Introdução
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EXPRESSÃO DO GENE ARGONAUTA EM POPULAÇÕES NATURAIS DE Aedes aegypti E SUA RELAÇÃO COM A RESPOSTA À INFECÇÃO VIRAL MEDIADA POR RNA RAQUEL JULIANA VIONETTE DO AMARAL UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ FEVEREIRO / 2008 EXPRESSÃO DO GENE ARGONAUTA EM POPULAÇÕES NATURAIS DE Aedes aegypti E SUA RELAÇÃO COM A RESPOSTA À INFECÇÃO VIRAL MEDIADA POR RNA RAQUEL JULIANA VIONETTE DO AMARAL Tese apresentada Biociências Universidade e ao Centro Biotecnologia, Estadual do de da Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia. ORIENTADORA: Drª MARÍLVIA DANSA DE ALENCAR PETRETSKI UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ. FEVEREIRO / 2008. I EXPRESSÃO DO GENE ARGONAUTA EM POPULAÇÕES NATURAIS DE AEDES AEGYPTI E SUA RELAÇÃO COM A RESPOSTA À INFECÇÃO VIRAL MEDIADA POR RNA RAQUEL JULIANA VIONETTE DO AMARAL “Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia, área de concentração Biologia Celular". COMISSÃO EXAMINADORA: ________________________________________________________ Prof. Dr. Renato Augusto DaMatta – LBCT / CBB / UENF ________________________________________________________ Profa. Dr. Jorge Hernandez Fernandez – LNCC / Labinfo ________________________________________________________ Prof. Dr. Ricardo Nascimento Araújo (Inst. de Ciências Biológicas – LFIH – UFMG) ________________________________________________________ Profa. Dra Marílvia Dansa de Alencar Petretski - CBB/ LQFPP/ UENF (Orientadora) II “Dedico este trabalho à minha família, em especial aos meus pais Delfim e Maria das Graças, minhas irmãs Karinna e Simone e ao meu marido Marcelo.” III AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar, agradeço a Deus por estar comigo em todos os momentos. Por ser o alicerce que me sustenta a cada dia e por me dar a força necessária para essa caminhada; A toda minha família, minhas irmãs, Simone e Karinna, tios, tias, primos, cunhados, meus sobrinhos Orlando, Júlia e Rafaela e, em especial, os meus pais. Obrigada pelo carinho, o grande apoio, e por acreditar na minha capacidade na realização desta conquista. Obrigada mãe! Por sempre estar intercedendo por mim nas suas orações! Ao meu marido Marcelo pelo apoio, estímulo, por compreender as minhas ausências em casa e por me acompanhar sempre! Obrigada Marcelo por sempre estar disposto a me ajudar; A Marílvia, por sempre ter sido a minha “Mãerílvia” do laboratório! Por todos os ensinamentos, paciência e amizade; A amiga Flávia Mury por todas as ajudas nos experimentos e pela amizade. Obrigada por eu sempre poder contar com você. Te devo muito! Aos amigos do LQFPP, em especial ao Beto, Gabriela, Lígia, Suwéllen, Bruno, Magda, Leonardo, Tatiana, Aristóteles e Vivian, pelos momentos de alegrias proporcionadas no laboratório, pelo auxílio no insetário e por me ajudar a carregar o alimentador do Franzé a cada experimento de infecção! As amigas Lígia, Jack, Andréia e Deise, pela eterna amizade, apoio e carinho; A família do meu esposo, pelo abrigo e apoio em Campos e no Rio, quando necessário; Ao Fábio Mury, por todos os esclarecimentos prestados; As técnicas do LBR, Jujuzinha, Núbia e Patrícia, pela enorme disposição de sempre! A técnica Adrianinha por autoclavar e descontaminar todos nossos materiais; Ao Leonardo Abreu, por me auxiliar nos desenhos de primers de argonauta; Ao Professor Edésio Tenório, por disponibilizar a B.O.D. enquanto não tínhamos no laboratório; IV Ao professor Gonçalo pela disposição e contribuição pelo andamento deste projeto; A Beatriz Ferreira, pela amizade, companheirismo e todos os ensinamentos no âmbito da Biologia Molecular. Valeu Bia! Ao professor Dr. Paulo Filemon Pimenta por abrir as portas do seu laboratório. Por ceder a cepa DENV-2 Ribeirão Preto e ainda, por todos do Laboratório de Entomologia Médica do Centro de Pesquisas René Rachou – FIOCRUZ, em especial a Eliane Campanelli (Lili) pela grande solidariedade; Ao professor Dr. Marcos Sorgine que também abriu as portas do seu laboratório e por permitir que todas as quantificações da PCR em Tempo Real fossem realizadas lá. Obrigada pela atenção, paciência, disposição e todos os ensinamentos, e a todos do Instituto de Bioquímica Médica da UFRJ em especial a Clara, pela atenção de sempre! A professora Drª Tânia, por se disponibilizar a revisar e contribuir para esta dissertação; Ao Biólogo Helder Rezende do Núcleo de Entomologia e Malacologia da Universidade Federal do Espírito Santo, pelas coletas de ovos de Aedes aegypti das populações de Nova Venécia, Vitória e Vila Velha; Ao Centro de Controle de Zoonozes do município de Cachoeiro de Itapemirim, pela disponibilidade dos agentes em especial ao Edmilson que tanto contribuiu nas coletas de larvas; A Fenorte/Tecnorte pelo suporte financeiro; E a todos que aqui não foram mencionados, mas que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. V ÍNDICE 1- INTRODUÇÃO ....................................................................................... 01 1.1 - Dengue..................................................................................... 01 1.2 - Histórico da ocorrência da Dengue.......................................... 01 1.3 – O mosquito Aedes aegypti...................................................... 07 1.4 – O vírus Dengue (DENV).......................................................... 08 1.5 – O vírus Sindbis (SINV)............................................................ 12 1.6 - O RNA de Interferência............................................................ 13 1.7 – Os complexos protéicos envolvidos em RNAi......................... 16 1.8 - Supressores de RNAi............................................................... 18 2- JUSTIFICATIVA ..................................................................................... 19 3- OBJETIVOS............................................................................................ 21 3.1 – Objetivo Geral .......................................................................... 21 3.2 – Objetivos Específicos .............................................................. 21 4- MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................... 22 4.1- Local da pesquisa..................................................................... 22 4.2- Coleta de ovos e larvas de Aedes aegypti................................ 22 4.3- Manutenção da colônia de Aedes aegypti................................. 23 4.4- Amostras Virais......................................................................... 23 4.5- Cultura e Infecção de células C6/36......................................... 23 4.6- Propagação Viral....................................................................... 24 4.7- Infecção de mosquitos.............................................................. 24 4.8- Extração de RNA de mosquitos Aedes aegypti........................ 24 4.9-RT-PCR..................................................................................... 25 4.10 – Real Time PCR em mosquitos Aedes aegypti ..................... 26 4.11 – Desenho de primers Argonauta de Aedes aegypti para Real Time PCR................................................................................. VI 26 4.12 – Controle Endógeno................................................................. 26 4.13 – Quantificação da Expressão................................................... 27 5 – RESULTADOS...................................................................................... 28 5.1 – Expressão Relativa de Ago em Aedes aegypti em resposta à alimentação.................................................................................... 28 5.2 – Expressão de Ago em células em cultura C6/36 infectadas com DENV-2...................................................................................... 32 5.3 – Infecção de populações naturais de mosquitos Aedes aegypti com Dengue Vírus (DENV-2)............................................................ 33 5.4 – Expressão do gene Ago em mosquitos Aedes aegypti infectados com DENV-2..................................................................... 39 5.5 – Expressão de Ago em mosquitos Aedes aegypti infectados com o vírus Sindbis (SINV)................................................................ 41 6- DISCUSSÃO............................................................................................ 43 7- CONCLUSÕES........................................................................................ 51 8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 52 VII ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Mapa da distribuição mundial da Dengue e Aedes aegypti em 2005....... 03 Figura 2: Presença do vírus DENV-3 nas Américas. Período de 1994-2003. ........ 04 Figura 3: Situação Epidemiológica da Dengue no Brasil em 2001........................................................................................................................ 05 Figura 4: Distribuição do vetor e da transmissão de Dengue no estado do Espírito Santo (situação em 2002)............................................ .............................. 06 Figura 5: Estrutura do capsídeo do vírus dengue (DENV), adaptado: Kuhn, et al. (2002)................................................................................................................... 09 Figura 6: Barreiras de Infecção em mosquitos Aedes aegypti (adaptado Black IV & Severson (2005))................................................................................................... 11 Figura 7: Estrutura do Sindbis vírus, adaptado Zhang et al. (2002)........................ 13 Figura 8 - Modelo proposto do caminho de silenciamento de RNA em insetos....... 15 Figura 9: Um modelo de siRNA-guiado por Argonauta para clivagem de mRNA.... 17 Figura 10: Gel de agarose 1%. Extração de RNA total de msquitos....................... 25 Figura 11: Gel de agarose 1,2%. Expressão de S7RP em mosquitos Aedes aegypti submetidos a dietas diferentes..................................................................... 28 Figura 12: Expressão relativa do gene Ago em mosquitos Aedes aegypti da linhagem Rockfeller submetidos ao jejum ou alimentados com sacarose (sac), plasma ou sangue em 12, 24 e 48 horas após a alimentação.................................. 29 Figura 13: Expressão relativa do gene Ago em mosquitos Aedes aegypti da população Nova Venécia submetidos ao jejum e alimentados com sacarose, plasma e sangue em 12, 24 e 48 horas após a alimentação.................................... 30 Figura 14: Expressão relativa do gene Ago em mosquitos Aedes aegypti da população Vila Velha submetidos ao jejum e alimentados com sacarose, plasma e sangue em 12, 24 e 48 horas após a alimentação................................................ 31 Figura 15: Gel de agarose da amplificação de Ago por PCR. Expressão de argonauta (Ago) em células C6/36 controle e infectada com DENV-2, cepa Jamaica 1409............................................................................................................ 32 Figura 16: Expressão Relativa do gene C (Capsídeo) do vírus dengue (DENV-2) 34 VIII na população de Vitória ES, infectada com a cepa Dengue-2 Jamaica 1409........... Figura 17: Mortalidade de mosquitos Aedes aegypti da população Vitória-ES após alimentação com sangue (controle) e infecção oral com DENV-2, cepa Jamaica 1409............................................................................................................ 34 Figura 18: Mortalidade de mosquitos Aedes aegypti da população São Fidélis-RJ após alimentação com sangue e infecção oral com DENV-2, cepa Jamaica 1409.. 35 Figura 19: Expressão Relativa do gene C (Capsídeo) do vírus dengue (DENV-2) na população de Vitória-ES, infectada com a cepa Dengue-2 Ribeirão Preto........................................................................................................................... 36 Figura 20: Mortalidade de mosquitos Aedes aegypti da população Vitória-ES após alimentação com sangue e infecção oral com DENV-2, cepa Ribeirão Preto.. 37 Figura 21: Expressão Relativa do gene C (Capsídeo) do vírus dengue (DENV-2) na população de Vila Velha-ES, infectada com a cepa Dengue-2 Ribeirão Preto........................................................................................................................... 38 Figura 22: Mortalidade de mosquitos Aedes aegypti da população Vila Velha-ES após alimentação com sangue e infecção oral com DENV-2, cepa Ribeirão Preto.......................................................................................................................... 38 Figura 23: Expressão Relativa do gene Ago em mosquitos alimentados com sangue e infectados com DENV-2 (Ribeirão Preto) na população Vitória-ES.......... 40 Figura 24: Expressão Relativa do gene Ago em mosquitos alimentados com sangue e infectados com DENV-2 (Ribeirão Preto) na população Vila Velha-ES.... 41 Figura 25: Expressão relativa do gene Ago em mosquitos Aedes aegypti da linhagem Red alimentados com sangue e infectados com Sindbis vírus................. IX 42 LISTA DE ABREVIATURAS Ago – Argonauta DENV – Dengue Vírus FHD – Febre Hemorrágica de Dengue MEB – Barreira de Escape do Intestino MIB – Barreira de Infecção do Intestino PB – Pares de bases qPCR – Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa RISC – Complexo de Silenciamento Induzido por RNA RNAi – RNA de Interferência RSS – Supressor de Silenciamento de RNA RT- PCR – Transcrição Reversa - Reação em Cadeia da Polimerase sac – sacarose SCD – Síndrome de Choque de Dengue SINV – Sindbis Vírus X “Um pouco de ciência nos afasta de Deus”, muito nos aproxima". L ouis Pasteur XI RESUMO Arbovírus incluem vários patógenos como Flavivirus (DENV) e Alphavirus (SINV). O silenciamento gênico baseado na degradação de RNA (RNA de Interferência ou RNAi) tem sido descrito em vários organismos. Em células de mosquitos, este fenômeno ocorre em resposta à infecção viral, quando é detectada a dupla-fita de RNA (ds-RNA), produzida durante a replicação do vírus-RNA. Nosso objetivo foi analisar a expressão do gene ago, que codifica a proteína argonauta, parte do mecanismo do RNAi, em populações naturais e linhagens de laboratório de mosquitos Aedes aegypti, quando infectados com Dengue-2 e Sindbis e em resposta a variação alimentar, relacionando a competência vetorial com a eficiência da resposta antiviral mediada por RNA. Nós quantificamos a infecção e a expressão do gene ago através da PCR em Tempo Real. Verificamos uma alta infectividade das populações Vitória e Vila Velha infectadas com DENV-2, cepa Ribeirão Preto, mostrando alta expressão relativa da proteína C de DENV-2. A população Vitória, quando infectada com DENV-2 cepa Jamaica 1409, apresentou baixa infectividade e a população de São Fidélis – Ipuca não foi capaz de ser infectada por essa cepa. Observamos ainda que ocorreu um aumento gradativo da infecção, sendo estabilizada a partir do sétimo dia. Ocorreu a inibição da expressão do gene ago em mosquitos infectados em relação ao grupo controle (alimentados com sangue sem conter o vírus). A inibição foi maior após 7 dias de infecção. Mosquitos da linhagem Red infectados com Sindbis mostraram uma redução de 50% da expressão do gene ago após 4 dias da infecção. Populações Rockfeller e Vila Velha tiveram uma alta expressão de ago quando alimentados com sangue, enquanto Nova Venécia, ocorreu na alimentação com plasma. Populações naturais de Aedes aegypti mostraram diferentes comportamentos quando infectados com DENV. A expressão de ago parece estar relacionada em resposta a infecção viral. Sendo assim, a inibição de ago verificada em mosquitos infectados sugere a presença de supressores de silenciamento de RNA, que permitiria a infecção persistente no mosquito. Palavras chave: Aedes aegypti, XII expressão de argonauta, DENV. ABSTRACT Arboviruses comprehend several human pathogens, as Flavivirus (DENV) and Alphavirus (SINV). Genic silencing based on RNA degradation (Interference RNA – RNAi) has been described in various organisms. In mosquito cells, this phenomen occurs responding to viral infection, once it’s detected by presence of dsRNA, created during RNA-vírus replication. We aimed to analyze the ago gene expression, witch codifies argonauta protein, part of RNAi mechanism, in Aedes aegypti natural populations and laboratory linkages when infected with Dengue-2 and Sindbis, as well responding to feeding variation, relationed to vectorial capacity with RNA-mediated antiviral response eficience. We quantified the populations infections and ago gene expression via Real Time - PCR. We verified low infection on Vitória population with DENV-2 Jamaica 1409 strain. São Fidélis-Ipuca population was uncapable to be infected by this strain. Infected populations with DENV-2 Ribeirão Preto strain (Vitória and Vila Velha) showed high relactive expression of DENV. It was observed gradative infection rise, stabilized after seven days. Inhibition of ago expression occurred in infected mosquitoes, different than the control group. The inhibition was higher after the 7th day. Sindbis infected Red mosquitoes showed 50% ago inhibition after the 4th day of infection. Rockfeller and Vila Velha populations had a higher ago expression when feeded with blood, while Nova Venécia showed that with plasma meal. Aedes aegypti natural populations demonstrated different behaviors when infected with DENV. The ago expression seems to be related to the viral infection response. The inhibition verified on infected mosquitoes sugests the presence of RNA Silencing Supressors (RSS), which could permits the persistent infection on mosquitoes. Keywords: Aedes aegypti, argonauta expression, DENV. XIII Introdução ____________________________________________________ 1 1 – INTRODUÇÃO 1.1 – Dengue Dengue é a arbovirose (virose transmitida por artrópode – arthropod-borne viruse) de maior incidência no mundo, sendo endêmica em todos continentes, exceto na Europa. Acomete o homem, constituindo um dos maiores problemas de saúde pública no Brasil e em vários países tropicais, cujas condições climáticas favorecem a proliferação do mosquito vetor (Claro et.al, 2004). A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 100 milhões de pessoas sejam infectadas anualmente, em 100 países, de todos os continentes exceto a Europa. Cerca de 550 mil doentes necessitam hospitalização e 20 mil morrem em conseqüência da Dengue no mundo (FUNASA, 2002). A infecção por Dengue causa uma doença cujo espectro inclui desde infecções inaparentes até quadros de hemorragias e choques, podendo evoluir para a morte (Sardagna, 2003). A Dengue é causada pelo vírus pertecente à família Flaviviridae, que apresentam propriedades antigêncicas distintas e que caracterizam quatro sorotipos designados DENV-1, 2, 3 e 4 (Nogueira et al., 2000). A transmissão envolve mosquitos Aedes – Aedes aegypti e Aedes albopictus (Kow et al., 2001) que se infectam após picarem indivíduos virêmicos, e transferem, pela picada, os vírus ao homem susceptível, determinando um ciclo de transmissão (Sardagna, 2003). Os sintomas vão desde febre e sintomas constitucionais leves até manifestações hemorrágicas e choque, ou dengue hemorrágico/síndrome do choque associada ao dengue (DH/SCD) (Sardagna, 2003). 1.2 – Histórico da ocorrência da Dengue Registros de sintomas de dengue foram primeiramente publicado na Enciclopédia Chinesa durante os anos de 265 a 420 d.C. sendo novamente publicada em 610 d.C. e 992 d.C. A doença ficou conhecida como “água envenenada”, pelos chineses, que relacionavam a insetos voadores associados à água. A doença apareceu nas Índias Francesas Ocidentais em 1635 e no Panamá em 1699. Dengue, ou doença Introdução ____________________________________________________ 2 muito similar, teve distribuição geográfica antes do século XVIII onde houve a primeira pandemia. Em 1780 houve uma epidemia de dengue na Filadélfia (Gubler, 1998). Até o momento ocorreram no mundo oito pandemias, com duração de três a sete anos, no período compreendido entre 1779 e 1916 (Howe, 1977). Em 1964, após 20 anos sem registro da doença, um pequeno surto de DEN-3 foi diagnosticado no Taiti, ilha do Pacífico Sul, que não se dissemina para as outras ilhas próximas. Após cinco anos, um novo episódio causado pelo mesmo vírus evidencia que este ficou circulando no local, sob a forma endêmica. Nos anos seguintes, epidemias de DEN-2 ocorreram em várias ilhas do Pacífico e, em 1975, o DEN-1 foi introduzido nesta região. Na Austrália, registros de dengue vêm sendo feitos desde 1800, com múltiplas epidemias ocorrendo até 1955. Em 1981, a virose reaparece neste local provocando severas epidemias em várias cidades (Gubler, 1998). A figura 1 mostra a distribuição mundial da Dengue e do vetor Aedes aegypti. Epidemias de febre de dengue ocorreram durante o século XX. No entanto, após a Segunda Guerra Mundial epidemias de Febre Hemorrágica de Dengue emergiram no sudeste da Ásia e subseqüentemente estendida para as Ilhas do Pacífico e Américas (Gubler, 1998; Henchal & Putnak, 1990). Introdução ____________________________________________________ 3 Figura 1: Mapa da distribuição mundial da Dengue e Aedes aegypti em 2005. Observa-se a predominância do vetor e da doença nos trópicos. Fonte: Centers for Disease Control and Prevention (CDC, 2005). Nas Américas, a dengue tem sido relatada há mais de 200 anos. Na década de 50, a Febre Hemorrágica do Dengue (FHD), foi descrita pela primeira vez na Tailândia e nas Filipinas e, após a década de 60, a dengue intensificou-se nas Américas. A partir de 1963, houve a circulação comprovada dos sorotipos 2 e 3 do vírus em vários países. O sorotipo 3 foi isolado primeiramente em Porto Rico causando subseqüentemente epidemias na Jamaica e no leste do Caribe. Em 1977, o sorotipo 1 foi introduzido nas Américas, inicialmente pela Jamaica. A partir de 1980, foram notificadas epidemias em vários países, aumentando consideravelmente a magnitude do problema. O acontecimento epidemiológico mais relevante na história de dengue nas Américas é a epidemia de dengue hemorrágico e síndrome de choque do dengue (DH/SCD) que ocorreu em Cuba, em 1981. Nesta epidemia foram notificados 344.203 casos, com 116.143 hospitalizações. Dentre os 10.312 casos considerados graves, 158 resultaram Introdução ____________________________________________________ 4 em óbitos e, destes, 101 foram crianças (Donalísio, 1995). A figura 2 mostra a distribuição da circulação de DENV-3 nas Américas. Figura 2: Presença do vírus DENV-3 nas Américas. Período de 1994-2003. A partir de 1963 foi introduzido o sorotipo 3 inicialmente em Porto Rico, disseminando nos demais países americanos. Atualmente, este sorotipo circula em praticamente todos os países da América central e do sul. Fonte: WHO/PAHO/CDC, agosto, 2004. Em 1980, no Brasil, apenas 12 municípios estavam infectados pelo Aedes aegypti e, ao fim de 1998, esse número aumentara para aproximadamente 2.910. Em 2001, 3.587 municípios das 27 unidades federadas encontravam-se infestados e a transmissão da infecção já ocorria em 2.262 municípios de 24 Estados (Gonçalves Neto, 2004). No entanto, a reinfestação no país ocorreu a partir de Roraima em 1981/1982 (Claro et al., 2004). Na região sudeste, o Rio de Janeiro foi o primeiro estado a ter notificações de casos, no ano de 1986, seguido de Minas Gerais e São Paulo. O Estado do Rio de Janeiro tem um papel importante no quadro epidemiológico da dengue no Brasil, pelo fato de ser o primeiro Estado do país a registrar a circulação concomitante de três tipos de vírus: 1, 2 e 3 (DENV-1, DENV-2 e DENV-3). Pode-se acompanhar a evolução das epidemias no estado desde 1986 a 2002, de acordo com os números oficiais divulgados: nos anos de 1986 e 87 com a introdução do DEN-1, Introdução ____________________________________________________ 5 foram notificados 93.910 casos. Em 1990 a identificação do DEN-2 em Nova Iguaçu, desencadeou nova epidemia de grandes proporções, com o surgimento dos primeiros casos de dengue hemorrágica. No período de 1990/91 foram notificados 105.576 casos, sendo 1.316 de dengue hemorrágica (462 confirmados) e 8 óbitos. Nos anos de 1995 e 1998, duas outras epidemias de menores proporções ocorreram, com o registro de 35.240 e 32.382 casos, respectivamente. Apesar da Fundação Nacional da Saúde (FUNASA) lançar o Plano de Intesificação do Combate à Dengue em 2001, o Estado do Rio de Janeiro foi aplacado com mais uma grave epidemia no ano de 2002 (Lenzi & Coura, 2004). A figura 3 mostra a distribuição dos sorotipos circulantes nos Estados brasileiros em 2001. Figura 3: Situação Epidemiológica da Dengue no Brasil. Em 2001 circulavam os sorotipos 1, 2 e 3 do vírus dengue no Brasil. No Estado do Rio de Janeiro circulava concomitantemente os três sorotipos. Fonte: FUNASA / Vigilância Epidemiológica, 2001. Extraído de Lenzi & Coura, 2004. No Espírito Santo houve a reinfestação a partir de 1995, com a notificação de 2.725 casos e, a partir deste ano, o estado tem registrado casos da doença em todos os anos subseqüentes (Ministério da Saúde, 2001). Em 1995, foi isolado no Espírito Santo o sorotipo DEN-2 e no ano seguinte os sorotipos DEN-1 e DEN-2, que passaram a circular nos municípios de Cariacica, Serra, Viana, Vila Velha, Vitória e Cachoeiro de Itapemirim (Coelho & Silva, 2001). Introdução ____________________________________________________ 6 No ano de 2002 houve a introdução do vírus DENV-3 e a notificação de 28.666 casos. A expressão clínica da doença modificou-se após a introdução do sorotipo 3 no Estado do Espírito Santo, quando ocorreu a explosão da terceira onda epidêmica no Estado e no Brasil. A figura 4 mostra a distribuição da dengue e do vetor Aedes aegypti no município do Espírito Santo. É iminente o risco de introdução do DENV-4 no país, em função do contínuo tráfego aéreo e marítimo com diversos países das Américas e de outros continentes onde este sorotipo circula. Figura 4: Distribuição do vetor e da transmissão de Dengue no estado do Espírito Santo (situação em 2002). Observa-se em 2002, que apenas 10 municípios não havia infestação do vetor e 11 não havia transmissão da doença. Fonte: Vigilância Ambiental em Saúde / Secretaria Estadual de Saúde – ES. Introdução ____________________________________________________ 7 1.3 – O mosquito Aedes aegypti Os mosquitos são classificados dentro da família Culicidae, subordem Nematocera da ordem Díptera. A família Culicidae possui acima de 3200 espécies descritas (Munstermann & Conn, 1997) e tipicamente é subdividida dentro de três subfamílias: Anophelinae, Culicinae e Toxorhynchitinae. O gênero Aedes é o principal da sub-família Culicinae que compreende mais de 1200 espécies (Kettle, 1995). Geralmente, o estágio imaturo do Aedes requer 7 dias para emergência do adulto em ambientes tropicais, embora recipientes naturais ou artificiais que acumulam água podem tornar-se potenciais criadouros do mosquito (World Health Organization, 1995). Os mosquitos sofrem metamorfose completa. Do ovo eclode larva que cresce transformando-se em pupa da qual emerge o mosquito adulto alado. Os estágios larval e pupal são aquáticos. As larvas sofrem quatro mudas sendo que a última acontece no momento da pupação (Matheson, 1932). A fêmea do mosquito adulto alimenta-se de sangue após 48 horas da emergência, a oviposição ocorre de 2 a 5 dias. Uma única fêmea pode colocar de 60100 ovos na oviposição inicial (World Health Organization, 1995). Muitas espécies de Aedes são vetores de arboviroses que infectam vários vertebrados, incluindo humanos. O Aedes aegypti é uma das espécies de maior importância médica do mundo, é o principal vetor do vírus da febre amarela urbana e é o vetor primário do vírus dengue (DENV) (Bosio, et al.,2000). É um mosquito com ampla distribuição geográfica predominando nas áreas tropicais e subtropicais situadas entre os paralelos de latitudes 45° Norte e 40º Sul (Bezerra et.al., 2006). É uma espécie de atividade diurna e tem a preferência domiciliar e locais sombrios. Prefere picar 2 a 3 horas depois do amanhecer e 3 a 4 horas depois do anoitecer. No entanto, o mosquito se alimenta dentro e fora das casas durante todo o tempo, especialmente em dias nublados (Gubler, 1998). Estudos laboratoriais indicam que a sobrevivência é de 20 e 30 dias para machos e fêmeas de Aedes adultos, respectivamente (World Health Organization, 1995). O Ae. aegypti foi introduzido no Brasil durante o período colonial tendo sido combatido em nosso território onde foi considerado erradicado em 1955. No entanto, a Introdução ____________________________________________________ 8 não erradicação do mosquito nos países vizinhos propiciou sua reinfestação no Brasil por Belém do Pará em 1967. A densidade e o grau de domiciliação dos vetores do dengue influem na capacidade vetorial das populações do mosquito em diferentes regiões (Donalísio & Glasser, 2002). Após alimentar-se de uma pessoa contendo o vírus dengue, a fêmea do mosquito Aedes normalmente requer um período de incubação de 8 a 10 dias onde o vírus se multiplica até a glândula salivar do mosquito. Após isso, o mosquito torna-se apto para transmitir o dengue vírus para um novo hospedeiro humano na ocorrência de repetidas alimentações. No homem, o período de incubação é de 5 a 7 dias. A fêmea do mosquito Aedes também pode transmitir o vírus imediatamente de uma pessoa infectada para outro indivíduo pela mudança do hospedeiro quando o repasto sangüíneo é interrompido – transmissão mecânica (World Health Organization, 1995). A prevenção e controle da dengue e da FHD depende do controle do Aedes aegypti em torno dos domicílios onde mais ocorre a transmissão. Inseticidas em sprays para mosquitos adultos não são eficazes, ao não ser que sejam usados dentro de casa. O caminho mais eficaz para o controle do mosquito seria a redução larval nos domicílios (Gubler, 1998). 1.4 – O vírus Dengue (DENV) Arbovírus (arthropod-borne vírus) incluem diversos patógenos humanos, muitos deles apresentando genoma constituído de RNA como DENV e Alphavirus. No entanto, os arbovirus não são considerados vírus de insetos verdadeiros, pois eles são tipicamente não patogênicos para estes hospedeiros. Vírus dengue (DENV) são agrupados em quatro sorotipos antigenicamente distintos denominados DENV-1, 2, 3 e 4 (Sabin, 1952; Hammon et al.,1960). Evidências da variação intratípica entre os vírus DEN têm sido demonstradas desde 1970 (McCloud et al., 1971; Russel & McCown, 1972), embora somente com os avanços da tecnologia molecular tem sido possível determinar a variabilidade genética de cada sorotipo (Miagostovich et al., 2003). Dengue (família Flaviviridae, gênero Flavivirus) é um vírus pequeno, de 50nm de diâmetro, envelopado que contém uma única fita RNA +sense de aproximadamente 11 kb, como genoma (Sanchez-Vargas et al., 2004). Este é traduzido em uma grande Introdução ____________________________________________________ 9 poliproteína (Clyde & Harris, 2006), posteriormente processada por proteases virais e celulares em três proteínas estruturais distintas, envolvidas na formação da partícula viral (Capsídeo (C), pré-membrana (prM) e envelope (E)) e outras sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (Xu et al., 2005). As proteínas NS são responsáveis pela replicação do RNA viral e também auxiliam na junção viral e na evasão da resposta imune do hospedeiro (Puig-Basagoiti, et al., 2006). NS1 é uma glicoproteína que é necessária na replicação do RNA. NS2A e NS2B são dois polipeptídeos hidrofóbicos. Essas proteínas são clivadas por proteases virais. A NS3 é uma proteína multifuncional com atividades de uma serino-protease (com a NS2B como um co-fator). O domínio intermediário da NS3 é uma nuclease, necessária para a replicação do RNA e o domínio C-terminal tem atividade RNA trifosfatase. NS4A e NS4B são poplipeptídeos hidrofóbicos que estão associados com a membrana (Straus & Straus, 2002). NS5 tem a função de uma RNA polimerase RNA-dependente (Puig-Basagoiti et al., 2006). A estrutura do capsídeo viral é mostrada na figura 5. Figura 5: Estrutura do capsídeo do vírus dengue (DENV), adaptado: Kuhn, et al., 2002. Estrutura do vírus mostrando cada monômero com os domínios I, II e III em vermelho, amarelo e azul, respectivamente. O triângulo define a simetria icosaédrica. Introdução ____________________________________________________ 10 Dentre as propriedades virais, destacam-se ainda, a morfologia esférica (Kuhn, et al., 2002). O nucleocapsídeo é icosaédrico e simétrico (Straus & Straus, 2002) agrupando-se com o RNA sobre a face citosólica da membrana do retículo endoplasmático. Em micrografias, a organização da proteína C no interior do nucleocapsídeo não é uma estrutura visível. A proteína C do DENV é essencial para o agrupamento do vírus para garantir a encapsidação do genoma viral. Um papel crítico da proteína C é a evidência que existe partícula subvirais que são liberadas das células infectadas (Ma et al.,2004.) As proteínas estruturais são codificadas na extremidade 5’ (Straus & Straus, 2002), o genoma contém a região cap tipo I na extremidade 5’ com 96 nucleotídeos (nt), chamada 5’ UTR (região não traducional) e 451 nt na região não poliadenilada 3’ UTR (Edigil et al., 2006). Uma mudança conformacional induz a fusão do vírus com a membrana celular do hospedeiro permitindo a entrada do genoma viral no citoplasma (Modis et al., 2004). No entanto, não foi identificado até o momento nenhum receptor celular mediando a entrada do vírus. Quando o mosquito se alimenta do sangue de um indivíduo virêmico, o vírus encontra várias barreiras de infecção. Primeiramente, o vírus estabelece uma infecção no intestino por vencer a barreira de infecção do intestino (MIB). Seguindo a replicação no epitélio intestinal, o vírus passa por uma barreira de escape do intestino (MEB) e replicam em outros tecidos, disseminando a infecção. Finalmente, o vírus infecta as glândulas salivares e se alojam na saliva sendo transmitido para o próximo hospedeiro vertebrado (Bosio et.al., 1998) – figura 6. Introdução ____________________________________________________ 11 Figura 6: Barreiras de Infecção em mosquitos Aedes aegypti (adaptado Black IV & Severson (2005)). Ao alimentar-se de sangue de um indivíduo virêmico, o vírus primeiramente ultrapassa a primeira barreira de infecção no mosquito – a Barreira de Infecção do Intestino (MIB) – estabelecendo a infecção nas células epiteliais e replicando-se nessas células. Em seguida, o vírus ultrapassa a Barreira de Escape do Intestino (MEB), passando pela lâmina basal e replicando-se em outros órgãos. Finalmente, o vírus chega à Barreira de Transmissão (TB), onde ocorre a infecção nas glândulas salivares e, conseqüentemente, a saída do vírus podendo, a partir daí, ser transmitido para outros indivíduos. A entrada do vírus dengue (DENV) ocorre no mosquito fêmea adulto que se infecta na ingestão de sangue. Começa com a amplificação viral unidirecional produzindo infecção nas células epiteliais do intestino médio. Seguindo a replicação do vírus nas células epiteliais, o vírus sai do intestino médio e dissemina no órgão alvo secundário: as glândulas salivares. A nova replicação ocorre nas glândulas salivares e o vírus é eventualmente abrigado no interior dos ductos dessas glândulas. A transmissão ocorre pelo caminho da infecção na saliva até uma subseqüente picada. O tempo entre a infecção inicial no intestino médio e a transmissão do vírus na saliva, é denominado Período Extrínseco de Incubação (EPI), que é geralmente de 7 a 14 dias (Sanchez-Vargas et al., 2004). Introdução ____________________________________________________ 12 1.5 – O Vírus Sindbis (SV) O gênero Alphavirus (família Togaviridae) é representado pelo Sindbis Vírus (SV). Estes vírus são responsáveis por doenças de sintomas febris, hemorragias e dores musculares e nas articulações (Mudiganti et al., 2006). O ciclo de transmissão de arbovírus envolve a replicação em insetos hematófagos, como os mosquitos, e hospedeiros vertebrados (Sanders et al., 2005). Vetores destes vírus incluem mosquitos do gênero Culex e Aedes (Myles et al., 2003). Quando o mosquito ingere sangue de um hospedeiro vertebrado virêmico, o vírus inicialmente infecta as células epiteliais do intestino e em seguida sai do órgão para infectar tecidos secundários, como o corpo gorduroso e glândulas salivares. A infecção ocorre severamente em uma espécie de mosquito ou população para serem competentes de transmitir os arbovírus (Sanders et al., 2005). Alphavirus são estruturas híbridas contendo proteínas e RNA codificados pelo vírus, e lipídeos e carboidratos derivados da célula hospedeira (Hernandez et al.,2005). O genoma é formado por uma longa fita simples de 11,703 nucleotídeos (nt) com uma região cap 5’ e uma cauda poli A 3’ (Li et al.; 2004). Diferente da maioria dos vírus envelopados que são livremente estruturados em proteínas modificadas em envelopes, os alphavirus são altamente organizados em um arcabouço de proteínas icosaédricas com uma membrana associada (Hernandez et al.,2005). A figura 7 mostra a estrutura do sindbis vírus. Em 1989, a criação de alphavirus auto-replicáveis foi um ponto de partida para o rápido desenvolvimento de vários vetores alphavirais (Rhême et al., 2004). Xiong et al., 1989 modificaram vírus sindbis infeccioso pela substituição da região de genes de proteínas estruturais com o gene da cloranfenicol acetil transferase (CAT). Para compactar replicons de RNA em partículas, um SINV foi usado para fornecer proteínas estruturais (Xiong et al.,1989). Vírus Sindbis recombinante tem sido usado para expressar ou silenciar genes in vitro ou in vivo e oferece grande potencial para caracterização de genes. O sistema do duplo subgenômico do vírus sindbis (dsSIN) contém um segundo promotor subgenômico entre genes de proteínas estruturais e Introdução ____________________________________________________ 13 regiões não-codificantes para facilitar a expressão de genes recombinantes (Cheng et al., 2001). Figura 7: Estrutura do Sindbis vírus, adaptado Zhang et al., 2002. A: Superfície do vírus, resolução 20ºA. B: O vírus na resolução de 11ºA mostrando claramente a bicamada lipídica e os domínios transmembranas atravessando a membrana. O nucleocapsídeo (NCP) é mostrado do lado de dentro da membrana e, mais internamente está localizado o RNA. 1.6 – O RNA de Interferência (RNAi) O mais importante avanço da biologia nessas últimas décadas tem sido a descoberta que moléculas de RNA podem regular a expressão de genes (Novina & Sharp, 2004). Estudos realizados entre 1980 e 1990, para avaliar o efeito da diminuição da expressão de genes envolvidos com a pigmentação de flores, biólogos de plantas trabalhando com petúnias, introduziram cópias de genes dihydroflavonol-4-reductase (DFR) ou chalcone synthase (CHS) no genoma de Petunia hybrida, e observaram um mecanismo de silenciamento gênico que ocorria naturalmente (Napoli et al., 1990). Em plantas, portanto, sabe-se que transgenes podem induzir o silenciamento e, conseqüentemente, silenciar genes endógenos homólogos por um processo denominado PTGS (“post-transcriptional gene silencing”) e em Neurospora crassa, uma levedura, transgenes também induzem o silenciamento de genes em um processo póstranscrição chamado “quelling” (Bosher & Labouesse, 2000). O mesmo fenômeno foi descoberto em animais primeiramente no nematóide Caenorhabditis elegans, em Introdução ____________________________________________________ 14 resposta à introdução de dupla fita de RNA (dsRNA) com o resultado do silenciamento de uma seqüência específica de um gene (Fire et al.,1998). RNA de interferência (RNAi) é o nome genérico que se dá a processos de silenciamento gênico por degradação de RNA de uma seqüência específica que ocorre no citoplasma de células eucarióticas induzidos pela presença de genes aberrantes, como dupla fita de RNA (double-stranded – dsRNA), transgenes ou transposons (Haasnoot et al., 2003). Estes mecanismos são altamente conservados, sendo descritos em plantas, leveduras, mamíferos e várias espécies de insetos, como Anopheles gambiae, Aedes aegypti e Drosophila melanogaster (Cerutti & Casas-Mollano, 1999). Além disso, o mecanismo de silenciamento gênico mediado por RNA tem sido utilizado como ferramenta para o estudo da função de genes em várias espécies de insetos, como Rhodnius prolixus, por exemplo (Araújo, et al., 2006). Em células de mosquito, este fenômeno ocorre em resposta à infecção viral, uma vez que essas células detectam a presença de dsRNA, formada transitoriamente durante a replicação do RNA-vírus. Visto que a dsRNA não é produzida normalmente por células, a presença desta é um sistema de aviso à infecção e o principal mecanismo anti-viral descrito em mosquitos (Olson et al., 2002). O RNAi tem duas funções distintas: O primeiro é a regulação celular da expressão de genes via microRNAs (miRNAs). miRNAs representam uma família altamente estruturada de pequenos RNAs não-codificantes que regulam a expressão de genes a nível pós-transcricional. A segunda função é a inibição da entrada de vírus e o silenciamento de transposons pela formação de pequenos RNAs de interferência (Berkhout & Haasnoot, 2006). Durante este processo, a dsRNA é inicialmente clivada em pequenos siRNA (small interference RNA) em um tamanho de 21-25 nucleotídeos (Sanchez-Vargas et al., 2004), por uma enzima RNAase III-simile, chamada DICER (Haasnoot et al., 2003). Os fragmentos de dsRNAs são incorporados ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). RISC é composta por proteínas da família Argonauta (rde-4, rde-1 e drh-1/2) em Caenorhabditis elegans ou Argonauta 2 em Drosophila melanogaster (Sanchez-Vargas et al., 2004). Estes pequenos RNAs (siRNA) são associados ao Complexo de Silenciamento Induzido por RNA (RISC) que possui atividade helicase. A fita antisense do siRNA guia o RISC para o RNA alvo complementar e o componente Introdução ____________________________________________________ 15 nuclease do complexo cliva o RNA alvo da seqüência específica. Além disso, os siRNA podem funcionar como moldes para a síntese de mais dsRNA a partir da fita simples (ssRNA) numa reação catalisada por uma RNA polimerase do hospedeiro (RdRp) (Haasnoot et al., 2003). Este processo, envolvido na amplificação e disseminação do sinal de RNAi, tem sido descrito principalmente em plantas e C. elegans, (Haasnoot et al., 2003, apud. Sijen et al., 2001). Figura 8 - Modelo proposto do caminho de silenciamento de RNA em insetos. (1) dsRNA é reconhecida pela Dicer e (2) clivada em fragmentos de dupla fita de 21-25 nucleotídeos, formando complexos de proteínas e siRNAs. (3) As moléculas de dsRNA são incorporadas ao complexo RISC. (4) RISC é guiada pela incorporação de siRNAs à molécula de RNA alvo de seqüência complementar. (5) RISC cliva o mRNA alvo. Dicer: RNase III com atividade nuclease e helicase dependente de ATP. RISC: Complexo de Silenciamento Induzido por RNA (endonuclease). Adaptado de Sanchez-Vargas et al., 2004. Introdução ____________________________________________________ 16 1.7 – Os complexos protéicos envolvidos em RNAi RNAi é o mecanismo pelo qual uma dupla fita de RNA (dsRNA) dispara uma cascata de reações que levam ao silenciamento de um gene por degradação de um RNAm específico. A dsRNA introduzida é primeiramente processada pela DICER, uma enzima com atividade RNAase III-simile, em pequenos fragmentos chamados de siRNA. Estes servem como uma seqüência guia induzindo o complexo de silenciamento (RISC) à degradação da molécula de RNA alvo fita simples (Galiana-Arnoux et al., 2006). DICER é uma enzima constituída por um domínio N-terminal DEXH-box RNA helicase, um domínio de função desconhecida (DUF283), um domínio PAZ, dois domínios ribonuclease (RIIIa e RIIIb) e um domínio ligado a dsRNA. Em Drosophilla há duas Dicers: dcr-1 e dcr-2. O gene dcr-1 desempenha o papel da biogênese de miRNA e a dcr-2 está envolvida com a produção de siRNA. A função da Dicer não é somente clivar a dsRNA mas também liberar as moléculas de siRNA para o Complexo RISC. RISC é um complexo de multiproteínas de 200 – 500 kDa e está diretamente ligada à clivagem do mRNA alvo (Bernstein et al., 2001). Proteínas da família Argonauta 1 (AGO-1) foram inicialmente caracterizadas em Arabidopsis (Bohmert et al., 1998). A família AGO é definida pela presença de duas regiões conservadas, um domínio PAZ e um domínio PIWI; o domínio PAZ interage com 2pb dos siRNA ou miRNA; e o domínio PIWI media o silenciamento do RNAm alvo através de sua atividade RNase (Ronemus et al., 2006). O domínio PAZ é constituído de 100 aminoácidos e o domínio PIWI de 300 aminoácidos na região N- e C-terminal, respectivamente (Cerutti et al., 1999). A figura 9 mostra um modelo esquemático de Argonauta de Pyrococcus furiosus. Evidências genéticas e bioquímicas têm demonstrado que AGO2 está envolvida diretamente com siRNA clivando o RNA alvo e a AGO1 está envolvida diretamente com miRNA na clivagem do RNA alvo (Kavi et al., 2005). Os siRNAs formam uma classe de dsRNAs de 21-22 nucleotídeos. Estes siRNA silenciam genes por promoverem a clivagem do mRNA de seqüências complementares. miRNA é a classe de 19-25 nucleotídeos de RNA fita-simples que são codificados por muitos organismos. Estes Introdução ____________________________________________________ 17 miRNA silenciam genes endógenos no estágio da síntese de proteínas (Novina & Sharp, 2004). Figura 9: Um modelo de siRNA-guiado por Argonauta para clivagem de mRNA. (A) Vista do potencial eletrostático de superfície de pfAgo (Pyrococcus furiosus) indicando um sulco carregado positivamente (em azul). O local aproximado do sítio ativo está marcado com asteriscos amarelos. (B) Uma porção 3’ do siRNA (roxo) foi colocada por superposição do domínio PAZ do domínio do complexo RNA Ago1-PAZ do domínio PAZ de Ago. A fita passageira do complexo Ago1-PAZ colocado de maneira similar foi usado para modelar a fita de mRNA (azul claro) por extensão de dois nucleotídeos de RNA na terminação 5’, e do meio dessa fita pelo sulco de ligação perto do sítio ativo de PIWI. O fosfato entre os nucleotídeos 11 e 12 da terminação 5’ do mRNA caem perto de resíduos do sítio ativo (vermelho). (C) Descrição esquemática do modelo de siRNA-guiado para clivagem de mRNA. O siRNA (amarelo) liga-se com a terminação 3’ no sulco PAZ e o 5’ é esperado que se ligue perto da outra terminação do sulco. O mRNA (marrom) vem internamente entre o N-terminal e domínios PAZ e externamente entre PAZ e o domínio intermediário. O sítio ativo do domínio PIWI (mostrados como tesouras) cliva o mRNA oposto ao siRNA guia. Song et al., 2004. Introdução ____________________________________________________ 18 1.8 – Supressores de RNAi Estudos recentes da resistência de mosquitos a DENV mediado pelo silenciamento de ação antiviral em Aedes aegypti mostraram que a transfecção recombinante do alphavirus Sindbis (SINV) com uma proteína estrutural de DENV induz a resistência em cultura de células e mosquitos. A resistência para DENV é sorotipoespecífica e independente da expressão da proteína de DENV, indicando que é mediado por RNAi (Li & Ding, 2005). O silenciamento mediado por RNA é um dos mais significativos processos de defesa contra vírus em um grande número de organismos, incluindo plantas e insetos. Em contrapartida, muitos vírus adquirem funções para a supressão do mecanismo de silenciamento mediado por RNA (Reed et al., 2003). As proteínas de contra-defesa viral com atividade de supressor de silenciamento (RSS) foram originalmente descobertas em membros de vírus de planta do gênero Potyvirus e Cucumovirus. RSSs foram encontrados em outros vírus de planta RNA sense+ que pertencem aos gêneros Tombusvirus, Sobemovirus, Potexvirus (Voinnet et al., 1999; Voinnet et al., 2000), Pecluvirus (Dunoyer et al., 2002) e Polerovirus (Pfeffer et al., 2002) e também em um vírus do gênero Nodavirus que infecta inseto (Li, et al., 2002). Buscas por RSSs tem se tornado uma parte essencial da caracterização funcional dos genomas virais (Reed, et al., 2003). A co-evolução hospedeiro-vetor-parasita é, portanto essencial para que uma dada doença permaneça afligindo as populações humanas. O entendimento desse processo pode ser a chave para a descoberta de novos caminhos para o controle delas. No presente trabalho a interação vírus-vetor é abordada através do monitoramento da expressão do gene Ago, parte do mecanismo de RNAi, com a capacidade vetorial de populações naturais de Aedes aegypti. Justificativa __________________________________________________ 19 2 – JUSTIFICATIVA Dengue é uma infecção re-emergente que vem preocupando mundialmente as autoridades sanitárias (Teixeira et al., 2001). É a arbovirose de maior incidência no mundo, sendo endêmica em vários continentes. Cerca de dois terços da população mundial vive em áreas infestadas com o mosquito vetor. No ano de 2003 foi realizada uma pesquisa que classificou as áreas de risco para epidemias de dengue nos municípios do ES (Silva et al., 2003). Dessa forma, os municípios do estado foram definidos em áreas de alto, médio e baixo risco de epidemias de Dengue. Este mapeamento é a base para a definição de populações naturais de Aedes aegypti, que talvez possuam diferentes competências vetoriais, determinando ou colaborando para as diferenças epidemiológicas locais. As principais epidemias de Dengue ocorridas no Rio de Janeiro foram em 1986/1987 com a introdução do sorotipo 1 do vírus, em 1990/1991 com a introdução e predominância do sorotipo 2 e em 2001/2002, com a introdução e predominância do sorotipo 3 (Casali et al., 2004). O município de São Fidélis, está localizado na mesorregião do Norte Fluminense, tem registrado poucos casos da doença nos últimos anos, com exceção o ano de 2007, quando foram registrados 144 casos (Secretaria Estadual de Saúde – RJ, 2007). Competência vetorial é a capacidade de uma população de mosquitos infectar-se com um vírus determinado e transmiti-lo após um período chamado ciclo extrínseco de multiplicação (Degallier et al., 2001), que parece ser bastante variável em populações naturais de Aedes. A suscetibilidade do mosquito à infecção com o vírus em populações naturais tem sido relacionada à existência de barreiras envolvendo a infecção das células do intestino ou a saída do vírus do intestino (Black et al., 2002). Entretanto muitas questões acerca da competência vetorial não foram ainda respondidas. Ao mesmo tempo em que o vírus dengue é capaz de infectar o Aedes aegypti, outros flavivírus são eliminados do trato digestivo do inseto (Wolff et al., 2001). O presente projeto se propõe investigar mecanismos de interação vírus/vetor através do monitoramento simultâneo da infecção viral e do padrão de expressão da Justificativa __________________________________________________ 20 proteína Argonauta (gene Ago). Argonauta é uma das proteínas que constituem o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), um dos complexos do sistema de RNAi, já descrito para um grande número de espécies. A hipótese de trabalho é que a suscetibilidade ou a refratoriedade do mosquito à infecção pelo vírus Dengue (DENV) pode estar relacionada à sua capacidade de responder à presença do vírus (RNAi como mecanismo antiviral), ou à competência do vírus de burlar estas defesas celulares (supressores de RNAi). Dessa forma, existiria uma co-evolução de mosquitos e vírus, de forma que uma determinada população de mosquito pode ser mais eficiente como vetor de uma determinada cepa, mas não de outra. A identificação de genes envolvidos na resposta antiviral e como sua expressão ocorre em resposta à infecção é fundamental para se entender os mecanismos de competência vetorial de populações naturais de Aedes aegypti. Com base nessas informações será possível identificar populações de vetores com um alto risco de transmissão de arbovírus em humanos, o que permitirá um planejamento racional dos programas de controle da dengue e outras doenças transmitidas por arbovírus. Além disso, informações como essas podem servir de base para a construção de mosquitos geneticamente modificados para que sejam refratários a esses vírus (Sanchez-Vargas, et al., 2004). O bjetivos ______________________________________________________ 21 3 – OBJETIVOS 3.1 – Objetivo Geral Relacionar a capacidade vetorial de populações naturais de Aedes aegypti com a eficiência da resposta anti-viral mediada por RNA (RNAi). 3.2 – Objetivos Específicos Monitorar a capacidade infectiva de diferentes populações naturais de Aedes aegypti por análise quantitativa; Monitorar comparativamente a expressão de Ago nas diferentes populações naturais de Aedes aegypti por análise quantitativa; Monitorar a expressão do gen Ago em Aedes aegypti em resposta a diferentes condições experimentais. M ateriais & M étodos _____________________________________________ 22 4– MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 – Local da Pesquisa A pesquisa foi realizada com as populações naturais de mosquitos Aedes aegypti coletadas no Estado do Espírito Santo e Rio de Janeiro, região sudeste do Brasil. Os municípios selecionados onde foram realizadas as coletas de amostras de ovos e/ou larvas do mosquito foram: ilha de Vitória, localizada em latitude Sul 20º 19’ e longitude Oeste 40º 20’; Vila Velha 20º 19’ latitude Sul e 40º 19’ longitude Oeste, Nova Venécia 18º42’ latitude Sul e 40º24’ longitude Oeste e São Fidélis 21º38’ latitude Sul e 41º44’ longitude Oeste (Estado do Rio). De acordo com a Secretaria Estadual de Saúde os municípios Vitória e Vila Velha têm apresentado nos últimos anos alta incidência de Dengue. O município Nova Venécia, localizado no norte do estado do Espírito Santo, apresenta poucos casos da doença, bem como o município de São Fidélis – distrito de Ipuca. 4.2 – Coleta de ovos e larvas de Aedes aegypti O trabalho foi desenvolvido em colaboração com os Centros de Controle de Zoonozes (CCZ) dos municípios envolvidos e com o Helder Ricas Rezende, biólogo do Núcleo de Entomologia da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES). As amostras de larvas e pupas oriundas do município de São Fidélis - Ipuca foram coletadas juntamente com os Agentes de Saúde do CCZ do município. As amostras de ovos do mosquito dos municípios da Grande Vitória (Vitória e Vila Velha) e de Nova Venécia foram cedidas pelo Núcleo de Entomologia da UFES, coletados através de ovitrampas instaladas nessas localidades. Estes foram transportados em sacos plásticos diretamente para o laboratório onde foram estocados a temperatura ambiente para posterior utilização, em até 6 meses. Foram utilizadas gerações F1 nos experimentos de infecção de mosquitos. M ateriais & M étodos _____________________________________________ 23 4.3 – Manutenção da colônia de Aedes aegypti As populações naturais de Aedes aegypti foram mantidas no insetário do Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos por até 2 gerações, exceto a linhagem Rockfeller, mantida por várias gerações em condições de laboratório e originalmente obtidas de uma colônia mantida pelo Prof. Dr. Francisco José Lemos (LBT-UENF), e a linhagem RED, cedidas pelo Prof. Dr. Marcos Sorgine (Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ) . Estas foram eventualmente utilizadas como controle. Na fase de larvas as populações são mantidas em água destilada em bandejas de plástico, sendo alimentadas com ração de camundongo moída. Na fase adulta, os mosquitos são alimentados com solução de sacarose (1%) para manutenção e as fêmeas são alimentadas com sangue de camundongo para postura de ovos e/ou experimentação. 4.4 – Amostras Virais As amostras virais foram cedidas pela Drª. Carol Blair do Arthropod-borne and Infectious Disease Laboratory (AIDL) da Colorado State University (Fort Collins, Colorado, USA), pelo Dr. Paulo Filemon Pimenta do Instituto René Rachou – Fiocruz BH e pelo Dr. Marcos Henrique Ferreira Sorgine do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ. As cepas utilizadas foram do sorotipo DENV-2, Jamaica 1409 e Ribeirão Preto, sendo esta última isolada de paciente que apresentava o quadro hemorrágico da doença. E a cepa AR339 do SINV. Estas cepas foram utilizadas para propagação viral em células C6/36 de Aedes albopictus (ATCC – CRL 1660) e para infecção de mosquitos Aedes aegypti através da alimentação artificial. 4.5 – Cultura e Infecção de células C6/36 As culturas de células C6/36 (Aedes albopictus) foram mantidas em Meio L-15 Leibovitz Medium - Gibco com uma concentração de 10% Soro Fetal Bovino (FSB) Cultilab, 1% de streptomicina e pH 7,2. Para a infecção com DENV, essas células foram mantidas até, aproximadamente, 90% de confluência. Em seguida, soltava-se estas células e acrescentava-se o vírus. A partir daí as células eram mantidas em meio com 2% FBS durante 7 dias que antecediam a infecção de mosquitos. O sobrenadante destas células era utilizado para a infecção. M ateriais & M étodos _____________________________________________ 24 4.6 – Propagação Viral Os vírus dengue (DENV2) foram propagados utilizando-se células C6/36 com aproximadamente 80% de confluência, em Meio L-15 Leibovitz Medium contendo 2% de FBS e 1% de streptomicina. Após sete dias, o meio foi trocado e mantido por mais, aproximadamente, 7 dias onde foi coletado, centrifugado, aliquotado em tubos criogênicos e estocados a -70ºC. 4.7 – Infecção de mosquitos Os mosquitos foram infectados através de alimentação oral, utilizando-se um sistema de alimentação artificial (Higgs & Beaty, 1996). Foram utilizados mosquitos fêmeas de 5-7 dias de idade desprovidas de sacarose 24 horas antes da infecção, adaptando o protocolo de Tardieux et al. (1990). Como controle, fêmeas de mesma idade foram alimentadas com sangue de camundongo contendo o mesmo volume de meio adicionado no lugar da suspensão viral. As fêmeas foram separadas em gaiolas juntamente com alguns machos para estimular a alimentação. Também foi utilizada solução de ATP a 1mM como fago-estimulante. A inativação do plasma sanguíneo foi realizada por 1 hora a 57ºC, antes da adição do vírus. O sangue utilizado pra infecção foi mantido a 37ºC, em um sistema de banho circulante com aquecimento. A proporção de solução viral e sangue utilizada foi de 1:2. 4.8 – Extração de RNA de mosquitos Aedes aegypti Para extração de RNA total, foram macerados um pool de 6 mosquitos em 500µL do reagente Trizol (Invitrogen). Em seguida, foi adicionado 200 µL de clorofórmio gelado agitando vigorosamente. Estas amostras foram centrifugadas a 12.000 g por 15 minutos. A fase aquosa resultante da centrifugação foi transferida para outro tubo e adicionado 500µL de isopropanol (p/v) desprezando a fase orgânica. Após 10 minutos de incubação, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 12.000 g. O sobrenadante foi descartado e o pelet lavado com 1mL de etanol 75% sendo centrifugado em seguida a 7.500 g por 8 minutos. O sobrenadante foi novamente descartado e o RNA total foi seco pela inversão dos tubos em papel absorvente. Após a secagem o RNA total foi eluído com 50 µL de água ultrapura livre de RNases (DEPC). M ateriais & M étodos _____________________________________________ 25 Todas incubações foram feitas em gelo para evitar a degradação do RNA. O RNA foi aliquotado e estocado a -70ºC. Posteriormente, foi quantificado em espectrofotômetro em comprimentos de onda de 260 e 280 nm para a posterior transcrição reversa (kit Applied Byossistems). Uma porção do RNA total extraído foi submetida à eletroforese sob condições desnaturantes em gel de agarose a 1% para determinar a qualidade do mesmo. A figura 10 mostra o gel resultado de uma extração de RNA de mosquitos Aedes aegypti. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Figura 10 – Gel de agarose 1%. Extração de RNA total de mosquitos Aedes aegypti (população natural – Vitória ES). 1, 2, 3, 4 e 5 – 1º, 2º, 3º, 6 e 8º dia de mosquitos infectados. 6, 7, 8, 9 e 10 - 1º, 2º, 3º, 6 e 8º dia de mosquitos controle. 4.9 - RT-PCR Primeira fita do cDNA foi sintetizada com 2 µg de RNA total usando High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit – Applied Byossistems. PCR foi semi-quantitativo para determinar intensidades relativas dos produtos alvos usando procedimentos descritos por Blandin et al. (2002) e Hoa et al. (2003) com algumas modificações. Reações de PCR foram realizadas em células C6/36 infectadas com DENV-2 ou controle para que fragmentos gênicos de argonauta pudessem ser obtidos. Cada reação continha 2,5 µl de tampão de reação 10X, 0,5 µl de dNTP (10 mM), 0,7 µl dos primers degenerados Ago F (5’ GCT CAR ATG CAA TCA TTC CC 3’) e Ago R (5’ CTG AAG YTT GGG WGG AGG 3’), 1,5U de Taq DNA polimerase (Biotools DNA polimerase). O volume final de cada reação foi ajustado com água para 20 µl. Todas as reações foram realizadas em termociclador Whatman Biometra (T Gradient) com os ciclos de temperatura programados para: 95°C por 5 min, 35 ciclos de 95°C por 1 min, 56°C por 45 s e 72°C M ateriais & M étodos _____________________________________________ 26 por 1 1/2 min, e uma etapa final a 72°C por 5 min. Tamanho do fragmento amplificado: 392 pb 4.10 – Real Time PCR em mosquitos Aedes aegypti O Real Time PCR foi realizado 1, 2, 3, 7 e 14 ou em 1, 2, 3, 6 e 8 dias após a infecção dos mosquitos, para monitoramento da evolução da infecção e da resposta anti-viral. Foram utilizados os primers do vírus dengue segundo Lanciotti et al,. 1992: D1 – Iniciador (sense) 5’ –TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G 3’ TS2 – anti-sense – 5’ – CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG 3’ Tamanho do fragmento amplificado: 119 pb 4.11 – Desenho de primers de Argonauta de Aedes aegypti para Real Time PCR A seqüência do gene Argonaute (Ago) de Aedes aegypti foi baixada do site: www.vectorbase.com. O fragmento amplificado está localizado em éxons diferentes: TCCAACCTCTGCCTGAAGATCAACGTCAAACTGGGTGGAATCAATTCAATCCTTGT GCCATCAATCAGACCAAAGGTATTCGACGAACCGGTCAT (fragmento do gen Ago, com localização de éxons diferentes) Os primers foram desenhados através do Programa Vector NT/9.0. Primers de Argonauta: bp Tm %GC LEFT PRIMER 20 59.80 50.00 TCCAACCTCTGCCTGAAGAT RIGHT PRIMER 20 59.82 50.00 ATGACCGGTTCGTCGAATAC Tamanho do fragmento amplificado: 98 pb. 4.12 – Controle Endógeno O gene S7RP foi utilizado como controle interno (Bai, et.al., 2007). ACCGCCGTCTACGATGCCATCCTGGAGGATCTGGTCTTCCCGGCTGAAGTCGTCG GCAAGCGTATGCGCGTCAAGCTGGACGGATCGCAGCTGATCAAGGTGCACCTGGA CAAGAACCAGCAGACCACCAT (fragmento do gen – mesmo éxon). Primer: AaS7RP Forward ACCGCCGTCTACGATGCCA M ateriais & M étodos _____________________________________________ 27 Reverse ATGGTGGTCTGCTGGTTCTT Tamanho do fragmento amplificado: 145 pb. 4.13 – Quantificação da Expressão O Real Time PCR foi realizado no equipamento Applied Byosistems 7500 RealTime PCR, com capacidade de 96 amostras. O método de quantificação foi da Expressão Relativa, baseando no seguinte cálculo: I. Média do CT Primeiramente calcula-se a média de todos os CTs das duplicatas; II. Delta CT (∆ CT) CT (gen alvo) – CT(gen referência); III. Delta-delta CT (∆∆CT) IV. Expressão Relativa: ∆ CT - ∆ CT (padrão); 2 (-∆∆CT) Dessa forma, foi monitorada a quantificação viral e, simultaneamente, a resposta anti-viral através da expressão do gene Argonauta. Foi monitorada ainda, a expressão do gen Ago em função dos diferentes tipos de alimentação de mosquitos Aedes aegypti. Estes experimentos foram realizados nas diferentes populações de mosquitos e em diferentes momentos da infecção viral. R esultados ______________________________ _____________________________ _ 28 5 – RESULTADOS 5.1 – Expressão Relativa de Ago em Aedes aegypti em resposta à alimentação Primeiramente, foi testado o gene para controle endógeno. Testou-se o gene RP49 (Gentile, 2005) nas amostras de mosquitos Aedes aegypti, no entanto não ocorreu uma boa amplificação deste gene nas amostras em estudo. Desta forma, o gene utilizado para controle endógeno foi da proteína ribossomal S7RP de Aedes aegypti (Bai et.al., 2007). Foi realizada uma RT-PCR nestas amostras para validar a utilização deste primer. A figura 11 mostra o gel do resultado de um RT-PCR de mosquitos Aedes aegypti da linhagem Rockfeller em diferentes condições alimentares (jejum, plasma e sangue), utilizando-se o primer S7RP que amplifica uma banda de aproximadamente 145 pares de bases. Não foi observada variação de amplificação deste gene nas amostras de mosquitos. Figura 11 – Gel de agarose 1,2%. Expressão de S7RP em mosquitos Aedes aegypti (linhagem Rockfeller) submetidos a diferentes condições alimentares: 1-Padrão de peso 100 kb, 2- jejum; 3alimentados com sacarose; 4- alimentados com plasma e 5: alimentados com sangue. Para testar a hipótese de que mosquitos alimentados com sangue teriam uma maior expressão de Ago, em função de ser a via de transmissão viral, populações naturais de Aedes aegypti foram submetidos ao jejum ou alimentados com diferentes dietas como sacarose, plasma e sangue, para verificar se há variação da expressão de Ago em função da alimentação deste inseto. A expressão do gene Ago foi analisada em 12, 24 e 48 horas após a alimentação. Os resultados a seguir mostram a expressão R esultados ______________________________ _____________________________ _ 29 relativa de Ago nas populações Rockfeller, Nova Venécia e Vila Velha em função da variação alimentar destas populações. Linhagem Rockfeller Foi verificada a expressão do gene Ago em diferentes condições alimentares da linhagem Rockfeller, uma linhagem de laboratório. O jejum foi utilizado como padrão para o cálculo da expressão relativa. Esta população não apresentou variação na expressão de Ago quando alimentada com sacarose (sac) após 12h e 48h ou quando alimentadas com plasma após 12h. No entanto, a partir de 24h após alimentação com plasma, começa a ser observado um aumento da expressão deste gene, que parece ser gradativo. Após 12h da alimentação com sangue já e observado um aumento da expressão, atingindo um pico máximo após 48h da alimentação (figura 12). Não houve mortalidade de animais nesta população (dado não mostrado). Figura 12: Expressão relativa do gene ago em mosquitos Aedes aegypti da linhagem Rockfeller submetidos ao jejum ou alimentados com sacarose (sac), plasma ou sangue em 12, 24 e 48 horas após a alimentação. As barras representam o resultado de um pool contendo 6 mosquitos em que o RNA total foi extraído e realizado o Real Time PCR, para a quantificação da expressão relativa de ago. R esultados ______________________________ _____________________________ _ 30 População natural de A.aegypti Nova Venécia ES A população de A.aegypti Nova Venécia parece ter apresentado a expressão relativa de Ago não variando nos mosquitos alimentados com sacarose (sac) 12h após a alimentação. Em 24h da alimentação com sac, ocorreu um aumento da expressão deste gene e, em seguida, um decréscimo em 48h após alimentação. Quando alimentados com plasma, ocorreu um aumento gradativo da expressão de Ago em 12, 24 e 48h após a alimentação. Esta população mostrou ainda, uma repressão do gene Ago após 12h da alimentação com sangue, atingindo o mesmo nível de expressão do jejum em 24h, ocorrendo um aumento após 48h da alimentação com sangue (figura 13). Foi observado então que, o pico da expressão de argonauta ocorre após 48h da alimentação com plasma nestas populações. Não houve mortalidade de animais nesta população (dados não mostrados). Figura 13: Expressão relativa do gene ago em mosquitos Aedes aegypti da população natural Nova Venécia ES submetidos ao jejum e alimentados com sacarose (sac), plasma e sangue em 12, 24 e 48 horas após a alimentação. As barras representam o resultado de um pool contendo 6 mosquitos em que o RNA total foi extraído e realizado o Real Time PCR, para a quantificação da expressão relativa de ago. R esultados ______________________________ _____________________________ _ 31 População natural de A.aegypti Vila Velha ES Em mosquitos alimentados com sacarose, a expressão de Ago aumenta após 12h, ocorrendo em seguida, uma repressão gradativa do gene nas horas após a alimentação. Observa-se que em 48h após alimentação com sac, os níveis de expressão do gene atinge os mesmos níveis do jejum. Quando alimentados com plasma, após 24h, ocorre um pequeno aumento da expressão do gene, e em 12h e 48h após, estes níveis de expressão aumentam ainda mais, não sofrendo variação entre 12 e 48h. Após 12h da alimentação com sangue também ocorre um aumento da expressão do gene Ago e, em 24h há uma redução, no entanto, a expressão gênica ainda continua relativamente maior que em mosquitos no jejum. Contudo, um aumento abrupto da expressão relativa pode ser observado em 48 horas após a alimentação com sangue (figura 14). Dentre as populações estudadas, a população Vila Velha foi a que apresentou a maior expressão relativa do gene Ago. O perfil da expressão gênica também ocorreu de maneira diferente, após 48h da alimentação com sangue, das demais populações. Não houve mortalidade de animais nesta população (dados não mostrados). Figura 14: Expressão relativa do gene Ago em mosquitos Aedes aegypti da população Vila Velha submetidos ao jejum e alimentados com sacarose, plasma e sangue em 12, 24 e 48 horas após a R esultados ______________________________ _____________________________ _ 32 alimentação. As barras representam o resultado de um pool contendo 6 mosquitos em que o RNA total foi extraído e realizado o Real Time PCR, para a quantificação da expressão relativa de ago. Estes resultados sugerem que, possivelmente, o efeito da alimentação pode ser uma característica variável entre diferentes populações. E que a alimentação com sangue, pode ser um fator determinante para a indução da expressão de genes, como Ago. 5.2 – Expressão de Ago em células em cultura C6/36 infectadas com DENV-2: Para verificar se há alteração do gene Ago em células de mosquitos na presença de vírus, células em cultura (C6/36) foram infectadas com DENV-2, cepa Jamaica 1409. Após o sétimo dia de infecção foram coletadas, o RNA foi extraído com Trizol e o cDNA obtido. O gel abaixo mostra o resultado do RT-PCR gradiente do material extraído das células infectadas e de células controle. O primer degenerado desenhado a partir das seqüências de Argonauta (Ago) de Apis melífera e Drosophila melanogaster, amplifica uma banda em torno de 390 pares de bases. A expressão de Ago foi maior nas células controle do que nas células infectadas (figura 15). Isso sugere que, algum mecanismo contra-defesa do vírus possa estar ocorrendo, inibindo a expressão de Ago. A figura abaixo mostra uma repressão do gene em células infectadas. No entanto, foram realizados experimentos posteriores para confirmar se também ocorreria em mosquitos. Este foi o primeiro experimento realizado para verificar alterações na expressão de Ago na presença viral. Figura 15 - Gel de agarose 1,2% da amplificação de Ago por RT-PCR gradiente testando diferentes temperaturas. Expressão de argonauta (Ago) em células C6/36 controle e infectada com DENV-2, cepa Jamaica 1409. Este gel mostra que a infecção viral parece resultar na inibição da expressão do gene Ago nas células em cultura. 1 – Padrão; 2 – Células controle 53.4ºC; 3 – Células controle 54ºC; 4 – Células R esultados ______________________________ _____________________________ _ 33 controle 54.7ºC; 5 - Células controle 55.4ºC; 6 - Células controle 56.3ºC; 7 – Células controle 57.1ºC; 8 – Células infectadas 53.4ºC; 9 – Células infectadas 54ºC; 10 – Células infectadas 54.7ºC; 11 – Células infectadas 55.4ºC; 12 – Células infectadas 56.3ºC. 5.3 – Infecção de populações naturais de mosquitos Aedes aegypti com Dengue Vírus (DENV-2): Populações naturais de mosquitos foram infectadas com DENV-2 através da alimentação artificial com sangue, contendo a suspensão viral, para o grupo de mosquitos infectados (inf) e, com o sangue apenas para o grupo controle (cont). As populações Vitória e São Fidélis foram infectadas com a cepa Dengue-2 Jamaica 1409 e as populações Vitória e Vila Velha, com a cepa Dengue-2 Ribeirão Preto (sendo esta última isolada de paciente que apresentou o quadro hemorrágico da doença). As populações Vitória e São Fidélis-Ipuca tiveram um monitoramento da infecção no 1º, 2º, 3º, 6º e 8º dia, após a alimentação dos insetos, para verificar se diferentes populações responderiam diferentemente à infecção viral. A população Vitória mostrou-se pouco competente à infecção com a cepa Jamaica 1409. A expressão relativa do gene C de DENV-2 permaneceu reduzida em todos os dias estudados. Observou-se a ocorrência do aumento da replicação no segundo dia. Entretanto, há uma queda no terceiro dia, aumentando a expressão relativa do gene C e, conseqüentemente, da replicação viral no sexto e oitavo dia, não alcançando os níveis de expressão do 2º dia (figura 16). Foi observada uma alta taxa de mortalidade de animais até o sexto dia após a alimentação. Os mosquitos alimentados com sangue apenas (sem conter a suspensão viral) tiveram uma maior mortalidade neste experimento (figura 17). R esultados ______________________________ _____________________________ _ 34 Figura 16 – Expressão Relativa do gene C (Capsídeo) do vírus dengue (DENV-2) na população de Vitória ES, infectada com a cepa Dengue-2 Jamaica 1409, nos dias 1, 2, 3, 6 e 8 após a alimentação. Mosquitos foram alimentados com sangue contendo o plasma inativado e a suspensão viral após 7 dias de propagação em células em cultura C6/36 (infectados) ou alimentados apenas co sangue (controle). As barras representam o resultado de um pool contendo 6 mosquitos em que o RNA total foi extraído e realizado o Real Time PCR, para o monitoramento da quantificação da carga viral nesta população de Aedes aegypti. Figura 17: Mortalidade de mosquitos Aedes aegypti da população Vitória ES após alimentação com sangue (controle) e infecção com DENV-2, cepa Jamaica 1409. Após experimentação, os insetos eram R esultados ______________________________ _____________________________ _ 35 mantidos com solução de sacarose 10% e a mortalidade acompanhada nos dias após a alimentação. O gráfico representa a taxa de mortalidade de fêmeas durante os dias após a infecção. A população São Fidélis – Ipuca (RJ) também foi submetida à alimentação com DENV-2 cepa Jamaica 1409. Entretanto, não houve amplificação do gene C de DENV-2 detectável no Real Time, sugerindo que esta população não foi capaz de ser infectada com a cepa referida (dado não mostrado). Este resultado sugere que esta população pode ser refratária ao vírus, o que está de acordo com os dados epidemiológicos do município de São Fidélis, que mostram uma baixa incidência de Dengue nesta região. Essa população em laboratório mostrou-se bastante frágil: as fêmeas ovopositavam pouco e estes ovos demoravam a eclodir ou eclodiam com baixa eficiência. A taxa de mortalidade desta população após a alimentação foi maior em mosquitos alimentados com a suspensão viral de DENV-2, cepa Jamaica 1409 em relação com os mosquitos controle, ou seja, alimentados apenas com sangue (figura 18). Estas diferenças parecem não ser significativa. Figura 18: Mortalidade de mosquitos Aedes aegypti da população São Fidélis RJ após alimentação com sangue e infecção oral com DENV-2, cepa Jamaica 1409. Após experimentação, os animais eram mantidos com solução de sacarose 10% e contada a mortalidade para cada dia. O gráfico representa a taxa de mortalidade de fêmeas durante os dias após a infecção. R esultados ______________________________ _____________________________ _ 36 Populações naturais de Aedes aegypti (Vitória ES e Vila Velha ES) também foram infectadas com DENV-2, cepa Ribeirão Preto (DENV-2 RP) - isolada de paciente que apresentou o quadro hemorrágico da doença. A população A.aegypti Vitória mostrou-se bastante competente à infecção com esta cepa viral. Observa-se uma expressão relativa da proteína de Capsídeo (C) de DENV-2 baixa nos primeiros dias após a alimentação, aumentando gradativamente nos dias posteriores. Outro dado verificado neste experimento foi a expressão relativa de DENV-2 no 14º dia, que não sofreu alterações em relação ao 7º dia. Este dado sugere que a partir do 7º dia, a replicação viral estabiliza-se (figura 19). A mortalidade desta população quando infectada com a cepa referida permaneceu baixa no decorrer dos dias pós-infecção e parecem não ocorrer diferenças significantes entre mosquitos controle e infectados, como mostra a figura 20. Figura 19 – Expressão Relativa do gene C (Capsídeo) do vírus dengue (DENV-2) na população de Vitória ES, infectada com a cepa Dengue-2 Ribeirão Preto, nos dias 1, 2, 3, 7 e 14 após a infecção. Mosquitos foram alimentados com sangue contendo o plasma inativado e a suspensão viral. As barras representam o resultado de um pool contendo 6 mosquitos em que o RNA total foi extraído e realizado o RT-qPCR (Real Time) para o monitoramento da quantificação da carga viral nesta população de Aedes aegypti. R esultados ______________________________ _____________________________ _ 37 Figura 20: Mortalidade de mosquitos Aedes aegypti da população Vitória ES após alimentação com sangue e infecção com DENV-2, cepa Ribeirão Preto. Após experimentação, os animais eram mantidos com solução de sacarose 10% e contada a mortalidade para cada dia. O gráfico representa a taxa de mortalidade de fêmeas durante os dias após a infecção. Na população de A. aegypti Vila Velha ocorreu uma infecção bastante alta, quando alimentada com DENV-2 cepa RP. A expressão relativa do gene C de vírus dengue sofreu uma queda no 2º dia, apresentando um aumento a partir do 3º dia após a alimentação. No 7º e 14º dia após a infecção, ocorreu um aumento acentuado da replicação viral. Da mesma forma como ocorre na população A.aegypti Vitória, na população A.aegypti Vila Velha o vírus também teve a replicação estabilizada a partir do 7º dia de infecção (figura 21). A mortalidade desta população quando infectada com a cepa Ribeirão Preto foi baixa, no entanto, parecendo mais elevada em mosquitos alimentados com a suspensão do vírus dengue em comparação com os mosquitos controle (figura 22). R esultados ______________________________ _____________________________ _ 38 Figura 21 – Expressão Relativa do gene C (Capsídeo) do vírus dengue (DENV-2) na população de Vila Velha ES, infectada com a cepa Dengue-2 Ribeirão Preto, nos dias 1, 2, 3, 7 e 14 após a infecção. Mosquitos foram alimentados com sangue contendo o plasma inativado e a suspensão viral. As barras representam o resultado de um pool contendo 6 mosquitos em que o RNA total foi extraído e realizado o Real Time PCR para o monitoramento da quantificação da carga viral nesta população de Aedes aegypti. Figura 22 – Mortalidade de mosquitos Aedes aegypti da população Vila Velha ES após alimentação com sangue e infecção com DENV-2, cepa Ribeirão Preto. Após experimentação, os animais eram mantidos com solução de sacarose 10% e contada a mortalidade para cada dia. O gráfico representa a taxa de mortalidade de fêmeas durante os dias após a infecção. R esultados ______________________________ _____________________________ _ 39 5.4 – Expressão do gene Ago em mosquitos Aedes aegypti infectados com DENV-2: Para investigar o efeito da infecção sobre a expressão do gene Ago, fêmeas de A. aegypti foram alimentadas com sangue de camundongo contendo o vírus DENV-2 Ribeirão Preto e a expressão do gene foi monitorada 1, 3, 7, e 14 dias após a infecção, nos mosquitos das populações Vitória ES e 1, 3 e 7 dias para a população Vila Velha ES. Foi observada uma redução da expressão do gene em ambas populações estudadas (figuras 22 e 23). Ocorreu uma redução da expressão do gene Ago nos insetos infectados da população Vitória ES, quando comparado aos insetos controle, em todos os dias analisados. A expressão relativa do gene Ago aumenta ao longo dos dias, nos mosquitos alimentados apenas com sangue (controle), atingindo um máximo no 14º dia após a alimentação. Em contrapartida, a expressão relativa deste gene em mosquitos infectados, diminui no mesmo período. No primeiro dia de infecção ocorreu uma redução de 50% da expressão de Ago quando comparado ao mosquito alimentado apenas com sangue, enquanto no terceiro dia houve uma redução maior do gene, de aproximadamente, 75%. O 7º dia apresentou uma redução da expressão de Ago também em 50%, como no primeiro dia, e no 14º esta redução chegou a 90% (figura 23). R esultados ______________________________ _____________________________ _ 40 Figura 23 – Expressão Relativa do gene Ago em mosquitos alimentados com sangue e infectados com DENV-2 (Ribeirão Preto) na população Vitória ES. Após experimentação, realizou-se a extração do RNA total dos insetos, o cDNA obtido e posteriormente realizado qPCR para quantificação do gene Ago em mosquitos alimentados com sangue e a comparação da expressão deste gene em mosquitos alimentados com DENV-2. Observa-se a inibição deste gen em mosquitos infectados. Cada barra representa o resultado obtido a partir do pool de 6 mosquitos fêmeas. Na população Vila Velha também houve uma redução da expressão relativa de Ago em mosquitos alimentados com sangue contendo o vírus dengue. O primeiro dia de infecção houve uma redução de, aproximadamente, 17% da expressão. No terceiro dia esta redução foi de 66% e no sétimo dia chegou a 83% de inibição de Ago (figura 24). Observa-se que a repressão do gene Ago foi maior na população Vitória no 1º e no 3º dia após a infecção. Entretanto, no 7º dia de infecção a inibição do gene foi maior na população Vila Velha. R esultados ______________________________ _____________________________ _ 41 Figura 24 – Expressão Relativa do gene Ago em mosquitos alimentados com sangue e infectados com DENV-2 (Ribeirão Preto) na população Vila Velha ES. Após experimentação, realizava-se a extração do RNA total dos insetos para posteriormente realizar o RT-qPCR para quantificação do gene Ago em mosquitos alimentados com sangue e a comparação da expressão deste gene em mosquitos alimentados com DENV-2. Observa-se a inibição deste gen em mosquitos infectados a partir do 3º dia pós-infecção.. 5.5 – Expressão de Ago em mosquitos Aedes aegypti infectados com o vírus Sindbis (SINV) Para investigar se os resultados observados eram específicos para DENV ou se o padrão de expressão de Ago também é alterado por outro vírus, mosquitos Aedes aegypti foram infectados com o vírus Sindbis (SINV), cepa AR339, um alphavírus. Quando infectados com SINV, mosquitos Aedes aegypti da linhagem Red apresentaram uma redução de 50% da expressão relativa de argonauta após 4 dias da infecção, em relação aos mosquitos alimentados com sangue não contendo vírus (figura 25). R esultados ______________________________ _____________________________ _ 42 Fig. 25: Expressão relativa do gene Ago em mosquitos Aedes aegypti da linhagem Red alimentados com sangue e infectados com Sindbis vírus. Foi realizada a extração do RNA total dos insetos para posteriormente realizar o Real Time PCR para quantificação do gene Ago em mosquitos alimentados com sangue e a comparação da expressão deste gene em mosquitos alimentados com SINV, cepa AR339. O gene ago foi inibido em 50% após 4 dias da infecção. D iscussão ________________________________ 43 6 – DISCUSSÃO Mosquitos são os mais importantes artrópodes vetores de doenças. Aedes aegypti é vetor natural de alguns arbovírus, como alphavirus e flavivirus, responsáveis pela dengue, febre amarela, encefalites e outras doenças, que causam grandes problemas de saúde pública anualmente. A manutenção e transmissão desses patógenos dependem, em parte, da competência genética de populações de mosquitos que sustentam a infecção viral (Sanchez-Vargas et al.,2004). RNA de Interferência é o mecanismo de silenciamento gênico que atua naturalmente contra transgenes e elementos de transposição (Haasnoot et al., 2003), e tem sido caracterizado como o principal mecanismo de defesa antiviral em mosquitos e plantas. Neste trabalho foi selecionado um dos genes responsáveis pela resposta antiviral mediada por RNA e este gene estudado em populações naturais de Aedes aegypti. A escolha recaiu sobre o gene da família Argonauta (Ago), que codifica uma importante proteína com atividade RNAsica, parte do Complexo RISC da cascata de RNAi. Mosquitos foram submetidos a diversas situações experimentais e a expressão de Ago foi monitorada no sentido de estabelecer uma relação com a competência vetorial destas populações. Um importante passo foi a escolha do gene para controle endógeno nos experimentos. Inicialmente foi testado o primer que amplifica um fragmento do gene RP49 (Gentile, et al., 2005) e observou-se que não havia amplificação deste gene, detectável pela PCR em Tempo Real (qPCR), nas amostras em estudo nas condições utilizadas, apesar deste primer ser utilizado em outros sistemas com bastante eficiência. Foi escolhido então um segundo primer a partir da seqüência do gene S7RP (Bai et al.¸2007) como controle interno, mostrando uma boa amplificação do gene, mostrado na figura 10. Após testar várias condições, optou-se pela temperatura de 60ºC para anelamento de todos os primers utilizados (S7RP, DENV-2 e Ago). O gene Ago codifica proteínas da família Argonauta, que apresentam atividade RNAse através do domínio PIWI mediando o silenciamento do RNA (Ronemus et al., 2006). Tais proteínas associadas a RISC participam na regulação da formação de 44 D iscussão ________________________________ siRNA ou miRNA (Olson et al., 2002), que é um componente essencial para a resposta do RNAi, sendo requerida na separação da dupla fita dos siRNAs e, conseqüentemente, na montagem destes no complexo RISC (Okamura et al., 2004). Assim, a expressão deste gene no mecanismo de RNAi se torna muito importante, conforme descrito por Sanchez-Vargas (2004). A expressão do gene Ago pode ser um bom parâmetro de medida da capacidade de resposta mediada pelo mecanismo de RNAi, como é o caso da resposta anti-viral em mosquitos, primeiramente descrito por Gaines et al. (1996). Para verificar a expressão do gene Ago e, conseqüentemente, a eficiência de RNAi em Aedes aegypti nas várias situações experimentais, realizou-se o monitoramento da expressão do gene utilizando-se o método quantitativo, por qPCR. Na primeira etapa deste trabalho foi verificada a expressão do gene Ago em função do tipo de alimentação. Em geral, foi observada uma baixa expressão do mesmo em mosquitos submetidos à alimentação com sacarose, nas populações Rockfeller, Nova Venécia e Vila Velha, (figuras 11,12 e 13). Testou-se a hipótese de que mosquitos alimentados com sangue teriam uma maior expressão de Ago em função de ser a via de transmissão viral. Com exceção à população Nova Venécia, as outras duas populações confirmaram esta hipótese. Não houve diferenças da expressão de Ago em mosquitos em jejum ou alimentados com sacarose na população Rockfeller (figura 11). Observou-se o aumento gradativo na expressão do gene na alimentação com plasma após 24h e sangue após 12h, 24h e 48h da alimentação. O pico de expressão de Ago em Rockfeller ocorre 48h após estes insetos alimentarem-se com sangue (figura 11), padrão semelhante ao encontrado na população Vila Velha (figura 13). Entretanto, a expressão de Ago foi mais alta em Vila Velha em comparação à Nova Venécia e Rockfeller (figuras 11, 12 e 13). A população Nova Venécia mostrou baixa expressão de Ago em mosquitos alimentados com sangue e alta expressão quando submetidos à alimentação com plasma (figura 12). Outro dado verificado em Nova Venécia foi um pico de expressão de Ago após 24h de alimentação com sacarose. A indução da expressão de genes em resposta à alimentação com sangue, tem sido descrita em insetos hematófagos. Muller et al., 1993, analisaram a expressão de genes da família de tripsinas (Antryp 1 e Antryp 2) em Anopheles gambiae nos estágios D iscussão ________________________________ 45 de pupa, machos adultos, fêmeas adultas não alimentadas com sangue e fêmeas adultas alimentadas com sangue. Verificaram então, que a expressão de tais genes que a expressão de ambos os genes é induzida pela alimentação com sangue. Verificaram ainda que o controle transcricional dos dois genes parecia ser diferente, uma vez que, a quantidade de RNAm de Antryp 1 foi sempre mais alta em relação ao RNAm de Antryp 2. Níveis significantes de transcritos de Antryp 1 puderam ser detectados em fêmeas não alimentadas, machos e pupas o que não ocorreu para o gene Antryp 2. Similarmente, observamos que a expressão do gene Ago também é modulada em função da variação alimentar. A alimentação de açúcar para mosquitos fêmeas e machos garante seu sustento nutricional/energético, mas não os requerimentos reprodutivos das fêmeas. Durante as primeiras horas da alimentação com sangue ocorre uma série de mudanças fisiológicas nestes mosquitos. O número de genes associados com o metabolismo de açúcar e proteína dentro de cada conjunto de genes, reflete na troca do metabolismo de açúcar para proteína. O produto de genes envolvidos na digestão com sangue é resultado de uma cascata de sinalizações celulares (Dana et al., 2005). Observamos diferenças na expressão de Ago entre as populações naturais de Aedes aegypti (figuras 11, 12, 13, 22 e 23). Os diferentes padrões de expressão de Ago entre as populações sugerem que a variabilidade genética dessas populações pode determinar diferenças importantes na capacidade de defesa antiviral via RNAi. A infecção viral em mosquitos é em geral, uma infecção persistente que não altera as condições fisiológicas do inseto (Valzelle-Falcoz et al., 1999). Populações naturais de mosquitos Aedes aegypti foram infectadas e monitoradas quanto à mortalidade, infecção e análise da expressão de Ago. Foi analisada a mortalidade das populações de insetos quando submetidos às condições de laboratório e experimentais, de maneira a acompanhar a saúde dos insetos e a fragilidade de algumas populações nas condições de experimentação utilizadas. A taxa de mortalidade foi aproximadamente a mesma em animais infectados com DENV-2 e animais controle, exceto a população Vitória quando infectadas com a cepa DENV-2 Jamaica 1409, que apresentou uma maior taxa de mortalidade em mosquitos alimentados com sangue, apenas, sem conter o vírus (figuras 16, 17,19 e 21). A alta mortalidade observada nas experimentações com as populações Vitória e São Fidélis-Ipuca (quando infectados D iscussão ________________________________ 46 com DENV-2 Jamaica 1409) possivelmente são variações genéticas das populações que tornam algumas mais sensíveis que outras às condições do laboratório. Esta diversidade dificulta o trabalho com algumas populações naturais que não se adaptam bem as condições de laboratório, o que pode determinar resultados que não sejam compatíveis às condições do campo. Portanto, o monitoramento de parâmetros que avaliem as condições de adaptação de populações naturais é essencial para a confiabilidade dos resultados apresentados. A quantificação da infecção viral avaliada por PCR em Tempo Real mostrou que a população São Fidélis-Ipuca não apresentou infecção pela cepa Jamaica 1409 (dados não mostrados). A população Vitória, também alimentada com esta cepa, apresentou uma baixa infecção viral quando comparada à infecção com a cepa Ribeirão Preto ou à população Vila Velha (também infectada com Ribeirão preto) (figuras 15, 18 e 20). Para confirmar que esta cepa viral é pouco infectiva para estas populações, serão necessários outros experimentos para comprovação da baixa titulação deste vírus. No entanto, pode-se afirmar que a cepa DENV-2 Jamaica 1409 é mais infectiva para população Vitória em comparação com a população de São Fidélis, pois Vitória foi capaz de se infectar embora mostrando uma baixa expressão relativa do vírus Dengue. Esses dados podem ser relacionados com os informes epidemiológicos dos casos de Dengue em ambas as regiões estudadas e também com o comportamento que as populações apresentaram em laboratório. A população São Fidélis-Ipuca apresentou baixa postura e eclosão de ovos após repasto sanguíneo. Além disso, relacionando com dados epidemiológicos, o distrito de Ipuca registra poucos casos de Dengue enquanto Vitória é uma região de alta incidência da doença. Esses resultados sugerem que as populações de Aedes aegypti de São Fidélis-Ipuca podem ser mais refratárias ao vírus DENV-2 Jamaica 1409 quando comparadas às de Vitória. Valzelle-Falcoz et al. (1999), também descreveram diferenças na competência vetorial em populações de mosquitos Aedes aegypti do Tahiti e Moorea, Polinésia Francesa, quando infectados com Dengue-2, comprovando que existem fatores genéticos que determinam a capacidade infectiva de populações naturais. Quando infectadas com DENV-2 Ribeirão Preto, mosquitos de Vitória e Vila Velha tiveram uma alta expressão relativa do gene C do vírus Dengue, ou seja, uma alta taxa de infecção viral. Em outras palavras, podemos dizer que ambas as D iscussão ________________________________ 47 populações são altamente susceptíveis ao vírus (figuras 18 e 20). O aumento da carga viral no decorrer dos dias após a alimentação pode ser observado e se deve à replicação e disseminação do vírus nos tecidos do mosquito. A rota migratória e o desenvolvimento de vírus dentro do trato intestinal de mosquitos iniciam-se pela entrada do patógeno no lúmen intestinal, seguido da entrada, replicação e saída das células epiteliais do intestino, percorrendo a hemolinfa até chegar nas glândulas salivares, onde continuam se replicando e residem até serem transmitidos a hospedeiros vertebrados (Beerntsen et al.,2000). Mosquitos da população Vitória infectados com a cepa Ribeirão Preto apresentaram tendência a um aumento da carga viral, enquanto a população Vila Velha teve uma pequena redução da amplificação de DENV-2 no 2º dia. De acordo com Smith et al. (2007), uma redução da carga viral logo após a alimentação pode ser explicada por um momento que precede aquele em que vírus estão em processo de invasão das células epiteliais do intestino. Neste momento, provavelmente parte da população viral se perde no lúmen intestinal por não conseguir invadir as células ou por ser atingida por enzimas digestivas e outros processos agressivos intestinais. A partir deste momento, com a invasão celular, se inicia então o processo de replicação com a retomada e crescimento da carga viral inicial e disseminação em tecidos adjacentes. São muitos os fatores que podem influenciar na competência vetorial de populações naturais de mosquitos, como fatores genéticos, fisiológicos e ambientais (Bósio et al., 1998 e Beerntsen et al.,2000) e que podem classificar populações naturais em susceptíveis ou refratárias à infecção por patógenos. Fatores fisiológicos podem atuar quando o mosquito ingere o patógeno, pois este fica exposto a enzimas proteolíticas que são secretadas no lúmen intestinal para a digestão do sangue. Estas enzimas digestivas podem ter um impacto positivo ou negativo para o patógeno influenciando na competência do vetor (Gass, 1977 e Shahabuddin et al., 1996). Outro fator é a grande variabilidade genética que pode ocorrer entre populações de Aedes aegypti de diferentes regiões geográficas e entre cepas virais (Armstrong & Hesse, 2003; Bennett et al., 2002; Valzelle-Falcoz et al. 1999; Bosio et al., 2000) e, além disso, a competência vetorial de arbovírus também pode estar relacionada com as barreiras anatômicas para uma infecção produtiva do vetor. Bennett et al. (2002) descrevem que potenciais vetores com MIB (Midgut Infection Barrier) apresentam baixa infectividade D iscussão ________________________________ 48 em função da falta de receptores virais na superfície da célula, ou as células epiteliais do intestino não serem permissivas a este vírus. Vetores com MEB (Midgut Escape Barrier) podem permitir a replicação do vírus no intestino, mas depois o vírus é incapaz de sair do intestino para causar a disseminação da infecção. Beerntsen et al. (2000) descreve que fatores comportamentais e ambientais podem desempenhar um papel decisivo na determinação da competência de um vetor, como por exemplo, uma determinada espécie não coexistir temporalmente e espacialmente com o hospedeiro vertebrado que habita o parasita. Estes fatores podem explicar os diferentes comportamentos observados nas populações naturais de mosquitos aqui estudadas (Rockfeller, Red, Vitória ES, Vila Velha ES e São Fidélis – Ipuca RJ). O conjunto de resultados de monitoramento do gene Ago em mosquitos infectados ou em função da variedade alimentar podem estar sugerindo que a alta expressão de Ago em mosquitos controle (alimentados apenas com sangue, sem o vírus) implica na preparação do inseto para receber o vírus e, em seguida, bloquear sua replicação, ativando os genes envolvidos na resposta antiviral via RNAi. Em contraste, a baixa expressão de Ago, ou seja, a repressão deste gene em contato com o vírus (DENV ou SINV) pode ocorrer em função da atividade de supressores de RNAi, um conjunto de proteínas que bloqueiam genes envolvidos no mecanismo da Interferência Mediada por RNA (Lichner, et al., 2003.) e, assim, tornando-se capazes de aumentar consideravelmente seu título e disseminar nos tecidos do mosquito, o que não ocorreria se o RNAi estivesse atuando de maneira eficaz. As diferenças observadas na expressão de Ago na população Vila Velha nos dois experimentos realizados (infecção e variedade alimentar) - figuras 14 e 24 - podem ter ocorrido em função da metodologia utilizada. A alimentação com sangue, no experimento de infecção foi realizada artificialmente, enquanto no outro experimento o repasto sanguíneo foi natural, feito com camundongo. Este resultado sugere que a melhor qualidade de sangue pode ser fundamental para estimular as vias de defesa naturais dos mosquitos, implicando no aumento da expressão de genes envolvidos na defesa antiviral. Valzelle-Falcoz et al. (1999) verificaram que a qualidade dos eritrócitos é um fator determinante para o sucesso da infecção artificial oral. Outra possível via de estimulação de mecanismos de defesa do mosquito pode estar relacionada ao sistema imune do hospedeiro. Enquanto na alimentação natural o sangue total é consumido D iscussão ________________________________ 49 pelo mosquito, a alimentação artificial consiste no sangue com o plasma inativado, o que diminuiria a necessidade do vetor em responder às defesas do hospedeiro. Outras formas de defesas antivirais já foram identificadas em arbovirus, relacionadas à variação da expressão gênica em função da alimentação sanguínea. Trabalhos foram realizados monitorando genes da tripsina após ingestão de sangue por mosquitos. Em Aedes aegypti existem três tripsinas: early tripsinas, que são constitutivamente expressas antes da alimentação com sangue, e duas late tripsinas, que são induzidas pelo sangue (Dana et al., 2005). Doherty et al. (1959), verificaram o efeito de proteases em DENV-2 e observaram uma redução da infectividade do vírus após 2h de tratamento com proteases a 37ºC. Dentre as proteases estudadas estavam a pronase, a tripsina e a quimotripsina. Mais tarde, Doherty et al. (1963) observaram uma maior redução da infectividade do vírus Sindbis, em relação ao DENV-2, na presença destas mesmas proteases nas mesmas condições. Segundo Gorman & Goss (1972), a alimentação com sangue induz a expressão de genes da família das tripsinas em intestinos de mosquitos, e esta reduz a infectividade viral pela autólise dos eritrócitos, impedindo assim a propagação viral. Sugere-se que, como ocorre a indução da expressão de genes da tripsina pela alimentação sanguínea em insetos hematófagos, o mesmo pode estar ocorrendo com o gene Ago em Aedes aegypti, como um mecanismo fisiológico pra impedir a infecção persistente no mosquito. A inibição da expressão do gene Ago em mosquitos infectados com DENV e SINV (figuras 22, 23 e 24) sugere a inibição da resposta mediada pelo mecanismo de RNAi em populações naturais de A.aegypti. Isso pode ser devido a uma capacidade limitada na resposta antiviral das populações de insetos ou a presença de um supressor de RNAi (RSS – Supressor de Silenciamento de RNA) produzido pelo vírus Dengue e Sindbis que permitiria a infecção persistente no mosquito, escapando do sistema antiviral do inseto. Ainda não foram descritos RSSs sintetizados pelo vírus Dengue, mas existem diversos já descritos em vírus de plantas (Voinnet, et al.,1999) insetos (Li, et al., 2002) e mamíferos (Haasnoot, et al., 2007). Vírus expressam diferentes proteínas supressoras de RNAi, e a supressão é essencial para uma eficiente infecção viral (Lichner, et al., 2003). Sendo assim, esses resultados sugerem que possivelmente existam supressores de RNAi que atuam na expressão de Ago, e que podem ser os D iscussão ________________________________ 50 responsáveis pelo sucesso de infecção no mosquito, como ocorreu em experimentos anteriores realizados em células C6/36 (figura14). Os dados aqui descritos são preliminares e experimentos serão repetidos para o processamento dos resultados estatisticamente. No entanto, estes dados apontam para a importância do mecanismo de RNAi nos processos que levam a susceptibilidade/refratoriedade de populações naturais de mosquitos Aedes aegypti à infecção por dengue. A abordagem utilizada aqui pode ser utilizada para o mapeamento dessas populações quanto à sua capacidade infectiva, norteando programas de controle desta, e possivelmente outras doenças transmitidas por arbovírus. Conclusões _______________________________________________ 51 7 – CONCLUSÕES A expressão do gene Ago parece ser induzida pela alimentação com sangue, em diferentes populações de mosquitos Aedes aegypti; As populações naturais de mosquitos Aedes aegypti Vitória e São Fidélis apresentaram uma baixa infectividade quando alimentadas com a cepa DENV-2 Jamaica 1409; As populações naturais Vitória e Vila Velha mostraram uma alta infectividade quando alimentadas com a cepa DENV-2 Ribeirão Preto; Em geral, parece não ocorrer diferenças significativas na mortalidade de animais infectados em relação aos insetos controle, exceto a população Vitória quando infectada com a cepa DENV-2 Jamaica 1409; Células em cultura C6/36 tiveram uma repressão do gene Ago quando infectadas com vírus DENV-2; Houve também uma redução dos níveis de expressão do gene Ago em mosquitos infectados com arbovírus (DENV e SINV), sugerindo a presença de supressores de RNAi inibindo a expressão do gene, assim como foi verificado em células em cultura. 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