caracterização dos produtos de degradação do captopril por
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA AMBIENTAL JULIA RAQUEL LINO E FREITAS CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DO CAPTOPRIL POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS DE ALTA RESOLUÇÃO E AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE APÓS A FOTOCATÁLISE HETEROGÊNEA (TiO2/UV-C) OURO PRETO 2014 JULIA RAQUEL LINO E FREITAS CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DO CAPTOPRIL POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS DE ALTA RESOLUÇÃO E AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE APÓS A FOTOCATÁLISE HETEROGÊNEA (TiO2/UV-C) Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Engenharia Ambiental, Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título: Mestre em Engenharia Ambiental. Área de Concentração: Meio Ambiente Orientador: Prof. Dr. Robson José de Cássia Franco Afonso OURO PRETO 2014 Dedico este trabalho aos meus pais, Joaquim e Gilva, pelo apoio, força e incentivo. AGRADECIMENTO A realização desta dissertação marca o fim de uma importante etapa da minha vida. Gostaria de agradecer a todos aqueles que contribuíram de forma decisiva para a sua concretização. Primeiramente à Deus, por ter permitido mais esta conquista, além de conceder-me sabedoria, força e coragem para vencer os obstáculos que tive que enfrentar no andamento deste trabalho. Agradeço aos meus pais, Joaquim Lino e Gilva Gonçalves, por todo apoio e compreensão que sempre me deram. Nunca pouparam esforços para que este sonho fosse realizado. Ao meu orientador Prof. Dr. Robson Afonso, pela oportunidade de trabalhar ao seu lado, pela confiança e por todo o aprendizado que foi transmitido nestes anos. À Profª. Drª. Alceni Werle, pela paciência que me deu durante anos, por todos os conselhos, ensinamentos e por toda a confiança. Ao Prof. Dr. Sérgio Aquino, pela disponibilidade, atenção e apoio, além de disponibilizar seu laboratório para a realização deste trabalho. Um agradecimento em especial ao Frederico Quintão, por todo amor, carinho, confiança e principalmente paciência que teve comigo. Acreditando e sempre dizendo que eu seria capaz. Quero agradecer ao Júlio César Silva, pela disponibilidade e ajuda decisiva para a realização desta pesquisa. Agradeço, também, a Cássia Cabral, por ter contribuído imensamente na parte ecotoxicológica. Em especial, aos amigos que fiz durante estes anos, no Laboratório de Caracterização Molecular/ Espectrometria de Massas e no Laboratório de Controle Ambiental: Amanda Quaresma, Ananda Sanson, André Barros, Marina Tonucci, Bruno Baeta, Diego Lima. Aos alunos de iniciação científica: Mariana Pierotti, Vinícius Gonçalves, Maria Clara Xavier e Débora Silva. À Prof. Drª. Silvana de Queiroz Silva e ao Prof. Dr. Versiane Albis Leão, que disponibilizaram os laboratórios para a realização de ensaios ecotoxicidade e COT. À UFOP e ao PROAMB pela oportunidade. À instituição de fomento CNPq. Muito obrigada! "C’est le temps que tu as perdu pour ta rose qui fait ta rose si importante." Antoine de Saint-Exupéry RESUMO Produtos farmacêuticos de diferentes classes terapêuticas são encontrados no meio ambiente, tornando-se um grande problema ambiental. Dentre estes, se destaca o captopril, o qual é um fármaco da classe dos anti-hipertensivos, utilizado mundialmente no tratamento de pacientes com hipertensão arterial, insuficiência cardíaca, infarto do miocárdio e nefropatia diabética. Processos oxidativos avançados são alternativas para aumentar a remoção e a mineralização dos microcontaminantes em águas. Este trabalho tem como objetivo caracterizar os produtos de degradação do captopril por Espectrometria de Massas de Alta Resolução, após a fotocatálise heterogênea utilizando TiO2/UV-C e avaliação da toxicidade dos produtos da degradação. Foram realizados ensaios de fotocatálise heterogênea com TiO2 suspenso, fotólise, hidrólise e adsorção e dessorção do fármaco em escala de bancada, utilizando um aparelho de Jar-Test. As determinações e as análises semi-quantitativas captopril e seus subprodutos formados foram realizadas por Espectrometria de Massas e Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência. O acompanhamento da mineralização foi realizado através da técnica de medida de carbono orgânico total. O teste de Ames e Artemia salina foram empregados para avaliação da toxicidade dos subprodutos. Como resultado, obteve-se, através da fotólise (UV-C) e fotocatálise (TiO2/UV-C), a remoção quase completa do captopril (93,5% para a fotólise e 99,86% para fotocatálise), as taxas de mineralização obtidas para os processos de fotodegradação foram de 9,09% para TiO2/UV-C e 2,92% para a fotólise para o tempo de exposição de 120 min. Foram identificados 11 subprodutos de degradação do fármaco e elucidadas suas respectivas estruturas químicas e também proposta a possível rota química de degradação. O teste de ecotoxicidade utilizando Artemia salina não apresentou diferença de toxicidade entre o fármaco e os subprodutos. Já no teste de Ames, o fármaco foi considerado mais tóxico do que os seus produtos da degradação. ABSTRACT Pharmaceuticals of different therapeutic classes are found in the environment, making this a major environmental problem. Among the pharmaceuticals, the captopril, which is a drug from the class of antihypertensive, is used worldwide in the treatment of patients with hypertension, heart failure, myocardial infarction and diabetic nephropathy. Advanced oxidation processes are alternatives to increase removal and mineralization of organic microcontaminants in waters. The aim of this work is to characterize the heterogeneous photocatalysis (TiO2/UV-C) degradation byproducts of captopril by High-Resolution Mass Spectrometry and to evaluate the toxicity of its degradation byproducts. The photodegradation assays were performed with suspended TiO2, photolysis, hydrolysis, adsorption and desorption of the drug in a bench scale apparatus, using a jar-test. Measurements and semiquantitative analysis of the captopril and its by-products were performed by Mass Spectrometry and Ultra Performance Liquid Chromatography. The mineralization was monitored using the total organic carbon analysis. The Ames test and Artemia salina were used to evaluate the toxicity of by-products. As results, after 120 min light exposure, there was obtained almost the complete removal of captopril, 93.5% at photolysis(UV-C) and 99.86% at photocatalysis (TiO2/UV-C). At these conditions, the rate of mineralization obtained 2,92 and 9.09%, respectively. 11 by-products of captopril photodegradation processes were identified and their respective chemical structures elucidated. It was also proposed a possible chemical degradation pathway. The ecotoxicity test using Artemia salina showed no difference in toxicity between the drug and its by-products. The Ames test show that captopril seems to be more toxic than its degradation byproducts. LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1 Principais classes farmacêuticas encontradas no meio ambiente, de acordo com o número de fármacos.................................................................................................................. 18 FIGURA 2 Principais rotas de exposição dos microcontaminantes no meio ambiente. .......... 22 FIGURA 3 Diferenças dos níveis energéticos dos materiais. .................................................. 24 FIGURA 4 Mecanismo simplificado para a fotoativação em um semicondutor TiO2............. 25 FIGURA 5 Mecanismo das reações na fotólise........................................................................ 26 FIGURA 6 Espectro de absorção do TiO2 comparado com o espectro solar. ......................... 28 FIGURA 7 Fatores que influenciam na fotocatálise. ............................................................... 30 FIGURA 8 Estrutura química do captopril. ............................................................................. 41 FIGURA 9 Oxidação do captopril a dissulfeto de captopril. ................................................... 42 FIGURA 10 Espectro de absorção de uma solução aquosa de captopril (10mgL-1). ............... 42 FIGURA 11 Componentes de um Espectrômetro de massas. .................................................. 44 FIGURA 12 Técnicas de ionização. ......................................................................................... 45 FIGURA 13 Esquema de ionização por ESI. ........................................................................... 46 FIGURA 14 Configuração do híbrido IT-TOF. ....................................................................... 47 FIGURA 15 Artemia salina...................................................................................................... 48 FIGURA 16 Ensaios envolvidos com a fotocatálise. ............................................................... 52 FIGURA 17 Sistema Jartest adaptado para os ensaios. ........................................................... 52 FIGURA 18 Cromatógrafo líquido acoplado ao espectrômetro de massas - LC-MS-IT-TOF (Shimadzu). .............................................................................................................................. 55 FIGURA 19 Thermo Scientific HiPerTOC. ............................................................................. 56 FIGURA 20 Esquema simplificado do teste de Ames. ............................................................ 58 FIGURA 21 Gráfico de monitoramento do captopril nos ensaios de hidrólise e adsorção/dessorção. .................................................................................................................. 59 FIGURA 22 Gráfico de monitoramento do captopril perante fotólise. .................................... 60 FIGURA 23 Gráfico de porcentagem de remoção de COT. .................................................... 61 FIGURA 24 Cromatograma de íon extraído do captopril durante a fotocatálise. .................... 62 FIGURA 25 Gráfico de monitoramento do captopril durante a fotocatálise. .......................... 63 FIGURA 26 Gráfico de porcentagem de remoção de COT. .................................................... 63 FIGURA 27 Espectros ESI-MS no modo negativo obtido das alíquotas da degradação de CPT pela fotocatálise. a) mostra-branco (água Milli-Q) e todos os tempos do ensaio; b) tempo de 60 e 120 minutos em uma escala maior. ................................................................................... 65 FIGURA 28 Cromatogramas dos subprodutos identificados na fotocatálise e na fotólise no tempo de 120 minutos. ............................................................................................................. 67 FIGURA 29 Relações isotópicas do subproduto C9H15NO6S. ................................................. 69 FIGURA 30 Rota de degradação do CPT. ............................................................................... 72 FIGURA 31 Gráficos do monitoramento dos subprodutos na fotocatálise e na fotólise. ........ 73 FIGURA 32 Cepas TA98 e TA100. ......................................................................................... 75 LISTA DE TABELAS TABELA 1 Fármacos e porcentagem das formas de excreção. ............................................... 19 TABELA 2 Classificação dos POAs. ....................................................................................... 24 TABELA 3 Relação entre tipo de radiação e comprimento de onda. ...................................... 29 TABELA 4 Estudos que avaliam a degradação de fármacos perante processos oxidativos convencionais e avançados. ...................................................................................................... 34 TABELA 5 Propriedades físico-químicas do captopril............................................................ 41 TABELA 6 Classificação científica da Artemia salina. ........................................................... 49 TABELA 7 Protocolo da fotodegradação. ............................................................................... 54 TABELA 8 Corrida cromatográfica. ........................................................................................ 56 TABELA 9 - Elucidação de possíveis subprodutos do captopril por fotodegradação. ............ 68 TABELA 10 Elucidação das estruturas químicas dos subprodutos formados da degradação do CPT. .......................................................................................................................................... 69 TABELA 11 Valores do RM para várias concentrações de CPT............................................. 75 TABELA 12 Valores da RM para a amostra da fotocatálise. .................................................. 76 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ME Microcontaminantes emergentes ETE Estação de Tratamento de Esgoto ETA Estação de Tratamento de Água POAs Processos Oxidativos Avançados ECA Enzima conversora de angiostensina CPT Captopril IBOPE Instituto Brasileiro de Opinião Pública e Estatística IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística EMEA Agência Européia de Avaliação dos Medicamentos CETESB Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental USEPA United States Environmental Protection Agency • OH Radical Hidroxila UV Luz ultravioleta US Ultrassom BV Banda de valência BC Banda de condução IECA Inibidores da enzima conversora de angiotensina FDA Food and Drug Administration INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia MS Espectrometria de Massas LC Cromatografia Líquida CG Cromatografia Gasosa EI Ionização por elétrons CI Ionização Química ESI Ionização por Electrospray APCI Ionização Química a Pressão Atmosférica SI Íons Secundários PD Dessorção por Plasma Q Quadrupolo (analisador) TOF Tempo de vôo (analisador) IT Íons Trap (analisador) E Setor elétrico (analisador) B Setor magnético (analisador) FT-ICR Ressonância Ciclotrônica de Íons com Transformada de Fourier (analisador) OM Orbital molecular ICP Plasma indutivamente acoplado APPI Fotoionização a pressão atmosférica DESI Ionização de Dessorção por Eletrospray DART Dessorção e ionização a pressão atmosférica SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 13 2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 16 2.1 Objetivo geral ..................................................................................................... 16 2.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 16 3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................. 17 3.1 Fármacos no meio ambiente ............................................................................... 17 3.2 Rotas de exposição para o meio ambiente .......................................................... 18 3.3 Tecnologias para tratamentos de águas e efluentes ............................................ 23 3.3.1 Processos oxidativos avançados .................................................................. 23 3.3.2 Fotocatálise heterogênea utilizando TiO2/UV-C ......................................... 26 3.4 Efeitos ecotoxicológicos ..................................................................................... 30 3.5 Aplicação ............................................................................................................ 33 3.6 Captopril ............................................................................................................. 40 3.6.1 Farmacologia e farmacodinâmica ................................................................ 40 3.6.2 Farmacovigilância ........................................................................................ 40 3.6.3 Características físico-químicas .................................................................... 41 3.6.4 Informações ecológicas e toxicológicas ...................................................... 43 3.6.5 Presença no meio ambiente ......................................................................... 43 3.7 Fundamentos das técnicas envolvidas ................................................................ 43 3.7.1 Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas de Ala Resolução ................................................................................................. 43 3.7.2 Carbono Orgânico Total – COT .................................................................. 47 3.7.3 Teste de ecotoxicidade ................................................................................. 48 4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 51 4.1 Limpeza de vidrarias ........................................................................................... 51 4.2 Reagentes e consumíveis .................................................................................... 51 4.3 Ensaios de Fotodegradação ................................................................................. 51 4.4 Determinações analíticas .................................................................................... 54 4.4.1 Espectrometria de Massas............................................................................ 54 4.4.2 Carbono Orgânico Total .............................................................................. 56 4.5 Teste de Ecotoxicidade ....................................................................................... 57 4.5.1 Artemia salina .............................................................................................. 57 4.5.2 Teste de Ames .............................................................................................. 57 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 59 5.1 Eficiência da degradação e mineralização do captopril ...................................... 59 5.1.1 Hidrólise e adsorção/dessorção .................................................................... 59 5.1.2 Fotólise ........................................................................................................ 60 5.1.3 Fotocatálise heterogênea .............................................................................. 61 5.2 Identificação dos subprodutos de degradação .................................................... 64 5.3 Elucidações dos subprodutos e rota de degradação ............................................ 69 5.3 Monitoramento dos subprodutos ........................................................................ 73 5.4 Testes de Ecotoxicidade ..................................................................................... 74 5.4.1 Artemia salina .............................................................................................. 74 5.4.2 Teste de Ames .............................................................................................. 75 6 CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 77 7 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS ................................................................ 78 REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 79 13 1 INTRODUÇÃO A sociedade utiliza diariamente vários compostos orgânicos sintéticos. Dentre estes compostos, citam-se produtos farmacêuticos, produtos de higiene pessoal, hormônios sintéticos, produtos veterinários, pesticidas, produtos e subprodutos industriais, aditivos alimentares e drogas ilícitas (KUMMERER, 2009b; RADJENOVIĆ; PETROVIĆ; BARCELÓ, 2009). A partir da década de 1960, iniciou-se a discussão sobre a presença de compostos orgânicos antrópicos no meio ambiente. A persistência destes compostos no meio ambiente levou a criação da classe dos microcontaminantes de preocupações emergentes (ME). Este termo é designado aos contaminantes orgânicos encontrados em amostras aquosas, com concentrações na ordem de nanogramas por litro (ηg.L-1) e microgramas por litro (µg.L-1). Até o momento, somente alguns destes ME são regulamentados, a grande maioria ainda são potenciais candidatos a regulamentações futuras (CARLSSON et al., 2006; RADJENOVIĆ et al., 2007; TAMBOSI, 2008; KÜMMERER, 2009; LAPWORTH et al., 2012; RODRIGUES, 2012). Em 1990 intensificou-se a discussão dos possíveis problemas que podem gerar com a presença de fármacos no meio ambiente. Atualmente produtos farmacêuticos de diferentes classes terapêuticas são encontrados no mundo inteiro em águas superficiais, subterrâneas e em água de abastecimento, tornando-se um grande problema ambiental. Vários estudos já foram realizados, investigando quais são os principais fármacos e em qual concentração são encontrados no meio aquoso (JORGENSEN; HALLING-SORENSEN, 2000; CARLSSON et al., 2006; RADJENOVIĆ et al., 2007; KOSJEK; HEATH, 2008; TAMBOSI, 2008; KÜMMERER, 2009; RODRIGUES, 2012; SANSON, 2012). Com a intesificação de estudos sobre os ME, várias fontes são apontadas para justificar o aparecimento destes no meio aquático, como: esgotos doméstico, efluentes industriais, rejeitos agropecuários. Os efluentes das estações de tratamento de esgoto (ETEs), bem como a disposição sem tratamento de esgotos doméstico, provavelmente são os principais responsáveis pela disseminação destes ME no meio ambiente (IKEHATA; JODEIRI NAGHASHKAR; GAMAL EL-DIN, 2006; KOSJEK; HEATH, 2008). Os fármacos são compostos altamente estáveis, com considerável poder recalcitrante. Devido a estas características os processos de tratamento convencionais existentes nas ETEs não são os mais adequados para a remoção destes compostos da água (JORGENSEN; HALLING-SORENSEN, 2000; KOSJEK et al., 2007). 14 Sabendo-se que o efluente lançado pela ETE pode ser reutilizado por uma estação de tratamento de água (ETA) à jusante, é importante analisar o efluente da ETE. Avaliando a eliminação e/ou redução dos ME, bem como, a formação de subprodutos perante os processos de tratamentos utilizados nas ETAs e nas ETEs (KASPRZYK-HORDERNA; ZIÓŁEKB; NAWROCKI, 2003; HASSAN; HAWKYARD, 2006; IKEHATA; JODEIRI NAGHASHKAR; GAMAL EL-DIN, 2006; SOARES et al., 2006; EROL; ÖZBELGE, 2008; FATTA-KASSINOS; VASQUEZ; KUMMERER, 2011; PEREIRA et al., 2011b). A presença dos ME em águas superficiais, subterrâneas e de abastecimento público causam efeitos tóxicos aos seres humanos e animais como, por exemplo, toxicidade aquática, desenvolvimento de resistência em bactérias patogênicas, genotoxicidade e distúrbios endócrinos. Estudos revelam que alguns fármacos e subprodutos de degradação persistem por mais de um ano em águas naturais tornando este problema ambiental ainda mais preocupante (KUMMERER, 2004; MOMPELAT; BOT; THOMAS, 2009; JARDIM et al., 2012; RATOLA et al., 2012). Processos de tratamentos de água não convencionais estão sendo desenvolvidos para aumentar a remoção e a mineralização dos microcontaminantes das águas. Alguns processos alternativos desenvolvidos e com grande potencial de uso são os processos oxidativos avançados (POAs), caracterizados pela geração de radicais hidroxila (OH•). Estes radicais são agentes fortemente oxidantes, capazes de oxidar matéria orgânica com certo poder recalcitrante (MORAES, 1995; ANDREOZZI et al., 1999; BELTRAN; AGUINACO; GARCIA-ARAYA, 2009; BUTH, 2009; HOMEM; SANTOS, 2011). O captopril, (S)-1-(3-mercapto-2-metil-1-oxopropil)-1-prolina), é um fármaco da classe dos anti-hipertensivos, o qual atua na inibição da enzima conversora de angiotensina (ECA). Seu uso é recomendado mundialmente para o tratamento de pacientes com hipertensão arterial, insuficiência cardíaca, infarto do miocárdio e nefropatia diabética (AZEVEDO; RIBEIRO; ARAÚJO, 2008; MAHMOUD; KUMMERER, 2012). A literatura reporta a presença de vários fármacos da classe dos anti-hipertensivos nos esgotos, em águas superficiais e até mesmo em águas potáveis (HERNANDO et al., 2007; LI et al., 2012; LÓPEZ-SERNA; PETROVIC; BARCELÓA, 2012). O captopril (CPT), apesar do seu vasto uso pela população, alta taxa de eliminação é um fármaco muito pouco estudado na área ambiental. O captopril foi encontrado, nos afluentes e nos efluentes de ETE´s em Portugal, na faixa de concentração de 32 ± 2 ɳg.L-1 e 1,376 ± 56 ɳg.L-1 , respectivamente, por (SALGADO et al., 2010). 15 Além da presença do captopril no meio ambiente, fazem-se necessários estudos do seu comportamento frente aos processos químicos de tratamento de água, particularmente quanto à toxidade de seus subprodutos. 16 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Caracterizar os produtos de degradação do captopril por Espectrometria de Massas de Alta Resolução, após a fotocatálise heterogênea utilizando TiO2/UV-C e avaliar a toxicidade dos produtos da degradação. 2.2 Objetivos específicos Realizar o ensaio de fotodegradação heterogênea utilizando TiO2/UV-C; Desenvolver método analítico de cromatografia e espectrometria de massas para identificar o captopril e seus subprodutos; Avaliar a degradação do captopril perante o processo de fotocatálise heterogênea; Identificar e avaliar a formação dos subprodutos gerados durante a degradação do captopril; Avaliar a toxicidade dos subprodutos gerados através do Teste de Ames e Teste da Artemia salina e comparar com a toxicidade do fármaco; Propor rotas químicas de degradação do captopril e formação dos subprodutos. 17 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 Fármacos no meio ambiente Fármacos são substâncias químicas biologicamente ativas, possuem propriedades farmacológicas com finalidade medicamentosa. São utilizados para diagnóstico, alívio, ou tratamento de moléstias. É empregado para modificar, explorar sistemas fisiológicos ou estados patológicos, em benefício humano ou animal na qual se administra. Estas substâncias são, geralmente, compostos orgânicos de baixo peso molecular (inferior a 500 Daltons). Para produzir os efeitos terapêuticos, o fármaco deve estar presente em concentrações apropriadas, geralmente em concentrações inferiores a miligramas por litro (mg/L) e atingir a célula-alvo (IKEHATA; JODEIRI NAGHASHKAR; GAMAL EL-DIN, 2006; RADJENOVIĆ; PETROVIĆ; BARCELÓ, 2009). Desde a década de 1960, sabe-se que os fármacos estão presentes no meio ambiente. São encontrados frequentemente em águas superficiais de vários lugares do mundo, em menor frequência e concentração nas águas subterrâneas e em águas potáveis. (JORGENSEN; HALLING-SORENSEN, 2000; HOMEM; SANTOS, 2011). Os fármacos estão inclusos à classe dos microcontaminantes de preocupações emergentes (ME), pois assim como outros contaminantes de origem antrópica, estão presentes nas concentrações de ηg.L-1 à µg.L-1 em amostras aquosas (KUMMERER, 2009a; TAMBOSI et al., 2010). A presença destes ME no meio ambiente chama a atenção, pois a cada ano aumenta o consumo de medicamentos pela população. Consequentemente será maior a probabilidade de atingir o meio ambiente, tanto em número quanto em concentração. De acordo com a estimativa do Instituto Brasileiro de Opinião Pública e Estatística (IBOPE), para o ano de 2013, o comércio de medicamentos movimentaria cerca de setenta bilhões de reais somente no Brasil, 12% maior do que foram gastos em 2012. A ocorrência dos ME é preocupante devido às propriedades intrínsecas destes compostos. Os fármacos são biologicamente ativos, polares, pouco voláteis e possuem estabilidade química, sendo fortemente resistentes à mineralização. A presença dos ME no meio ambiente pode causar efeitos adversos sobre a vida aquática e aos seres humanos (ANDREOZZI et al., 1999; PAL et al., 2010; LAPWORTH et al., 2012; RATOLA et al., 2012). Santos e colaboradores (2010) compilaram informações de 134 artigos publicados entre os anos de 1997 e 2009, identificando as principais classes terapêuticas presentes no 18 meio ambiente (SANTOS et al., 2010). Dentre as classes farmacêuticas encontradas no meio ambiente, citadas na FIGURA 1, estão os anti-hipertensivos. A contribuição desta classe é relativamente alta. De todos os fármacos encontrados no meio ambiente 12% são da classe dos anti-hipertensivos. Tal resultado condiz com o alto consumo desta classe de medicamento pela população. FIGURA 1 Principais classes farmacêuticas encontradas no meio ambiente, de acordo com o número de fármacos. Agonistas Adrenérgicos 3% Produtos Constrastes de raio X Veterinários 3% 3% Anti-ácidos 3% Anti-neoplásicos 4% Hipoglicemiantes 3% Anti-psicóticos 1% Anti-hipertensivos 4% Anti-depressivos 4% Anti-inflamatórios não esteroidais 16% Ansiolíticos 4% Beta bloqueadores 8% Antibióticos 15% Anti-epilépticos 8% Hormônios sexuais 9% Hipolipemiantes 12% Fonte: Adaptado de Santos, 2010. 3.2 Rotas de exposição para o meio ambiente Ao serem administrados, os fármacos são absorvidos, distribuídos e posteriormente metabolizados no organismo. O metabolismo dos fármacos começa com várias reações bioquímicas (transformação de fase I), em que se adicionam grupos funcionais nas moléculas (exemplo: reações de hidroxilação, epoxidação, redução e hidrólise). Logo depois, moléculas endógenas altamente polares, tais como: ácido glucurônico, sulfato e aminoácidos, são adicionados aos fármacos ou metabólitos da transformação da fase I, para gerar conjugados, 19 estas reações são denominadas de transformação de fase II. Após as reações de fase II, os fármacos conjugados são mais solúveis em água, permitindo a excreção pela urina ou pela bile. Embora haja absorção e metabolização, uma quantidade significativa do fármaco pode ser eliminada sem sofrer nenhuma transformação, serão eliminados na forma inalterada (H. JONES; VOULVOULIS; LESTER, 2005; IKEHATA; JODEIRI NAGHASHKAR; GAMAL EL-DIN, 2006; RADJENOVIĆ; PETROVIĆ; BARCELÓ, 2009). A TABELA 1 apresenta informações sobre a porcentagem quantidade e a forma que alguns fármacos são eliminados do organismo, isto é, se o fármaco é eliminado na forma inalterada ou como metabólitos. TABELA 1 Fármacos e porcentagem das formas de excreção. Fármaco Aciclovir Ácido Acetil Forma inalterada Metabólito (%) 75 ± 10 10 Salicílico (%) 9-carboximetoximetilguanina 8-14 8-hidroxi-9-(2-hidroxietoximetil) guanina 0,2 Ácido salicilúrico 75 Ácido fenólico 10 Amoxicilina 86 ± 8 Ácido penicilóico Atenolol 94 ± 8 Metabolito hidroxilado 3 Conjugado glicuronídeo 60-90 Azitromicina 12 Bezafibrato Brometo de n-butil- 10-25 80 escopolamina Captopril 40-50 Dímero de dissulfeto de captopril e dissulfeto de captopril-cisteína Cefalexina 91 ± 18 Diacetilfalotina (metabólito menos ativo) Cefazolina sódica Cimetidina Ciprofloxacino Claritromicina 50-90 50-70 20-40 n-glixuronídeo cimetidina 7-14 hidroximetilcimetidina 4 Oxociprofloxacino (metabólito ativo) 3 Sulfociprofloxacino (metabólito ativo) 8 114-hidroxiclaritromicina Prometazina desmetilprometazina 1 24 sulfóxido de cimetidina Sulfoxido de prometazina e n- sódio 27-54 80 ± 16 Cloreto de Diclofenaco de 40 10-15 4’-hidroxidiclofenaco 20-30 5,3 e 4,5-dihidroxidiclofenaco 10-20 20 Cloridrato de 5 ondansetrona Diltiazem 35 Doxiciclina 41 ± 19 Enalapril 88 ± 7 Eritromicina Diacetildiltiazem-DAD (metabólito ativo) Ácido enalaprílico (metabólito ativo) 2-4 43-56 2-5 Estriol Conjugado com ácido glicurônico Fluconazol 60-80 Fosfato de 10 95 11 N-desmetilclindamicina Clindamicina Furosemida 71 ± 10 Genfibrozila <1 Conjugado glicuronídeo Ibuprofeno <1 Hidrolisado 90 Desmetil e n-oxido 5 Produtos de oxidação 50 Metabólitos ativos 6 6-desmetilnaproxeno 1 Conjugado com ácido glicurônico 1 Levofloxacino Linezolida Losartana Potássica 61-87 30 12 ± 2,8 Metformina 99,9 ± 0,5 Naproxeno 95 Norfloxacina 25-40 Nitrofurantoina 47 ± 13 Oxitetraciclina 10-35 Paracetamol 3±1 Propranolol Conjugado com o ácido glucurônico <0,5 5-10 Aminofurantoína 1,2 Conjugado com ácido glicurônico 60 Conjugado com ácido sulfúrico 35 Conjugado com cisteína 3 Conjugado com glicuronideo 4-hidroxipropranolol (ativo) Ranitidina Sulfametoxazol Tetraciclina 69 ± 6 35-50 60-90 20 n-óxido 3-6 s-óxido 1-2 desmetil ranitidina 1-2 Derivado de N4-acetilato 50-70 Conjugado com ácido glicurônico. 15-20 1,3 oxidos e derivados de 3,4- hidroxi 10-20 58 ± 8 Trimetoprima 60 Varfarina sódica <2 Fonte: (GOODMAN; GILMAN, 2005; KASPRZYK-HORDERN; DINSDALE; GUWY, 2008a; PUBCHEM, 2013). Após serem excretados do organismo por meio da urina e fezes, os fármacos são diluídos no esgoto doméstico sendo dispostos em corpos d'água ou levados às ETEs. Nesta 21 mesma rota inclui-se o descarte de forma inadequada (por exemplo, no vaso sanitário) de produtos não usados ou com o prazo de validade expirado, indo para o esgoto. Quando ocorre a disposição em aterros sanitários clandestinos, a chuva pode solubilizar estes compostos, assim, podem sofrer infiltração no solo (atingindo águas subterrâneas) e escoamento superficial (alcançando as águas superficiais) (IKEHATA; JODEIRI NAGHASHKAR; GAMAL EL-DIN, 2006; KOSJEK et al., 2007; RATOLA et al., 2012). Os medicamentos veterinários são lançados diretamente no meio ambiente pela excreção dos animais, consequentemente, podem sofrer infiltração e escoamento superficial (IKEHATA; JODEIRI NAGHASHKAR; GAMAL EL-DIN, 2006; KOSJEK et al., 2007; RATOLA et al., 2012). Os fármacos que foram eliminados do organismo na forma conjugada (por exemplo, com os grupos glucurônicos, sulfurônicos) podem sofrer biodegradação pelos microrganismos nas ETEs e retornar à forma original (forma inalterada) (TAMBOSI et al., 2010). Assim, como produto final pode haver (i) compostos totalmente mineralizados, isto é, foram completamente degradados a dióxido de carbono e água; (ii) compostos convertidos, os quais sofreram algumas alterações em sua estrutura química formando subprodutos de degradação, não necessariamente menos tóxicos que os precursores; ou (iii) compostos íntegros, compostos que não sofreram nenhuma alteração na estrutura química (geralmente compostos recalcitrantes) (QUINTANA; WEISS; REEMTSMA, 2005; GROS et al., 2010). Tendo em vista que os processos de tratamento de esgoto podem ser ineficientes na remoção de ME, alguns fármacos e subprodutos formados nos processos de tratamentos podem continuar nos efluentes das ETEs. Estes efluentes são lançados em um corpo d'água receptor, contaminando o meio aquático a jusante, e comprometendo a qualidade das águas (MOMPELAT; BOT; THOMAS, 2009; ACERO et al., 2010; ZHANG et al., 2013). Além da contaminação dos corpos d'água pelos efluentes das ETEs, países em desenvolvimento sofrem com outra rota de contaminação: a contaminação direta do esgoto nos corpos d’água devido à falta de coleta e/ou tratamento de esgoto em alguns municípios. Dados publicados pelo IBGE no Atlas de Saneamento de 2011 revelam que no ano de 2008, pouco mais de 70% dos municípios apresentavam em todos os distritos tratamento de água distribuída por rede geral. Aproximadamente 28,5% dos municípios (incluindo seus distritos) faziam o tratamento do esgoto coletado, dentre estes, somente 72% tratavam todo o esgoto coletado. Do número total de municípios brasileiros, 30,5% lançavam esgoto não tratado em rios, lagos ou lagoas. Estes municípios utilizam, à jusante, a água dos corpos 22 receptores para vários usos, como: abastecimento de água (16%), irrigação (23%), recreação e aquicultura. Após o que foi dito anteriormente, é possível esquematizar a rota de exposição dos microcontaminantes no meio ambiente. Este esquema está exposto na FIGURA 2. FIGURA 2 Principais rotas de exposição dos microcontaminantes no meio ambiente. Uso humano Produção (dométisco e hospitalar) (indústria e farmácia) Aterro Esgoto Água subterrânea Uso veterinário (aquicultura, pecuária, animais domésticos) Esterco Solo Estação de tratamento de esgoto (degradação química e/ou biológica) Cadeia alimentar Lodo Água superficial lixiviaçã o disposição Estação de tratamento de água escoamento superficial excreçã o descarte direto Água tratada esgoto não coletado e/ou não tratad o Fonte: adaptado de (IKEHATA; JODEIRI NAGHASHKAR; GAMAL EL-DIN, 2006; TAMBOSI, 2008; KUSMIEREK et al., 2009; HOMEM; SANTOS, 2011). 23 3.3 Tecnologias para tratamentos de águas e efluentes Novas tecnologias para tratamentos de água e efluentes são testadas para degradar poluentes orgânicos não eliminados em tratamentos biológicos convencionais em ETEs. Estas tecnologias consistem principalmente na transferência de fase e na oxidação química (ZIOLLI; JARDIM, 1998; ANDREOZZI et al., 2004; JARDIM; CANELA, 2004). A transferência de fase é um tipo de tecnologia que transfere o poluente de um meio para outro, como por exemplo, a floculação/decantação, adsorção com o carvão ativo. A oxidação química do poluente tem como objetivo a mineralização do poluente em dióxido de carbono, água e material inorgânico, ou em apenas moléculas mais simples e menos tóxicas (ZIOLLI; JARDIM, 1998; ANDREOZZI et al., 2004; JARDIM; CANELA, 2004). As técnicas de oxidação química podem ser: convencional e avançada. A oxidação avançada utiliza-se de agentes oxidantes fortes capazes de formar, principalmente, radicais hidroxilas, os quais promovem a oxidação dos compostos orgânicos presentes na água (KASPRZYK-HORDERNA; ZIÓŁEKB; NAWROCKI, 2003; JARDIM; CANELA, 2004). 3.3.1 Processos oxidativos avançados Os processos oxidativos avançados (POAs) são alternativas ou complementos aos processos convencionais para tratamento de efluentes, águas superficiais ou subterrâneas. Os POAs possuem a capacidade de eliminar ou reduzir substâncias de elevada estabilidade e baixo grau de mineralização presentes na água. Nos últimos anos, estes processos têm sido amplamente estudados devido ao alto potencial reativo (MUNTER, 2001; AGUSTINA; ANG; VAREEK, 2005; SOUSA et al., 2012). Os POAs são técnicas de oxidação química que utilizam oxidantes fortes (ozônio e peróxido de hidrogênio) aliados a fonte de energia (luz ultravioleta-UV, ultrassom-US e feixe de elétron), e catalisadores (íons ferrosos, semi-contudores) para produzir radicais hidroxilas (OH•) (SOUSA et al., 2012). O radical hidroxila é uma espécie extremamente reativa e pouco seletiva. O potencial de oxidação deste radical (Eº = 2,80V) é superior ao dos oxidantes convencionais e inferior apenas ao potencial de oxidação do flúor (Eº = 3,03V). Portanto, o OH• é capaz de oxidar matéria orgânica até então consideradas refratárias (TEIXEIRA; JARDIM, 2004). Os POAs são classificados quanto à presença ou ausência de irradiação e quanto à homogeneidade do sistema (homogêneo ou heterogêneo). A homogeneidade do sistema é 24 determinada pelo método de geração de radicais hidroxilas. Assim, sistemas heterogêneos possuem catalisadores sólidos, constituindo duas fases ao sistema, e sistemas homogêneos possuem apenas uma fase (ANDREOZZI et al., 1999; MUNTER, 2001; KASPRZYKHORDERNA; ZIÓŁEKB; NAWROCKI, 2003). A TABELA 2 apresenta a classificação dos POAS de acordo com a homogeneidade e presença ou ausência de irradiação. TABELA 2 Classificação dos POAs. Sistemas Homogêneos Sistemas Heterogêneos Presença de irradiação O3/UV H2O2/UV Feixe de elétrons US H2O2/US UV/US TiO2/UV TiO2/H2O2/UV Ausência de irradiação O3/H2O2 O3/OHH2O2/Fe2+ (fenton) Eletro-fenton Fonte: adaptado de (KASPRZYK-HORDERNA; ZIÓŁEKB; NAWROCKI, 2003). 3.3.1.1 Fotocatálise heterogênea A fotocatálise heterogênea é caracterizada pela presença de catalisadores do tipo semicondutor. Estes catalisadores são materiais cristalinos sólidos, cuja condutividade elétrica está entre um material condutor e não-condutor, como mostrado na FIGURA 3. Alguns exemplos de semicondutores são: TiO2, ZnO, Fe2O3, CdS, GaP and ZnS (BUTH, 2009). FIGURA 3 Diferenças dos níveis energéticos dos materiais. Fonte: adaptado de (TEIXEIRA; JARDIM, 2004). Os semicondutores possuem uma região energética chamada de banda de valência (BV) e a banda de condução (BC) e entre eles há a band-gap. A BV possui baixa energia e 25 não há movimentos de elétrons, a BC possui alta energia e os elétrons são livres para se movimentarem através do cristal (AGUSTINA; ANG; VAREEK, 2005; CHONG et al., 2010). O semicondutor, na presença de uma fonte de energia, absorve um fóton com energia superior ou igual à energia de band gap. A energia absorvida promove a transferência de um par de elétrons da BV para a BC. Com a geração do par elétron/lacuna (e-/h+) o semicondutor começa a apresentar condutividade elétrica, assemelhando-se a condutividade elétrica de um metal. O par de elétrons pode sofrer recombinação interna, externa (na superfície) ou participar de reações de oxi-redução. A FIGURA 4 esquematiza a fotoativação do semicondutor TiO2 (ZIOLLI; JARDIM, 1998; MUNTER, 2001; HOMEM; SANTOS, 2011). FIGURA 4 Mecanismo simplificado para a fotoativação em um semicondutor TiO 2. hv: energia; P: produto; P+: produto oxidado Fonte: Adaptado de (CHONG et al., 2010). A fotocatálise apresenta vantagens quando comparada a outros POAs: (i) pode-se trabalhar em temperatura e pressão ambiente; (ii) consegue mineralizar compostos orgânicos e seus subprodutos; (iii) remove traços de fármacos da água; (iv) baixo custo operacional. Atualmente, a degradação fotocatalítica com semicondutor é vista como uma tecnologia promissora para a remoção de contaminantes tóxicos orgânicos e inorgânicos presentes na água (H. JONES; VOULVOULIS; LESTER, 2005; CHONG et al., 2010). 26 3.3.1.2 Fotólise (UV) A fotólise química ocorre por ação da luz em comprimentos de onda específicos, as reações estão apresentadas na FIGURA 5. A luz incidente pode excitar a molécula (M) em solução aquosa. Consequentemente um elétron do orbital molecular ligante (OM) é transferido para um orbital molecular antiligante (OM*), assumindo o estado singleto (1). Uma molécula em um estado excitado singleto pode sofrer uma conversão para um estado em que o elétron excitado tenha seu spin modificado, tal estado é chamado de estado tripleto (2). Os estados singleto e tripleto de uma molécula são de níveis energéticos com alta probabilidade de submeter-se a reações químicas de foto-indução. Dois mecanismos principais de degradação são reportados a partir do estado tripleto: oxidação direta com formação de subprodutos, por exemplo, descarboxilação e degradação da cadeia lateral (3) e dissipação com formação de espécies oxigenadas reativas (EOR). A dissipação pode proceder através da formação de um oxigênio singleto 1O2 (etapa 4a), transferência de elétron, formando O2•- e M•- (etapa 4b), degradação homolítica com a formação de M•- e OH• (etapa 4c) e dissipação física (etapa 4d). Os produtos EOR podem reagir com outras moléculas e formar produtos de degradação, chamados de oxidação autossensibilizidos (VAN DOORSLAER et al., 2011). FIGURA 5 Mecanismo das reações na fotólise. Fonte: adaptado de (VAN DOORSLAER et al., 2011) 3.3.2 Fotocatálise heterogênea utilizando TiO2/UV-C Vários estudos sobre a utilização da fotocatálise com TiO2 foram realizados nos últimos anos. Essa tecnologia é utilizada no tratamento de efluentes industriais, domésticos, 27 chorume, na descontaminação do solo, nas emissões gasosas e nas ETAs. A grande vantagem de utilizar o TiO2/UV é que durante o processo não há a geração de subprodutos carcinogênicos, como pode ocorrer na cloração (TAFFAREL, 2007). Entre todos os catalisadores citados, o dióxido de titânio (TiO2) é o catalisador mais comumente utilizado na fotocatálise por reunir as seguintes características: não tóxico, insolubilidade em água, foto-estabilidade, estabilidade química em uma ampla faixa de pH, resistência química e mecânica, possibilidade de ativação pela luz solar (redução dos custos do processo), possibilidade de imobilização, alta atividade catalítica e maior rendimento (NEELAVANNAN; REVATHI; AHMED BASHA, 2007; BUTH, 2009; NAKATA; FUJISHIMA, 2012). O TiO2 possui a propriedade simultânea de atuar como agente oxidante e agente redutor, aumentando o rendimento global do processo. Andreozzi e colaboradores (1999) propuseram os seguintes mecanismos de reações que ocorrem na fotocatálise heterogênea com TiO2, as séries de equações químicas estão apresentadas a seguir: TiO2 EQUAÇÃO 1 UV hBV+ + eBC- As reações de oxidação podem ocorrer entre a lacuna da BV e a água (EQUAÇÃO 2) ou com os íons hidroxila (EQUAÇÃO 2), produzindo radicais hidroxilas. EQUAÇÃO 2 TiO2(h+) + H2Oads TiO2 + •OHads + H+ EQUAÇÃO 3 TiO2(h+) + HOads- TiO2 + •OHads Os radicais hidroxila produzidos reagem rapidamente com a matéria orgânica adsorvida na superfície do catalisador, por elétrons ou por átomos de hidrogênio abstraídos, formando cátions radicais orgânicos ou por reação de adição em sistemas π (ELMOLLA; CHAUDHURI, 2010a). As reações de redução podem ocorrer entre o elétron da BC e o oxigênio, produzindo o íon radical superóxido (O2-•) (EQUAÇÃO 4), o qual pode produzir peróxido de hidrogênio (EQUAÇÃO 5-8); este, por sua vez, produz radicais hidroxilas (EQUAÇÃO 9 e EQUAÇÃO 10). O2 + eBC- O2•- EQUAÇÃO 4 28 O2•- + H+ HO2• + HO2• O2•- + HO2• HO2- +H+ TiO2(e-) + H2O2 H2O2 + O2•- HO2• H2O2 + O2 HO2- + O2 H2O2 TiO2 + HO- + HO• OH• + OH- +O2 EQUAÇÃO 5 EQUAÇÃO 6 EQUAÇÃO 7 EQUAÇÃO 8 EQUAÇÃO 9 EQUAÇÃO 10 Outro caminho possível para a oxidação do substrato adsorvido (RXads) é a oxidação direta por transferência de elétrons, de acordo com a EQUAÇÃO 11. TiO2(h+) + RXads TiO2 + RXads•+ EQUAÇÃO 11 A fonte de energia na fotocatálise é de extrema importância, pois ela deve ser capaz de ativar o semicondutor, sendo assim, para ativar o TiO2, a energia deve ser superior ao potencial de oxidação de 3,2 eV, o que corresponde a um comprimento de onda menor que 386 nm, que é a energia do band gap. Dentre as opções de fonte de energia, pode-se utilizar para a fotoativação do TiO2 a luz solar ou a luz UV (BUTH, 2009). Na FIGURA 6 apresenta o espectro de absorção do TiO2 comparado ao espectro solar. É possível observar que a faixa de absorção da luz solar pelo TiO2 é pequena, indicando que a ativação do catalisador pela luz solar é baixa, comprometendo a fotocatálise. FIGURA 6 Espectro de absorção do TiO2 comparado com o espectro solar. Fonte: adaptado de (ALMEIDA, 2011). 29 A luz UV pode ser dividida em UV-A, UV-B e UV-C, esses tipos de luz UV foram determinados tendo em vista a faixa de comprimento de onda da emissão da energia. A TABELA 3 apresenta os tipos de luz UV e suas respectivas faixas de comprimentos de onda (BUTH, 2009). TABELA 3 Relação entre tipo de radiação e comprimento de onda. Tipo de radiação Faixa de comprimento de onda UV C 100 a 279 nm UV B 280 a 314 nm UV A 315 a 399 nm Fonte: adaptado de (EPA, 2010). A eficiência dos POAs é influenciada por alguns fatores como: a concentração do contaminante orgânico, a presença e concentração de oxidantes auxiliares (H2O2, O3), as propriedades, concentração e forma do TiO2, característica da fonte luminosa, temperatura, pH e a presença de ânions. Um esquema que sintetiza os principais fatores e a maneira como interferem nos processos de fotocatálise estão apresentados na FIGURA 7 (TEIXEIRA; JARDIM, 2004). 30 FIGURA 7 Fatores que influenciam na fotocatálise. Contaminante orgânico • A taxa de oxidação fotocatalítica eleva com o aumento da concentração do substrato, mas ao atingir um valor crítico, a concentração não influencia na taxa de oxidação. • Se o poluente absorve luz UV, ele pode recobrir o TiO2 impedindo que a luz atinja a superfície do catalisador. Catalisador • O desempenho do catalisador varia de acordo com: concentração, área superficial, distribuição uniforme de partículas, forma cristalina (forma anatase é mais ativa). Fonte luminosa • As reações de degradação dependem da intensidade luminosa. Temperatura • A velocidade das reações fotoquímicas não sofre influência da temperatura. pH • As propriedades superficiais do catalisador (carga das partículas, tamanho dos agregados e posições das BC e BV) sofrem alterações com a mudança de pH. Presença de ânios • Determinadas substâncias inibem ou aceleram a velocidade de degradação dos contaminantes. Fonte: (TEIXEIRA; JARDIM, 2004). 3.4 Efeitos ecotoxicológicos Uma questão cada vez mais importante para os órgãos reguladores ambientais é a presença dos fármacos no meio ambiente e os riscos potenciais ao ecossistema que eles 31 podem causar. Os fármacos são sintetizados com o objetivo de produzir ação farmacológica em um local-alvo, sendo necessário possuir uma resistência quanto à inativação antes de exercer o seu efeito. No entanto, estas mesmas propriedades idealizadas para promover o bem ao ser humano ou animais, são paradoxalmente responsáveis pelos efeitos tóxicos em ecossistemas aquáticos e terrestres (FENT; WESTON; CAMINADA, 2006; KÜMMERER, 2009). Organismos que possuem vias metabólicas, receptores ou biomoléculas semelhantes às humanas são expostos a substâncias ativas lançadas ao meio ambiente, podendo induzir a uma toxicidade. Os efeitos tóxicos nos organismos podem ser classificados em efeitos agudos e crônicos. Os efeitos agudos são causados por grandes concentrações do composto com a exposição em um intervalo de tempo curto. Em contrapartida, os efeitos crônicos são causados por baixas concentrações com a exposição em um intervalo de tempo longo (GOODMAN; GILMAN, 2005; FENT; WESTON; CAMINADA, 2006; KUMMERER, 2009a; SANTOS et al., 2010). Testes ecotoxicológicos avaliam os efeitos tóxicos que os fármacos podem provocar na fauna circunvizinha, virtualmente em qualquer nível da hierarquia biológica, ou seja, células, órgãos, organismos, populações, ecossistemas. Geralmente, os testes toxicológicos agudos avaliam as taxas de mortalidade, e os testes crônicos avaliam as modificações que ocorrem ao organismo frente a diferentes concentrações de um composto químico em um período de tempo prolongado (VILLEGAS-NAVARRO; ROSAS-L; REYES, 2003). Villegas-Navarro e colaboradores (2003), realizaram estudos utilizando antihipertensivos em meio aquoso e o crustácio Daphinia magna. Os autores comprovam que anti-hipertensivos presentes na água em baixa concentração por um longo período podem causar problemas no sistema circulatório da Daphinia magna, quando aumenta a concentração do anti-hipertensivo pode levar à morte do crustáceo. Os hormônios sexuais sintéticos presentes em águas superficiais, em baixas concentrações dentro de um espaço de tempo longo, podem induzir a feminização de peixes. Estes compostos promovem a redução da concentração de testosterona, tal resultado é devido aos efeitos que os desreguladores endócrinos causam no desenvolvimento e crescimento gonodal de animais. Este efeito não está limitado somente aos peixes, podendo ocorrer até mesmo em seres humanos (MIMEAULT et al., 2005; VIGLINO et al., 2008). Adicionalmente aos efeitos tóxicos, certas classes de fármacos tais como antibióticos, mesmo em baixas concentrações, podem provocar mudanças irreversíveis em longo prazo no 32 genoma de microrganismos, tornando-os resistentes na sua presença (KLAVARIOTI; MANTZAVINOS; KASSINOS, 2009). Kummerer (2004), estudando corpos d’água que receberam efluentes de esgotos, identificou diferentes classes de antibióticos e cepas de bactérias menos sensíveis aos mesmos. Indicando que a presença de antibióticos no meio aquático está induzindo a seleção de bactérias resistentes. A questão de exposição crônica do homem a estes microcontaminantes é real. Há presença de grupos farmacêuticos, como analgésicos e anticonvulsivantes, em águas potáveis, sendo esta principal rota que expõe seres humanos a estes microcontaminantes. Ainda não se sabe quais os efeitos que a exposição crônica causa à saúde humana, sendo assim, é necessário que haja medidas para evitar a presença destes compostos na água de consumo (IKEHATA; JODEIRI NAGHASHKAR; GAMAL EL-DIN, 2006). A exigência de uma avaliação dos riscos ambientais como pré-requisito para obtenção de uma autorização para comercialização de produtos farmacêuticos veterinários foi requerida, pela primeira vez em 1995, pela Agência Européia de Avaliação dos Medicamentos (EMEA). A diretriz era aplicável apenas para produtos farmacêuticos de uso veterinário, mas, posteriormente, ampliou para os de uso humano. A avaliação do risco ambiental de ambos os produtos é dividida em duas fases. Na Fase I, é estimada a exposição ambiental para o fármaco ou seus metabolitos. E na fase II, compreende a avaliação dos destinos e os efeitos no ambiente, para a execução desta fase, ela é subdividida em duas subfases: a primeira faz-se a avaliação do possível destino e os efeitos; e a segunda, é realizada a avaliação dos efeitos sobre a fauna e flora dentro de compartimentos ambientais que possam ser afetados. Entretanto, os estudos de fase II só são exigidos, se a concentração ambiental prevista em águas superficiais seja igual ou superior a 0,01µg.L-1 (CRANE; WATTS; BOUCARD, 2006; FENT; WESTON; CAMINADA, 2006). Nos Estados Unidos, o órgão regulador Food and Drug Administration (FDA), exige a avaliação ecotoxicidade para os fármacos de uso veterinário, mas para os fármacos de uso humano são necessárias somente se a concentração ambiental dele for superior a 1µgL-1 (CRANE; WATTS; BOUCARD, 2006; FENT; WESTON; CAMINADA, 2006). Os estudos da presença dos fármacos no meio ambiente são numerosos e existentes em todo o mundo. No Brasil são vários grupos de pesquisa dedicados a este assunto,. MOREIRA et al. (2011); RODRIGUES (2012); SANSON (2012); LOPEZ-SERNA et al. (2013), apresentam trabalhos realizados com águas superficiais brasileiras. Entretanto, as avaliações dos riscos ambientais dos fármacos no meio ambiente, ainda são insuficientes, percebe-se essa 33 falta de estudos quando se faz um levantamento dos artigos científicos que são publicados, como será apresentado no próximo item. 3.5 Aplicação A TABELA 4 apresenta uma compilação dos trabalhos que avaliaram a degradação de fármacos e pertubadores endócrinos em diferentes processos oxidativos convencionais e avançados para a remoção de fármacos em diferentes matrizes aquosas. Observa-se que são poucos os estudos que apontaram a formação de subprodutos em conjunto com testes de toxicidade. 34 TABELA 4 Estudos que avaliam a degradação de fármacos perante processos oxidativos convencionais e avançados. Fármaco 17 -estradiol 17 -etinil estradiol 17b-estradiol Acetoaminofeno Ácido oxolínico Amoxicilina Ampicilina Cloração Avaliação de subproduto sim Ozonólise sim água e esgoto HPLC-FLR cultura de célula (ALUM et al., 2004) Cloração sim água e esgoto HPLC-FLR cultura de célula (ALUM et al., 2004) Ozonólise sim água e esgoto HPLC-FLR cultura de célula (ALUM et al., 2004) cloração sim Água LC-ESI-MS estrogenicidade (HU et al., 2003) TiO2/UV sim Água LC–MS Cloração sim Água HPLC-UV Cloração sim água e esgoto LC-UV-MS Foto-fenton sim Água LC–MS TiO2/UV sim Água UV-vis TiO2/UV sim Água IV TiO2/UV sim Água CG-MS (MOCTEZUMA et al., 2012) (MOCTEZUMA et al., 2012) (ZHANG et al., 2008) TiO2/UV não Água HPLC (YANG; YU; RAY, 2008) TiO2/UV sim LC–MS Cloração sim Água água potável e esgoto água supercificial Zn-UV não Água HPLC TiO2/H2O2/UV não Água HPLC TiO2/UV não Água Foto-fenton sim Água água e efluente de tratamento secundário LC-MS-TOF Tratamento Tipo de água Análise química Teste de toxicidade Referência água e esgoto HPLC-FLR cultura de célula (ALUM et al., 2004) (MAI et al., 2008) (PINKSTON; SEDLAK, 2004) (BEDNER; MACCREHAN, 2006) Vibrio fischeri Daphnia magna V. Fisheri HPLC-DAD TiO2/UV-A não HPLC Foto-fenton não Água HPLC Foto-fenton não água HPLC (TROVO et al., 2012) (GIRALDO et al., 2010) (ACERO et al., 2010) (ELMOLLA; CHAUDHURI, 2010a) (ELMOLLA; CHAUDHURI, 2010b) (MAI et al., 2008) D. magna (TROVO et al., 2011) (DIMITRAKOPOULOU et al., 2012) (ELMOLLA; CHAUDHURI, 2009) (ELMOLLA; CHAUDHURI, 2009) 35 Tratamento Avaliação de subproduto Tipo de água Análise química Zn-UV não Água HPLC TiO2/H2O2/UV não Água HPLC Cloração sim Água HPLC-UV TiO2/UV não Água UV-A/TiO2 não Benzafibrato TiO2/UV Captopril Fármaco Atenolol Carbamazepina Cetoprofeno Cimetidina Ciprofloxacino Teste de toxicidade Referência HPLC D. magna (ELMOLLA; CHAUDHURI, 2010a) (ELMOLLA; CHAUDHURI, 2010b) (PINKSTON; SEDLAK, 2004) (IOANNOU et al., 2011) Água UV–Vis D. magna sim Água LC–TOF–MS Fotólise sim Água LC–UV–MS/MSIT Fotólise/UV sim Água TiO2/UV não Água Ozonólise não água e rio H2O2/UV sim Água HPLC e GC/MS Cloração sim Água HPLC-UV Cloração sim água e esgoto LC-MS Cloração sim água e esgoto RMN-H Cloração sim água e esgoto IV Ozonólise sim Água LC–MS H2O2 sim Água LC–MS TiO2/UV-A e UV-C não Água HPLC-DAD TiO2/UV sim Água LC-MS/MS Foto-Fenton não Água HPLC Zn-UV não Água HPLC V. fischeri P. subcapitata D. magna Cloxacilina (HAPESHI et al., 2010) (LAMBROPOULOU et al., 2008) (MAHMOUD; KUMMERER, 2012) (DONNER et al., 2013) (MAI et al., 2008) (ANDREOZZIA et al., 2002) (VOGNA et al., 2004a) (PINKSTON; SEDLAK, 2004) (BUTH; ARNOLD; MCNEILL, 2007) (BUTH; ARNOLD; MCNEILL, 2007) (BUTH; ARNOLD; MCNEILL, 2007) (DE WITTE et al., 2009) (DE WITTE et al., 2009) (VAN DOORSLAER et al., 2011) An, 2010 (ELMOLLA; CHAUDHURI, 2009) (ELMOLLA; CHAUDHURI, 2010a) 36 Fármaco Diclofenaco de sódio Fenacetina Tratamento Avaliação de subproduto Tipo de água Análise química TiO2/H2O2/UV não Água HPLC TiO2/UV sim Água LC-MS V. fischeri TiO2/UV sim Água LC-MS V. fischeri TiO2/UV não Água UV Ozonólise não água e esgoto HPLC TiO2/O3/UV-A não água e esgoto HPLC TiO2/UV não Esgoto UV Ozonólise sim Água HPLC (VOGNA et al., 2004b) H2O2/UV sim Água HPLC (VOGNA et al., 2004b) Ozonólise sim Água CG-MS (VOGNA et al., 2004b) H2O2/UV sim Água CG-MS (VOGNA et al., 2004b) Fotólise não água, lago, esgoto (BAEZA; KNAPPE, 2011) H2O2/UV não água, lago, esgoto (BAEZA; KNAPPE, 2011) TiO2/UV-A não Cloração sim Água água potável e esgoto água supercificial Fenton sim Água LC-MS-qTOF Foto-fenton sim Água LC-MS-qTOF TiO2/UV sim Água LC-MS-qTOF TiO2/UV/H2O2 sim Água LC-MS-qTOF TiO2/UV sim Água HPLC-UV VIS (RODRIGUES-SILVA et al., 2013a) (RODRIGUES-SILVA et al., 2013a) (RODRIGUES-SILVA et al., 2013b) (RODRIGUES-SILVA et al., 2013b) (YURDAKAL et al., 2007) TiO2/UV sim Água CG-MS (YURDAKAL et al., 2007) UV-Vis HPLC-DAD Flumequina Genfibrozila Teste de toxicidade D. magna Artemia salina P. subcapitata D. magna D. magna D. magna P. subcapitata Lepidium sativum D. magna Referência (ELMOLLA; CHAUDHURI, 2010b) (CALZA et al., 2006) (MENDEZ-ARRIAGA; ESPLUGAS; GIMENEZ, 2008) (RIZZO et al., 2009) (AGUINACO et al., 2012) (AGUINACO et al., 2012) (RIZZO et al., 2009) Achilleos, 2010 (ACERO et al., 2010) 37 Fármaco Ibupronefo Indometacina Tratamento Avaliação de subproduto Tipo de água Análise química Cloração sim Água HPLC-UV Cloração sim Água HPLC-UV TiO2/UV sim Água LC-MS Ultrason não Esgoto UV TiO2/UV-C e UV-A sim Água LC-MS-IT-TOF Cloração sim Água HPLC-UV TiO2/UV-C não Água HPLC Ozonólise não Água HPLC Cloração sim Água HPLC-UV Cloração sim TiO2/UV sim água potável e esgoto água supercificial Água TiO2/UV sim Fotólise/UV Teste de toxicidade V. fischeri A. salina Levofloxacino Metoprolol HPLC-DAD Referência (PINKSTON; SEDLAK, 2004) (PINKSTON; SEDLAK, 2004) (MENDEZ-ARRIAGA; ESPLUGAS; GIMENEZ, 2008) (MENDEZ-ARRIAGA et al., 2008) (DA SILVA et al., 2014) (PINKSTON; SEDLAK, 2004) (NASUHOGLU et al., 2012) (NASUHOGLU et al., 2012) (PINKSTON; SEDLAK, 2004) (ACERO et al., 2010) LC-ESI-MS V. fischeri (ROMERO et al., 2011) Água LC-MSD-TOF V. fischeri não Água HPLC-DAD UV/H2O2 não Água HPLC-DAD H2O2/Fe2+ não Água HPLC-DAD UV/H2O2/Fe2+ não Água HPLC-DAD TiO2/UV-A e UV-C não Água HPLC-DAD TiO2/UV-A não Água HPLC-DAD Nadolol Cloração sim Água HPLC-UV Naproxeno Cloração sim Água HPLC-UV (ROMERO et al., 2011) (SHEMER; KUNUKCU; LINDEN, 2006) (SHEMER; KUNUKCU; LINDEN, 2006) (SHEMER; KUNUKCU; LINDEN, 2006) (SHEMER; KUNUKCU; LINDEN, 2006) (VAN DOORSLAER et al., 2011) (VAN DOORSLAER et al., 2012) (PINKSTON; SEDLAK, 2004) (PINKSTON; SEDLAK, 2004) Metronidazol Moxifloxacino 38 Fármaco Tratamento Avaliação de subproduto Tipo de água Análise química Cloração sim água potável e esgoto água supercificial HPLC-DAD TiO2/UV sim Água LC-MS Teste de toxicidade Referência (ACERO et al., 2010) V. fischeri (MENDEZ-ARRIAGA; ESPLUGAS; GIMENEZ, 2008) não Esgoto UPLC-MS/MS UV-A/TiO2 TiO2/ Luz solar e Luz solar artificial não Água UV–Vis Sorghum saccharatum L. sativum Sinapis alba D. magna D. magna sim Água HPLC-DAD V. fischeri Cloração sim Água HPLC-UV fotólise não Água TiO2/UV não Água TiO2/UV não Água HPLC D. magna (PINKSTON; SEDLAK, 2004) (DE LA CRUZ et al., 2013) (DE LA CRUZ et al., 2013) (IOANNOU et al., 2011) TiO2/UV sim Água LC-ESI-MS V. fischeri (ROMERO et al., 2011) TiO2/UV sim Água LC-MSD-TOF V. fischeri (ROMERO et al., 2011) Salbutamol TiO2/UV sim Água LC-MS V. fischeri (SAKKAS et al., 2007) sulfaclorpiridazina TiO2/UV sim Água LC-MS/MS Fotólise não água, lago, esgoto (BAEZA; KNAPPE, 2011) H2O2/UV não água, lago, esgoto (BAEZA; KNAPPE, 2011) Fotólise não água, lago, esgoto (BAEZA; KNAPPE, 2011) Fotólise não água, lago, esgoto (BAEZA; KNAPPE, 2011) H2O2/UV não água, lago, esgoto (BAEZA; KNAPPE, 2011) Ozonólise sim Água CG-MS Sulfapiridina TiO2/UV sim Água LC-MS/MS Sulfisoxazol TiO2/UV sim Água LC-MS-MS (YANG et al., 2010) Tamoxifeno TiO2/UV sim Água HPLC-UV-VIS (YURDAKAL et al., 2007) Ofloxacino Oxitetraciclina Propranolol Sulfadiazina Sulfametoxazol Foto-fenton/luz solar Chlorella vulgaris (MICHAEL et al., 2012a) (HAPESHI et al., 2010) (PEREIRA et al., 2011a) (YANG et al., 2010) cultura de célula (YARGEAU et al., 2008) (YANG et al., 2010) 39 Fármaco Tetraciclina Trimetropina TiO2/UV Avaliação de subproduto sim TiO2/UV não Água Cloração sim Água Tratamento Tipo de água Análise química Água CG-MS Teste de toxicidade Referência (YURDAKAL et al., 2007) (REYES et al., 2006) LC-MS (DODD; HUANG, 2007) S. saccharatum L. sativum S. alba D. magna Foto-fenton/luz solar não Esgoto Fotólise não água, lago, esgoto (BAEZA; KNAPPE, 2011) H2O2/UV não (BAEZA; KNAPPE, 2011) Solar Fenton sim Fotólise sim TiO2/ luz solar sim água, lago, esgoto água, simulação de água doce e esgoto e efluente água e simulação de água do mar água e simulação de água do mar UPLC-MS/MS (MICHAEL et al., 2012a) UPLC-MS-qTOF V. fischeri (MICHAEL et al., 2012b) LC-MS-TOF V. fischeri (SIRTORI et al., 2010) LC-MS-TOF V. fischeri (SIRTORI et al., 2010) 40 3.6 Captopril 3.6.1 Farmacologia e farmacodinâmica O Captopril (CPT) é um fármaco anti-hipertensivo que diminui a pressão arterial atuando na inibição da enzima conversora de angiotensina (ECA). É empregado na terapêutica em esquemas de monoterapia ou em associações para o tratamento de pacientes com hipertensão arterial na terapia anti-hipertensiva e também no tratamento da insuficiência cardíaca, infarto do miocárdio e nefropatia diabética (MARCATTO et al., 2005; AZEVEDO; RIBEIRO; ARAÚJO, 2008; SOARES et al., 2012). No mercado nacional, o captopril se apresenta na forma farmacêutica encapsulada e comprimidos. As concentrações mais usuais são 12,5, 25 e 50 mg por comprimido, sendo que a dose diária máxima durante o tratamento pode ser de até 450 mg de CPT por dia (AZEVEDO; RIBEIRO; ARAÚJO, 2008). De todo o CPT administrado de modo oral, cerca de 68 a 76% são absorvidos pelo trato gastrointestinal. A eliminação do captopril é realizada principalmente pela via renal, sendo que no período de 24 horas, mais de 95% da dose absorvida e eliminada pela urina, cerca de 40 a 50% na forma inalterada e o restante na forma de dímero de dissulfeto de captopril e dissulfeto de captopril-cisteína (AZEVEDO; RIBEIRO; ARAÚJO, 2008; MAHMOUD; KUMMERER, 2012). 3.6.2 Farmacovigilância O uso do CPT no tratamento de hipertensão pela população é extenso. Vários artigos foram publicados atualmente apresentando a frequência do uso deste medicamento no Brasil. Um estudo verificou que 25,7% dos pacientes internados em um hospital universitário, no primeiro semestre de 2005, tiveram prescrição do CPT precedendo a elevação da pressão arterial (OLIVEIRA et al., 2008). Silva e colaboradores (2007) avaliaram o perfil do tratamento da insuficiência cardíaca no ambulatório de Insuficiência Cardíaca e Transplante do Instituto do Coração, do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O resultado obtido foi próximo do preconizado pelas diretrizes, aproximadamente 95% dos pacientes recebem inibidor de IECA (captopril ou enalapril). Em uma avaliação dos principais fármacos utilizados no tratamento da hipertensão no Centro de Saúde de Rincão, durante período de outubro a dezembro de 2007, o CPT tinha 41 prevalência de 42% dos prontuários em paciente de monoterapia e houve predominância a associação de CPT e hidroclorotiazida em 30% das prescrições avaliadas, seguida da associação de furosemida e CPT em 12% das prescrições (VERONEZ; SIMÕES, 2008). Outro estudo indicou que 25% dos idosos da Unidade Municipal de Saúde de Jaú-SP fazem uso de anti-hipertensivos. Dentre os anti-hipertensivos com maior ocorrência estão os inibidores da enzima conversora de angiotensina (IECA) com prevalência de 11,15%, sendo que CPT é um dos princípios ativos encontrados (SIMÕES; MARQUES, 2005). 3.6.3 Características físico-químicas Captopril (S)-1-(3-mercapto-2-metil-1-oxopropil)-1-prolina) é o nome químico do captopril (FIGURA 8). As propriedades físico-químicas deste fármaco estão expressas na TABELA 5. O CPT apresenta elevada susceptibilidade à degradação oxidativa (MARCATTO et al., 2005; INMETRO, 2012; MAHMOUD; KUMMERER, 2012). FIGURA 8 Estrutura química do captopril. TABELA 5 Propriedades físico-químicas do captopril. Fórmula molecular Peso molecular C9H15NO3S (captopril); C18H28N2O6S2 (dissulfeto) 217,0774g/mol (captopril) 432,5576g/mol (dissulfeto) Forma e cor Pó cristalino branco Odor Ligeiro odor de ácido sulfidrila Ponto de fusão 103-104ºC Constantes de dissociação pKa1= 3,7; pKa2= 9,8 Coeficiente octanol/água (log KOW) 0,34 Solubilidade Sol vel em água (160 mg/L), acetonitrila, metanol, etanol, cloreto de metileno, moderadamente solúvel em clorofórmio, acetato de etila Fonte: (INMETRO, 2012; MEDICINE, 2014). 42 A degradação é promovida pela elevada temperatura e umidade, com formação de quantidades crescentes do dímero, dissulfeto de captopril. Esta degradação se intensifica com o pH>4 através de um complexo mecanismo, envolvendo a função tiol (Erro! Autoreferência de indicador não válida.), portanto as soluções aquosas deste fármaco devem ser analisadas imediatamente após preparo (MARCATTO et al., 2005; INMETRO, 2012; MAHMOUD; KUMMERER, 2012). FIGURA 9 Oxidação do captopril a dissulfeto de captopril. O espectro de absorção do CPT em meio aquoso (FIGURA 10), realizado entre as faixas de 190 a 250 nm, mostra que há um pico no comprimento de onda máximo de 200 nm, indicando que o CPT é capaz de absorver energia na faia do UV. Comparando com a TABELA 3, a qual está descrito os comprimentos emitidos pelos diferentes tipos de luz UV, percebe-se que lâmpada UV-C emite energia entre 100 a 279 nm, comprimentos de onda compatível com a faixa de absorção do CPT. FIGURA 10 Espectro de absorção de uma solução aquosa de captopril (10mgL-1). Absorbância 0.15 0.10 0.05 0.00 190 200 210 220 230 Comprimento de onda 240 250 43 3.6.4 Informações ecológicas e toxicológicas Os componentes da formulação e seus produtos de degradação são potencialmente tóxicos para o meio ambiente. Sendo assim, não devem ser descartados na rede de esgoto, em coleções de água ou no solo. A persistência do CPT em coleções de água e solo é baixa e sua mobilidade no solo é média, apresentando potencial de bioacumulação baixo (INMETRO, 2012). Quanto aos dados toxicológicos, o CPT possui poder teratogênico em humanos, pois é capaz de atravessar a barreira placentária, e no período de lactação se apresenta no leite materno. Quanto à carcinogenicidade, não está listado como substância carcinogênica pela American Conference of Industrial Hygienists (ACGIH), International Agency for Research on Cancer (IARC), National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH), National Toxicology Program (NTP) ou Occupational Safety and Health Administration (OSHA). Os dados de mutagenicidade não estão disponíveis (INMETRO, 2012). 3.6.5 Presença no meio ambiente Na área ambiental, o CPT é um fármaco muito pouco estudado. Relatos de sua presença em água só foram divulgados por Salgado e colaboradores (2012). Estes autores monitoraram 65 fármacos, dentre estes o CPT, em cinco estações de tratamento de esgoto em Portugal, em duas campanhas. Analisando o afluente da estação, dentre as 10 amostragens, em 5 foram encontrados o CPT, concentração máxima de 32 ± 2 ng.L-1, analisando o efluente da estação, dentre as 9 amostragens, em 1 foi encontrado na concentração de 1,376 ± 56 ng.L-1 (SALGADO et al., 2010). 3.7 Fundamentos das técnicas envolvidas 3.7.1 Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas de Ala Resolução A análise de fármacos em amostras ambientais exige a utilização de técnicas analíticas mais sofisticadas pelo fato destes compostos, muitas vezes, estarem em misturas complexas e em baixas concentrações. Sendo assim, os métodos para estas análises precisam ser capazes 44 de separar, identificar e quantificar os compostos químicos com alta sensibilidade e especificidade (FATTA-KASSINOS; MERIC; NIKOLAOU, 2011). A espectrometria de massas (do inglês mass spectrometry - MS) acoplado à cromatografia líquida (do inglês liquid chromatography – LC) é uma técnica analítica de alta sensibilidade e seletividade, considerado um dos métodos instrumentais mais qualificados para análises de amostras ambientais (BARCELÓ; ELJARRAT; PETROVIC, 2005; DALMÁZIO et al., 2005; KASPRZYK-HORDERN; DINSDALE; GUWY, 2008a). Basicamente, a análise através da MS consiste na geração de íons com base em compostos (orgânicos ou inorgânicos) por meio de um método de ionização apropriado. Em seguida, os íons são separados por meio de sua relação massa/carga (m/z) em um analisador de massas e detectados qualitativamente e ou quantitativamente por meio de um detector. O sinal elétrico é coletado em função da razão m/z, e convertido por um processador de dados, o qual gera o espectro de massas correspondente (FIGURA 11) (HOFFMANN; STROOBANT, 2007). FIGURA 11 Componentes de um Espectrômetro de massas. Fonte: adaptado de (HOFFMANN; STROOBANT, 2007). Através da determinação precisa da razão massa/carga dos analitos, a espectrometria de massas é capaz de fornecer informação sobre: (i) a composição elementar de amostras; (ii) a estrutura molecular; (iii) a composição qualitativa e quantitativa de misturas complexas; (iv) a estrutura e a composição de superfícies sólidas e as proporções isotópicas de átomos em amostras (ARDREY, 2003) Existe uma grande variedade de técnicas de ionização (FIGURA 12), cuja escolha deve levar em conta as propriedades físico-químicas do analito e a energia transferida durante o processo de ionização (HOFFMANN; STROOBANT, 2007). 45 FIGURA 12 Técnicas de ionização. Fase Gasosa •Ionização por elétrons (EI -Electron Ionization) •Ionização Química (CI – Chemical Ionization) Fase Líquida •Ionização por Electrospray (ESI) •Ionização Química a Pressão Atmosférica (APCI – Atmospheric Pressure Chemical Ionization) •Fotoionização em pressão atmosférica (APPI) •Thermospray •Plasma iduticamente acoplado (ICP) Fase Sólida •Ionização e Dessorção por Laser Assistida por Matriz (MALDI – Matrix Assited Laser Dessorption Ionization) •Íons Secundários (SI – Secondary Ions) •Dessorção por Plasma (PD – Plasm Dessorption) •DESI •DART Fonte: (HOFFMANN; STROOBANT, 2007) Os tipos de analisadores mais utilizados são: quadrupolos (Q), armadilha de íons (Íon Trap), tempo de vôo (TOF – Time of Flight), setor elétrico (E) e setor magnético (B), ressonância ciclotrônica de íons com Transformada de Fourier (FT-ICR – Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance) e configurações híbridas, por exemplo, IT-TOF (HOFFMANN; STROOBANT, 2007). A ESI é técnica de ionização mais utilizada para análise de substâncias polares e determinação de produtos de degradação em matrizes complexas (DALMÁZIO et al., 2005; KASPRZYK-HORDERN; DINSDALE; GUWY, 2008b; NARAYANAM et al., 2014). Na ESI, o analito de interesse contido na fase móvel, passa através de um capilar de metal extremamente fino, na pressão atmosférica, sob alta tensão (geralmente entre 3 a 5kV para a produção de íons positivos, e entre - 2,5 a -3,5 kV para a produção de íons negativos). Na saída do capilar são formadas aerossóis de microgotas carregadas, que são dessolvatadas por um fluxo contínuo de gás seco (geralmente N2). À medida que ocorre a dessolvatação, o tamanho das gotas é reduzido e a densidade de carga da superfície da molécula aumenta até o 46 momento em que as forças repulsivas de Coulomb, entre as cargas superficiais, exceder as tensões superficiais, levando às divisões consecutivas das microgotas iniciais. As reações de transferência de cargas acontecem ainda em meio líquido, na superfície das gotículas. As transferências destes íons para a fase gasosa no ESI são explicadas pelos modelos de íonevaporação, modelo de carga residual ou pelo modelo eletroquímico, entretanto, espera-se que todos estes processos de transferência de íons para a fase vapor acontecem concomitantemente, dependendo do analito e das condições operacionais da fonte de ionização (FIGURA 13) (KOSTIAINEN; KAUPPILA, 2009; RODRIGUES, 2012). FIGURA 13 Esquema de ionização por ESI. Fonte: (RODRIGUES, 2012). Este método de ionização é considerado de baixa energia, pois envolve reações de transferência de cargas, pela protonação e desprotonação ainda em fase líquida. Sendo assim, consegue formar íons dos analitos com elevada estabilidade, sem induzir a fragmentações ou degradação térmica dos analitos. É possível produzir, também, íons com múltiplas cargas, dependendo das massas moleculares dos analitos (BARCELÓ; ELJARRAT; PETROVIC, 2005; NARAYANAM et al., 2014). Vários analisadores híbridos foram propostos. Um exemplo de analisador híbrido é a configuração IT-TOF. O IT é usado para acumular íons e selecioná-los, além de realizar fragmentações antes de passar para o TOF. O TOF é utilizado para a análise de massas. Com esta configuração (FIGURA 14), é possível obter alta exatidão de massa e alta resolução (10.000 FWHM a 1000 m/z) em todos os modos MS (HOFFMANN; STROOBANT, 2007; SHIMADZU, 2012). 47 FIGURA 14 Configuração do híbrido IT-TOF. Fonte: adaptado de (SHIMADZU, 2012) 3.7.2 Carbono Orgânico Total – COT A diminuição da concentração de carbono orgânico total (COT) presente na água é um parâmetro que avalia a eficiência de um sistema de tratamento. O COT fornece quantitativamente a soma de todos os carbonos ligados organicamente em espécies orgânicas dissolvidas e não dissolvidas. Portanto, o monitoramento a concentração do COT na água em tratamento revela o quanto de matéria orgânica foi removida, isto é, se ocorreu mineralização da matéria orgânica ou somente transformou a matéria orgânica em outra mais fragmentada (BELTRÁN; AGUINACO; GARCÍA-ARAYA, 2010). O carbono está presente na amostra em duas formas: carbono inorgânico (CI) e carbono orgânico (CO). Os CI são os minerais, dióxido de carbono, ácido carbônico e suas espécies dissociadas. Resíduos de animais, plantas, micro-organismos em diferentes estados de decomposição, substâncias húmicas e microcontaminantes são considerados a fração orgânica, o CO da amostra. Podem-se classificar os tipos de método para determinação do carbono orgânico total em direto e indireto. Em geral as metodologias têm o mesmo princípio: converter todas as diferentes formas de carbono em uma forma simples, dióxido de carbono, que é mais facilmente quantificado. No método direto, remove o CI por um tratamento ácido e mede-se o CO2, e depois, com outra alíquota da amostra faz a medição do carbono total (CT). No método indireto, o CT é medido através da oxidação de todo o carbono presente, e o CI é medido na purga do gás do tratamento ácido ou por decomposição após a eliminação do CO 2, o COT é obtido através de uma subtração matemática: o COT é igual ao CT menos o CI 48 contido na amostra (BISUTTI; HILKE; RAESSLER, 2004; VISCO; CAMPANELLA; NOBILI, 2005). 3.7.3 Teste de ecotoxicidade 3.7.3.1 Artemia salina A Artemia salina (FIGURA 15) é um micro crustáceo encontrado em águas salgadas (TABELA 6), mas é utilizada como alimento vivo para peixes ornamentais. Em laboratórios a A. salina tem sido largamente utilizada como organismo bioindicador em testes de toxicidade aguda (KOUTSAFTIS; AOYAMA, 2007; PIMENTEL et al., 2011). FIGURA 15 Artemia salina. Fonte: (NATUREPHOTO-CZ, 2010). Os testes de toxicidade aguda têm como objetivo avaliar a sobrevida de indivíduos expostos a um agente ou amostra a ser analisada, por um determinado período de tempo. A A. salina tem demonstrado razoável aceitabilidade, pois seu grau de tolerância em relação a um fator ambiental é reduzido e específico, de modo que a letalidade desse organismo é utilizada para identificação de respostas biológicas, onde as variáveis como a morte ou vida são as únicas envolvidas. Além da sensibilidade a vantagem de se utilizar a A. salina é decorrente ao baixo custo, rapidez e ser de fácil manuseio. A determinação da toxicidade é realizada através do percentual de mortalidade dos crustáceos (MEYER et al., 1982; KOUTSAFTIS; AOYAMA, 2007; PIMENTEL et al., 2011). 49 TABELA 6 Classificação científica da Artemia salina. Classificação científica Reino Animalia Filo Arthropoda Subfilo Crustacea Classe Branchiopoda Ordem Anostraca Família Artemiidae Gênero Artemia Fonte: adaptado de (PIMENTEL et al., 2011). 3.7.3.2 Teste de Ames O teste de Ames foi desenvolvido por Bruce Ames e colaboradores na década de 1970. O teste emprega cepas de Salmonella typhimurium derivadas da linhagem parental LT2 dependente de histidina, apresentando diferentes mutações no operon deste aminoácido. Estas cepas foram especialmente construídas para detectar mutações do tipo deslocamento de quadro de leitura ou substituição de pares de base (MARON; AMES, 1983). O princípio do teste se baseia na incapacidade destas cepas de sintetizar o aminoácido histidina (histidina dependentes), consequentemente, as cepas são incapazes de crescerem e formarem colônias na ausência deste aminoácido. Novas mutações no local dessas préexistentes, ou nas proximidades dos genes, podem restaurar a função do gene e permitir que as células sintetizem histidina, podendo crescer na ausência de histidina e formar colônias. Por esta razão, o teste é muitas vezes referido como um “ensaio de reversão". A frequência de reversão é medida pela contagem de colônias que crescem no meio mínimo após a exposição de uma população de células a um agente mutagênico. Os agentes mutagênicos podem ser divididos em mutágenos diretos ou indiretos (promutágenos). Os mutágenos diretos possuem ação diretamente no DNA, já os mutágenos indiretos são substâncias que não tem ação "per se" sobre o DNA, entretanto quando metabolizados no organismo, são convertidas em compostos altamente reativos com o DNA. As cepas mais utilizadas para a realização do teste de Ames são as cepas TA100 e TA98. A cepa TA100 detecta mutágenos que causam substituição de pares de bases, enquanto que a TA98 detecta mutágenos que causam deslocamento do quadro de leitura do DNA. Apesar das linhagens bacterianas utilizadas no teste de Ames não apresentarem enzimas de metabolização, ainda é possível detectar agentes mutágenos indiretos por este teste. Para agentes mutágenos indiretos é necessário incluir homogenados de fígado de mamíferos, por exemplo, de ratos, este homogenado é denomidade de mistura S9. Em alguns 50 casos o sistema de metabolização pode inativar compostos mutagênicos, contudo é necessário realizar o teste na presença e na ausência da mistura S9 (MARON; AMES, 1983). O teste de Ames é o principal teste empregado na avaliação de mutagenicidade de produtos químicos puros, de amostras atmosféricas e de amostras ambientais líquidas, tanto efluentes industriais como de corpos d'água que os recebem, além de água tratada. Nos Estados Unidos da America o teste de Ames é bastante difundido. Desde 1989, a agência de proteção ambiental USEPA (United States Environmental Protectuin Agency) inseriu em seu programa "Clean Water Act" o procedimento para análise de poluentes utilizando o teste de Ames. No estado de Nova Jérsia, é necessário realizar o teste de Ames nos efluentes industriais para a obtenção da licença de funcionamento e instalação das indústrias (FERRAZ, 2008). No Brasil, a Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB) incluiu o teste de Ames na rede de monitoramente de suas águas, com o intuito de avaliar a qualidade das águas, quanto à atividade genotóxica de determinadas classes de compostos presentes nas amostras coletadas (CETESB, 2014). No estado do Rio Grande do Sul, a Resolução Consema nº 129/2006 exige a realização do teste de Ames nos efluentes líquidos lançados em águas superficiais do estado (BRASIL, 2006). A mutagenicidade pode ser determinada através da razão de mutagenicidade (RM) para cada dose analisada. O RM é a média do número de revertentes da placa teste (mutação espontânea e induzida) dividido pela média do número de revertentes por placa de controle negativo (mutação espontânea). Considera-se uma amostra como positiva quando o RM for maior ou igual a dois em pelo menos uma das doses ensaiadas. Quando o RM não atingir o valor dois, mas a amostra apresenta uma relação linear entre as doses e o número de revertantes por placa (ou vice-versa), considera-se que a amostra apresenta indícios de mutagenicidade (VALENT, 1990). 51 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Limpeza de vidrarias As vidrarias utilizadas no desenvolvimento desta pesquisa foram submetidas a um processo de limpeza criterioso com o intuito de evitar contaminação da amostra com outras substâncias. As vidrarias foram lavadas duas vezes com Extram® (2,5%) e posteriormente enxaguadas exaustivamente com água corrente e, em seguida, enxaguadas com quantidade suficiente de água ultrapura para retirar os vestígios de água de torneira. Após esta etapa, todas as vidrarias foram mantidas imersas em solução de ácido nítrico 20% durante 24 horas ou ultrassonificadas por 60 minutos. Em sequência foi realizado um enxágue com água ultrapura até a completa remoção do ácido nítrico e finalmente as vidrarias foram secas em estufa a 60 °C e, quando volumétricas, secas ao ar, e somente os frascos utilizados para análise de carbono orgânico total ficaram na estufa a 250°C por 4 horas. 4.2 Reagentes e consumíveis Água ultra-pura foi adquirida através de um sistema de troca iônica (TKA Wasseraufbereitungssysteme®, Alemanha). A acetonitrila (J. T. Baker®) e ácido fórmico 88% (J. T. Baker®) grau HPLC, dióxido de titânio anatase (Quimesp®), captopril (Pharma Nostra®). 4.3 Ensaios de Fotodegradação Para avaliar a degradação do fármaco perante fotocatálise heterogênea com TiO2 suspenso, foram realizados ensaios de fotólise, hidrólise e adsorção e dessorção do fármaco. Isto com a finalidade de comparar os processos e subtrair a ação de cada processo isoladamente na fotocatálise heterogênea. Os quatros ensaios foram realizados concomitantemente (FIGURA 17) conduzidos no equipamento Jartest da marca Nova Ética®, modelo 218-6 LDB. Foram necessárias algumas adaptações para a execução dos experimentos: (i) as cubas de acrílico do equipamento foram substituídas por cubas de material de vidro para evitar a adsorção do fármaco; (ii) durante os ensaios foi acoplado um phmetro para acompanhar constantemente do pH durante as oxidações químicas; (iii) nos ensaios da fotocatálise e fotólise foram adaptados na cuba 52 lâmpadas ultravioletas germicidas (PL-S, Philips®) com potência nominal de 9W (potência total de 27 W), que emitem luz no comprimento de onda na faixa de 100 a 279 nm (UV-C). A FIGURA 16 mostra um esquema simplificado que apresenta os quatro ensaios realizados simultaneamente no sistema de degradação, e a FIGURA 17 mostra o sistema real do Jartest adaptado para os ensaios. FIGURA 16 Ensaios envolvidos com a fotocatálise. FIGURA 17 Sistema Jartest adaptado para os ensaios. A fotocatálise heterogênea é caracterizada por possuir uma fonte de radiação capaz de excitar um catalisador sólido do meio produzindo radicais hidroxilas, degradando a matéria 53 orgânica. Dessa forma, foi proposta a utilização de três lâmpadas fluorescentes e o catalisador TiO2 na forma de suspensão na solução a ser tratada fotocataliticamente. A fotólise se constitui pela emissão de radiação da luz UV na solução de fármaco. Portanto se propôs a utilização da radiação idêntica ao da fotocatálise heterogênea, três lâmpadas fluorescentes. A hidrólise ocorreu somente com a agitação da solução do fármaco no aparelho de Jartest, sem a adição do catalisador e na ausência da fonte de emissão de radiação. Por sua vez, o ensaio de adsorção/dessorção foi proposto para verificar se o catalisador adsorve o fármaco da solução. Sendo assim, adicionou-se o catalisador em condições idênticas à fotocatálise à solução de fármaco na ausência de luz UV-C. As cubas onde foram realizados os experimentos que utilizam a luz UV-C foram revestidas externamente com material refletivo (folha de alumínio), para garantir que irradiação aplicada não se dissipasse para o meio. As demais cubas foram revestidas com material opaco para não permitir a entrada da irradiação externa. Os experimentos foram realizados utilizando concentrações iniciais de 10 mg.L-1 do fármaco captopril. Embora essa concentração seja superior àquelas encontradas no meio ambiente, ela foi adotada para realizar a análise de caracterização molecular, dispensando os procedimentos de preparo das amostras, além de permitir a identificação dos subprodutos formados em baixas concentrações. As soluções de fármacos foram preparadas separadamente em suas respectivas cubas no Jartest (2000 mL). Em razão do captopril ser muito solúvel em água, as soluções ficaram sob agitação por 20 minutos antes de iniciar os ensaios. Após esse tempo adicionou-se TiO2 (concentração final de 120 mg.L-1) nas cubas da fotocatálise e da adsorção/dessorção. Após esta adição, agitou-se por mais 10 minutos para a homogeneização da suspensão. Durante os testes de degradação o Jartest esteve em operação com uma rotação de 250 rpm. Os ensaios foram realizados à temperatura ambiente de 22 ± 1 °C, durante um período de 2 horas, e as amostras foram coletadas em frascos de vidro âmbar nos tempos de 0, 5, 10, 15, 30, 60 e 120 minutos. TABELA 7 é o protocolo seguido para a realização do processo oxidativo. 54 TABELA 7 Protocolo da fotodegradação. Tempo (min) - 30 -10 0 5 10 15 30 60 120 Procedimento Adição de fármaco e água Adição de TiO2 nas cubas de fotocatálise e adsorção e dessorção Início dos ensaios /Ligar as lâmpadas /Coletar ponto 0 Coletar ponto 1 Coletar ponto 2 Coletar ponto 3 Coletar ponto 4 Coletar ponto 5 Coletar ponto 6 As alíquotas coletadas referentes aos experimentos de fotocatálise heterogênea e adsorção/dessorção foram centrifugadas a 5000 rpm por 30 minutos (centrífuga excelsa baby I® modelo 206 - Fanem, São Paulo - Brasil), para a remoção do catalisador TiO2, o sobrenadante foi recuperado e armazenado. Após a oxidação as amostras foram prontamente analisadas. 4.4 Determinações analíticas 4.4.1 Espectrometria de Massas As determinações e as análises semi-quantitativas do fármaco, bem como seus subprodutos, formados nos processos oxidativos, foram realizadas por espectrometria de massas e cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas (Ultra Performance Liquid Cromatograph/ Mass Spectrometry, UPLC/MS) (FIGURA 18). O espectrômetro de massas (Shimadzu®, LC/IT/TOF) possui dois analisadores de massa em série. O primeiro é a armadilha de íons (IT), e o segundo é o tempo de vôo (TOF), que confere alta sensibilidade e resolução na obtenção de espectros. A interface entre o UPLC e o espectrômetro de massas consiste em uma fonte de ionização por electrospray operada no modo negativo (-3,5 kV) e no modo positivo (+4,5kV) simultaneamente. Utilizando-se fluxo de gás de nebulização (N2) constante a 1,5 L.min-1, pressão do gás de secagem (N2) igual a 130 kPa e temperatura do CDL (curved dessolvation line) igual a 200°C. 55 FIGURA 18 Cromatógrafo líquido acoplado ao espectrômetro de massas - LC-MS-IT-TOF (Shimadzu). Foram realizados dois métodos de análise no espectrômetro de massas, o primeiro método consistiu na injeção direta ESI-MS das amostras no espectrômetro de massas e o segundo utilizou-se o sistema cromatográfico. Os dois métodos estão descritos detalhadamente a baixo. 4.4.1.1 Injeção direta ESI-MS As amostras foram introduzidas diretamente na fonte ESI através do amostrador automático do UPLC. Foi injetado um volume total de 8 µL de amostra, em um fluxo de 0,2 mL.min-1 de acetonitrila com ácido fórmico 0,1%. O tempo de acumulação de íons no octapolo foi definido como 10 ms. A faixa de razão massa/carga (m/z) analisada foi de 100 m/z a 600 m/z. 4.4.1.2 Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas de Alta Resolução O cromatógrafo líquido utilizado é equipado com um sistema binário de bombas (modelo LC-30AD Shimadzu®) e um amostrador automático (modelo SIL 30AC Shimadzu®). Para a separação cromatográfica utilizou-se uma pré-coluna e a coluna nucleosil® 100-5 CN, 100 Å, 250 mm, 5 µm, 4.6 mm (Macherey Nagel). Esta coluna é constituída por sílica modificada com grupos cianos, os quais lhe confere uma certa polaridade, sendo assim, a separação cromatográfica baseia-se em interações π-π, interações polares e interações hidrofóbicas. A fase móvel utilizada para a cromatografia foi água com o modificador de fase ácido fórmico 0,1% (fase A) e acetonitrila com o modificador de fase ácido fórmico 0,1% (fase B). 56 O volume de amostra injetado foi de 15 µL e o fluxo da fase móvel igual a 1,0 mL.min-1. A corrida cromatográfica foi realizada no modo gradiente, apresentado na TABELA 8. TABELA 8 Corrida cromatográfica. Tempo (min) 00.00 03.00 16.00 18.00 22.00 27.00 Concentração da fase B (%) 30 30 90 90 30 30 Antes de entrar na interface, o fluxo da fase móvel foi dividido para um fluxo no ESI de 0,2 mL.min-1. Foi realizado uma varredura da cromatografia no tempo de 0 a 18 minutos, com aquisição da razão massa/carga na faixa de 100 a 600 m/z. Os parâmetros da interface utilizados foram descritos anteriormente. Realizaram-se as análises de MS e MS/MS automático para os íons de maior intensidade. O tempo de acumulação de íons no octapolo foi de 10 ms para o MS e 50 ms para o MS/MS. A energia de colisão e o gás de colisão em 50%. 4.4.2 Carbono Orgânico Total As análises de carbono orgânico total (COT) foram realizadas no instrumento Thermo Scientific® HiPerTOC (FIGURA 19), pertencente ao Laboratório de Bio&Hidrometalurgia do Departamento de Engenharia Metalúrgica e de Materiais da Universidade Federal de Ouro Preto. O princípio de funcionamento baseia-se na oxidação do carbono a alta temperatura (1000°C). É obtido o valor de carbono total e carbono inorgânico, e o valor de carbono orgânico total é obtido pela diferença dos outros dois anteriores. FIGURA 19 Thermo Scientific HiPerTOC. 57 4.5 Teste de Ecotoxicidade 4.5.1 Artemia salina Para avaliar a toxicidade dos subprodutos do CPT, formados na fotocatálise heterogênea, foram realizados testes de ecotoxicidade aguda com o crustáceo Artemia salina (artemia). Utilizou-se uma adaptação da metodologia de Meyer e colaboradores, 1982. Para a eclosão das artermias foi utilizado um recipiente de politereftalato de etileno com formato cônico. Neste recipiente foi adicionado água salina 35% (38 gramas de sal marinho para cada litro de água), ovos de Artemia salina e adaptado um aerador. A eclosão durou 24 horas, durante esse tempo foi mantida uma lâmpada incandescente com filamento de tungstênio de 100 W de potência e a temperatura da sala de 23°C. O teste de toxicidade utilizando a A. salina foi realizado com as amostras submetidas à fotocatálise e fotólise, em todos os tempos coletados (0, 5, 10, 15, 30, 60 e 120 minutos) em triplicata. Utilizandou-se frascos de vidro, para cada amostra, adicionaou-se 1 mL de água salina, 10 larvas de A. salina e 4 mL da amostra. Como controle positivo utiliou-se água salina e como controle negativo dicromato de potássio 30 ppm. As larvas foram incubadas na presença de luz, por 24 horas. Cessado o tempo de 24 horas, realizou-se a contagem visual do número de crustáceos, mortos e sobreviventes, e o resultado apresentado foi em porcentagem de sobreviventes. 4.5.2 Teste de Ames Os testes de Ames foram realizados no Laboratório de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos do Departamento de Ciências Biológicas do Instituto de Ciências Exatas e Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto. Obedecendo a metodologia proposta por Maron e Ames (1983). O teste foi realizado com a amostra da fotocatálise no tempo de 120 minutos, diluída em 10 vezes. A partir desta diluição foi realizado sucessivas diluições, obtendo concentrações finais de 0,75, 0,50, 0,25 e 0,01 mg/L. Cada amostra foi testada com as cepas TA98 e TA100 com e sem a mistura S9, em triplicata. O controle negativo utilizou água milli-Q (em quintuplicata) e o controle positivo utilizou dois compostos sabidamente mutagênicos (azida sódica e fluorenamina), realizando-os em duplicata. Um esquema resumido das etapas do ensaio está apresentado na FIGURA 20. 58 FIGURA 20 Esquema simplificado do teste de Ames. 59 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Eficiência da degradação e mineralização do captopril 5.1.1 Hidrólise e adsorção/dessorção Para verificar a eficiência do processo de fotocatálise é de extrema importância avaliar os efeitos da hidrólise, adsorção/dessorção. No gráfico apresentado na FIGURA 21, está plotado a área do íon CPT desprotonado (m/z 216,0700) normalizada em função do tempo dos ensaios de hidrólise e adsorção/dessorção com TiO2. FIGURA 21 Gráfico de monitoramento do captopril nos ensaios de hidrólise e adsorção/dessorção. 120 A/A0 (%) 100 Hidrólise Adsorção/Dessorção 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120 Tempo Por meio do gráfico apresentado na FIGURA 21, percebe-se que durante os ensaios de hidrólise não houve mudanças significativas na concentração do fármaco, justificado pelas áreas dos íons do CPT, que permanecem praticamente constantes durante os 120 minutos do ensaio. Ainda neste gráfico, verifica-se que, assim como ocorreu na hidrólise, a concentração do CPT não sofreu grandes alterações durante o ensaio de adsorção/dessorção (REYES et al., 2006; ZHANG et al., 2008). Através destes resultados pode-se admitir que qualquer alteração na concentração do CPT durante a fotocatálise e fotólise não é atribuída à hidrólise do fármaco, ou a adsorção/dessorção ao catalisador. 60 5.1.2 Fotólise A área do CPT normalizada em função do tempo da fotólise (UV-C), extraída da área normalizada do pico cromatográfico do CPT desprotonado (m/z 216,0700) para cada tempo de coleta do ensaio, está apresentada no gráfico da FIGURA 22. FIGURA 22 Gráfico de monitoramento do captopril perante fotólise. 100 A/A0 (%) 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120 Tempo Nota-se que as áreas normalizadas do fármaco foram gradativamente reduzidas à aproximadamente 6,5% da área inicial, durante os 120 minutos de reação. Estes dados permitem concluir que a fotólise é capaz de degradar este fármaco. 5.1.2.1 Mineralização O fármaco pode sofrer reações químicas formando intermediários (subprodutos) até chegar à mineralização completa, CO2 e água. A extensão da reação pode ser investigada pela análise de carbono orgânico total (COT), que mede a quantidade de carbono orgânico presentes, no início e no final do ensaio. O gráfico da FIGURA 23, exibe a redução do COT durante o ensaio de fotólise. Observa-se que a redução apenas de 2,92%, o que permite afirmar que o CPT está sendo degradado a intermediários (subprodutos da reação) e não a CO2 e H2O. 61 FIGURA 23 Gráfico de porcentagem de remoção de COT. Remoção de COT (%) 100 95 90 85 0 30 60 90 120 Tempo Um estudo realizando a fotólise do CPT, foi utilizado uma lâmpada de amplo espectro de 41 W que varia de 200 a 600 nm. A solução aquosa do fármaco foi irradiada por 512 minutos. Obteve-se a degradação total do CPT, mas não foi observada nenhuma mineralização (MAHMOUD; KUMMERER, 2012). O resultado apresentado corrobora com o resultado obtido no presente trabalho. Entretanto, mesmo utilizando uma condição experimental diferente, pode se afirmar que a condição experimental do presente trabalho apresenta uma eficiência maior, tendo em vista o tempo reacional de 120 minutos. Além disso, foi observada uma taxa de mineralização de 2,92%, apesar de que alguns autores afirmam que esta taxa de mineralização é ínfima e estatisticamente insignificante (ABELLÁN et al., 2007; DE LA CRUZ et al., 2013). Como discutido na revisão da literatura, o CPT absorve energia de comprimento de onda de aproximadamente 200 nm, a mesma faixa de emissão da luz UV utilizada no ensaio. Portanto, já se esperava que ocorresse degradação do fármaco no ensaio de fotólise, corroborando assim, com o resultado obtido. 5.1.3 Fotocatálise heterogênea Durante a fotocatálise heterogênea foi realizada o monitoramento do CPT através da UPLC/HRMS. A FIGURA 24 apresenta os cromatogramas em uma sequência temporal do monitoramento do CPT desprotonado ( m/z 216,0700) no decorrer do ensaio de fotocatálise. 62 FIGURA 24 Cromatograma de íon extraído do captopril durante a fotocatálise. Os dados mostram que há uma redução na intensidade do pico cromatográfico (tempo de retenção em 4,6 minutos) de acordo com o aumento do tempo reacional, principalmente nos tempos de 60 e 120 minutos. 63 Na FIGURA 25, plotado a partir da área do CPT desprotonado (m/z 216,0700) normalizada em função do tempo da fotocatálise (TiO2/UV-C). Nota-se que as áreas normalizadas do fármaco foram gradativamente reduzidas, chegando a praticamente a zero (0,14%) da área inicial no decorrer do ensaio. A degradação mais intensa ocorre a partir de 15 minutos, com degradação de 50% do inicial em 50 minutos de experimento. FIGURA 25 Gráfico de monitoramento do captopril durante a fotocatálise. 100 A/A0 (%) 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120 Tempo 5.1.3.1 Mineralização A análise do COT é fundamental na avaliação da mineralização do fármaco perante o processo. Sendo assim, o COT foi monitorado durante toda a fotocatálise e sua concentração normalizada foi utilizada para plotar o gráfico da FIGURA 26. FIGURA 26 Gráfico de porcentagem de remoção de COT. Remoção de COT (%) 100 95 90 85 0 30 60 90 120 Tempo A fotocatálise heterogênea do CPT apresentou uma remoção de COT de apenas 9,1%. Mais de 50% do valor final do COT foram removidos nos primeiros 30 minutos de 64 experimento. Depois desse tempo, só ocorreu nova redução significativa após 60 minutos de experimento. Com este resultado é possível afirmar que, assim como a fotólise, o CPT foi degradado à intermediários, obtendo baixas taxas de mineralização. Concluindo que diante dessas condições experimentais, o CPT é susceptível à fotólise e à fotocatálise. Entretanto os subprodutos, que formam durante a reação, não apresentam este perfil, caracterizando-os como substâncias recalcitrantes. Durante o ensaio de fotocatálise foi monitorado o pH da solução. No início do experimento o pH da solução era de 4,62. No decorrer do ensaio o pH foi diminuindo, ao final do ensaio o pH era de 4,28. 5.2 Identificação dos subprodutos de degradação Para a detecção e identificação dos subprodutos de degradação formados na fotocatálise foi utilizado a ESI-MS como ferramenta. A FIGURA 27 apresenta os espectros de massas no modo negativo gerado das amostras coletadas durante a fotocatálise. 65 FIGURA 27 Espectros ESI-MS no modo negativo obtido das alíquotas da degradação de CPT pela fotocatálise. a) mostra-branco (água Milli-Q) e todos os tempos do ensaio; b) tempo de 60 e 120 minutos em uma escala maior. 66 No primeiro espectro de massas, que apresenta a água milli-Q utilizada no ensaio, observa-se apenas um pico de baixa intensidade ([M-H]- 239,1727). No início do ensaio, tempo 0, é possível identificar o pico do CPT ([M-H]- 216,0700), do dissulfeto do captopril ([M-H]- 431,1313) e outros picos considerados como impureza da amostra. Na sequência destes espectros percebe-se que do tempo 0, até o tempo de 30 minutos, não houve alterações significativas no perfil dos espectros. O perfil do espectro modifica no tempo de 60 minutos. Neste tempo ainda é possível observar a presença dos picos do CPT e do dissulfeto de captopril, com o aumento na intensidade dos íons [M-H]- = 264,0535; 250.0377 e 136,9924. No final do ensaio, no tempo de 120 minutos, já não é possível observar o íon relativo ao CPT nem o dissulfeto. Além dos picos que apareceram no tempo de 60 minutos, outros picos surgiram. Para os picos já existentes, observa-se também que suas intensidades aumentaram. Através da ESI-MS e a análise cromatográfica pela UPLC/HRMS, foi possível identificar onze subprodutos formados nos ensaios de fotodegradação. Na fotocatálise foram identificados 10 e na fotólise 10, sendo que 9 subprodutos são equivalentes em ambos os ensaios. A FIGURA 28 apresenta os cromatogramas de cada um dos subprodutos encontrados no tempo final de 120 minutos do ensaio da fotocatálise e fotólise. 67 FIGURA 28 Cromatogramas dos subprodutos identificados na fotocatálise e na fotólise no tempo de 120 minutos. 68 A TABELA 9 apresenta os possíveis subprodutos, como fórmula molecular, massa molecular, razão massa/carga da molécula desprotonada teórica, razão massa carga molécula desprotonada experimental, erros em relação às massas calculadas para cada espécie, e o Double Bond Equivalence (DBE). Estes dados foram obtidos do programa Formula Predictor (versão 1.12, Shimadzu Corporation). TABELA 9 - Elucidação de possíveis subprodutos do captopril por fotodegradação. Composto Fórmula Massa 1 (M-H)- (M-H)- Erro DBE2 Molecular Molecular Teórica Experimental (ppm) CPT C9H15NO3S 217,0774 216,0700 216,0700 0 3 1 C9H15NO6S 265,0621 264,0547 264,0535 0 3 2 C9H13NO4 199,0845 198,0772 198,0771 -0,50 4 3 C8H15NO6S 253,0621 252,0547 252,0552 1,98 2 4 C8H15NO7S 269,0571 268,0496 268,0497 0,37 2 5 C8H13NO5S 235,0516 234,0442 234,0449 2,99 3 6 C8H13NO6S 251,0465 250,0391 250,0391 0 3 7 C8H13NO7S 267,0414 266,0340 266,0321 -7,14 3 8 C9H15NO7S 281,0571 280,0496 280,0496 0,36 3 9 C9H13NO7S 279,0414 278,0340 278,0341 0,36 4 10 C9H15NO8S 297,0520 296,0446 296,0441 -1,69 3 11 C3H6O4S 137,9987 136,9914 136,9928 10,22 1 1 massa molecular calculada pelo software LCMS-Solutions/ Accurate Mass Calculator 2 Double Bond Equivalence (equivalencia de duplas ligações) As fórmulas propostas para os ions encontrados apresentam baixos erros entre os valores teóricos e experimentais, abaixo de 20 ppm. As fórmulas propostas podem ser confirmadas pelas intensidades das relações isotópicas, conforme exemplificado na FIGURA 29. Nesta figura, observa-se as razões m/z medidos em azul e as razões m/z teóricos em vermelho, confirmando que a fórmula molecular proposta está de acordo com a razão isotópica. 69 FIGURA 29 Relações isotópicas do subproduto C9H15NO6S. 5.3 Elucidações dos subprodutos e rota de degradação Como discutido na revisão da literatura, as reações tanto de fotocatálise quanto de fotólise são reações radicalares, muitas vezes pelo radical hidroxila. Tendo em vista esse mecanismo de degradação e a TABELA 9, foram propostas as estruturas químicas dos subprodutos da degradação do CPT, apresentadas na TABELA 10. Sendo dispensável o uso da massa segunda para propor os subprodutos. TABELA 10 Elucidação das estruturas químicas dos subprodutos formados da degradação do CPT. Ordem [M-H]- Nome IUPAC 1 264,0547 Ácido 1-(2-metil-3sulfopropanoil)pirrolidina-2-carboxílico 2 198,0772 Ácido 1-(2-metil-3oxopropanoil)pirrolidina-2- carboxílico 3 252,0547 Ácido 3-(2,3-dihidroxipirrolidin-1-il)-2metil-3-oxopropano-1-sulfônico 4 268,0496 Ácido 2-metil-3-oxo-3-(2,3,5trihidroxipirrolidin-1-il)propano-1sulfônico Estrutura Química 70 5 234,0442 Ácido 2-metil-3-oxo-3-(2-oxopirrolidina1-il)propano-1- sulfônico 6 250,0391 Ácido 3-(3-hidroxi-2-oxopirrolidin-1-il)2-metil-3-oxopropano-1- sulfônico 7 266,0340 Ácido 3-(3,5-dihidroxi-2-oxopirrolidin-1il)-2-metil-3-oxopropano-1-sulfônico 8 280,0496 Ácido 3-hidroxi-1-(2-metil-3sulfopropanoil)pirrolidine-2-carboxílico 9 278,0340 Ácido 1-(2-metil-3-sulfopropanoil)-3oxopirrolidina-2- carboxílico 10 296,0446 Ácido 3,5-dihidroxi-1-(2-metil-3sulfopropanoil)pirrolidina-2-carboxílico 11 136,9914 Ácido 2-oxopropano-1- sulfônico Dos subprodutos propostos, dez não foram reportados como subprodutos da fotodegradação do captopril na literatura disponível, até o momento. O ácido 1-(2-metil-3sulfopropanoil)pirrolidina-2-carboxílico foi o único subproduto, dos 11 identificados neste 71 trabalho, como subproduto da fotólise do CPT, o que corrobora com os resultados obtidos (MAHMOUD; KUMMERER, 2012). Após a elucidação dos subprodutos, pode-se admitir que a degradação do CPT se deu em maior parte através da oxidação do fármaco, corroborando com o que foi discutido no item anterior sobre a via de degradação proposta devido aos radicais hidroxilas. A partir das estruturas propostas, foi elucidada a rota química de degradação (FIGURA 30). A rota química de degradação inicia-se com o CPT. A partir dele, foram propostos reações de acordo com o meio reacional para a formação de cada subproduto identificado na EM. Foi proposta a formação de alguns subprodutos não identificados na EM (ressaltados na rota química de degradação pela cor vermelha), justificado pelo curto tempo de meia-vida. 72 FIGURA 30 Rota de degradação do CPT. 73 A rota proposta, a partir dos subprodutos encontrados, mostra que o primeiro derivado (1) é formado a partir da oxidação do grupo tiol. Provavelmente, isto acontece devido à capacidade do enxofre de expandir o octeto. O progresso da degradação ocorre através de rotas diferentes: i) descarboxilação (1a), seguida de várias etapas oxidativas; ii) oxidação em várias etapas; iii) dessulfonação seguida de processos oxidativos. O subproduto com o maior grau de degradação encontrado (11) pode ser formado a partir de todos os subprodutos sulfonados. Não foram detectados subprodutos a partir do anel pirrolidínico com seus diversos graus de oxidação 5.3 Monitoramento dos subprodutos O monitoramento dos subprodutos foi realizado por meio da Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas para cada tempo de coleta dos ensaios (0, 5, 10, 15, 30, 60 e 120 minutos). As áreas obtidas foram plotadas nos gráficos, considerando como 100% a área do CPT (FIGURA 31). FIGURA 31 Gráficos do monitoramento dos subprodutos na fotocatálise e na fotólise. 74 Em ambos os processos, é possível observar o decaimento da área do CPT contrapondo com a formação dos subprodutos no decorrer dos ensaios. Observa-se que o principal subproduto formado (1), é também o de maior concentração e o primeiro a ser formado, corroborando com a rota química de degradação proposta. Como foi discutido anteriormente, na fotocatálise há uma maior degradação do CPT, por meio desses gráficos e também há uma menor concentração dos subprodutos, o que condiz com a maior taxa de mineralização que ocorreu na fotocatálise. Os perfis de formação dos subprodutos durante os ensaios são diferenciados. Nota-se, na fotocatálise entre o tempo de 60 minutos a 120 minutos, que o subproduto 1 sofre um decaimento, e os subprodutos 6 e 8 são formados em maior proporção. Na fotólise não há um decaimento do subproduto 1 e somente o subproduto 8 é formado em maior proporção. Considerando que a formação do subproduto 1 é mais propícia, é válido dizer que a fotocatálise possui maior poder de oxidação, pois consegue oxidar em maior proporção o subproduto 1. Pode-se afirmar, portanto, que o gráfico apresentado na FIGURA 30, condiz com os resultados apresentados do COT e com a rota química de degradação. Concluindo que embora a fotólise e a fotocatálise apresentam os mesmos subprodutos, a fotocatálise se mostrou mais eficiente na mineralização e degradação. 5.4 Testes de Ecotoxicidade 5.4.1 Artemia salina O teste de ecotoxicidade em A. Salina foi realizado com o objetivo de avaliar e prever os efeitos tóxicos no ambiente aquático dos compostos que foram gerados a partir da fotocatálise do CPT. Em todos os tempos o número de A. Salina permaneceu o mesmo (10 artemias por amostra), significando que a amostra não é tóxica para este crustáceo. Sendo assim, não foi possível, por meio deste teste, observar diferença entre a toxicidade da solução final e a toxicidade da solução inicial. 75 5.4.2 Teste de Ames O teste de Ames foi utilizado para avaliar a mutagenicidade dos compostos gerados a partir da fotocatálise do CPT. O teste foi realizado com as cepas TA98 e TA100 com e sem a mistura S9, em triplicata (FIGURA 32). FIGURA 32 Cepas TA98 e TA100. Foi realizado uma primeira análise do CPT com o teste de Ames nas concentrações de 10, 1, 0,75, 0,5, 0,25 e 0,01 mg/L para a avaliação da mutagenicidade do composto inicial. Para a TA100 na presença de enzimas de metabolização S9 (TA100/S9+), TA100 na ausência de enzimas de metabolização S9 (TA100/S9-) e TA98 na ausência de enzimas de metabolização S9 (TA198/S9-), não foi observado mutagenicidade nas amostras, de acordo com a razão de mutagenicidade (RM), pois seus valores foram menores que 2. Entretanto, para a cepa TA98 na presença de enzimas de metabolização S9 (TA98/S9+), a amostra foi considerada mutagência, pois apresentou RM maior que 2, como apresentado na TABELA 11. TABELA 11 Valores do RM para várias concentrações de CPT. Razão de Mutagenicidade (RM) Concentração (mg/L) TA100/S9+ TA100/S9- TA98/S9+ TA98/S9- 10 0,97 1,48 4,13 1,30 1 0,76 1,08 7,43 1,06 0,75 0,73 0,87 4,96 0,80 0,50 0,54 0,66 4,50 0,46 0,25 0,23 0,61 5,87 0,01 0,01 0,00 0,27 7,79 0,28 76 O teste de Ames foi realizado para a amostra da fotocatálise no tempo de 120 minutos. O resultado deste teste está representado na TABELA 12. Como observado na tabela, para nenhuma cepa a RM foi maior ou igual a 2, indicando que esta amostra não apresenta mutagenicidade. Com os resultados apresentados, podemos afirmar que o CPT é um composto mutagênico indireto para a cepa TA100, portanto, é um composto que não tem ação "per se" sobre o DNA, mas após ser metabolizado no organismo é convertido em um composto que causa substituição de pares de bases no DNA. TABELA 12 Valores da RM para a amostra da fotocatálise. Razão de Mutagenicidade (RM) Concentração (mg/L) TA100/S9+ TA100/S9- TA98/S9+ TA98/S9- 1 0,98 1,41 0,99 0,85 0,75 1,24 1,07 1,02 0,93 0,50 1,12 1,21 0,47 0,97 0,25 1,27 1,22 1,11 1,12 0,01 1,13 1,44 0,75 0,25 Quando o CPT é submetido ao processo de fotocatálise heterogênea com TiO2/UV-C, o composto é degradado a subprodutos, os quais não apresentam mutagenicidade. 77 6 CONCLUSÃO O presente trabalho promoveu a fotocatálise heterogênea utilizando TiO2/UV-C do fármaco anti-hipertensivo captopril, um dos produtos farmacêuticos mais consumidas no mundo inteiro. Através do desenvolvimento de uma metodologia analítica, utilizando cromatografia líquida de ultra performance acoplada à espectrometria de alta resolução. Verificou-se que a fotocatálise e a fotólise foram capazes de causar uma degradação quase completa do captopril, após um tempo de reação de 120 min. No entanto, também foi demonstrado que entre os sistemas estudados, o processo fotocatalítico de TiO2/UV-C foi o mais eficiente na promoção tanto da degradação quanto da mineralização do substrato. A análise, por espectrometria de massa de alta resolução, permitiu a detecção e caracterização de onze subprodutos, sendo que dez são inéditos como subprodutos da fotodegradação do captopril na literatura. Estes subprodutos são persistentes mesmo depois de uma exposição à radiação UV-C de 120 minutos. Foi apresentada uma rota química de degradação, que leva a formação dos 11 subprodutos identificados, a partir do fármaco inicial, captopril. A rota consiste em sequência de ataques por radicais hidroxila, espécies reativas produzidas in situ sob as condições de ambos os processos. Subprodutos gerados na fotocatálise foram submetidos à avaliação da toxicidade pelos do Teste da Artemia salina que avalia toxicidade aguda e Teste de Ames que avalia a mutagenicidade. Em nenhum dos testes o subproduto gerado foi mais tóxico que o precursor. 78 7 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS A revisão da literatura mostra que não há muitos estudos que avaliam a formação de subprodutos e sua toxicidade durante e após os processos oxidativos convencionais e avançados. Sendo assim, é necessário que sejam feitos vários estudos, utilizando os fármacos que estão mais presentes como microcontaminantes na águas superficiais. Estes estudos devem estender-se a outros processos. Até mesmo com associações de processos, a fim de conseguir um sistema capaz de reduzir significativamente os microcontaminantes das águas. Um estudo cinético, variando pH e concentração do catalisador, também é válido. Com uma metodologia bem definida, métodos de extrações eficientes, estes estudos realizados no presente trabalho podem ser estendidos aos afluentes e efluentes de estações de tratamento de esgoto e sistemas de tratamento de águas. 79 REFERÊNCIAS ABELLÁN, M. N., B. BAYARRI, J. 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