ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE INDIVÍDUOS DE

Boletim de Pesquisa 69
e Desenvolvimento ISSN 1676 - 1340
Outubro, 2004
ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE INDIVÍDUOS DE
POPULAÇÕES DE Heliconia bihai e Heliconia rostrata.
Heliconia rostrata
Heliconia bihai
República Federativa do Brasil
Luiz Inácio Lula da Silva
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ISSN 1676 - 1340
Outubro, 2004
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 69
ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE
INDIVÍDUOS DE POPULAÇÕES DE Heliconia bihai e
Heliconia rostrata
Jaqueline Matos Marques
Paulo J. A. Coelho
Marco Antônio Ferreira
Zilneide Pedrosa de Souza Amaral
Antônio Carlos Torres
Jaqueline Ceolin de Amorim
Gláucia Salles Cortopassi Buso
Brasília, DF
2004
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Normalização Bibliográfica: Maria Alice Bianchi e Maria Iara Pereira Machado
Editoração eletrônica: Maria da Graça S. P. Negrão
1ª edição
1ª impressão (2004): 150 unidades
Estudo da variabilidade genética entre indivíduos de populações de Heliconia bihai e
Heliconia rostrata / Jaqueline Matos Marques ... [et al.]. – Brasília, DF : Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2004.
15 p. -- (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia, ISSN 1676-1340 ; n. 69)
1. Helicônia – Variabilidade genética. 2. Helicônia – RAPD. 3. Helicônia –
Marcadores moleculares. 4. Heliconia bihai 5. Heliconia rostrata. I. Marques,
Jaqueline Matos. II. Série.
584.39 - CDD 21
SUMÁRIO
Resumo.................................................................................................................. 6
Abstract ................................................................................................................. 8
INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 9
MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................... 10
RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 11
CONCLUSÕES .................................................................................................... 14
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 14
Bibliografia complementar................................................................................. 14
5
ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE INDIVÍDUOS DE
POPULAÇÕES DE Heliconia bihai e Heliconia rostrata.
_________________________________________________________
Jaqueline Matos Marques 1
Paulo J. A. Coelho 2
Marco Antônio Ferreira
Zilneide Pedrosa de Souza Amaral 3
Antônio Carlos Torres 4
Jaqueline Ceolin de Amorim 5
Gláucia Salles Cortopassi Buso 6
Resumo
As helicônias são plantas de origem tropical, mais precisamente da região noroeste da
América do Sul. São as únicas representantes da família Heliconiaceae. Devido ao colorido
de suas brácteas são muito usadas para fins ornamentais. O gênero Helicônia com mais de
150 espécies ainda é muito pouco estudado. No Brasil encontram-se cerca de quarenta
espécies, distribuídas principalmente na região Amazônica e na Mata Atlântica. As helicônias
vêm apresentando crescente comercialização no mercado internacional, sendo cultivada na
América Latina e na Europa. No Brasil, áreas de cultivo já são encontradas em vários
estados. A comercialização de flores e plantas ornamentais está em franco crescimento no
Brasil, onde o PIB do negócio está estimado em US$ 1,2 bilhões, entretanto, as exportações
brasileiras não têm ultrapassado os US$ 15 milhões por ano, o que representa 0,2% do total
mundial. Esse valor é muito baixo, se comparado com países de menor potencial econômico
como o Equador, que exporta US$ 150 milhões por ano. O meio de propagação mais
utilizado no cultivo de helicônias é através de rizomas já que a obtenção de plantas por
sementes é um processo lento e difícil. Para a maioria das espécies, a germinação ocorre no
prazo de 120 dias, mas algumas chegam a levar três anos, pois cada fruto normalmente
contém três sementes envolvidas por um endocarpo bastante duro dificultando a
germinação. Além disso, para se identificar o híbrido e a variabilidade resultante do
cruzamento é necessário esperar o florescimento para se fazer uma análise do fenótipo
resultante. Uma forma de se detectar a variabilidade ainda no início do desenvolvimento da
planta e com grande rapidez é através da utilização de marcadores moleculares. Dentre
estes, RAPD se caracteriza por ser uma técnica simples, rápida e que requer baixos custo e
mão-de-obra. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi verificar a variabilidade genética
dentro de duas populações de helicônia obtidas através da extração dos embriões das
sementes de plantas de duas espécies distintas: Heliconia rostrata e H. bihai (cultivadas em
1
2
3
Estudante de graduação, Universidade de Brasília.
Pesquisador, Embrapa Agroindústria Tropical.
Assistente de operações I, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
Pequisador, Embrapa Hortaliças.
5
Estudante de graduação, Universidade de Brasília
6
Pesquisadora, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
4
6
condições naturais). Obteve-se uma população com 31 indivíduos de Heliconia bihai e 33 de
Heliconia rostrata, constituídas de indivíduos meio-irmãos. Foram identificados 101
marcadores polimórficos, observando-se diferenças entre e dentro de cada população.
Assim, observou-se considerável variabilidade genética em plantas de helicônia regeneradas
por meio de cultura de embriões extraídos de sementes.
Palavras chaves: Diversidade genética, marcadores moleculares, RAPD, helicônia.
7
STUDY OF GENETIC VARIABILITY AMONG INDIVIDUALS OF
Heliconia bihai AND Heliconia rostrata POPULATIONS.
_________________________________________________________
Abstract
The heliconias are plants of tropical origin, more precisely from the North-west Region of
South America. They are the only representatives of the Heliconiacea family. Due to the
colors of their bracteas they are often used for ornamental purposes. The Heliconia genus
with more than 150 species is seldom studied. There are about 40 species, in Brazil,
distributed mainly in the Amazon region and in the Atlantic Forest. The heliconias have been
showing a crescent commercialization in the international market and they have been
cultivated in Latin America and Europe. In Brazil, they are cultivated in many states. The
commercialization of ornamental flowers and plants are increasing in Brazil, the NGP
(National Growth Product) of this market is estimated in about US$ 1,2 billions, however, the
Brazilian exportations are not surpassed the US$ 15 millions per year, what means 0,2% of
the whole global negotiations, this is not enough if we compare with some countries which
have a minor economic potential, like Equator, for example, US$ 150 millions per year. The
most used propagation mean of heliconia is through rhizomes as the plants obtained through
seeds are a slow and difficult process. For most species germination occurs within 120 days,
although some take even three years as each fruit usually contains three seeds wrapped by a
quite hard endocarp making germination more difficult. Besides, in order to identify the hybrid
and the resulting variability from the cross-over it is necessary to wait the flourishing to make
an analysis of the resulting phenotype. A way to detect the variability still in the beginning of
the plant development and faster would be through the use of molecular markers. Among
those, RAPD is characterized for being a simple and fast technique, which requires low cost
and workforce. This work objective was to verify the genetic variability inside two heliconia
populations obtained through the extraction of seed embryos of plants from two different
species: Heliconia rostrata and H. bihai (grown in natural conditions). Two populations were
achieved, one with 31 individuals of H. bihai and other with 33 of Heliconia rostrata,
constituted by half siblings individuals. One hundred and one polymorphic markers were
identified, showing differences among and within each population. It was possible to verify
that there was considerable genetic variability in heliconia plants regenerated from cultured
embryos extracted from seeds.
Keys-words: Genetic diversity, molecular markers, RAPD, heliconia
8
INTRODUÇÃO
As helicônias (Figura 1) são plantas de origem tropical, mais precisamente da região
noroeste da América do Sul sendo as únicas representantes da família Heliconiaceae. São
grandes herbáceas perenes com brácteas de cores muito vivas e por isso são muito usadas
para fins ornamentais. O gênero Helicônia é muito pouco estudado e ainda é incerto o
número de espécies existentes, porém estima-se que haja entre 150 a 250 espécies. No
Brasil encontram-se cerca de quarenta espécies distribuídas principalmente na Mata
Atlântica (até o norte do estado de Santa Catarina) e na região Amazônica (Helicônias,
2004). As helicônias vêm apresentando crescente comercialização no mercado internacional
em função do aumento da área de produção nos países da América Central e da América do
Sul, proporcionando uma maior oferta e divulgação do produto. Existem também cultivos
comerciais na Europa (Holanda, Alemanha, Dinamarca e Itália), mas sob condições
protegidas. No Brasil, áreas de cultivo já são encontradas nos estados do Rio de Janeiro,
São Paulo, Santa Catarina e Pernambuco, com expansão para os estados do Amazonas e
Ceará (Helicônias, 2004). A comercialização de flores e plantas ornamentais está em franco
crescimento no Brasil, onde o PIB do negócio está estimado em US$ 1,2 bilhões, entretanto,
as exportações brasileiras não têm ultrapassado os US$ 15 milhões por ano, ou apenas
0,2% do total mundial, o que demanda rápidas mudanças de postura em termos de política
agrícola, uma vez que países de menor potencial econômico e tecnológico da América
Latina, como a Colômbia (US$ 560 milhões), Equador (US$150 milhões) e Costa Rica
(US$125 milhões), e da África, como Quênia (US$132 milhões) e Zimbabwe (US$ 60
milhões) têm na comercialização de flores um forte componente de suas economias (Lamas,
2002). Além disso, a produção de flores gera muitos empregos, principalmente na etapa de
colheita, pois demanda basicamente mão-de-obra humana, sendo a utilização de maquinário
muito reduzida. Portanto, tem importante papel social, na geração de empregos, por poder
proporcionar maior rentabilidade por área cultivada (3 a 5 vezes superior à fruticultura), e ser
praticada em pequenas áreas de agricultura familiar. São grandes as oportunidades para as
espécies tropicais, em razão da crescente procura por flores não tradicionais, a proximidade
com os países importadores e a existência de vários ecossistemas distintos, com
temperaturas amenas e estáveis durante todo o ano, principalmente nas serras úmidas, onde
a altitude de 750 a 950 metros e a luminosidade intensa (3.000 horas de sol anuais)
conferem melhor qualidade ao produto.
O meio de propagação mais utilizado no cultivo de helicônias é através de rizomas,
sendo a variabilidade genética muito baixa. Outra forma de propagação se dá por meio de
sementes. Para a maioria das espécies, a germinação ocorre no prazo de 120 dias, mas
algumas chegam a levar três anos, já que cada fruto normalmente contém três sementes
envolvidas por um endocarpo bastante duro dificultando a germinação, caracterizando-a
como um processo lento e difícil (Helicônias, 2004). Além disso, para se identificar o híbrido e
a variabilidade resultante do cruzamento é necessário esperar o florescimento para se fazer
uma análise do fenótipo resultante. Uma das formas de se detectar a variabilidade no início
do desenvolvimento da planta e com grande rapidez é através da utilização de marcadores
moleculares. Dentre estes, RAPD se caracteriza por ser uma técnica precisa, rápida e que
requer baixos custo e mão-de-obra. O objetivo deste trabalho foi verificar a variabilidade
genética dentro de duas populações de helicônia obtidas através da extração dos embriões
das sementes de plantas de duas espécies distintas: Heliconia rostrata e H. bihai.
9
Heliconia rostrata
Heliconia bihai
Figura 1. Espécies do gênero Heliconia utilizadas para fins ornamentais.
MATERIAIS E MÉTODOS
Material utilizado: As duas populações de helicônia foram obtidas através da extração dos
embriões (Duval et al., 2003) das sementes de plantas de duas espécies distintas: Heliconia
rostrata e H. bihai, cultivadas em condições naturais, no Rancho Paraná, localizado no
município de Brazlândia, Distrito Federal. Esses embriões foram desinfestados com solução
a 0,5% de hipoclorito de sódio, lavados com água destilada e colocados em frascos com
meio nutritivo MS por 60 dias, depois foram transferidos para vasos contento areia e
vermiculita e mantidos em casa de vegetação, obtendo-se uma população com 31 indivíduos
de Heliconia bihai e 33 de Heliconia rostrata, constituídas de indivíduos meio-irmãos, cujo pai
é desconhecido.
10
Reações de amplificação: O DNA foi extraído das folhas dos indivíduos constituintes dessas
populações seguindo o protocolo CTAB 2 % (Ferreira e Grattapaglia, 1998). As reações de
RAPD foram preparadas com um coquetel de reagentes com as seguintes concentrações:
3,0 µl de DNA genômico a 3,00 ng/µl; 4,92 µl de água milli-Q autoclavada; 1,30 µl Tampão
10X para Taq DNA Polimerase; 1,04 µl de dNTP 2,5 mM; 1,04 µl de BSA 2,5 mM; 1,5 µl de
Primer (Operon Technologies, USA) 10ng/µl e 0,2 µl de enzima Taq DNA Polimerase
totalizando um volume final de 13µl. As reações de RAPD preparadas foram colocadas em
um termociclador PTC-100 (MJ Research) e as condições de amplificação foram:
desnaturação por um minuto a 92°C, anelamento do primer por um minuto a 35°C e extensão
pela Taq polimerase com incorporação de nucleotídeos por dois minutos a 72°C, esse ciclo
foi repetido 40 vezes, adicionando-se ainda um passo final de extensão de 5 minutos a 72°C
para finalizar os produtos amplificados (Ferreira e Grattapaglia, 1998). O DNA amplificado foi
separado por eletroforese (120 volts por 4 horas) em gel de agarose 1,5 % com brometo de
etídio e fotografado sob luz UV.
Análise estatística: As bandas de DNA amplificadas e fotografadas foram analisadas como
presentes (1) ou ausentes (0) e os dados resultantes foram utilizados na construção de uma
matriz de similaridade genética utilizando-se o coeficiente de Dice, do programa NTSYS
versão 2.10z. (Adams et al, 2002). A partir desta matriz foi gerado um dendrograma
utilizando o método de agrupamento UPGMA a fim de se verificar a diferença existente entre
os indivíduos de cada população. Com os dados obtidos, foi feita a análise de variância
molecular (AMOVA) do programa Arlequin (Schneider, 2000), para verificar a distribuição da
variação entre e dentro das populações e se o grau de variação entre os indivíduos de cada
população foi estatisticamente significativo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para a análise de RAPD, 50 primers foram testados, destes, 15 foram selecionados
(OP-A1, OP-A7, OP-A3, OP-A4, OP-A20, OP-C2, OP-F3, OP-F5, OP-L2, OP-R2, OP-V17,
OP-V16, OP-V10, OP-V15 e OP-V18) por serem diferenciadores, ou seja, polimórficos
(Figura 2), que geraram 101 marcadores.
Figura 2. Gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio, mostrando os fragmentos de DNA de H. bihai amplificados ao acaso. As setas
indicam os marcadores polimórficos.
11
Os dados obtidos na análise das bandas foram utilizados para se estimar a
similaridade genética entre os indivíduos de cada população a fim de se obter um
dendrograma (Figura 3). Analisando o dendrograma gerado, pode-se observar que as duas
populações formam dois grandes grupos bem distintos e dentro de cada população
verificam-se pequenos agrupamentos. Os individuos BM1, BM2 e RM1, RM2 são as mães
da progênie de H .bihai e H. rostrata, respectivamente. O indivíduo BC foi analisado como
sendo suposto pai de ambas as populações. No grupo de H. bihai, o indivíduo BC
aproximou-se mais dos agrupamentos formados pelos membros da progênie, principalmente
dos três pequenos agrupamentos formados pelos indivíduos: 44, 37, 32, 43, 33, 39, 55, 54,
41, 36, 47, 45, 59 e 40 (Figura 3), tendo grandes chances de ser o genitor masculino, pois
além do índice de similaridade apresentado ter sido de 0,85 em média, muitos indivíduos
apresentaram bandas idênticas às dele e que as mães não possuíam. No grupo de H.
rostrata esse indivíduo apresentou baixo índice de similaridade (0,66 em média) com relação
aos membros da progênie, fazendo parte do grande agrupamento populacional dessa
espécie, porém sem se agrupar especificamente com nenhum outro indivíduo. Portanto não
se pode afirmar que os indivíduos que apresentaram bandas semelhantes às dele são seus
filhos, porque essas bandas coincidiam com às das mães da progênie (RM1 e RM2),
provavelmente esses indivíduos herdaram essas bandas da mãe e não do BC.
RM1MW
12
O índice de similaridade variou de 0,47 a 0,98 na população de Heliconia rostrata, e de 0,67
a 1,00 na população de H. bihai, mostrando, dessa forma, que a primeira população é mais
heterogênea, ou seja, tem uma variabilidade genética maior (Figura 4). Entre as populações
esse índice variou de 0,21 a 0,75; porém os indivíduos 29,30 (H. rostrata) e 39 (H. bihai)
apresentaram um índice de 0,91, mostrando uma grande proximidade entre eles mesmo
sendo de populações e espécies diferentes, não se sabe ao certo o motivo dessa
proximidade. Através da análise de variância molecular (AMOVA), constatou-se que o grau
de variação entre os indivíduos de cada população foi estatisticamente significativo, sendo a
porcentagem de variação 57,33% entre as populações e de 42,67% dentro de cada
população.
0.24
52
BC
BM1
42
0.04
9
3
4959
C3
58 BC
50 56 47
36
57
45
44
55 37
54
40
33 38BM2
-0.16
31
32
48 43
41
4
12
28 27 8
14 25
RM1
23
2 105 13RM2
24 26
7
18
15 16
22
17 19
11
6
35
1
46 53
20
21
30
-0.36
51
-0.46
-0.56
0.63
0.70
C1 0.77 39
0.85
0.92
-0.22
C2
0.02
29
0.26
0.50
‹Heliconia bihai
‹Heliconia rostrata
Figura 4: Análise de coordenadas principais baseada nas estimativas de similaridade
genética de duas populações de Heliconia, 31 indivíduos de Heliconia bihai e 33 de Heliconia
rostrata.
13
CONCLUSÕES
- A técnica de RAPD foi bastante útil e eficiente para se detectar rapidamente a variabilidade
genética de indivíduos híbridos das espécies de helicônia estudadas.
- Foi possível verificar que através da obtenção de plantas de helicônia por meio de cultura
de embriões extraídos de sementes alcançou-se considerável variabilidade genética,
indispensável nos programas de melhoramento.
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DUVAL, F. G.; PAIVA, S. V. A.; TORRES, A. C; GRACIANO RIBEIRO, D. Meio e condições
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FAMÍLIAS
Zingiberales.
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HELICONIA
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