camada plexiforme externa – CPE, 4) camada nuclear interna – CNI, 5) camada plexiforme interna – CPI e 6) camada de células ganglionares e fibras nervosas – CGFN. As 57 camadas limitantes externa e interna não foram consideradas por serem vistas como uma linha muito tênue e, portanto, não ser viável a mensuração de suas respectivas áreas. As camadas de células glanglionares e de fibras nervosas foram analisadas em conjunto devido à pequena espessura de ambas. ‘FIGURA 3 – Relação P/A 5.3 Análise Estatística Os dados foram submetidos à estatística descritiva, teste de normalidade e de homocedasticidade utilizando os programas SAEG (Sistema para Análise Estatística, versão 9.1, 2007, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG) e SAS (Statistical Analysis System, versão 8.0, SAS Institute, Cary, NC, EUA). Para análise de variância foi utilizado o programa SAS. Para estatística inferencial foi feito o teste de correlação de Pearson, utilizando o programa SAEG para o caso de distribuição normal dos dados e teste de Mann-Whitney para análise não paramétrica dos dados de distribuição não normal. 6 Reação de TUNEL 58 Para pesquisa de apoptose foram utilizados critérios morfológicos associados à reação de TUNEL – “Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End Labeling” ou marcação in situ da fragmentação do genoma com transferase terminal de desoxinucleotídeo (TdT- FragEL TM DNA Fragmentation DetectionKit, Cat QIA33, Calbiochem). As lâminas silanizadas com os cortes histológicos passaram por dois banhos de xilol de 5 minutos cada um. A seguir, os cortes foram hidratados em banhos decrescentes de etanol, sendo dois banhos de álcool absoluto por 5 minutos cada e banhos de 3 minutos em álcool a 95%, álcool 90%, álcool 80% e álcool 70%. Os cortes foram então lavados em TBS 1X. Para permitir maior penetração do tampão contendo TdT e nucleotídeos marcados, foi feita a imersão em Tampão Citrato pré-aquecido por 5 minutos e posteriormente aplicada a proteinase K (2mg/ml) diluída em Tris 10 mM na proporção 1:100 durante 20 minutos, sendo em seguida lavado com TBS 1X. Foi utilizado o peróxido de hidrogênio a 30% vol diluído em metanol na proporção 1:10 durante 5 minutos a fim de bloquear a peroxidase endógena, sendo o material lavado a seguir com TBS. O excesso de solução ao redor do corte foi removido e as lâminas foram cobertas com tampão de equilíbrio por 10 minutos. Solução contendo 60 μl da enzima TdT diluída (57 μl de Labeling reaction mix e 3 μl de enzima TdT) foi aplicada sobre cada corte, que por sua vez foram cobertos com protetores plásticos (Parafilme) e incubados em câmara úmida a 37o C durante 24 horas. Depois os protetores plásticos foram removidos, os cortes foram lavados em 1X com TBS e cobertos com 100 μl de tampão de parada (stop buffer) por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, os cortes foram novamente lavados em 1X com TBS e cobertos com 100 μl de tampão de bloqueio por 10 minutos em temperatura ambiente. Foi feita a diluição do conjugado em tampão de bloqueio na proporção de 1:50. Os cortes foram cobertos com 100 μl da solução e incubados por 45 minutos, em câmara úmida, em temperatura ambiente e posteriormente lavados em 1X com TBS. 59 Para revelar a reação, os cortes foram cobertos com 100 μl de DAB por 15 minutos em temperatura ambiente e em seguida lavados com água destilada. Os cortes foram submetidos a contracoloração com verde de metila por 20 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente, os cortes foram desidratados em 2 banhos (4X) em álcool absoluto e 1 banho (4X) em xilol. Por fim, montaram-se as lâminas. 60 RESULTADOS 61 1 Descrição da morfologia do olho normal: grupo controle Neste estudo não observamos alterações morfológicas ao exame histopatológico dos olhos dos camundongos do grupo controle (FIG 4). FIGURA 4 – Olho normal (HE) – animal controle: a) Esclera, b) coróide, c) membrana de Bruch, d) epitélio pigmentar da retina, e) fotorreceptores, f) membrana limitante externa – tênue membrana acelular coranda em rosa pelo HE, g) camada nuclear externa – núcleo dos fotorreceptores, h) camada plexiforme externa, i) camada nuclear interna, j) camada plexiforme interna, k) camada de células ganglionares, l) camada de fibras nervosas. 2 Análise dos olhos dos camundongos infectados pelo T. gondii Os olhos dos animais no 60º dia após infecção IP com 30 cistos de T. gondii apresentaram focos de infiltrado inflamatório, células pigmentadas invadindo a retina neurossensorial e formas císticas contendo o parasita. Os cistos encontrados na camada plexiforme interna não mostraram celulas inflamatórias adjacentes (FIG 5). Infiltrado inflamatório, edema e reação glial foram observados na retina (CPI e CGFN, especialmente nas regiões perivasculares), na interface vitreorretiniana e no vítreo. Foi evidenciada a formação de lacunas nas CFR, CNE e CNI (FIG 5, 6B, 7A e B, 8A). Células pigmentadas foram vistas nas diversas camadas da retina 62 neurossensorial, às vezes em grumos. Estas células provavelmente migraram do EPR e, ao fazê-lo, desorganizaram as camadas da retina em seu trajeto (FIG 6B, 7A e B, 8A). FIGURA 5 – Cisto de Toxoplasma gondii (HE). Cisto de T. gondii na CPI (seta amarela). Vacuolização nas CFR, CNE e CNI (setas vermelhas). FIGURA 6 – Vasculite retiniana e retinite (HE): A e B) Infiltrado inflamatório perivascular (seta amarelas), células inflamatórias no vítreo e na interface vitreorretiniana (setas pretas). B) Reação glial, células pigmentadas (setas vermelhas) e vacuolização difusa na CFR. A desorganização das camadas da retina foi um achado freqüente, apresentando-se como aumento ou diminuição da espessura da camada, 63 sinuosidade e perda da regularidade – aumento da anfractuosidade (FIG 6B, 7A e B, 8A e B). A B FIGURA 7 – Migração de células pigmentadas (HE): A e B) Células pigmentadas invadindo a retina neurossensorial (setas vermelhas), vacúolos na CFR, CNE e CNI, além de desorganização nas camadas. FIGURA 8 – Desorganização da arquitetura da retina (HE): A e B) Infiltrado inflamatório nas camadas internas da retina (setas vermelhas), células inflamatórias no corpo vítreo (setas pretas) e descolamento da retina neurossensorial (setas amarelas). A) Vasculite (seta branca) e desorganização das camadas externas da retina. B) Desorganização da camadas internas: plexiforme interna, de células ganglionares e de fibras nervosas. Descolamento da retina neurossensorial foi encontrado em alguns cortes (FIG 8A e B). Células inflamatórias foram encontradas na câmara anterior e na cavidade vítrea, inclusive na região do corpo ciliar. 64 3 Morfometria 3.1 Espessura da retina A variável espessura da retina mostrou distribuição normal pelo teste de Lilliefors e homocedasticidade (efeito posição de medida) pelo método Cochran & Bartlett. A seguir foi realizada estatística simples para variáveis contínuas para cada grupo (TAB. 1), mostrando coeficiente de variação menor que 20% (baixa instabilidade) e número amostral suficiente para cada grupo. TABELA 1 Estatística simples para variável contínua espessura da retina Número de Observações Média Geral Desvio Padrão Coeficiente de Variação Amostra Ideal (10%) ANIMAIS NÃO INFECTADOS INFECTADOS NO FOCO DE RETINITE 36 121,2 14,6 12,0 5,96 24 183,3 15,99 8,7 3,3 INFECTADOS FORA DO FOCO DE RETINITE 24 147,3 12,2 8,3 2,96 A tabela 2 mostra estatística com quebras para variável espessura da retina em animais infectados para cada posição de medida, demostrando que a instabilidade foi baixa (CV menor que 20%) e que o número amostral foi suficiente. TABELA 2 Estatística simples para variável espessura da retina em animais infectados para cada posição Número de Observações Média Geral Desvio Padrão Coeficiente de Variação Amostra Ideal (10%) ESQUERDA 16 164,8 22,4 13,6 8,3 CENTRO 16 164,8 24,9 14,8 9,96 DIREITA 16 163,3 23,1 14,2 9,1 65 As médias de espessura da retina para cada posição de medida em animais infectados e não infectados pode ser vista na tabela 3. Nos animais infectados, a tabela 4 mostra as médias de espessura da retina considerando a posição de medida e a presença ou ausência de foco de retinite no local de medida. TABELA 3 Comparação entre as médias da variável espessura da retina para cada posição em animais infectados e não infectados Não infectados (1) Infectados (2) Esquerda Centro 121,5 ± 14,8 121,1 ± 15,4 164,8 ± 22,4 167,8 ± 24,9 (1) Número de observações para cada posição: 12 (2) Número de observações para cada posição: 16 Direita 121,1 ± 14,9 163,3 ± 23,1 TABELA 4 Médias da espessura da retina de animais infectados para cada posição e considerando se a medida foi feita em um foco de retinite ou não No Foco (1) Fora do foco (1) Esquerda 182,3 ± 14,7 147,3 ± 12,4 Centro 187,7 ± 16,6 147,9 ± 12,2 Direita 180,1 ± 17,7 146,6 ± 13,7 A correlação geral entre as medidas de localização (esquerda, centro e direita) tomadas em indivíduos não infectados e infectados, no foco ou fora do foco de retinite pode ser observada na tabela 5, mostrando alta magnitude (aproximadamente 99%) e forte significância (p=0.000), o que sugere que as respostas poderiam ser medidas em apenas uma destas localizações específicas sem comprometimento do resultado final. TABELA 5 Correlações paramétricas de Pearson para espessura da retina em cada posição de medida Variável Esquerda Esquerda Centro Variável Centro Direita Direita Observações 28 28 28 Correlação 0.9949 0.9890 0.9928 Significância 0.000 0.000 0.000 Na análise de variância, com delineamento inteiramente casualizado, o estudo da localização (esquerda, centro e direita) nas medidas de espessura da 66 retina em indivíduos não infectados, não indicou diferença significativa para as médias entre as posições (P=0.9973) como pode ser visto na tabela 6. TABELA 6 Comparação entre as médias de espessura em cada posição de medida em animais não infectados POSIÇÃO Esquerda Centro Direita MÉDIA 121.460 a 121.081 a 121.064 a N 12 12 12 Médias com letras iguais não são significativamente diferentes entre si, pelo teste de Tukey Na análise de variância, com delineamento em bloco casualizado, o estudo do efeito da retinite nas medidas de espessura da retina em indivíduos infectados, blocando o local onde tais medidas foram tomadas demonstrou que as médias para a variável espessura da retina medida no foco de retinite e fora do foco de retinite apresentaram diferença fortemente significativa entre si (p=0,0001) como pode ser observado na tabela 7 e que o local de medida (esquerda, centro e direita) não influenciou significativamente nesta comparação (TAB 8). TABELA 7 Comparação entre as médias de espessura medidas no foco e fora do foco de retinite em animais infectados RETINITE No foco Fora do foco MÉDIA 183.341a 147.261b N 24 24 Médias seguidas de letras distintas são significativamente diferentes entre si, pelo teste de Tukey TABELA 8 Comparação entre as médias de espessuras em cada posição de medida em indivíduos infectados POSIÇÃO Esquerda Centro Direita MÉDIA 167,8 a 164,8 a 163,3 a N 16 16 16 A espessura da retina dos camundongos infectados mostrou aumento (medida na posição central: 167,8 ± 24,9) estatisticamente significante se comparada com a dos camundongos não infectados (medida na posição central: 121,1 ± 15,4) com p = 0,00002. Quando consideramos a espessura da retina no foco 67 de retinite (todas as posições: 183,3 ± 15,99) notamos aumento, também significativo, se comparada com a espessura da retina de camundongos infectados fora dos focos de retinite (todas as posições: 147,3 ± 12,2), devido ao infiltrado inflamatório e edema. A diferença na espessura da retina dos camundongos não infectados e a dos infectados foi significativa mesmo se consideradas apenas as medidas fora dos focos de retinite provavelmente em decorrência do edema difuso na retina dos camundongos infectados, o que também pode ser observado na histopatologia (vacúolos) em várias camadas. 3.2 Relação perímetro/área (P/A) da retina e suas camadas Todas as respostas estudadas apresentaram condições de distribuição normal e homocedasticidade, exceto os resultados referentes às medidas tomadas na retina inteira. A tabela 9 mostra a estatística simples para a variável anfractuosidade (relação perímetro/área) da retina e de cada uma de suas camadas. Pode-se observar que a variável mostrou baixa instabilidade (coeficiente de variação menor que 20%) e número amostral suficiente nas CNE, CPE e CPI. Na retina por inteiro a P/A mostrou alta instabilidade e número amostral insuficiente. TABELA 9 Estatística simples para variável P/A da retina e suas camadas Número de Observações Média Geral Desvio Padrão Coeficiente de Variação Amostra Ideal (10%) RETINA CFR CNE CPE CNI CPI CGFN 20 20 20 20 20 20 20 0,04 0,06 0,11 0,02 0,06 0,01 0.30 0,05 0,11 0,04 0,08 0,02 0,12 0,03 144,7 22,5 11,2 15,6 36,8 17,7 28,1 914,9 22,1 5,5 10,6 59,2 13,7 34,4 A estatística com quebras para a variável anfractuosidade, considerando o status de infectado ou não infectado, pode ser vista na tabela 10. 68 Os resultados das medidas da anfractuosidade (P/A) tomados da retina inteira além de não indicarem homogeneidade de variância na comparação por níveis de infecção, não apresentaram distribuição normal, conforme tabela 11. TABELA 10 Estatística com quebras para a variável P/A. Quebra: infecção NAÕ INFECTADOS (1) 0,04 ± 0,05 0.12 ± 0,15 0,59 ± 0,50 0,32 ± 0,04 0,14 ± 0,06 0,85 ± 0,02 0,11 ± 0,04 Retina CFR CNE CPE CNI CPI CGFN ANFRACTUOSIDADE INFECTADOS (2) 0,04 ± 0,06 0,86 ± 0,21 0,50 ± 0,31 0,26 ± 0,02 0,68 ± 0,06 0,79 ± 0,10 0,14 ± 0,03 TODOS (3) 0,04 ± 0,06 0,11 ± 0,24 0,06 ± 0,01 0,30 ± 0,05 0,11 ± 0,04 0,82 ± 0,02 0,12 ± 0,04 (1) Número de observações: 12 (2) Número de observações: 8 (3) Número de observações: 20 TABELA 11 Testes de normalidade e homocedasticidade da P/A da retina por inteiro Variável Anfractuosidade Anfractuosidade Teste Lilliefors Bartlett Valor calculado 0.4496 0.3802 Valor (P=0.05) 0.190 3.840 Valor (P=0.01) 0.231 6.635 Várias estratégias de transformação das respostas (logarítmica, radicial e arco-sênica) foram tentadas sem que se obtivesse a condição de normalidade exigida pela análise de variância. Por esta razão, o estudo da anfractuosidade da retina em função da presença ou ausência de infecção foi desenvolvido através do teste estatístico não paramétrico de Mann-Whitney. Houve diferença significativa entre os grupos testados (P=0,0069). As análises para a variável anfractuosidade foram feitas por um delineamento inteiramente casualizado em sistema de parcela subdividida (Split-Plot), para 14 tratamentos em sistema fatorial 2 x 7 (2 níveis de infecção e 7 locais da retina), visto que os dados apresentaram distribuição normal e homocedasticidade (com exceção da retina completa). Os dados são desbalanceados com 8 repetições nos grupos infectados e 12 nos não infectados. O status de infecção (infectado ou não infectado) foi considerado na parcela, enquanto as localizações na retina foram 69 estudadas na subparcela. A figura 7 demonstra o desenho experimental. Na figura 8 pode-se observar um resumo da análise de variância definindo as fontes de variação e seus respectivos graus de liberdade. Diferença estatisticamente significativa foi encontrada nas medidas da anfractuosidade da retina dos animais infectados e não infectados, nas CFR, CPE, CNI e na CGFN, como pode ser visto na tabela 12. GRUPO REPETIÇÕES LOCAL INFECTADO NÃO INFECTADO RET CF R CNE CPE CNI CPI CGFN RET CF R CNE CPE CNI CPI CGFN I13 I14 I15 I16 I17 I18 I19 I20 I13 I14 I15 I16 I17 I18 I19 I20 I13 I14 I15 I16 I17 I18 I19 I20 I13 I14 I15 I16 I17 I18 I19 I20 I13 I14 I15 I16 I17 I18 I19 I20 I13 I14 I15 I16 I17 I18 I19 I20 I13 I14 I15 I16 I17 I18 I19 I20 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12 I1 I2 I3 I2 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12 I1 I2 I3 I2 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12 I1 I2 I3 I2 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12 I1 I2 I3 I2 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12 I1 I2 I3 I2 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12 I1 I2 I3 I2 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12 FIGURA 9 – Desenho experimental da análise estatística dos dados da relação P/A da retina e suas camadas. ANOVA FV Parcelas Infecção (I) Erro A Subparcelas Local (L) Interação (I X L) Erro B GL 19 1 18 139 6 6 108 = 139 – 19 – 6 - 6 GLerroB = GLsub-parcelas - GLparcelas - GLsexo - GLinteração FIGURA 10 – Análise de variância dos dados da P/A da retina e suas camadas. 70 TABELA 12 Comparação entre os status de infecção para o mesmo local de medida da P/A LOCAL Retina CFR CNE CPE CNI CPI CGFN INFECÇÃO NAÕ INFECTADOS 0,0390 A 0,0861 B 0,0498 A 0,2578 B 0,0676 B 0,0787 A 0,1391 A INFECTADOS 0,0378 A 0,1194 A 0,0588 A 0,3244 A 0,1432 A 0,0849 A 0,1130 B Médias seguidas por letras distintas diferem estatisticamente entre si 4 Pesquisa de apoptose As lâminas contendo cortes de olhos de camundongos infectados e não infectados foram submetidos à reação de TUNEL. Na retina dos animais não infectados não houve marcação (FIG 11). FIGURA 11 – Retina de animais não infectados submetida à reação de TUNEL (contracoloração com verde de metila). A marcação de células esparsas pela reação de TUNEL pode ser notada em todas as camadas da retina neurossensorial de camundongos infectados como pode ser observado nas figuras 12 A, B, C, D, E e F. 71 FIGURA 12 – Retina de animais infectados marcada por TUNEL: Podemos observar focos de retinite (A, D e F), migração de células pigmentadas (B e F), células no corpo vítreo e interface vitreorretiniana, além de células marcadas (setas vermelhas) pela reação de TUNEL nas diversas camadas da retina, no vítreo e na interface vitreorretiniana (contracoloração com verde de metila). 72 No entanto, houve marcação de células em maior quantidade no corpo vítreo, na interface vitreorretiniana e região perivascular, coincidindo com o local onde são encontradas as células inflamatórias, sugerindo serem estas as células preferencialmente atingidas pela apoptose induzida pela infecção. As células marcadas pelo TUNEL também mostraram as alterações morfológicas características da apoptose, tais como tamanho reduzido, densidade aumentada e algumas já se mostravam fragmentadas. 73 DISCUSSÃO 74 No presente trabalho estudamos a toxoplasmose ocular experimental considerando a infecção com cistos de T. gondii através da via de inoculação intraperitoneal em camundongos fêmeas adultas. Como a intenção do trabalho foi o estudo na fase crônica da doença, utilizamos animais no 60º dia de infecção, pois segundo TEDESCO et al. (2004) os animais infectados por via i.p. mostram títulos semelhantes de anticorpos antitoxoplasma IgM e IgG no 15º dia de infecção, havendo a queda dos títulos para IgM a partir do 30º ao 60º dia, com elevação dos títulos para IgG indicativo da cronificação da doença. A via de inoculação utilizada no presente estudo mostrou-se eficiente, como já demonstrado anteriormente por TEDESCO et al.(2004). As vias intraperitoneal e oral (gavagem) são comumente empregadas por outros autores (DUTTON et al., 1986; GAZZINELLI et al., 1994; PEREIRA et al., 1999). A via intravítrea é menos utilizada devido às alterações provocadas pelo trauma de inoculação no olho e quando empregada geralmente é em animais de maior porte (YOSHIZUMI, 1976; GARWEG, 1998; HU et al., 1999). Durante os nossos experimentos observamos infiltrado inflamatório mononuclear no vítreo, na interface vitreorretiniana, e nas camadas internas da retina especialmente nas regiões perivasculares (vasculite), necrose, reação glial, distorção da arquitetura da retina, migração de células pigmentares e cisto parasitário na camada plexiforme interna. De acordo com GONÇALVES & YAMAMOTO (1997) a retina é o sítio primário da infecção pelo Toxoplasma. Assim como neste trabalho, estudos anteriores no modelo experimental (NUSSEMBLATT & PALESTINE, 1989; TEDESCO et al., 2004) demonstram um infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear e necrose na retina, com o aspecto semelhante ao da toxoplasmose ocular em humanos. A vasculite foi também encontrada por outros autores (DUTTON et al., 1986; McMENAMIN et al., 1986). HAYASHI et al. (1996) descreveram inflamação causada por infiltrado mononuclear podendo originar destruições na retina em vários graus. A baixa porcentagem de parasitas (cistos) observada nos olhos dos animais apesar da presença da retinite sugere que o T. 75 gondii pode dar início a um processo inflamatório autorreativo, que eventualmente culmina nas lesões oculares, como proposto por GAZZINELLI et al. (1994). Os cistos localizados na retina, observados no nosso modelo crônico, não estavam acompanhados de alterações evidentes ao seu redor, semelhante ao observado por McMENAMIN et al. (1986). Como descrito anteriormente por TEDESCO et al., (2004), a migração das células do EPR para dentro da retina e as alterações na camada dos segmentos externos dos fotorreceptores (FR) foram características marcantes nos focos de retinite no nosso estudo. De acordo com CRAFOORD et al. (2000) a migração das células da retina está associada com a destruição focal dos fotorreceptores, o que também pode ser observado em nosso estudo. Existe uma forte evidência do papel crucial da migração das células do EPR na toxoplasmose experimental. O EPR pode ser importante na eliminação do parasita através da fagocitose, considerando que as células do EPR atuam fisiologicamente como células fagocitárias. A habilidade das células do EPR em participar da regulação imune, tanto pela estimulação quanto pela inibição da proliferação dos linfócitos, tem sido demonstrada em vários modelos de auto-imunidade in vivo (GASPARI et al., 1988). As células do EPR foram preferencialmente encontradas suprimindo a proliferação dos linfócitos cultivados com antígenos endógenos (LIVERSIDGE et al., 1993). Como já salientado e considerando que a patologia da infecção pelo T. gondii resulta da interação entre fatores do parasita e do hospedeiro e que as descrições das alterações histopatológicas são essencialmente subjetivas, os diversos trabalhos da literatura podem apresentar resultados não comparáveis, ainda que os modelos experimentais sejam rigorosamente iguais. Com o desenvolvimento da morfometria a partir de programas de computador, dados objetivos puderam ser construídos. Mas, como a literatura ainda não dispõe de dados morfométricos da retina de camundongos infectados pelo T.gondii, nosso estudo baseou-se nos dados subjetivos da descrição histopatológica que sugeriam aumento de espessura da retina devido ao edema e infiltrado inflamatório e distorção da arquitetura normal da retina pela inflamação e necrose. A partir disso, estudamos a histopatologia da retinite por Toxoplasma em modelo murino com mensuração da espessura da retina e da distorção na arquitetura da retina (relação 76 perímetro/área) através da morfometria, com obtenção de resultados objetivos (numéricos). Como citado anteriormente, os resultados da análise histopatológicas deste trabalho estão de acordo com o descrito por outros autores. A espessura da retina dos camundongos infectados mostrou aumento estatísticamente significante se comparada com a dos camundongos não infectados (167,8±24,9 versus 121,1 ± 15,4 com p = 0,00002). Como era esperado devido ao infiltrado inflamatório e edema no foco de retinite, nos animais infectados observouse aumento na espessura da retina no foco de retinite comparada com a espessura fora dos focos de retinite (183,3±15,99 versus 147,3±12,2 com p = 0,0001). A diferença na espessura da retina dos camundongos não infectados e a dos infectados foi significativa mesmo se consideradas apenas as medidas fora dos focos de retinite provavelmente em decorrência do edema difuso na retina dos camundongos infectados como também pode ser observado na histopatologia (vacúolos) em várias das camadas, alteração também descrita por TEDESCO et al. (2004). Foi considerado estatisticamente significativo o p< 0,05. A mudança na arquitetura da retina de camundongos infectados e não infectados, avaliada neste trabalho através da relaçãoP)A, não apresentou distribuição normal e homocedasticidade mesmo após várias tentativas de transformação matemática e por isso foi avaliada através do teste não paramétrico de Mann-Whitney. Apesar da alta instabilidade, mostrou diferença estatística entre camundongos infectados e não infectados refletindo a mudança na arquitetura da retina em decorrência da infecção, que também foi descrita por TEDESCO et al. (2004). Quando avaliada cada camada separadamente, a P/A mostrou homocedasticidade e distribuição normal. A variável apresentou baixa instabilidade e número amostral suficiente nas camadas nuclear externa (CNE), plexiforme externa (CPE) e plexiforme interna (CPI), mas somente na camada plexiforme externa observou-se diferença estatística entre infectados e não infectados. Nas camadas de fotorreceptores (CFR), nuclear interna (CNI) e na camada de células ganglionares e fibras nervosas (CGFN) a variável apresentou média instabilidade e apesar do 77 número amostral teoricamente insuficiente mostrou diferença estatística entre os dois grupos. Assim, a P/A foi capaz de mostrar matematicamente a alteração na arquitetura da retina e nas camadas de fotorreceptores, plexiforme externa, nuclear interna e na de células ganglionares e fibras nervosas. Com a demonstração das diferenças estatisticamente significativas, acreditamos que as medidas de espessura da retina e da relação P/A tornam-se importantes ferramentas de comparação para futuros estudos envolvendo a retinite por Toxoplasmose. Na pesquisa de apoptose, células marcadas pela reação de TUNEL foram encontradas no corpo vítreo, na interface vitreorretiniana e nas diversas camadas da retina neurossensorial, mas em maior quantidade região perivascular, coincidindo com o local onde foi encontrado maior número de células inflamatórias. Apesar de não contarmos com nenhum trabalho que tenha pesquisado a apoptose na fase crônica, o resultado não nos surpreende visto que LÜDER & GROSS (2005) demonstraram que na toxoplasmose sistêmica, populações específicas de células imunológicas não parasitadas são induzidas à apoptose pelo T. gondii. Além disso, SHEN et al. (2001) mostraram que os olhos de camundongos do tipo selvagem não infectados expressam constitucionalmente níveis mais altos de moléculas próapoptóticas que o cérebro e que a apoptose foi encontrada mais freqüentemente no olho que no cérebro durante a infecção aguda. HU et al. (1999) também encontrara aumento da apoptose no olho durante a infecção aguda pelo T. gondii. CALABRESE et al. (2007) demonstraram que em camundongos no 300 dia após a infecção ocorre diminuição de 20% no nível sérico de Fas e seu ligante enquanto que no líquido intraocular o nível de Fas aumenta 82% e Fas L 56% sugerindo aumento da apoptose no olho durante a infecção. O aumento do Fas-L dentro do olho, encontrado por CALABRESE et al. (2007), reforça a suspeita de que as células inflamatórias sejam o principal alvo da apoptose induzida pela toxoplasmose, já que essas células expressam o receptor Fas na sua superfície. Novos estudos são necessários para determinar se a apoptose encontrada no olho na fase crônica da infecção é induzida pelo Toxoplasma gondii ou se é decorrente do fato de o olho ser um sítio de privilégio imune. Como tal, o olho expressa moléculas pró apoptóticas, o que leva a apoptose de células inflamatórias que alcançam o espaço intraocular. 78 CONCLUSÕES 79 1. A análise morfométrica mostrou diferença estatística entre a espessura da retina de camundongos infectados se comparada com a dos animais não infectados (167,8 ± 24,9 versus 121,1 ± 15,4), bem como entre a espessura nos focos de retinite comparada com a espessura fora dos focos de retinite (183,3±15,99 versus147,3±12,2) em animais infectados. A análise da relação perímetro/área da retina dos animais infectados mostrou diferença estatística se comparada com a dos animais não infectados refletindo a mudança na arquitetura decorrente da infecção. Difernça estatística também foi encontrada nas camadas de fotorreceptores, plexiforme externa, nuclear interna e de camada de células ganglionares e fibras nervosas. Não houve diferença significativa entre infectados e não infectados nas camadas dos núcleos dos fotorreceptores e plexiforme interna. 2. A apoptose não vista na retina dos animais do grupo controle e foi encontrada em células no corpo vítreo, na interface vitreorretiniana e em todas as camadas da retina neurossensorial, mas predominantemente na região perivascular, local coincidente com o infiltrado inflamatório. O resultado sugere que as células inflamatórias são possivelmente os alvos preferenciais da apoptose induzida pela infecção. 80 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 81 ADAMS, J.M.; CORY, S. The Bcl-2 protein family: Arbiters of cell survival. Science., v.281, p.1322-1326, 1998. APPLEBY, D.W.; MODAK, S.P. DNA degradation interminally differentiating lens fiber cells from chick embryos. Proc. Natl. Acad. 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