Diagnose e manejo de viroses em Cucurbitácea

Diagnose e manejo de viroses em Cucurbitácea
Mirtes Freitas Lima
Embrapa Hortaliças. BR 060, Km 09, 70359-970 C.P. 218 Brasília – DF; 2 Universidade de Brasília Campus Universitário Darcy
Ribeiro, Brasília - DF, 70910-900. [email protected];
Introdução
As doenças de origem viral constituem um dos principais desafios à produção de cucurbitáceas em
todo o mundo, ocorrendo frequentemente em áreas produtoras cultivadas com essas espécies de plantas. São
doenças complexas para as quais não há medidas de controle curativo e as estratégias de manejo disponíveis
baseiam-se no emprego de medidas preventivas.
Em nível mundial, mais de trinta espécies de vírus já foram registradas infectando naturalmente as
cucurbitáceas. No Brasil, onde cerca de pelo menos dez vírus já foram identificados causando doenças
nessas espécies de plantas, os maiores problemas têm como principais agentes os potyvírus Papaya ringspot
virus – type watermelon (PRSV-W; Lima et al., 1996), Watermelon mosaic virus-II (WMV-II; Sá &
Kitajima, 1991) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV; Lima et al., 1996). Entretanto, merecem destaque
também o comovírus Squash mosaic virus (SqMV; Lima & Amaral, 1985), o cucumovírus Cucumber
mosaic virus (CMV; Cupertino et al., 1988), o tospovírus Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV; Pozzer et
al., 1996) e o carlavírus Melon yellowing-associated virus (MYaV; Nagata et al., 2003) que também podem
reduzir a produção e resultar perdas significativas. Entre as culturas mais afetadas destacam-se as
consideradas economicamente mais importantes como melão, pepino e maxixe (gênero Cucumis), melancia
(gênero Citrullus), abóbora, abobrinha e moranga (gênero Cucurbita) e chuchu (gênero Sechium).
Plantas de cultivares suscetíveis quando infectadas podem apresentar sintomas caracterizados por
mosaico, mosqueado, deformação e redução do limbo foliar, redução no crescimento da planta, além de
alterações nos frutos.
Diagnose. A diagnose da doença com a correta identificação do patógeno constitui o primeiro passo
na definição das medidas de manejo a serem adotadas no seu controle, visando reduzir os danos resultantes
da infecção ou evitar a sua ocorrência. Dessa forma, a utilização de métodos diagnósticos para detecção de
vírus que sejam rápidos, acurados e pouco onerosos é altamente desejável e de importância crucial na
tomada de decisão quanto às estratégias de manejo a serem empregadas. Na detecção de vírus em
cucurbitáceas são utilizados testes laboratoriais (sorológicos; moleculares) e testes conduzidos sob
condições controladas (biológicos), em casa de vegetação.
Os métodos sorológicos e os métodos moleculares possibilitam a identificação de vírus de forma
precisa, além de serem extremamente sensíveis. Entretanto, os métodos biológicos (sintomatologia;
transmissão) são também importantes e complementam a investigação da doença. Dessa forma, o emprego
de pelo menos dois desses métodos na investigação do agente causal de uma doença é recomendado para
obtenção de uma diagnose confiável.
Os métodos sorológicos baseiam-se na capacidade de reconhecimento de certas proteínas por
anticorpos específicos. O teste mais comum para detecção de vírus que infectam cucurbitáceas é o Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), pela sensibilidade, rapidez na obtenção dos resultados (24 h-48 h) e
por ser pouco oneroso. O ELISA foi adaptado para detecção de vírus em plantas na segunda metade da
década de 1970, sendo o método mais recomendado para avaliação de amostras em larga escala. O extrato
da planta teste é preparado em tampão de extração e aplicado em superfície solida (placa de poliestireno;
placa de microtitulação) e os resultados são obtidos pelo produto da reação enzimática do conjugado
(enzima fosfatase alcalina conjugada ao anticorpo) com substrato específico. A reação é monitorada pela
mudança de coloração, como resultado da digestão do substrato pela enzima. O ELISA é um teste
quantitativo, com leitura obtida por meio de espectrofotometria em leitora de placas e filtro de 405 nm.
Amostras consideradas positivas devem exibir valores de absorbância pelo menos 2-3 vezes maior que
valores de absorbância da planta sadia.
O dot-blot, dot-Elisa ou NCM-ELISA também é muito utilizado na identificação de vírus em
cucurbitáceas. Utiliza-se membrana de nitrocelulose como suporte para a aplicação do extrato vegetal
preparado em tampão PBS-Tween. Após o bloqueio da membrana em solução contendo leite desnatado e
aplicação do anticorpo específico, a membrana é imersa em conjugado universal (anticorpo secundário
contra IgG de coelho produzido em cabra conjugado à enzima fosfatase alcalina). Nesse caso, a revelação da
membrana é realizada com o emprego de BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) e NBT (Nitro blue
tetrazolium). O NCM-ELISA é um teste qualitativo e, dessa forma, a avaliação dos resultados é visual. As
amostras quando positivas apresentam coloração arroxeada como resultado da formação de precipitado pela
ação da enzima fosfatase alcalina sobre os substratos BCIP e NBT (cromogênica).
O Western blot é uma técnica imunoeletroforética que propicia a detecção de proteínas do vírus pela
exposição da membrana em solução contendo anticorpos produzidos contra a proteína do vírus a ser
detectado. Entretanto, é pouco utilizada em diagnose, sendo mais indicada para caracterização de proteínas
virais.
A limitação na utilização dos testes sorológicos está associada a não existência de antissoros
produzidos para identificação de alguns dos vírus que infectam essas culturas, o que inviabiliza a utilização
do método. Nesses casos, outras técnicas devem ser empregadas na diagnose da doença e identificação do
vírus. Ambos os testes, ELISA e NCM-ELISA, tem propiciado a identificação de PRSV-W, WMV, ZYMV,
CMV, ZLCV e MYaV em plantas infectadas (Yuki et al., 2000; Oliveira et al., 2000; Moura et al., 2001;
Halfeld-Vieira et al., 2004; Lima et al., 2009; Lima & Nagata, 2008; Ali et al., 2012).
Os métodos moleculares propiciam a detecção do ácido nucleico e nesse caso, a transcrição reversa
(RT) associada à reação em cadeia da polimerase (PCR) é a técnica mais empregada na identificação de
vírus em cucurbitáceas. A RT-PCR possibilita a amplificação de fragmentos do material genético do vírus
utilizando-se um par de oligonucleotídeos que são complementares às regiões que flanqueiam a sequência a
ser amplificada e as enzimas Transcriptase reversa (apenas para vírus de RNA) e Taq DNA Polimerase
(vírus de RNA e vírus de DNA), esta última, tesmoestável. A reação ocorre por meio da incubação em
termocilador, no qual é submetida, geralmente, a 25-35 ciclos sucessivos de desnaturação, anelamento e
extensão que resultam na amplificação exponencial (2n, onde n=número de cópias) do fragmento do DNA.
A alta sensibilidade é a principal vantagem da técnica que torna-se muito útil na detecção de vírus para os
quais não há disponibilidade de antissoros, entretanto, nesse caso é necessário o conhecimento da sequência
parcial do genoma do vírus para o desenho dos oligonucleotídeos. Os fragmentos de DNA amplificados são
visualizados em gel de agarose corado com brometo de etídeo. Diversos trabalhos relatam o emprego da RTPCR para diagnose de viroses em cucurbitáceas (Thompson et al., 1995; Giampan, 2007; Jadão et al., 2010;
Ali et al., 2012). Outros métodos que também sensíveis são as hibridizações Northern blot (dtecção de
RNA) e Southern blot (detecção de DNA). Nessas duas técnicas, a detecção do ácido nucleico do vírus
imobilizado em membrana de nylon ocorre por meio da utilização de sondas moleculares.
Os métodos biológicos consistem na observação da sintomatologia exibida pelas plantas infectadas
no campo e também na transmissão do vírus para plantas herbáceas indicadoras. Os sintomas exibidos por
plantas de cucurbitáceas naturalmente infectadas em campo, possuem reduzido valor diagnóstico,
considerando a grande similaridade dos sintomas induzidos pela maioria das espécies virais que infectam
cucurbitáceas e também, pela possibilidade de ocorrência de infecção múltipla, quando a planta é infectada
por mais de um agente viral, dificultando a identificação dos sintomas de cada patógeno isoladamente. A
infecção pode ser latente e nesse caso, a planta, apesar de infectada, não exibe sintomas ou ainda, ser o
resultado da ação de fatores abióticos sobre a planta. Com relação à transmissão do vírus, essa pode ser
mecânica, pela fricção do extrato da planta infectada em folhas de plantas sadias, previamente pulverizadas
com agentes abrasivos (carborundo; celite), por meio de enxertia ou pela utilização de insetos vetores. A
avaliação é feita pela observação de sintomas e realização de testes de detecção para confirmação da
presença ou ausência do vírus nas plantas inoculadas.
A observação de partículas virais ao microscópio eletrônico também pode ser utilizada como método
auxiliar na diagnose de doenças origem viral, pois possibilita a determinação das características
morfológicas dos vírus.
Controle. Não há medidas curativas para infecção causada por vírus em plantas, o que torna o seu
controle bastante complexo. Entretanto, o manejo dessas doenças deve ser feito segundo um conjunto de
estratégias a ser adotado de maneira preventiva, com o objetivo de minimizar a ocorrência de perdas na
produção e na qualidade dos frutos. Algumas das estratégias que visam a prevenção da infecção por vírus
nas lavouras incluem erradicação da fonte do vírus e do vetor, para evitar que possam atingir a cultura.
Dessa forma são importantes as medidas de sanitização com a eliminação de restos de cultura logo após a
colheita, assim como também, a eliminação de plantas hospedeiras alternativas que podem atuar como
reservatório do vírus e do inseto vetor. Outra medida é a redução da disseminação do vírus por meio do
controle do vetor, entretanto, nesse caso, o controle químico pode não ser efetivo para os afídeos vetores de
vírus, considerando-se que devido à rapidez com que efetuam a transmissão (“picada de prova”) do vírus,
esse já pode ter sido transmitido antes que o inseticida possa ter algum efeito sobre o inseto. A utilização de
material livre de vírus (mudas e/ou sementes) também é de importância crucial no estabelecimento de novos
plantios, pois diminui o risco de introdução de vírus na lavoura. Como última medida, a resistência genética,
que constitui a estratégia mais eficiente e econômica no controle de viroses. Dessa forma, a identificação de
fontes de resistência a determinados vírus e incorporação em cultivares que possuem características
agronomicamente desejáveis é a medida mais eficiente para o controle dessas doenças.
Referências
ALI, A; MOHAMMAD, O; KHATTAB, A. 2012. Distribution of viruses infecting cucurbit crops and
isolation of potential new virus-like sequences from weeds in Oklahoma. Plant Disease, 96:243-248.
AVILA, AC de; INOUE-NAGATA, AK; NEVES, FM; MATOS, LG; DIAS, R de CS; RANGEL, M;
NAGATA, T. 2000. Produção de anti-soro e detecção por DAS-ELISA do Melon yellowing-associated virus
em melão. Tropical Plant Pathology, 33:245-247.
CANDRESSE, T; HAMMOND, RW; HADIDI, A. 1998. Detection and identification of plant viruses and
viroids using polymerase chain reaction (PCR). In: A Hadidi, RK Khetarpal, K Koganezawa (eds.) Control
of plant virus diseases, APS Press, ISBN 978089054191-3, St. Paul, MN, USA. 399–416.
CLARK, MF; ADAMS, AN. 1977. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked
immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology, 34: 475-483.
CUPERTINO, FP; KITAJIMA, EW; FONSECA, MEN; MEYER, MC. 1988. Viroses em olerícolas no
Estado de Goiás. Fitopatologia Brasileira, 13:101.
GIAMPAN, JS. 2007. Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV): detecção, avaliação de danos em abobrinha
de moita e reação de espécies de cucurbitáceas. 2007. Tese (Doutorado em Fitopatologia) - Escola Superior
de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2007. Disponível em:
<http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11135/tde-18102007-090656/>. Acesso em: 2014-05-03.
HALFELD-VIEIRA, BA; RAMOS, NF; RABELO FILHO, FAC; GONÇALVES, MFB; NECHET, KL;
PEREIRA, PRVS; LIMA, JAA. 2004. Identificação sorológica de espécies de potyvírus em melancia, no
estado de Roraima. Fitopatologia Brasileira, 29:687-689.
JADÃO, AS; BURIOLA, JE; Rezende, JAM. 2010. First Report of Papaya ringspot virus–Type W and
Zucchini yellow mosaic virus infecting Trichosanthes cucumerina in Brazil and Zucchini yellow mosaic
virus infecting Trichosanthes cucumerina in Brazil. Plant Disease, 94: 789.
LIMA, JAA; AMARAL, MRG. 1985. Purificação e sorologia de “squash mosaic virus” isolado de melancia.
Fitopatologia Brasileira, 10:605-611.
LIMA, MF; INOUE-NAGATA, AK. 2008. Report of Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) infecting
cucurbits in the Northeast Brazil. In: NATIONAL MEETING OF VIROLOGY, 19., Caxambu, MG.
Suplemento. Caxambu, MG: SBV, 2008. v.13, p.283-283.
LIMA, JAA; VALE, CC; MIRANDA, ACMM; OLIVEIRA, VB. 1996. Identificação sorológica do ZYMV
em plantios de melão no Rio Grande do Norte. Fitopatologia Brasileira, 21:426.
LIMA, MF; NAGATA, T; NEVES, FM; INOUE-NAGATA, AK; MOITA, AW; SOUSA, C; DELLA
VECCHIA, M; RANGEL, MG; DIAS, RCS; DUTRA, LS; ÁVILA, AC. 2009. Detecção por sorologia do
Melon yellowing associated vírus (MYaV) em áreas produtoras de melão no Nordeste brasileiro.
Horticultura Brasileira, 27: 473-478.
MATHEWS, REF. 1980. Host plant responses to virus infection. In: H. Fraenkel-Conrat and R.R. Wagner
(eds.). Comprehensive virology, vol. 16, virus-host interaction, viral invasion, persistence, and diagnosis.
Plenum Press, New York, USA. Pages 297–359.
MOURA, MCCL; LIMA, JAA; OLIVEIRA, VB; GONÇALVES, MFB. 2001. Identificação sorológica de
espécies de vírus que infetam cucurbitáceas em áreas produtoras do Maranhão. Fitopatologia Brasileira,
26:90-92.
NAGATA, T; KITAJIMA, EW; ALVES, DMT; CARDOSO, JE; INOUE-NAGATA, AK; OLIVEIRA,
MRV; de AVILA, AC. 2003. Isolation of a novel carlavirus from melon in Brazil. Plant Pathology, 52:797.
NAIDU, RA; HUGHES, J.d’A. 2001. Methods for the detection of plant virus diseases. In: Plant virology in
sub-Saharan Africa. Hughes, Jd’A; Odu, BO (Eds.), 233–260, Proceedings of a Conference Organized by
IITA, International Institute of Tropical Agriculture, ISBN 9781312149, Nigeria.
OLIVEIRA, VB; LIMA, JAA; VALE, CC; PAIVA, WO. 2000. Caracterização biológica e sorológica de
isolados de potyvirus obtidos de cucurbitáceas no Nordeste Brasileiro. Fitopatologia Brasileira, 25:628-636.
POZZER, L; RESENDE, R de O; BEZERRA, IC; NAGATA, T; LIMA, MI; KITAJIMA, EW; ÁVILA, AC.
1996. Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV), a proposed new species in the Tospovirus genus.
Fitopatologia Brasileira, 21:432.
REZENDE, JAM; GALLETI, SR; RESENDE, R de O; AVILA, AC de; SCAGLIUSI, SMM. 1997.
Incidence and the biological and serological characteristics of a tospovirus in experimental fields of zucchini
in São Paulo State, Brazil. Fitopatologia Brasileira, 22:92-95.
ROBINSON, RW; DECKERS-WALTERS, DS. 1997. Cucurbits. CAB International, Wallingford, UK.
SÁ, PB de; KITAJIMA, EW. 1991. Characterization of an isolate of watermelon mosaic virus 2 (WMV-2)
from Brazil. Fitopatologia Brasileira, 16:217-222.
THOMPSON, KG; DUETZGEN, RG; GIBBS, AJ; TANG, YC; LIESACK, W; TEAKLE, DS;
STACKEBRANDT, E. 1995. Identification of Zucchini yellow mosaic potyvirus by RT-PCR and analysis
of sequence variability. Journal Virological Methods, 55: 83-96.
WEBSTER, CW; WYLIE, SJ; JONES, MGK. 2004. Diagnosis of plant viral pathogens. Current Science,
86:1604-1607.
YUKI, VA; REZENDE, JAM; KITAJIMA, EW; BARROSO, PAV; KUNIYUKI, H. 2000. Occurrence,
distribution and relative incidence of five viruses infecting cucurbits in the state of São Paulo, Brazil. Plant
Disease, 84:516-520.
ZITTER, A; HOPKINS, DL; THOMAS, CE (Eds.). 1996. Compendium of cucurbit diseases. APS PRESS:
St. Paul. 120pp.