Aulas práticas de Microbiologia Bucal
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Aulas práticas de Microbiologia Bucal AULA: Aplicação da anti-sepsia no exercício da odontologia Objetivo da aula: verificar a presença da microbiota da cavidade oral e mãos do profissional, assim como, a redução da microbiota após lavagem e anti-sepsia Importância do uso da anti-sepsia como rotina na clínica odontológica Redução na microbiota, consequentemente: Resultados mais confiáveis, com uma melhor cicatrização dos tecidos do paciente. Maior segurança nas medidas terapêuticas Os aerossóis gerados terão um menor nº. de microrganismos e consequentemente menor será o risco de contaminação do campo operatório, ou mesmo a introdução de bactérias na corrente sanguínea (prevenção de bacteremias) Diminuir o risco de contaminação do profissional através dos aerossóis Minimizar o risco de infecção cruzada durante o atendimento ao paciente na prática odontológica. Metodologia 1o. Experimento: - Inicialmente uma placa de Petri, com ágar simples, será dividida em terços. - No primeiro terço (área 1) fazer a impressão digital do polegar, com as mãos sem qualquer lavagem ou anti-sepsia prévia. - No segundo terço (área 2) fazer a impressão digital do mesmo polegar após uma lavagem prévia com sabonete líquido e secagem com uma gaze esterilizada. - No último terço (área 3) realizar a impressão digital do polegar após a anti-sepsia com um anti-séptico tópico (PVP-I 10%). A aplicação do PVP-I será feita com auxilio de um swab ou com algodão esterilizado, aplicado em apenas uma direção (evita a contaminação). - Incubar a placa a 37ºC por 48 h 2o. Experiemento: - Coletar amostra da boca com auxilio de um swab esterilizado que deverá ser friccionado num determinado nicho da cavidade oral do paciente - Semear esta amostra em um tubo de ensaio contendo caldo simples (Tubo 1) - Colocar o paciente para bochechar com um colutório (cepacol, listerine ...) durante um minuto - Friccionar com outro swab esterilizado o mesmo nicho (aplicar força semelhante) - Semear esta amostra em um tobo contendo caldo simples (Tubo 2) - Incubar os tubos a 37ºC por 48 h AULA : Resultados esperados 1º. Experimento: - No primeiro terço ocorrerá a formação de várias colônias de m.os (quantitativamente abundante e qualitativamente diferenciadas) -No segundo terço ocorrerá a formação de menos colônias e com uma variedade menor. Isso representa uma redução quantitativa e qualitativa, houve uma diminuição da microbiota transitória. -No terceiro terço houve uma eliminação quase total dos m.os, devido às características antimicrobianas do agente utilizado (teoricamente existe uma redução de 99,8% de toda a microbiota após uma antissepsia com PVP-I). 2º. experimento: -Houve uma diferença na intensidade de turvação entre os meios de cultura do tubo 1 e tubo 2. O meio no qual foi coletado amostras sem anti-sepsia prévia há uma maior turvação, indicando um maior crescimento microbiano. AULA: Controle da qualidade de agentes químicos de uso Odontológico (método da bolinha de algodão). Objetivo da aula: verificar a eficácia dos agentes químicos de uso odontológico sobre bactérias Gram positivas (Staphylococcus aureus) e Gram negativas (Pseudomonas aeruginosa). Metodologia: - Com auxilio de um swab semear por disseminação em duas placas de petri contendo ágar simples respectivamente uma cultura de S.aureus e P.aeruginosa - Escolher um determinado agente químico para avaliar - Com auxilio de uma pinça flambada pegar uma bolinha de algodão esterilizada e embeber no agente químico a ser avaliado (usar o mesmo agente químico nas duas placas) - Colocar assepticamente a bolinha com agente químico no centro da placa e fazer uma leve pressão - Incubar a 37ºC por 48h AULA: Resultado Avaliar e comparar o tamanho do halo de inibição do agente químuco sobre as diferentes culturas semeadas no ágar simples AGENTE QUÍMICO S.aureus P.aeruginosa Críticas ao método. - Não houve padronização do inóculo (isto é, diferentes quantidades das culturas foram semeadas nas respectivas placas). - Não houve padronização na quantidade do agente químico testado entre as duas placas - Alguns agentes químicos não se difundem no ágar (não significando, portanto que não tenham ação eficaz, ex: listerine) - Alguns agentes químicos são voláteis, e formarão provavelmente um halo de inibição maior, ex: formaldeido). AULA: Cultura de orofaringe Objetivo da aula– Isolamento Streptococcus da orofaringe e identificação de Staphylococcus e 1. Isolamento de Staphylococcus da orofaringe - Com auxilio de um swab será coletado material da orofaringe, é importante que não haja contato com outra estruturas da cavidade bucal ou com saliva para evitar contaminação, assim deve-se utilizar um abaixador de língua para facilitar o processo. - Descarregar o material da orofaringe no canto de uma placa de petri contendo meio de Chapman - um meio seletivo para Staphylococcus, contem manitol-substrato, vermelho de fenol-indicador de pH e NaCL a 6,5% (torna o meio hipertônico – uma forma de seleção). O meio é laranja. - Com auxilio de uma alça de platina previamente flambada, se faz, a partir do local que contém a amostra coletada, semeadura por estrias. - Incubar a 37ºC por 48h. 2. Isolamento de Streptococcus da orofaringe - Com auxilio de um swab será coletado material da orofaringe, é importante que não haja contato com outra estruturas da cavidade bucal ou com saliva para evitar contaminação, assim, deve-se utilizar um abaixador de língua para facilitar o processo. - Descarregar o material da orofaringe no canto de uma placa de petri contendo meio de ágar sangue. Os Streptococcus são mais exigentes do ponto de vista nutricional que os Staphylococcus. Pode-se acrescentar ao ágar sangue a substância azida sódica para tornar o meio seletivo para Streptococcus, visto que o ágar sangue é um meio enriquecido permitindo o crescimento de vários microrganismos). - Com auxilio de uma alça de platina previamente flambada, se faz, a partir do local que contem a amostra coletada, semeadura por estrias. - Incubar a 37ºC por 48h. AULA: Estudo da morfologia colonial/Gram/ catalase/ hemólise/ Repique com caldo BHI) 1. Identificação de Staphyloccus da orofaringe em meio de Chapman Morfologia colonial O meio para os Staphylococcus, especificamente S. aureus, passa de laranja para amarelo, devido à fermentação do manitol, caso haja presença desses m.os. Colônia suspeita de S.aureus é amarela, enquanto Staphylococcus epidermidis ou Staphylococcus saprophyticus são colônias brancas ou cinzas. Gram Staphylococcus são células esféricas (cocos) arranjados em cachos semelhantes a uva e são corados de roxo (Gram positivos) - Com auxilio de uma alça de platina flambada retirar uma parte da colônia a ser avaliada e realizar um esfregaço numa lâmina de vidro e em seguida fixa-la na chama do bico de bunsen - * Coloração de Gram: Cristal Violeta- Corante primário - Aplicar durante 1 min. Lugol (Solução de Iodo – É um mordente -fixa o corante no interior da célula)- Aplicar por 1 min. Álcool (agente descorante)- Inclinar a lâmina e aplicar até que escorra uma solução límpida (aproximadamente 10 seg.) LAVAGEM em água corrente – Muito importante Fucsina – Corante de fundo - Aplicar durante 30 seg. Lavar em água corrente e secar com papel de filtro Microscopia: objet H2O iva de 100x com uso do óleo de imersão Prova bioquímica da catalase É uma prova bioquímica rápida para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus. - Em uma lâmina de vidro colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (H2O2) -Com auxilio de uma alça de platina flambada retira-se uma outra parte da colônia eleita para estudo e coloca-la nesta lâmina - Caso haja formação de bolhas significa que a bactéria tem a enzima catalase que quebra a H2O2 em H2O + O2, indicado uma prova da catalase positiva. Os Staphylococcus são catalase positivo Repique para caldo BHI - Com auxilio de uma alça de platina retira outra parte da colônia eleita para estudo e repicar para caldo BHI (semear em caldo BHI). - Incubar a 37ºC por 48h. - A partir desse crescimento será realizada a prova para identificação de S.aureus - prova da coagulase. 2. Identificação de Streptococcus da orofaringe em meio de agar sangue Morfologia colonial / Padrão de hemólise Streptococcus α hemolíticos -> se obtém uma hemólise parcial, de coloração esverdeada. Streptococcus β hemolíticos -> se obtém uma hemolise total. Streptococcus γ hemolíticos -> não realizam hemólise No meio contendo de ágar sangue o maior interesse é em verificar a presença de β hemolíticos, ou Streptococcus do grupo A, representado pelos S. pyogenes. As colônias formadas por esses Streptococcus são pequenas, puntiformes e com hemólise total. Streptococcus pyogenes é altamente patogênico e está associado ao desenvolvimento de faringites podendo o paciente apresentar como seqüela um quadro de febre reumática aguda e consequentemente uma possível lesão de válvula cardíaca tornando-o um individuo susceptível a endocardite bacteriana. É importante para o dentista saber o risco do paciente para desenvolver essas doenças, necessitando assim, antes de um procedimento cirúrgico ou invasivo, fazer profilaxia antibiótica, evitando qualquer tipo de infecção ou complicação. Gram Streptococcus são células esféricas (cocos) arranjados em cadeias semelhantes a um colar de contas e são corados de roxo (Gram positivos) - Com auxilio de uma alça de platina flambada retirar uma parte da colônia a ser avaliada e realizar um esfregaço numa lâmina de vidro e em seguida fixa-la na chama do bico de bunsen e proceder a coloração de Gram descrita anteriormente. Prova bioquímica da catalase É uma prova bioquímica rápida para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus. - Em uma lâmina de vidro colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (H2O2) -Com auxilio de uma alça de platina flambada retira-se uma outra parte da colônia eleita para estudo e coloca-la nesta lâmina - Caso não haja formação de bolhas significa que a bactéria não possui a enzima catalase que quebra a H2O2 em H2O + O2, indicado uma prova da catalase negativa. Os Streptococcus são catalase negativo. Repique para caldo BHI - Com auxilio de uma alça de platina retira outra parte da colônia eleita para estudo e repicar para caldo BHI (semear em caldo BHI). - Incubar a 37ºC por 48h. - A partir desse crescimento será realizada a prova para identificar S.pyogenes – Prova da bacitracina. AULA: Identificação de S.aureus e S. pyogenes 1. Material suspeito de S. aureus: - Realizar prova da coagulase, para a qual apenas Staphylococcus aureus é positivo: em um tubo de ensaio contendo 0,5 mL de plasma de coelho será acrescido com auxilio de uma pipeta 0,5 mL da cultura suspeita de S.aureus em caldo BHI. Incubamos a 37o.C por 48 horas. 2. Material suspeito de S. pyogenes: - Realizar prova da bacitracina, pois S. pyogenes são sensíveis a bacitracina: Com auxilio de um swab coleta-se uma amostra da cultura suspeita de S.pyogenes crescida em BHI e realiza-se semeadura por disseminação em uma placa de Petri contendo ágar BHI. Em seguida acrescenta-se um disco de bacitracina no centro da placa e faz uma leve pressão. Incubar a 37ºC 48h. AULA : Resultado Resultado da prova da coagulase: caso haja coagulação do plasma significa que a bactéria possui a enzima coagulase que transforma o fibrinogênio em fibrina indicando uma prova positiva e consequentemente confirma-se a suspeita de S.aureus Resultado da prova da bacitracina: caso forme um halo de inibição ao redor do disco é S. pyogenes, indicando a sensibilidade dos S. pyogens à bacitracina e consequentemente confirma a suspeita da presença de S.pyogenes. AULA: Isolamento e identificação de Streptococcus orais na saliva Metodologia - Coletar 1,5 mL de saliva em uma placa de Petri pequena esterilizada - Realizar diluições seriadas: com auxilio de uma pipeta esterilizada, transferir 1,0 mL desta saliva para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de solução salina esterilizada (Tubo 1). Submeter esta diluição a um vórtex com objetivo de homogeneizar a amostra de saliva diluída 1/10 ou 10-1. Com auxilio de outra pipeta esterilizada, transferir 1mL da saliva diluída 10-1 para outro tubo de ensaio contendo também 9mL de solução salina esterilizada (Tubo 2) e submeter a ação de um vórtex- diluição 10-2. - Com auxilio de uma pipeta esterilizada colocar 0,1 mL da saliva diluída 10-2 no centro de uma placa de Petri contendo meio de cultura ágar Mitis-salivarius( meio seletivo para estreptococos orais – contem sacarose, telurito de potássio 1% e azul de tripan) -Com auxilio de uma alça de Drigalsky semear esta amostra por disseminação - Incubar a 37ºC por 48h AULA: Identificação de Streptococcus mutans. Estudo da morfologia colonial em ágar Mitis-salivarius - Colônia suspeita de S. mutans : colônias altas, convexas, mucóides, azul claro, com estrutura granular ( aspecto de vidro fosco- devido a produção de polissacarídeos Extracelular- PEC) - Colônia suspeita de S. sanguis : Colônia pequena mucóide, com forte aderência ao meio de cultura - Colônia suspeita de S.mitis : colônia azul escuro, pequenas e não aderentes ao meio de cultura - Colônia suspeita de S.salivarius : colônia mucóide, grande, aspecto de “ gum drop”, azul claro. Coloração pelo método de Gram - confirmar morfologia celular - células esféricas em cadeia. De acordo com o aspecto da colonial e coloração de Gram: - Com auxilio de uma alça de platina realizar provas bioquímicas para identificar S.mutans : repicar a mesma colônia para um tubo contendo caldo de BHI e uma bengala de vidro (prova da formação da placa “in vitro” ; uma outra parte da colônia em estudo para um tubo com caldo manitol e outra parte para um tubo com caldo sorbitol. - Incubar a 37ºC por 48 h AULA: resultado da identificação de S.mutans Identificação Bioquímica Teste Formação de placa in vitro Prova do Manitol Prova do Sorbitol S.sanguis Neg/(pos) Neg Neg S.mitis S.mutans Neg/(pos) Pos Neg Pos Neg Pos S.salivarius Neg/(pos) Neg Pos Obs: Prova da formação de placa in vitro pos (+): colonização na bengala de vidro Obs: Prova do Manitol positivo : o meio passa de vermelho para amarelo Obs: Prova do Sorbitol positivo : o meio passa de vermelho para amarelo AULA: Bacterioscopia dos Principais Nichos da Cavidade Bucal Objetivo da aula: observar os diferentes tipos morfológicos microrganismos presentes nos principais nichos da cavidade bucal. Selecionaremos um nicho específico da boca, que pode ser: - palato - língua - dente - Mucosa jugal de Metodologia: - Escolher um nicho para estudar - Com auxilio de um swab coletar amostra do referido nicho - Colocar o material em uma lamina de vidro e fazer o esfregaço /fixação - Coloração pelo método de Gram. Obs: Quando o sítio é o dente, - A placa bacteriana deve ser coletada com auxilio de uma cureta dentinária - Colocar um pouco de solução salina na lâmina de vidro antes do esfregaço/ fixação - Coloração pelo método de Gram e Gram. - O material é observado no microscópio. AULA: Contagem de Lactobacillus da saliva Objetivo da aula: realizar a contagem de lactobacilos na saliva como teste microbiológico para verificar a tividade de cárie de um indivíduo Metodologia: - Coletar aproximadamente 1,5 mL de saliva em uma placa de Petri pequena esterilizada. - Realizar diluição seriada da saliva em solução salina: 1,0 mL desta saliva é transferida para um tubo de ensaio com 9,0 ml de solução salina (diluição de 10 –1 ). Caso a saliva seja muito viscosa se indica outra(s) diluição(s) ou quando o paciente apresenta uma grande quantidade de placa bacteriana, ou ainda é portador de aparelho ortodôntico. - Semear por Pour-Plate 0,1mL de saliva diluída a 10 –1 ou a diluição ideal para cada paciente: colocar este volume da amostra em uma placa de Petri esterilizada e verter 20mL do meio de cultura ágar Rogosa fundido e resfriado (seletivo para Lactobacilos, pois contem ácido acético e baixa tensão superficial, o pH está em torno de 5,4; a seletividade não é absoluta, a seleção é feita para m.os. acidúricos). Obs: é necessário deixar o meio esfriar um pouco (controle pela pele). - Incubar a 37ºC por 48 h AULA: Resultado da contagem de Lactobacillus da saliva As colônias formadas terão aspecto de milho de alpiste e em um aparelho faremos a leitura da quantidade de colônias. Utilizaremos a fórmula: R = n. de colônias formadas Vol. semeado x fator de diluição Obs: o resultado é dado em UFC/ mL Segundo uma padronização é colocado o risco relativo do paciente: 0 – 1000 -> sugestivo de negativa ou pequena atividade de cárie 1000 – 5000 -> sugestivo de discreta atividade de cárie 5000 – 10000 -> Sugestivo de moderada atividade de cárie > 10000->Sugestivo de acentuada atividade de cárie Esse resultado é relativo, pois analisamos apenas a quantidade de microrganismos acidogênicos presentes na boca do individuo. Porém outros fatores devem ser analisados antes de se determinar o risco de desenvolvimento de cárie, ex: exame clínico, fluxo e composição salivar, Contagem de bactérias do grupo mutans , teste de Snyder, dieta, grau de higienização... AULA: Teste de Snyder Objetvo: avaliar a atividade de cárie de um indivíduo. O teste está fundamentado na velocidade de produção de ácidos pelos microrganismos acidogênicos da cavidade bucal. Metodologia - Coletar em uma placa de Petri esterilizada aproximadamente 1 mL de saliva - Transferir 0,2 mL desta saliva para um tubo de ensaio contendo 10 mL de meio de ágar Snyder fundido e resfriado (meio de ágar-glicose contendo verde de bromocresol e pH entre 4,7 e 5,0, que é um meio verde e se tornará amarelo quando submetido a condições ácidas). - Este tipo de semeadura é denominada semeadura Shake tube. O tubo é colocado no vótex para homogeneizar a mistura e em seguida incubado a 37ºC. Como é o fator velocidade que é analisado, será realizada a leitura em 3 tempos: 24 horas, 48 horas e 72 horas e observa-se em que tempo o meio passou de verde para amarelo. De acordo com uma tabela padronizada teremos a atividade de cárie e uma possível sugestão de risco de cárie do paciente: Atividade de cárie Acentuada Moderada Pequena Negativa 24 horas 48 horas 72 horas positivo negativo negativo negativo positivo positivo negativo negativo positivo positivo positivo negativo AULA : Teste dos condutos Radiculares Objetivo : verificar a “esterilização” dos condutos radiculares após tratamento endodontico. Esse teste pode ser direto ou indireto. Metodologia No consultório o teste direto: é feito após um isolamento absoluto, após o qual é introduzido no canal um cone de papel absorvente esterilizado, durante 1 a 2 minutos. A seguir em uma lâmina de vidro é feito o esfregaço com a amostra coletado com o cone, fixação e coloração pelo método de gram No consultório o teste indireto: é feito após um isolamento absoluto, após o qual é introduzido no canal um cone de papel absorvente esterilizado, durante 1 a 2 minutos. A seguir o cone é colocado assepticamente no meio tioglicolato de sódio (meio é reduzido) e incubado a 37o.C por 48 horas. Para se ter um controle deve-se incubar em outro tubo de ensaio contendo o mesmo meio uma ponta não introduzida no canal (tubo controle da ponta) e também deve-se incubar o meio, apenas (tubo controle do meio). Na prática laboratorial: deve-se dispor de três tubos contendo caldo tioglicolato de sódio), porém como não há pacientes nem canal disponíveis introduz-se a ponta de papel absorvente esterilizada do tubo teste ( Tubo 1) em uma cultura (ex; Pseudomonas aeruginosa, S.aureus ...) e transfere-se assepticamente para o meio de cultura com auxilio de uma pinça clinica flambada (Tubo 1). A seguir no tubo controle da ponta(Tubo 2) introduz-se uma outra ponta de papel absorvente esterilizada nas mesmas condições da primeira. Para o controle do meio basta incubar um tubo contendo meio de cultura esterilizado nas mesmas condições dos anteriores (tubo 3). Os três tubos devem ser incubados a 37ºC por 48h. AULA : Resultado do teste dos condutos radiculares As possibilidades de resultados são: Tubo teste Controle da ponta Controle do meio + - - + + + + + - - - - Resultado e conduta a ser adotada Conduto contaminado – realizar novo tratamento Meio contaminado – repetir o experimento tomando cuidado com a esterilização e assepsia durante a prática Ponta contaminada – repetir o experimento tomando cuidado com a esterilização e assepsia durante a prática Sucesso do tratamento endodôntico
