Um exame da segurança ambiental das proteínas Cry34Ab1 e

Um exame da segurança ambiental das
proteínas Cry34Ab1 e Cry35Ab1
Centro de Avaliação de Riscos Ambientais, Fundação de Pesquisas do ILSI
1156 Fifteenth Street N.W., Washington D.C. 20005-1743 EUA
7 de fevereiro de 2013
INTRODUÇÃO
Este documento fornece um exame abrangente das
informações e dados relevantes para a avaliação de
risco ambiental de duas proteínas codificadas por
genes isolados de Bacillus thuringiensis, Cry34Ab1 e
Cry35Ab1, e apresenta uma síntese sobre a segurança
ambiental destas proteínas quando produzidas no
evento de milho geneticamente modificado (GM)
DAS-59122-7 (Zea mays, L.). Todas as fontes de
informação aqui examinadas estão disponíveis
publicamente e incluem dossiês apresentados a
autoridades regulatórias, documentos de decisões
preparados por autoridades regulatórias, descrições de
produtos preparadas por desenvolvedores do produto e
literatura revisada por pares.
As avaliações de risco ambiental relacionadas ao
plantio de culturas GM são feitas caso a caso levandose em conta a biologia da planta, as características
dos transgenes e das proteínas codificadas, o fenótipo
conferido pelos transgenes, as utilizações previstas
da cultura e a natureza do ambiente receptor onde
a planta será introduzida. Essas avaliações, que
consideram tanto o perigo e a exposição, geralmente
envolvem comparações com uma linha parental não
transformada ou isolinhas intimamente relacionadas
(Craig, Tepfer, Degrassi e Ripandelli, 2008; OCDE,
2007). O objetivo dessas comparações é identificar o
risco potencial que a planta GM pode apresentar além
do que já é aceito para plantas não geneticamente
modificadas semelhantes cultivadas no meio ambiente.
As consequências desses riscos, caso existam, são então
avaliadas.
Aprovações regulatórias1 para a liberação ambiental
e uso em alimentos e rações do evento de milho
GM DAS-59122-7, presente isoladamente em uma
variedade de milho ou piramidado com outros eventos
GM, foram emitidas em três países: Canadá (em
1 Os regulamentos podem exigir renovação periódica de
registros dos agrotóxicos. Por exemplo, a situação atual dos
registros na USEPA pode ser encontrada em http://www.epa.
gov/oppbppd1/biopesticides/pips/pip_list.htm.
2005), Japão (em 2006) e Estados Unidos (em 2005)
(ver ILSI, GM Crop Database, http://cera-gmc.org/
index.php?action=gm_crop_database).
ORIGEM E FUNÇÃO DAS PROTEÍNAS
CRY34Ab1 E CRY35Ab1
Bacillus thuringiensis e as proteínas inseticidas
Cry34Ab1 e Cry35Ab1
Palavras-chave
Cry34, Cry35, proteínas cristalinas inseticidas, toxina binária,
Bacillus thuringiensis, resistência a insetos, geneticamente
modificada, avaliação de risco
ambiental
A Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria grampositiva em forma de bastonete que produz endósporos
de vida longa. Apesar de ser considerada uma bactéria do
solo, a Bt é onipresente no meio ambiente. Ela tem sido
extensivamente estudada e utilizada comercialmente
há muitos anos como pesticida agrícola, devido à
sua capacidade de sintetizar um grande número de
proteínas com atividade contra uma ampla variedade
de pragas de culturas (Hofte e Whiteley, 1989; OCDE,
2007; Schnepf et al., 1998; van Frankenhuyzen, 2009).
Preparações de isolados naturais da bactéria Bt foram
usadas pela primeira vez como inseticidas comerciais na
França em 1938 e, desde então, o uso de preparações
de Bt como inseticidas tem se tornado comum em
todo o mundo. A Bacillus thuringiensis foi registrada
para uso nos Estados Unidos desde 1961 (USEPA,
1998), e várias preparações de Bt foram registradas na
Austrália, Canadá e União Europeia (APVMA, 2013;
DGSANCO, 2013; Health Canada, 2008; Kumar,
Sharma e Malik, 1996; Schnepf et al., 1998). Estas
preparações são derivadas de culturas de células da
bactéria Bt, por isso contêm uma mistura complexa
de todas as proteínas pesticidas produzidas pela cepa
de Bt usada. Várias centenas de proteínas pesticidas
foram isoladas a partir de culturas de Bt (Crickmore
et al., 2012) e estas proteínas exibem uma enorme
variedade na diversidade de sequências, modo de
ação e especificidade do alvo (Hofte e Whiteley,
1989; OCDE, 2007; Pigott e Ellar, 2007; Schnepf
et al, 1998;. Vachon, Laprade e Schwartz, 2012; van
Frankenhuyzen, 2009). Elas incluem compostos
antifúngicos, ß-exotoxinas, proteínas Cyt (citolíticas),
Copyright © ILSI
Foundation 2013
Research
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proteínas inseticidas vegetativas (Vip) e δ-endotoxinas, um grupo que
inclui as proteínas inseticidas Cry (cristalinas) (Hofte e Whiteley, 1989;
OCDE, 2007; Schnepf et al., 1998). Estas proteínas podem interagir
umas com as outras para influenciar a toxicidade e a faixa de atividade
das preparações bacterianas individuais (OCDE, 2007; Schnepf et al.,
1998).2
Em 2002, cientistas industriais reportaram o isolamento de uma nova
substância proteinácea a partir de corpos de inclusão paraesporais
cristalinos de várias cepas de Bt (Ellis et al., 2002; Narva et al., 2000).
Descobriu-se que esta substância era tóxica para o verme da raiz do milho
ocidental (Diabrotica virgifera virgifera) (WCR), mas não para a broca do
milho europeia (Ostrinia nubilalis) (ECB), lagarta da espiga (Helicoverpa
zea), ou lagarta rosca (Agrotis ipsilon). Outras análises revelaram que a
toxina era na verdade composta por duas proteínas, uma com uma massa
de aproximadamente 44 kDa e a outra com uma massa entre 13 e 14
kDa. As duas proteínas eram codificadas por genes adjacentes em um
único operon, com o gene que codifica a proteína menor localizado a
montante do gene da proteína maior, separados por um espaçador de
aproximadamente 100 bp. Embora nenhuma das duas proteínas tinham
homologia de sequência significativa com proteínas Cry de Bt inseticidas
conhecidas, a proteína de 44 kDa tinha aproximadamente 26 a 29% de
homologia de sequência com proteínas Cry inseticidas de B. sphaericus3
tendo atividade contra mosquitos (Ellis et al., 2002; Jones et al., 2007;
Schnepf et al., 2005).
As cepas recombinantes de Bt que produziam apenas a proteína de
14 kDa ou a de 44 kDa não eram inseticidas para WCR, levando à
conclusão de que as duas proteínas formam uma toxina binária (Ellis
et al., 2002).4 Quando testada em larvas do verme da raiz do milho
meridional (Diabrotica undecimpunctata howardi) (SCR), a proteína de
14 kDa sozinha inibiu o crescimento de insetos, mas a sua toxicidade
contra SCR foi sinergizada pela proteína de 44 kDa. Quantidades
relativamente pequenas da proteína de 44 kDa parecem ser necessárias
para o sinergismo. Por exemplo, uma proporção de 9:1 de 14 kDa:44
kDa é suficiente para alta mortalidade de SCR. No entanto, uma relação
ideal não foi identificada (Ellis et al., 2002; Herman et al., 2002).
As proteínas de 14 kDa e 44 kDa são classificadas como δ-endotoxinas
Cry e foram designadas Cry34Ab1 e Cry35Ab1, respectivamente
(Crickmore et al., 2012). Os genes que codificam as proteínas, cry34Ab1
2 A faixa de atividade das pulverizações preparadas de uma cultura de Bt
específica deve-se a uma combinação das várias toxinas produzidas pela bactéria,
bem como às qualidades das células bacterianas, que podem afetar a seletividade
e a gama de hospedeiros de uma preparação específica (Schnepf et al., 2005;
Tabashnik, 1992). Portanto, a faixa de atividade das pulverizações preparadas
de culturas de bactérias Bt pode ser diferente da faixa de atividade das proteínas
individuais de Bt produzidas por uma planta GM (OCDE, 2007).
3 Bacillus sphaericus foi renomeado Lysinibacillus sphaericus (ver Ahmed et
al. 2007. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology
57(5): 1117-25.
4 Neste documento, os termos "toxina binária", "Cry34Ab1 e Cry35Ab1", e
"Cry34Ab1/Cry35Ab1" serão usados de forma intercambiável.
2
e cry35Ab1,5 foram clonados em Pseudomonas fluorescens para a expressão
heteróloga (Gao et al., 2004; Huang, Badger, Haney e Evans, 2007).
A atividade biológica da forma binária da toxina, quando produzida
em P. fluorescens, foi comparável à da toxina produzida em plantas de
milho GM (Gao et al., 2004; Huang et al., 2007; Moellenbeck et al.,
2001; USEPA, 2005a). As proteínas, quer produzidas em P. fluorescens ou
milho, tinham o mesmo peso molecular, reconhecimento imunogênico
e sequências N-terminais. Além disso, nenhuma das proteínas são
glicosiladas em P. fluorescens ou no milho, apesar de ambas as proteínas
conterem locais de N-glicosilação (Gao et al., 2004). A proteína
Cry34Ab1 passa prontamente por truncamento C-terminal no intestino
médio de insetos sensíveis, o que reduz seu peso molecular para 40 kDa,
mas o truncamento não inibe os efeitos sinérgicos da Cry35Ab1 sobre a
toxicidade da Cry34Ab1; na verdade, a versão truncada da Cry35Ab1
tem um efeito de potenciação mais forte na toxicidade da Cry34Ab1
(Gao et al., 2004).
A toxina binária tem uma faixa de atividade estreita, sendo tóxica
principalmente para espécies de larvas de coleópteros. As larvas de
WCR, SCR e do verme da raiz do milho setentrional (Diabrotica
barberi) são as mais sensíveis. Portanto, genes que codificam a toxina
binária são utilizados, isoladamente ou em combinação com os genes
para outras toxinas de Bt Diabrotica ativas, em variedades de milho com
probabilidade de serem cultivadas em regiões onde a predação do verme
da raiz provoca perdas de safras significativas (Baum et al., 2004).
Mecanismo da atividade inseticida da Cry34Ab1/
Cry35Ab1
Como outras proteínas Cry inseticidas, a toxina binária provoca danos
nas células no intestino médio de insetos suscetíveis através da criação
de canais de íons, o que resulta na desestabilização da membrana. Este
efeito é significativamente aumentado sob condições ácidas, tais como as
tipicamente presentes no sistema digestivo dos coleópteros, ao contrário
das condições alcalinas encontradas no intestino médio das larvas de
lepidópteros (Masson et al., 2004; Moellenbeck et al., 2001). Poros
podem ser criados pela proteína Cry34Ab1 ou pela proteína Cry35Ab1
atuando isoladamente, mas misturas das duas proteínas resultam em
poros que permanecem abertos por mais tempo, provocando uma maior
desestabilização da membrana. Além disso, a versão trucada de 40 kDa da
proteína Cry35Ab1 foi mais eficaz na formação de poros do que a versão
nativa de 44 kDa. A conversão da proteína nativa para a versão truncada
tem um pH ótimo de 5,5 a 6,0, semelhante ao pH do intestino médio
das larvas de coleópteros, e pensa-se que o processo de truncamento
possa ser crucial para a atividade completa da toxina binária. O intestino
médio dos lepidópteros proporciona um ambiente mais alcalino, e essa
diferença pode ser um fator na seletividade da toxina binária (Masson et
al., 2004). Embora o mecanismo preciso pelo qual a toxina binária forma
poros e desestabiliza as membranas seja desconhecido, parece envolver
um mecanismo diferente do que aquele associado com a Cry3Bb1, outra
5 Pesquisas adicionais revelaram que a toxina binária Cry34Ab1/Cry35Ab1
é membro de uma família de toxinas produzidas por várias cepas de B.
thuringiensis encontradas na Ásia, Austrália, América do Norte e América do
Sul (Jones et al., 2007). No entanto, entre as toxinas descobertas até agora dentro
desta família, a toxina binária Cry34Ab1/Cry35Ab1 tem o nível mais elevado de
atividade pesticida contra WCR (Baum et al., 2004; Schnepf et al., 2005).
proteína inseticida Bt ativa contra WCR (Gassmann, Petzold-Maxwell,
Keweshan e Dunbar, 2011; Masson et al., 2004).
Expressão de Cry34Ab1/Cry35Ab1 em milho GM
resistente a insetos
Os níveis de expressão de transgenes em plantas GM podem ser
influenciados por vários fatores relacionados com o processo de
transformação genética, incluindo os tipos de sequências promotoras
e terminadoras empregadas, bem como a localização cromossômica
onde o transgene foi incorporado ao genoma. Os níveis de expressão
também podem ser influenciados pelo tipo de tecido amostrado, pela
idade da planta no momento da colheita da amostra e pelas condições
ambientais sob as quais a planta estava crescendo. Dados de ensaios
imunoabsorventes ligados a enzimas (ELISA), mostrando os níveis
de expressão das proteínas Cry34Ab1 e Cry35Ab1 em milho GM
DAS-59122-7 foram disponibilizados em submissões regulatórias e
documentos de decisão associados a processos de autorização regulatória
a nível nacional, supranacional e de estados membros publicamente
acessíveis (BBAC, 2009; CFIA, 2005a; EFSA, 2008, 2009a, 2009b;
FSANZ, 2005; USDA, 2005). Amostras foram coletadas de vários tipos
de tecido, em vários estágios de crescimento, e de plantas cultivadas em
vários locais diferentes para produzir dados representativos da gama
típica de expressão proteica de ambas as proteínas. A Tabela 2 apresenta
os maiores valores reportados de expressão de Cry34Ab1/Cry35Ab1 em
plantas de milho GM que contêm DAS-59122-7 sozinho ou quando o
DAS-59122-7 é piramidado com outros eventos na mesma planta. Dados
de expressão de proteínas podem ser usados para estimar o potencial
de exposição de vários organismos no meio ambiente à Cry34Ab1/
Cry35Ab1 quando o evento de milho GM DAS-59122-7 que produz
estas proteínas é cultivado. Dados de expressão de proteínas disponíveis
atualmente para Cry34Ab1/Cry35Ab1 por DAS-59122-7 e por DAS59122-7 piramidados com outros eventos GM são apresentados no
Anexo I. Em alguns casos, quando as plantas de milho GM continham
cry34Ab1/cry35Ab1, bem como um gene de tolerância a herbicidas (pat
ou epsps), os dados de expressão de proteínas foram coletados de plantas
que tinham sido tratadas com o herbicida apropriado, glufosinato ou
glifosato, bem como de plantas cultivadas no mesmo local mas não
pulverizadas, para determinar se o herbicida teve qualquer efeito sobre as
concentrações de proteína.
Tabela 1. Concentração de proteínas Cry34Ab1 e Cry35Ab1 mais altas
relatadas em milho GM DAS-59122-7 e piramidações de tecidos de
DAS-59122-7.
Tecido
ng de Cry34Ab1/mg
de peso seco
(estágio de crescimento)
ng de Cry35Ab1/mg
de peso seco
(estágio de crescimento)
Folha
302
(R4 – conteúdo do grão é
pastoso)
126
(R4 – conteúdo do grão é
pastoso)
Grão
117
(Maturidade das sementes)
3,7
(Maturidade das sementes)
Raiz
102
(Maturidade)
15,4
(V9 – colar da 4a folha é visível)
Pólen
87,2
(Antese)
0,15
(Antese)
Planta
inteira
88
(Maturidade)
18,1
(R1 – cabelos se tornam visíveis)
Modificações nos genes que codificam Cry34Ab1 e
Cry35Ab1 em milho GM
Para produzir o milho GM resistente a insetos DAS-59122-7, genes
de cry34Ab1 e cry35Ab1 foram isolados da cepa PS149B1 de B.
thuringiensis Berliner (Ellis et al., 2002). Versões sintéticas dos genes
foram criadas nas quais as sequências de DNA haviam sido modificadas
de modo a refletir a preferência de codons no milho, para expressão
ideal de proteínas (Murray, Lotzer e Eberle, 1989). As sequências de
aminoácidos das proteínas Cry34Ab1 e Cry35Ab1 resultantes eram
idênticas às sequências das proteínas bacterianas nativas. A transcrição
dos genes da cry34Ab1 e da cry35Ab1 foi dirigida pelo promotor de
ubiquitina e pelo promotor de peroxidase de trigo, respectivamente.
A terminação da transcrição foi dirigida pelo terminador 35S (CFIA,
2005a; EFSA, 2008; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA,
2005; USEPA, 2005a, 2005b, 2010; USFDA, 2004).6
TESTES DE ORGANISMOS NÃO-ALVO E EFEITOS
DA EXPOSIÇÃO ÀS PROTEÍNAS CRY34Ab1 E
CRY35Ab1
A toxina binária Cry34Ab1/Cry35Ab1 tem propriedades inseticidas
contra certas espécies de insetos coleópteros quando expressa no milho
GM DAS-59122-7. A toxina tem como alvo pragas de insetos coleópteros
que se alimentam de raízes, reduzindo desse modo os danos causados
pela alimentação (Baum et al., 2004; Ellis et al., 2002; Gao et al., 2004;
Herman et al., 2002; Kaiser-Alexnat, Büchs, e Huber, 2009; Oppert,
Ellis, e Babcock, 2010; Schnepf et al., 2005; Storer, Babcock, e Edwards,
2006). Os organismos presentes no meio ambiente que não são pragas
do milho, mas são direta ou indiretamente expostos à toxina binária são
chamados de organismos não-alvo (ONA). A exposição direta ocorre
quando ONA se alimentam de tecidos vivos de culturas que expressam a
toxina binária ou de resíduos de culturas, quer acima ou abaixo do solo.
A exposição indireta resulta da predação por um organismo sobre outro
organismo que teve exposição direta à toxina binária. O potencial de dano
a ONA decorrente da exposição à toxina binária tem sido considerado
nas avaliações de risco realizadas por várias autoridades reguladoras
(CFIA, 2005a; EFSA, 2008; USDA, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Os
dados coletados em ensaios de campo de milhos GM que produzem a
toxina binária submetidos às autoridades regulatórias estabeleceram que
as proteínas Cry34Ab1/Cry35Ab1 são ativas especificamente contra o
subconjunto de pragas de coleópteros que se alimentam de raízes de
milho e são inofensivas para espécies vertebradas e outros ONA (CFIA,
2005a; EFSA, 2008; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA,
2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).
As avaliações dos possíveis efeitos em ONA e as decisões regulatórias
informadas pelas avaliações, foram fundamentadas na bem documentada
e longa história de avaliação das clássicas formulações inseticidas,
incluindo formulações microbianas de B. thuringiensis (Romeis et al.,
2008, 2013; Sanvido et al., 2012). As avaliações dos efeitos em ONA
6 A sequência de DNA usada no processo de transformação original, que
resultou no isolamento do evento DAS-59122-7, continha também o gene pat,
que confere tolerância a herbicidas de glufosinato de amônio. Para uma discussão
completa da segurança ambiental da proteína PAT, consulte "Um exame da segurança ambiental da proteína PAT" (CERA, 2011).
3
incluem a revisão crítica dos dados apresentados pelo desenvolvedor do
produto para demonstrar que os ONA expostos, direta ou indiretamente,
à toxina binária não são prejudicados. A avaliação de riscos aos ONA
começa tipicamente com uma determinação de quais organismos são
suscetíveis de ser direta ou indiretamente expostos à toxina binária.
Atenção especial é frequentemente dada a ONA com funções ambientais
benéficas, tais como polinizadores ou os inimigos naturais de pragas
agrícolas. As autoridades reguladoras podem dar atenção especial a ONA
que foram designados como espécies ameaçadas ou em perigo ou espécies
de reconhecido valor agrícola. Estas espécies, ou substitutos válidos
dessas espécies, são então testadas para determinar se a exposição à toxina
binária pode causar efeitos adversos significativos.
A abordagem de testes em "níveis" para avaliar os efeitos dos pesticidas
químicos sobre ONA tem sido utilizada de forma eficaz há muitos
anos, e os testes em níveis também foram determinados por cientistas
e reguladores como apropriados para a avaliação dos possíveis efeitos
de culturas GM sobre ONA (Duan, Lundgren, Naranjo, e Marvier,
2009; Dutton, Romeis, e Bigler, 2003; EFSA, 2006; Garcia-Alonso et
al., 2006; Raybould, 2006; Romeis et al., 2008, 2013; USEPA, 2007,
2011). Estudos de nível inicial geralmente envolvem a exposição de
ONA ou espécies substitutas a concentrações elevadas do pesticida, em
condições laboratoriais controladas. Estes estudos identificam as espécies
que são significativamente afetadas pelo pesticida. Tais efeitos, quando
encontrados, podem exigir uma análise mais aprofundada a um nível
mais elevado. Testes de nível inicial também identificam os ONA que
não são afetados pela proteína pesticida e para os quais testes de níveis
mais elevados são desnecessários. Testes de níveis mais elevados também
podem ser apropriados quando os resultados dos testes de nível inicial
são inconclusivos. Testes em níveis mais elevados geralmente envolvem
níveis crescentes de complexidade e condições de ensaio cada vez mais
realistas (EFSA, 2006; Garcia-Alonso et al., 2006; Romeis et al., 2008;
USEPA, 2007, 2011).
Vias de exposição ambiental
Além do contato direto com a planta de milho GM, as autoridades
reguladoras podem considerar outras vias de exposição potencial à toxina
binária Cry34Ab1/Cry35Ab1: exposição à toxina no pólen, exposição
à toxina depositada no solo pela decomposição de material vegetal,
e exposição a espécies predadoras que consomem herbívoros que se
alimentaram de plantas de milho GM (CFIA, 2005a; EFSA, 2007, 2008;
FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA, 2004, 2005; USEPA,
2005a, 2010).
A exposição a Cry35Ab1 via pólen é limitada pelos baixos níveis de
expressão desta proteína no pólen de variedades que foram autorizadas
para liberação ambiental por reguladores (ver Tabela 2 e Anexo II). A
expressão de Cry34Ab1 no pólen é comparável aos níveis observados
em plantas de milho inteiras, mas a exposição à Cry34Ab1 via pólen
é limitada pela rápida diminuição da densidade de deposição de pólen
com o aumento da distância da planta de origem (JBCH, 2006a). (Ver
o Anexo I para dados do nível de expressão no pólen de variedades
aprovadas.) Além disso, os dados apresentados às autoridades reguladoras
indicam que a toxina binária sofre degradação rápida depois de liberada
4
da decomposição de tecido vegetal e não é provável que persista ou se
acumule no ambiente do solo (USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005b,
2010).
Testes ecotoxicológicos de Cry34Ab1 e Cry35Ab1 em
organismos não-alvo
Testes ecotoxicológicos de Cry34Ab1 e Cry35Ab1 em ONA foram
realizados em uma variedade de organismos de teste bem caracterizados
que são tipicamente usados para testes ecotoxicológicos de pesticidas
químicos, e os dados destes testes foram avaliados pelas autoridades
reguladoras no decurso da realização de avaliações de riscos para a
liberação no meio ambiente de variedades de milho GM. Apesar de
alguma exposição biologicamente significativa poder ocorrer a uma curta
distância das áreas de cultivo, as autoridades reguladoras têm geralmente
solicitado dados apenas para os impactos da toxina binária sobre as
espécies de polinizadores representativas como, por exemplo, abelhas
melíferas. Além disso, a especificidade da toxina binária para coleópteros,
bem como as evidências que sugerem o potencial de exposição a partir
do solo, levou os reguladores a exigir testes de espécies representativas de
artrópodes que habitam o solo. Algumas autoridades reguladoras também
exigem que dados sejam coletados sobre espécies não artrópodes que
habitam o solo, como minhocas, para demonstrar que a exposição à toxina
binária não tem efeitos significativos sobre estas espécies. Organismos de
teste incluíram Apis mellifera (abelha comum); Orius insidious (percevejopirata); Coleoptera: Coccinella septempunctata, Hippodamia convergens e
Coleomegilla maculata (joaninha) Chrysoperla carnea (crisopídeo); Nasonia
vitripennis (vespa parasita); Folsomia candida (colêmbolo); Daphnia
magna; e Eisenia foetida (minhoca) (Balog, Szenasi, Szekeres, e Palinkas,
2011; CFIA, 2005a; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA, 2004,
2005; USEPA, 2005a, 2010). Os organismos de teste foram expostos a
níveis de Cry34Ab1 e Cry35Ab1 representando estimativas de cenário
de pior caso de exposição baseadas nas concentrações mais elevadas de
toxina binária observadas em tecidos de plantas de milho GM, variando
de 0,15 a 302 ng/mg de peso de tecido seco (veja a Tabela 2). Nenhum
dos organismos de teste mostraram uma resposta significativa à toxina
binária (CFIA, 2005a; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA,
2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Além disso, testes de toxicologia em
vertebrados e testes de equivalência nutricional foram realizados em Mus
musculus (camundongo); Oncorhynchus mykiss (truta arco-íris); Gallus
domesticus (frango); e Rattus rattus (rato Sprague-Daley)(CFIA, 2005a;
EFSA, 2007; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; Malley et al., 2007;
USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005b, 2010).7 Ver Tabela 2.
Os resultados dos testes de Nível 1 indicam que nenhum teste de nível
mais elevado é necessário do ponto de vista regulamentar, pois nenhum
efeito adverso foi observado;8 no entanto, como exposto abaixo, foram
realizados estudos sobre os efeitos da toxina binária em populações
naturais de ONA.
7 A USEPA emitiu um registro condicional do evento DAS-59122-7, mas exigiu
que o requerente realize dois testes adicionais usando Orius insidiosus (percevejo
pirata) e um carabídeo (besouro de solo) (USEPA, 2005a).
8 A realização de estudos de campo é considerada caso a caso, com base
no nível de perigo potencial e exposição, e os objetivos podem ser ajustados
conforme informações e experiências se acumulam (USEPA, 2007).
Tabela 2. Resumo dos estudos ecotoxicológicos de Cry34Ab1 e Cry35Ab1 em organismos não-lepidópteros não-alvo (Malley et al., 2007; USDA, 2004)
Espécie
Método de exposição
Resultados
Apis mellifera (abelha
comum)
Pólen Cry34/35Ab1 do evento
TC5639
NOECpólen = 2 mg/larva (0,056 μg Cry34/35Ab1 ICP†/larva)
NOECICP = 20 μg/larva
Comentários
Proteína Cry34Ab1 (54% de pureza)
e proteína Cry35Ab1 (37% de pureza)
microbianas
NOECCry34Ab1 = 3,2 μg/larva
NOECCry35Ab1 = 2,4 μg/larva
Chrysoperla carnea
(crisopídeo)
Proteína Cry34Ab1 (54% de pureza)
e proteína Cry35Ab1 (37% de pureza)
microbianas
NOEC > 280 μg a.i./mL
LC50 Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mL
NOEC Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mL
LC50 Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mL
NOEC Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mL
Coleomegilla maculata
(joaninha)
Proteína Cry34Ab1 (54% de pureza)
e proteína Cry35Ab1 (37% de pureza)
microbianas
LC50 > 902 μg a.i./g
NOEC > 902 μg a.i./g
LC50 Cry34Ab1 > 900 μg a.i./g
NOEC Cry34Ab1 > 900 μg a.i./g
LC50 Cry35Ab1 > 2 μg a.i./g
NOEC Cry35Ab1 > 2 μg a.i.
Redução de peso relatada
Pólen de homozigoto endogâmico
misturado 1:1 com ovos de lagarta da
espiga moídos
NOEC >58,52 μg a.i./g
NOEC Cry34Ab1 > 58,5 μg a.i./g
NOEC Cry35Ab1 > 0,02 μg a.i./g
Nenhum efeito sobre
a mortalidade, peso ou
desenvolvimento
Daphnia magna
Proteína Cry34Ab1 (54% de pureza)
e proteína Cry35Ab1 (37% de pureza)
microbianas
EC50 > 100 mg a.i./L
NOEC > 100 mg a.i./L
LC50 Cry34Ab1 > 57 mg a.i./L
NOEC Cry34Ab1 > 57 mg a.i./L
LC50 Cry35Ab1 > 43 mg a.i./L
NOEC Cry35Ab1 > 43 mg a.i./L
Eisenia fetida
(minhoca)
Proteína Cry34Ab1 (54% de pureza)
e proteína Cry35Ab1 (37% de pureza)
microbianas
LC50 > 25,4 mg a.i./kg de solo seco
NOEC > 25,4 mg a.i./kg de solo seco
LC50 Cry34Ab1 > 6,4 mg a.i./kg de solo seco
NOEC Cry34Ab1 > 6,4 mg a.i./kg de solo seco
LC50 Cry35Ab1 > 19,0 mg a.i./kg de solo seco
NOEC Cry35Ab1 > 19,0 mg a.i./kg de solo seco
Folsomia candida
(Colêmbolo)
Proteína Cry34Ab1 (54% de pureza)
e proteína Cry35Ab1 (37% de pureza)
microbianas
LC50 > 12,7 mg a.i./kg de dieta
NOEC > 12,7 mg a.i./kg de dieta
LC50 Cry34Ab1 > 3,2 mg a.i./kg de dieta
NOEC Cry34Ab1 > 3,2 mg a.i./kg de dieta
LC50 Cry35Ab1 > 9,5 mg a.i./kg de dieta
NOEC Cry35Ab1 > 9,5 mg a.i./kg de dieta
Gallus domesticus
(frango)
Ração constituída de 60% de milho,
evento DAS-15344
LC50 > 25,1 ng a.i./mg de dieta
NOEC > 25,1 ng a.i./mg de dieta
LC50 Cry34Ab1 > 23 ng a.i./mg de dieta
NOEC Cry34Ab1 > 23 ng a.i./mg de dieta
LC50 Cry35Ab1 > 2,1 ng a.i./mg de dieta
NOEC Cry35Ab1 > 2,1 ng a.i./mg de dieta
Hippodamia convergens
(joaninha)
Proteína Cry34Ab1 (54% de pureza)
e proteína Cry35Ab1 (37% de pureza)
microbianas
LC50 ICP > 280 μg a.i./mL
NOEC > 280 μg a.i./mL
LC50 Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mL
NOEC Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mL
LC50 Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mL
NOEC Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mL
Mus musculus
(camundongo)
Proteína Cry34Ab1 (54% de pureza)
e proteína Cry35Ab1 (37% de pureza)
microbianas
LD50 Cry34Ab1> 2700 mg a.i./kg
LD50 Cry35Ab1> 1850 mg a.i./kg
LD50 Cry34/35Ab1> 2000 mg a.i./kg
Nasonia vitripennis
(vespa parasita)
Proteína Cry34Ab1 (54% de pureza)
e proteína Cry35Ab1 (37% de pureza)
microbianas
LC50 > 280 μg a.i./mL
NOEC > 280 μg a.i./mL
LC50 Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mL
NOEC Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mL
LC50 Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mL
NOEC Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mL
Nenhum efeito sobre a
mortalidade, ganho de peso,
eficiência alimentar ou
rendimento de carcaça
continua na página 6
5
Tabela 2 (continuação)
Espécie
Método de exposição
Resultados
Comentários
Oncorhynchus mykiss
(truta arco-íris)
Proteína Cry34Ab1 (54% de pureza)
e proteína Cry35Ab1 (37% de pureza)
microbianas
LC50 > 100 mg a.i./kg de dieta
NOEC > 100 mg a.i./kg de dieta
LC50 Cry34Ab1 > 25 mg a.i./kg de dieta
NOECCry34Ab1 > 25 mg a.i./kg de dieta
LC50 Cry35Ab1 > 75 mg a.i./kg de dieta
NOEC Cry35Ab1 > 75 mg a.i./kg de dieta
Rattus rattus
(ratos Sprague Daley)
Ensaio subcrônico de 90 dias; ração
constituída de 35% de milho, evento
DAS-59122-7
Nenhuma diferença
adversa relacionada à dieta
observada
† ICP = Proteína cristalina inseticida
Estudos em campo de Cry34Ab1/Cry35Ab1 em organismos
não-alvo
As autoridades reguladoras têm considerado o impacto potencial da
toxina binária em populações naturais de ONA e determinou que efeitos
adversos sobre ONA são improváveis por várias razões. Em primeiro
lugar, a toxina binária tem uma faixa estreita de atividade pesticida.
Em segundo lugar, ensaios laboratoriais de Nível I, empregando uma
gama de espécies de invertebrados presentes nos ecossistemas agrícolas
do milho, ou espécies representativas destas espécies, têm mostrado
que a toxina binária não causa efeitos observáveis significativos​nestas
espécies. Em terceiro lugar, estudos de Nível I demonstraram também
que a toxina binária não tem nenhum efeito observável em espécies
aquáticas e de vertebrados representativas. Em quarto lugar, os níveis
de toxina binária utilizados nestes ensaios de Nível I eram muito mais
elevados do que os medidos nos tecidos de milho GM cultivados no
campo. Em quinto lugar, estudos de campo de variedades de milho que
produzem a toxina binária não mostram efeitos adversos significativos
sobre o besouro estafilinídeo, um artrópode benéfico não-alvo (Balog et
al., 2011) e nenhum efeito sobre a lagarta rosca (Agrotis ipsilon) (USDA,
2004). Em sexto lugar, quando comparado ao controle de insetos via
a toxina binária, o controle de insetos tradicional que usa pesticidas
químicos altera significativamente a diversidade de espécies e prejudica
espécies não-alvo. Juntos, esses resultados indicam que é improvável que
a toxina binária tenha efeitos adversos sobre as populações naturais de
organismos, exceto para os coleópteros pragas de culturas alvo (Balog et
al., 2011; CFIA, 2005a; EFSA, 2008; FSANZ, 2005; Health Canada,
2006; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).
ESTABELECIMENTO E PERSISTÊNCIA NO
MEIO AMBIENTE DE PLANTAS DE MILHO QUE
EXPRESSAM CRY34Ab1 E CRY35Ab1
Biologia das espécies de plantas
A biologia das espécies de plantas não-GM no meio receptor geralmente
é o ponto de partida para avaliações de risco ambiental de plantas
geneticamente modificadas (OCDE, 2003, 2007). Informações sobre a
biologia da planta não-GM podem ser usadas para avaliar se uma variedade
geneticamente modificada da planta pode tornar-se daninha, invasiva, ou
de outro modo prejudicial para o meio ambiente. As informações também
podem fornecer detalhes sobre as interações significativas entre a planta
e os outros organismos que possam ser importantes ao se considerar a
6
probabilidade de riscos. Analisando a biologia da planta hospedeira, um
avaliador de riscos consegue identificar os riscos prováveis que podem
estar associados à expressão da nova proteína (por exemplo, a Cry34Ab1
ou a Cry35Ab1) e, portanto, consegue avaliar a probabilidade destes
riscos serem concretizados. Por exemplo, se a planta é uma espécie anual
ou perene, ou se a planta é auto-polinizada ou polinizada pelo vento pode
influenciar a avaliação da probabilidade de a planta GM se estabelecer e
persistir fora do cultivo (EFSA, 2006; OCDE, 1992, 2003, 2007).
Dados fenotípicos
Informações sobre o fenótipo de plantas GM que expressam Cry34Ab1
e Cry35Ab1 são coletadas de estudos em laboratórios, estufas, e
experimentais de campo e são apresentadas em submissões regulatórias
para (1) identificar quaisquer alterações intencionais no fenótipo que
possam impactar a segurança ambiental da planta e (2) identificar
quaisquer alterações não intencionais na biologia da planta que
possam afetar a segurança ambiental. Dados fenotípicos em submissões
regulatórias e publicações revisadas por pares concentraram-se nas
características da planta que possam contribuir para a sua sobrevivência
ou persistência (ou seja, possível capacidade de competir, sobreviver e
se espalhar), ou que afetem negativamente o desempenho agrícola (por
exemplo, dados de susceptibilidade a doenças e produtividade) (CFIA,
2005a; JBCH, 2006a; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). As
observações fenotípicas levam em conta o fenótipo desejado resultante da
característica transgênica, neste caso a resistência à predação por insetos
mediada por Cry34Ab1 e Cry35Ab1. Alguns dos dados recolhidos são
quantitativos (por exemplo, altura da planta ou percentual de germinação
de sementes), enquanto outros dados são qualitativos e observacionais
(por exemplo, sintomas de susceptibilidade a doenças). Diferenças
estatisticamente significativas entre plantas de milho GM que expressam
a toxina binária e controles foram observadas, mas estas diferenças
não foram consistentes entre os locais de ensaios de campo e ficaram
dentro da faixa relatada para variedades não-GM de milho (CFIA,
2005a; JBCH, 2006a; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).
Coletivamente, os reguladores determinaram que os dados fenotípicos
não suportam a hipótese de que a expressão da toxina binária teve
algum impacto indesejável sobre a morfologia bruta ou características
fenotípicas das plantas de milho, além de conferir resistência a pragas de
insetos coleópteros (CFIA, 2005a; JBCH, 2006a; USDA, 2004, 2005;
USEPA, 2005a, 2010).
Capacidade de competir, sobreviver e se espalhar nos
ambientes agrícolas
O milho não é geralmente considerado uma erva daninha, possuindo
poucas das características que aumentam a probabilidade de uma planta
de se tornar uma erva daninha, como a dormência das sementes, dispersão
das sementes por degrane e competitividade (Baker, 1974; Carpenter et
al., 2002; JBCH, 2006a; OCDE, 2003; Raybould et al., 2011; USDA,
2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Não existem dados que indiquem
que a expressão da toxina binária resulta em alteração da dormência
das sementes, capacidade de hibernação ou outras características que
alterariam a prevalência de milho voluntário em épocas de cultivo
subsequentes (Carpenter et al., 2002; JBCH, 2006a; OCDE, 2003;
Raybould et al., 2011; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Não
se espera que plantas de milho voluntárias na época de cultivo seguinte
que produzam a toxina binária apresentem qualquer dificuldade de
manejo e podem ser tratadas da mesma maneira que plantas voluntárias
convencionais de milho.
Capacidade de competir, sobreviver e se espalhar em
ambientes não-agrícolas
Os principais mecanismos pelos quais a toxina binária pode ser introduzida
em um ambiente não-agrícola são através do movimento de propágulos
fora das áreas cultivadas e através de fluxo gênico da planta GM para
uma população naturalizada de parentes sexualmente compatíveis
(Lee e Natesan, 2006). As avaliações de risco do milho geneticamente
modificado que expressa a toxina binária levaram em consideração os
efeitos prováveis associados aos dois tipos de movimento (Carpenter et
al., 2002; JBCH, 2006a; OCDE, 2003; Raybould et al., 2011; USDA,
2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Como resultado do cruzamento
seletivo extenso, as variedades comerciais de milho são severamente
restringidas na sua capacidade para persistir em ambientes não-agrícolas
sem intervenção humana, e o milho não é considerado uma erva daninha
invasiva ou agressiva fora dos sistemas agrícolas (Carpenter et al., 2002;
JBCH, 2006a, 2006b; OCDE, 2003; USDA, 2004, 2005; USEPA,
2005a, 2010). Dados agronômicos mostram que a toxina binária não
tem um impacto significativo sobre as características associadas com a
capacidade de competir, sobreviver e se espalhar (Carpenter et al., 2002;
JBCH, 2006a; OCDE, 2003; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a,
2010). Embora a liberação de fatores de controle natural (incluindo
insetos herbívoros) tenha sido apresentada como uma explicação parcial
para o sucesso de espécies invasoras (Blumenthal, 2005; Keane e Crawley,
2002; Mack, 1996; Mason, Braun, Warwick, Zhu e Stewart, 2004),
as decisões reguladoras determinaram ser improvável que a adição de
resistência a pragas de coleópteros permitiria que o milho que produz a
toxina binária se torne invasivo em ambientes não-agrícolas (Carpenter
et al., 2002; JBCH, 2006a, 2006b; OCDE, 2003; USDA, 2004, 2005;
USEPA, 2005a, 2010).
Movimento de transgenes para parentes sexualmente
compatíveis
a espécies sexualmente compatíveis, a mobilidade e viabilidade do pólen,
e a presença de polinizadores adequados. O milho é predominantemente
polinizado pelo vento e não tem parentes sexualmente compatíveis que
sejam considerados invasivos (Carpenter et al., 2002; OCDE, 2003). O
milho hibridiza livremente com teosintos silvestres, mas acredita-se que a
introgressão de genes seja limitada (Baltazar, De Jesús Sánchez-Gonzalez,
De la Cruz-Larios e Schoper, 2005; Castillo-Gonzalez e Goodman, 1997;
OCDE, 2003). As populações silvestres de teosinto estão limitadas ao
México, Guatemala e uma única população na Nicarágua, e enquanto o
teosinto é considerado uma grave erva daninha por alguns agricultores no
México, é tratado como uma planta de forragem por outros agricultores,
sendo considerado uma espécie significativa para a cultura (González
e Corral, 1997; Mondragon-Pichardo e Vibrans, 2005). Cruzamentos
entre teosinto e milho GM que expressa as proteínas Cry34Ab1 e
Cry35Ab1 não devem ocorrer mais frequentemente do que aqueles entre
teosinto e variedades de milho tradicionalmente cultivadas (Carpenter et
al., 2002; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).
ANÁLISE DE COMPOSIÇÃO DE PLANTAS DE MILHO
QUE EXPRESSAM CRY34Ab1 E CRY35Ab1
Uma análise da composição é necessária em muitos processos de aprovação
regulamentar para plantas GM destinadas a serem usadas em alimentos
ou rações. Dados de composição podem ser utilizados para identificar
alterações indesejáveis na cultura devido à presença do transgene. A
análise tipicamente compara a planta GM com a linha parental não
transformada ou uma isolinha intimamente relacionada, e os analitos
medidos dependem da cultura e as suas utilizações previstas. A análise
pode usar as plantas cultivadas em uma variedade de locais ao longo de
mais de um ano, porque as condições ambientais locais podem afetar a
composição nutricional mesmo em variedades cultivadas tradicionais. O
objetivo da análise é confirmar que os valores obtidos para a planta GM
estão dentro da faixa observada em variedades tradicionais cultivadas sob
condições comparáveis.
Sementes de milho GM que expressam Cry34Ab1 e Cry35Ab1 passaram
por análise centesimal para determinar os níveis de proteína bruta,
gordura bruta, fibra, umidade e cinzas. Além disso, os níveis de minerais,
ácidos graxos e aminoácidos específicos foram determinados. Algumas
plantas cultivadas produzem toxinas ou compostos anti-nutritivos, e
os níveis destes compostos também são medidos para determinar se a
presença dos transgenes, inadvertidamente, resultou na produção elevada
destas substâncias. O milho é conhecido por produzir os compostos
anti-nutritivos ácido fítico, rafinose e inibidor de tripsina (OCDE,
2002), e os níveis destas substâncias foram determinados. Dados de
fontes publicamente disponíveis estão resumidos no Anexo II. Todas as
diferenças verificadas entre as variedades de milho GM analisadas e as
variedades de comparação estavam dentro da faixa normal de variação,
e essas diferenças foram consideradas irrelevantes para a segurança
ambiental (CFIA, 2005a; EFSA, 2008, 2009b; Health Canada, 2006;
USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).
O movimento de transgenes de uma planta GM para os seus parentes
silvestres é mediado por pólen e a produção de híbridos de reprodução
viável depende de diversos fatores: se o doador de pólen é autopolinizado, a proximidade física e temporal das plantas GM em relação
7
CONCLUSÃO
As proteínas Cry34Ab1 e Cry35Ab1 produzidas por plantas GM
resistentes a insetos são derivadas da bactéria do solo comum Bacillus
thuringiensis e são especificamente tóxicas para coleópteros. Ensaios
de toxicidade com uma gama de organismos não-alvo representativos
produziram valores de NOEC em concentrações significativamente mais
elevadas do que as concentrações ambientais esperadas de Cry34Ab1
ou Cry35Ab1. Os dados de campo sugerem que o cultivo de plantas
de milho GM que expressam a toxina binária não afeta a abundância
de artrópodes não-alvo. A toxina binária em plantas pode ser tóxica
para coleópteros não-alvo, mas avaliações de risco regulamentares para
produtos aprovados concluíram que o risco é baixo devido à ausência de
exposição à toxina no meio ambiente, em especial quando comparado
com outras práticas de controle de insetos. O peso da evidência de
análises de dados fenotípicos e de composição demonstra que a expressão
de Cry34Ab1 e Cry35Ab1 nas variedades de milho aprovadas não altera
a fisiologia bruta das plantas cultivadas e indica que estas plantas não são
mais propensas a se tornar daninhas ou invasivas do que as variedades de
milho convencionais.
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ANEXO I. RESUMO DOS DADOS DE EXPRESSÃO DE
CRY34Ab1/CRY35Ab1
Tabela I.1. Níveis médios máximos e mínimos de expressão de Cry34Ab1
e Cry35Ab1 em milho DAS-59122-7
As tabelas a seguir apresentam dados resumidos de documentos de decisões preparados por autoridades regulatórias e submissões regulatórias.
Sempre que possível, os dados e as estatísticas que acompanham são apresentados como apareceram no documento citado para facilitar a referência cruzada. Informações adicionais sobre as metodologias de coleta e
amostragem podem ser encontradas nas fontes citadas.
Média mínima
ng/mg de peso seco de tecido
Média máxima
ng/mg de peso seco de tecido
Cry34Ab1
29,2
(caule híbrido pulverizado*)
232
(folha híbrida pulverizada)
Cry35Ab1
0,01
(pólen híbrido pulverizado)
85,3
(folha híbrida não
pulverizada)
* Tratamentos "pulverizados" receberam duas aplicações sequenciais de herbicida
glufosinato de amônio.
Tabela I.2. Níveis de expressão em grãos (ng/mg de peso seco de tecido) (EFSA, 2008, 2009a, 2009b)
59122 x NK6031
Média
Faixa
59122 x 15072
Média
59122 x 1507 x NK603
Faixa
Média
59122
Faixa
Média
Faixa
Cry34Ab1
52
34 – 76
52
28 – 88
48
23 – 70
41
30 – 51
Cry35Ab1
2,8
2,1 – 3,7
2,3
1,7 – 3,1
2,1
1,4 – 2,9
2,2
1,3 – 3,2
1 Linha parental NK603 conferiu tolerância ao glifosato (CP4 EPSPS).
2 Linha parental 1507 conferiu tolerância ao glufosinato e resistência a insetos (PAT e Cry1F).
Tabela I.3. Resumo dos níveis de expressão da proteína Cry34Ab1 em grãos de milho DAS-59122-7 colhidos na maturidade
Média
(ng/mg de peso seco)
Desvio padrão
Faixa
(ng/mg de peso seco)1
Número de amostras2
0
0
0-0
6/6
Híbrido GM não pulverizado
49,7
16,2
28,9-84,8
30/0
Híbrido GM pulverizado
61,1
19,4
30,9-117
30/0
Endogâmico GM
51,7
11,5
38,6-78,3
15/0
Controle não GM
1 O limite de quantificação (LOQ) para Cry34Ab1 de grãos foi de 0,072 ng/mg de peso seco.
2 Número de amostras = número de amostras analisadas/número de amostras abaixo do limite de quantificação.
Tabela I.4. Resumo dos níveis de expressão da proteína Cry35Ab1 em grãos de milho DAS-59122-7 colhidos na maturidade
Média
(ng/mg de peso seco)
Desvio padrão
Faixa
(ng/mg de peso seco)1
Número de amostras2
0
0
0-0
6/6
Híbrido GM não pulverizado
0,99
0,33
0,48-1,58
30/0
Híbrido GM pulverizado
0,92
0,30
0,50-1,61
30/0
Endogâmico GM
1,10
0,54
0-1,83
15/2
Controle não GM
1 O limite de quantificação (LOQ) para Cry34Ab1 de grãos foi de 0,072 ng/mg de peso seco.
2 Número de amostras = número de amostras analisadas/número de amostras abaixo do limite de quantificação.
Tabela I.5. Níveis de expressão médios de Cry34Ab1 e Cry35Ab1 em tecidos de uma linhagem de milho híbrido contendo o evento DAS-59122-7
(USEPA, 2005a, 2010)
Tecido
Cry34Ab1 (ng/mg de peso seco de tecido ± desvio padrão)*
Cry35Ab1 (ng/mg de peso seco de tecido ± desvio padrão)*
Folha
50±8 - 220±38
41±7 - 85±19
Raiz
37±9 - 50±20
3±2 - 8±8
Planta inteira
32±16 - 77±10
7±2 - 14±2
Pólen
74±7
0,02±0,04
Caule
33±4
10±2
Forragem
53±10
12±3
Grão
50±16
1±0,3
* As faixas refletem a gama de médias em diferentes estágios de crescimento.
11
Tabela I.6. Resumo dos níveis de expressão da proteína Cry34Ab1 medidos em tecidos coletados do híbrido de milho 59122 (evento DAS-59122-7)
(USDA, 2004)
Estágio de
crescimento
V93
R14
R45
Maturidade6
R6
7
Média de Cry34Ab1 (ng/
mg de peso seco de tecido)
Desvio padrão
Faixa de Cry34Ab1 (ng/mg
de peso seco de tecido)1
Número de amostras2
Folha
49,5
Raiz
38,8
7,79
37,0 - 81,4
30
8,28
24,6 - 56,3
Planta inteira
18
31,5
15,5
8,67 - 51,9
6
Folha
80,6
12,4
59,1 - 103
30
Tecido
Pólen
74,4
6,57
62,9 - 87,2
30
Caule
32,9
4,14
25 - 40,6
30
Raiz
36,8
8,54
23,3 - 52,1
30
Planta inteira
45,4
13,5
35 - 71,9
6
Folha
220
37,5
143 - 302
18
Raiz
49,1
9,23
33,3 - 67,3
18
Forragem
53,1
19,1
30,5 - 82,6
6
Grão
49,7
16,2
28,9 -- 84,8
30
Folha
163
83,6
4,26 - 296
18
Raiz
49,7
19,6
25,7 - 102
18
Planta inteira
76,5
10,3
60,5 - 88
6
1 Limite de quantificação (LOQ) das amostras para Cry34Ab1: 0,18 ng/mg de peso seco para folha; 0,26 ng/mg de peso seco para pólen; 0,12 ng/mg de peso seco para caule;
0,99 ng/mg de peso seco para raiz; e 0,072 ng/mg de peso seco para grãos e tecidos vegetais inteiros.
2 Todas as amostras medidas estavam acima do LOQ
3 Estágio de crescimento em que o colar da quarta folha se torna visível.
4 Estágio de crescimento em que os cabelos se tornam visíveis.
5 Estágio de crescimento em que o material dentro do grão produz uma consistência pastosa. Este estágio pode ocorrer tão cedo quanto 24 dias após a polinização.
6 Maturidade típica de colheita para grãos.
7 Maturidade, a maturidade típica de colheita para grãos.
Tabela I.7. Resumo dos níveis de expressão da proteína Cry35Ab1 medidos em tecidos coletados do híbrido de milho 59122 (evento DAS-59122-7)
(USDA, 2004)
Estágio de
crescimento
V9
3
R14
R45
Maturidade
6
R67
Tecido
Média de Cry34Ab1 (ng/
mg de peso seco de tecido)
Desvio padrão
Faixa de Cry34Ab1 (ng/mg
de peso seco de tecido)1
Número de amostras2
Folha
40,7
7,29
29,7 – 55,1
30
18
Raiz
8,06
2,98
4,08 – 15,4
Planta inteira
7,36
2,19
4,13 – 10,1
6
Folha
52,2
12,9
29,2 – 80,8
30
Pólen
0,02
0,04
0 – 0,15
30
Caule
10,0
2,26
5,64 – 14,2
30
30
Raiz
5,08
1,57
2,49 – 8,85
Planta inteira
12,3
3,54
9,02 – 18,1
6
Folha
85,3
18,9
61,1 – 126
18
Raiz
3,50
0,85
1,74 – 5,76
18
Forragem
12,4
2,77
8,44 – 16,4
6
Grão
0,99
0,33
0,48 – 1,58
30
Folha
54,4
22,2
1,41 – 77,3
18
Raiz
3,10
2,43
0,72 – 10,6
18
Planta inteira
13,9
1,91
10,7 – 16,4
6
1 Limite de quantificação (LOQ) das amostras para Cry34Ab1: 0,18 ng/mg de peso seco para folha; 0,26 ng/mg de peso seco para pólen; 0,12 ng/mg de peso seco para caule;
0,99 ng/mg de peso seco para raiz; e 0,072 ng/mg de peso seco para grãos e tecidos vegetais inteiros.
2 Todas as amostras medidas estavam acima do LOQ
3 Estágio de crescimento em que o colar da quarta folha se torna visível.
4 Estágio de crescimento em que os cabelos se tornam visíveis.
5 Estágio de crescimento em que o material dentro do grão produz uma consistência pastosa. Este estágio pode ocorrer tão cedo quanto 24 dias após a polinização.
6 Maturidade típica de colheita para grãos.
7 Maturidade, a maturidade típica de colheita para grãos.
12
Tabela I.8. Estimativas de exposição elevada (HEEE)1 para a expressão das proteínas Cry34/35Ab1. As HEEE baseiam-se nos valores de expressão obtidos
de plantas de milho não pulverizadas com glufosinato de amônio e de plantas pulverizadas com glufosinato de amônio. (USDA, 2004)
Cry34Ab1
Tecido (fase de crescimento)
Média
Soma de
Cry34 e
Cry35
Cry35Ab1
Desv. pad.
HEEEa
N
Média
Desv. pad.
HEEE
N
HEEE
Folha (V9)
45,93
7,56
47,19
60
36,27
9,07
37,79
60
84,98
Planta inteira (V9)
39,41
22,76
48,31
12
7,75
1,92
8,50
12
56,81
Raiz (V9)
38,48
8,72
40,37
36
8,05
2,80
8,65
36
49,02
Pólen (R1)
74,27
6,09
75,29
60
0,02
0,03
0,03
60
75,32
Caule (R1)
31,03
4,62
31,81
60
8,64
2,54
9,06
60
40,87
Raiz (R1)
40,58
10,43
42,32
60
5,24
1,58
5,50
60
47,83
Folha (R1)
76,24
1,257
78,34
60
54,51
14,30
56,91
60
135,25
Planta inteira (R1)
46,48
14,23
52,05
12
12,66
4,27
14,34
12
66,38
Forragem (R4)
46,58
24,23
56,06
12
13,25
2,89
14,38
12
70,44
Raiz (R4)
57,98
22,00
62,75
36
3,70
1,02
3,93
36
66,68
Folha (R4)
226,44
39,52
235,03
36
83,01
18,39
87,00
36
322,03
Grão (R6, colheita)
55,39
18,3
58,51
60
0,95
0,31
1,01
60
59,52
Planta inteira, incluindo o grão
(R6, senescência)
86,30
18,01
93,35
12
15,38
2,93
16,52
12
109,87
Planta inteira, excluindo o grão
(R6, senescência)
109,032
132,533
Raiz (R6, senescência)
54,04
20,83
58,56
36
3,33
2,18
3,80
36
62,37
Folha (R6, senescência)
149,52
81,93
167,31
36
53,20
23,26
58,25
36
225,57
Estimativa de exposição elevada = Média + (t0,1 cauda superior, n-1 x desvio padrão)/n1/2.
2 g de ps/A de grãos = ((235 bu/A – 235 bu/A x (1-0,85 de peso seco)) x 56 lb/bu) x 1 g/0,002205 lb = 5073016. g de ps/A de fração volumosa = g de ps/A de grãos x 1/0,45 =
11273369. Proteína em fração volumosa, μg/g de peso seco = (proteína na planta inteira, incluindo os grãos (R6, senescência) x soma de g ps/A de grãos + fração volumosa. Proteína
nos grãos (R6, colheita) x g ps/A dos grãos) x 1/g ps/A da fração volumosa = (93,35 x 16346384 – 58,51 x 5073016) x 1/11273369 = 109,03.
3 (109,87 x 16346384 – 59,52 x 5073016) x 1/11273369 = 132,53.
Tabela I.9. Média das proteínas Cry34Ab1 e Cry35Ab1 produzidas no milho DAS-59122-7 (CFIA, 2005b)
Folha,
todas as fases de
crescimento
Raiz,
todas as fases de
crescimento
Cry34Ab1
54,9-266,41
Cry35Ab1
23,3-97,1
Caule
Grão
Pólen
Forragem
35,4-43,7
49
36,4
64,7
97,7
5,3-15,5
19,3
2,0
0,06
28,1
1 Todos os valores expressos em nanogramas de proteína por miligrama de peso seco de tecido.
13
ANEXO II: RESUMO DAS ANÁLISES DE
COMPOSIÇÃO DE MILHO GM QUE EXPRESSA
CRY34Ab1 E CRY35Ab1
Tabela II.1. Resumo da análise elementar e de fibra em grãos de milho DAS-59122-7 (em 6 locais) (FSANZ, 2005)
Analito1
Faixa de Literatura
Médias2
DAS-59122-7 não pulverizado
DAS-59122-7 pulverizado
Controle
Proteína bruta
6-16,1
10,0*
10,3*
9,61
Gordura bruta
1,2-18,8
4,69
4,62
4,49
2,3
1,6-5,5
2,3
2,2
Fibra em detergente ácido
1,82-11,3
3,5
3,6
3,5
Fibra em detergente neutro
3,0-22,6
10,8
11,2*
10,3
Cinza
0,62-6,28
1,55*
1,6*
1,42
Carboidratos3
63,3-89,8
83,8
83,5*
84,5
Fibra bruta
1 Porcentagem de peso seco
2 Médias de quadrados mínimos
3 Carboidrato=100% - % de proteína -% de gordura -% de cinza
* Diferença estatisticamente significativa entre os grãos do DAS-59122-7 e os grãos do controle (P<0,05)
Tabela II.2. Resumo da análise elementar e de fibra de DAS-59122-7 e forragem de controle (em 6 locais) (FSANZ, 2005)
Analito1
Faixa de Literatura
Médias2
DAS-59122-7
Controle
Erro padrão
Proteína bruta
3,14 - 15,9
6,45
6,27
0,097
Gordura bruta
0,37 - 6,7
2,73
2,68
0,068
19 - 42
24,0
23,7
0,237
Fibra em detergente ácido
16,1 - 41,0
31,7
31,1
0,363
Fibra em detergente neutro
20,3 - 63,7
49,4
49,4
0,388
Cinza
1,3 - 10,5
5,60*
5,13
0,103
Carboidratos3
66,9 - 94,5
85,2*
85,9
0,210
Fibra bruta
1 Porcentagem de peso seco
2 Médias de quadrados mínimos
3 Carboidrato=100% - % de proteína -% de gordura -% de cinza
* Diferença estatisticamente significativa entre os grãos do DAS-59122-7 e os grãos do controle (P<0,05)
Tabela II.3. Resumo da análise mineral de milho DAS-59122-7 (em 6 locais) (FSANZ, 2005)
Analito1
Faixa de Literatura
Médias2
DAS-59122-7 não pulverizado
DAS-59122-7 pulverizado
Controle
Cálcio
0,002-0,1
0,00278*
0,00286*
0,00227
Fósforo
0,21-0,75
0,299
0,308*
0,266
Cobre
0,000085-0,001
0,000112
0,000104
0,000118
Ferro
0,0001-0,01
0,00199
0,00225
0,00194
Magnésio
0,08-1,0
0,117
0,123
0,108
Manganês
0,000577
0,00007-0,0054
0,000648
0,000686*
Potássio
0,28-0,72
0,352
0,362
0,332
Sódio
0,0-0,15
0,000427
0,000367
0,000378
Zinco
0,00065-0,0037
0,00183
0,00179
0,00163
1 Porcentagem de peso seco
2 Médias de quadrados mínimos
* Diferença estatisticamente significativa entre os grãos do DAS-59122-7 e os grãos do controle (P<0,05)
14
Tabela II.4. Resumo da análise dos ácidos graxos de grãos de milho DAS-59122-7 (em 6 locais) (FSANZ, 2005)
Analito1
Faixa de Literatura
Médias2
DAS-59122-7 não pulverizado
DAS-59122-7 pulverizado
Controle
Ácido palmítico
6,51-19
11,5*
11,7
12,1
Ácido esteárico
0-4,17
1,39*
1,40*
1,57
Ácido oleico
18,6-46
22,8
23,1
23,3
Ácido linoléico
34-70
63,0*
62,4
61,7
Ácido linolénico
0-2,0
1,14
1,15*
1,07
1 Porcentagem de peso seco
2 Médias de quadrados mínimos
* Diferença estatisticamente significativa entre os grãos do DAS-59122-7 e os grãos do controle (P<0,05)
Tabela II.5. Resumo da análise dos aminoácidos em grãos de milho DAS-59122-7 (em 6 locais) (FSANZ, 2005)
Analito1
Faixa de Literatura
Médias2
DAS-59122-7 não pulverizado
DAS-59122-7 pulverizado
Controle
Metionina
0,1-0,46
0,20
0,19
0,19
Cisteina
0,08-0,32
0,23
0,22
0,22
Lisina
0,05-0,55
0,28
0,29
0,28
Triptofano
0,04-0,13
0,06*
0,06
0,06
Treonina
0,21-0,58
0,38
0,41*
0,37
Isoleucina
0,19-0,071
0,34*
0,35*
0,33
Histidina
0,15-0,40
0,26*
0,28*
0,25
Valina
0,21-0,85
0,46*
0,48*
0,45
Leucina
0,43-2,41
1,33*
1,38*
1,28
Arginina
0,22-0,64
0,29*
0,30*
0,28
Fenilalanina
0,04-0,83
0,56*
0,59*
0,54
Glicina
0,24-0,50
0,35
0,36*
0,33
Alanina
0,37-1,20
0,82
0,83*
0,80
Ácido aspártico
0,37-0,95
0,69
0,70*
0,66
Ácido glutâmico
0,89-3,04
2,03
2,08*
1,97
Prolina
0,43-1,46
0,96*
0,98*
0,91
Serina
0,24-0,91
0,51
0,54*
0,50
Tirosina
0,11-0,79
0,24*
0,26*
0,21
1 Porcentagem de peso seco
2 Médias de quadrados mínimos
* Diferença estatisticamente significativa entre os grãos do DAS-59122-7 e os grãos do controle (P<0,05)
Tabela II.6. Resumo da análise das vitaminas de grãos de milho DAS-59122-7 (em 6 locais) (FSANZ, 2005)
Analito1
Faixa de Literatura
Médias2
DAS-59122-7 não pulverizado
DAS-59122-7 pulverizado
Controle
Beta-caroteno
1,0, 2,5
7,62
7,74
6,87
Vitamina B1
1,0-8,6
5,45
5,93
5,77
Vitamina B2
0,25-16,5
N/D4
ND
ND
Ácido fólico
0,147-1,209
0,593*
0,603
0,634
Vitamina E5
1,5-6,87
6,59*
6,60*
5,65
3
1 Porcentagem de peso seco
2 Médias de quadrados mínimos
3 Apenas 2 valores de referência estavam disponíveis
4 ND = Não detectada
5 Medida como α-tocoferol
* Diferença estatisticamente significativa entre os grãos do DAS-59122-7 e os grãos do controle (P<0,05)
15
Tabela II.7. Resumo de metabólitos secundários e antinutrientes de grãos de milho DAS-59122-7 (em 6 locais) (FSANZ, 2005)
Analito1
Faixa de Literatura
Médias2
DAS-59122-7 não pulverizado
DAS-59122-7 pulverizado
Controle
Metabólitos secundários
Inositol
NR3
0,022
0,022
0,021
Rafinose
0,08-0,31
0,13
0,13
0,12
Furfural
NR
N/D4
ND
ND
0,003-0,058
0,014
0,014
0,015
0,02-0,37
0,177
0,176
0,182
Ácido fítico
0,29-1,29
0,877
0,798
0,798
Inibidor de tripsina (TIU/g)
1,1-7,18
2,82
2,84
2,84
P-Ácido cumárico
Ácido ferúlico
Antinutrientes
1 Porcentagem de peso seco
2 Médias de quadrados mínimos
3 NR = Não reportado
4 ND = Não detectado
16