Ecologia química de machos de Aedes (Stegomyia) aegypti

KELLY DA SILVA PAIXÃO
Ecologia química de machos de Aedes (Stegomyia) aegypti Linnaeus, 1762
(Diptera: Culicidae) e identificação química de compostos presentes na
cutícula de adultos
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Belo Horizonte, MG
2011
KELLY DA SILVA PAIXÃO
Ecologia química de machos de Aedes (Stegomyia) aegypti Linnaeus,
1762 (Diptera: Culicidae) e identificação química de compostos
presentes na cutícula de adultos
Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Parasitologia do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal
de Minas Gerais, como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em Ciências.
Área de concentração: Entomologia
Orientador: Dr. Álvaro Eduardo Eiras
Co-orientador: Dr. Evaldo Ferreira Vilela
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Belo Horizonte, MG
2011
Trabalho desenvolvido no Laboratório de
Ecologia
Química
de
Insetos
Vetores
(LabEQ), Universidade Federal de Minas
Gerais com auxílio do CNPQ.
PESQUISADORES COLABORADORES
Dr. Klaus Carbonel. Jaffé – Laboratório de Comportamiento, Universidad Simón
Bolívar – Venezuela.
Dra. Daniela Maria do Amaral Ferraz Navarro – Laboratório de Ecologia Química,
Departamento de Química Fundamental – Universidade Federal de Pernambuco.
Dra. Luciane Gomes Batista-Pereira – Laboratório de Ecologia Química de Insetos
Vetores.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao programa de Pós-Graduação em Parasitologia da UFMG pela
oportunidade de desenvolver este projeto.
Aos professores e funcionários do Departamento de Parasitologia da UFMG,
especialmente à Sumara Ferreira, secretária do programa de pós-graduação, um
verdadeiro anjo em nossas vidas que não mede esforços para ajudar.
Ao CNPQ pela concessão da bolsa de doutorado.
Ao Dr. Álvaro E. Eiras, meu orientador, pela oportunidade, pelo voto de
confiança ao iniciarmos este projeto e pelos ensinamentos ao longo de todos esses anos.
Ao Dr. Evaldo F. Vilela, co-orientador do projeto, por todo o apoio, todas as
contribuições e por me permitir aprender um pouco com ele.
Ao Dr. Klaus C. Jaffé pela colaboração e auxílio no preparo dos extratos.
À Dra. Daniela M. A. F. Navarro pela participação na identificação química,
trabalho realizado de maneira competente e impecável. Obrigada por me receber tão
bem em Recife e tornar prazerosa minha estadia.
À Dra. Luciane G. Batista- Pereira pela colaboração auxiliando na parte de
cromatografia, pelas revisões na tese e no artigo, pelo carinho e atenção, sempre.
Aos funcionários da central analítica do Departamento de Química Fundamental
da Universidade Federal de Pernambuco, em especial ao Sr. Lúcio, à Conceição e à
Eliete.
À técnica de nível superior Célia de Sá Sciavico por estar sempre disponível
para ajudar. É difícil imaginar como uma única pessoa possa ter tantas qualidades. Você
é um anjo que Deus colocou no LabEQ!
Aos voluntários nos experimentos com odor humano obrigada pela
disponibilidade em ajudar.
Aos muitos estagiários que passaram por atuaram neste trabalho e abraçaram um
projeto que começou do zero, mas com muito, muito trabalho: Ariana, Carla, Lucilene,
Marina. Especialmente ao Caio Leme e o Iuri Pereira que resistiram bravamente até o
fim ao calor da sala de machos ao separar pupas e o forno da sala de olfatometria.
Obrigada pela dedicação e compromisso, essa conquista também é de vocês!
À técnica Taís Ribeiro Guimarães, responsável pela manutenção da colônia de
insetos do laboratório. Querida Taís, obrigada por ser tão doce e se esforçar tanto para
cuidar dos meus mosquitos!
Aos amigos que fiz no LabEQ com os quais muito aprendi e hoje ensinam a
outros: Andrey, Claudinha, Ivi, Marcelo, Renatinha e Rose, que mesmo de longe torcem
e confortam nos momentos de desespero!
Aos amigos que ainda estão por aqui e tornam meus dias mais felizes. Ana Paula
Carrusca (que trouxe mais alegria ao lab), Andréia, Anna, Caio, Caro, Célia, Estefane,
Isadora, Iuri, Laila, Lú, Milton, Moreno, Priscila, Taís, Tati. Obrigada por tornarem o
LabEQ um lugar especial, obrigada pelas companhias em congressos, pelos ―ojos
grandes‖, pelos almoços, açaís, filmes, gargalhadas ... Que Deus abençoe imensamente
a cada um de vocês e retribua todo o bem que me fazem.
Aos amigos do Departamento de Parasitologia e da minha turma de mestrado.
Aos amigos e familiares que tanto oraram por mim! Aos tios, primos, amigos,
sogros e cunhados que estão sempre na torcida. À minha família pelo carinho, amor e
atenção: meus pais Edimar e Maria Raimunda, meus irmãos Keidson, Kenny e Camila e
minha cunhada Taís. Amo vocês!
.
Ao Bruno, meu marido e amigo de verdade, que acredita e confia em mim mais
que eu mesma. Que ao final disso tudo já virou Biólogo de tanto me ouvir falar!
Inclusive me dando idéias para os experimentos! Obrigada por deitar para dormir perto
de mim, enquanto eu virava noites trabalhando e dizer: ―se precisar de alguma coisa me
acorde‖! Você sabe que não dá pra escrever tudo aqui, senão seria outra tese. Amo
você! 3=1!
Agradeço a Deus, o principal responsável, por mais uma etapa concluída, por
mais uma conquista com a certeza de que Ele sempre esteve à frente.
“É preciso que eu suporte duas ou três
larvas se quiser conhecer as borboletas.”
Antoine Saint-Exupéry
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO GERAL
1.1 O mosquito Aedes (Stegomyia) aegypti
1.2 Aspectos da biologia de Aedes aegypti
1.3 Comportamento de alimentação e de localização de hospedeiros realizados pelo
Aedes aegypti
1.4 Importância do Aedes aegypti em Saúde Pública
1.5 Ecologia química de insetos
1.6 Feromônios sexuais em insetos
1.7 Orientação dos insetos
1.8 Bioensaios comportamentais
2 JUSTIFICATIVA
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
3.2 Objetivos específicos
20
21
21
21
24
28
31
32
33
34
36
36
36
Capítulo I: Resposta de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762) ao odor de
hospedeiros vertebrados em olfatômetro horizontal de dupla escolha
1 Introdução
2 Material e métodos
38
39
41
2.1 Criação dos insetos
41
2.2 Bioensaios em olfatômetro horizontal de dupla escolha
2.3 Experimento 1. Avaliação da metodologia de captura dos insetos para teste
43
45
2.4 Experimento 2: Respostas de machos virgens de Aedes aegypti de diferentes
idades ao odor humano
47
2.5 Experimento 3: Respostas de machos e fêmeas, virgens e copulados, ao odor de
diferentes hospedeiros humanos
48
2.6 Experimento 4: Respostas de machos virgens de Aedes aegypti ao odor de
diferentes hospedeiros vertebrados
2.7 Análise estatística
3 Resultados
3.1Experimento 1: Avaliação da metodologia de captura dos insetos para teste
49
51
52
52
3.2 Experimento 2: Respostas de machos virgens de Aedes aegypti de diferentes
idades ao odor humano
53
3.3 Experimento 3: Respostas de machos e fêmeas, virgens e copulados, ao odor de
diferentes hospedeiros humanos
54
3.4 Experimento 4: Resposta de machos virgens de Aedes aegypti ao odor de
diferentes hospedeiros vertebrados
57
4 Discussão
59
Capítulo II. Padronização da extração e identificação química dos compostos presentes
na cutícula de adultos virgens de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762)
1 Introdução
63
64
2 Material e métodos
2.1 Criação de Aedes aegypti para o preparo dos extratos
2.2 Extração do odor de adultos de Aedes aegypti
2.2.1 Padronização da extração de compostos cuticulares de Aedes aegypti
2.2.2 Cromatografia a gás
2.2.3 Cromatografia a gás acoplada ao espectrômetro de massas (CG - EM)
3 Resultados
67
67
67
67
69
69
71
3.1 Padronização da extração de compostos cuticulares de Aedes aegypti e análise
no cromatógrafo a gás
3.2 Cromatografia a gás acoplada ao espectrômetro de massas (CG - EM)
4 Discussão
71
77
80
Capítulo III: Atratividade de insetos virgens de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus
1762) ao odor de adultos co-específicos e a extratos hexânicos de adultos
1 Comportamento de cópula e reconhecimento intra-específico em Culicidae
2 Material e métodos
2.1 Criação dos insetos
2.2. Olfatômetro
2.3 Resposta de adultos de Aedes aegypti ao odor de insetos co-específicos
2.4 Resposta de adultos de Aedes aegypti a extratos de insetos co-específicos
3 Resultados
3.1 Resposta de adultos de Aedes aegypti ao odor de insetos co-específicos
3.2 Resposta de adultos de Aedes aegypti a extratos de insetos co-específicos
A. Resposta de fêmeas virgens
B. Resposta de machos virgens
4 Discussão
82
83
84
84
85
86
87
88
88
88
88
90
92
CONCLUSÕES
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
96
98
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Número de casos e óbitos de Dengue e Dengue Hemorrágica no Brasil e nas
Américas durante os últimos cinco anos e percentual de casos brasileiros em
relação ao total de casos no continente americano. * Dados até a 17ª semana
27
epidemiológica (DADOS: OPAS 2010, SVS 2009, 2010).
Tabela 2
Quantidade de Aedes aegypti danificados após captura com
capturador manual de Castro e gaiola de seleção (n=30).
Tabela 3
53
Percentual médio de resposta (±e.p.) de adultos de Aedes aegypti ao odor de
diferentes hospedeiros humanos.
●
Voluntários do sexo feminino. °
Voluntários do sexo masculino. *Significativamente atrativo comparado
56
com o controle (t-test ou Mann-Whitney, p<0.05).
Tabela 4
Percentual médio de resposta de machos de Aedes aegypti em olfatômetro
horizontal de dupla escolha a diferentes hospedeiros vertebrados e a
compostos de localização de hospedeiros.
a
Tubo de apresentação do
estímulo no olfatômetro. * Diferença significativa entre os estímulos
(p<0,05, Mann-Whitney) (n=15). b Os valores apresentados em ―Mosquitos
58
ativos‖ se referem à soma dos percentuais médios de mosquitos ativados,
mosquitos no Tubo A e mosquitos no Tubo B.
Tabela 5
Média de picos presentes em extratos hexânicos de adultos virgens de
Aedes aegypti (machos e fêmeas) filtrados e não-filtrados, seguindo
metodologia de Jaffé (comunicação pessoal 2009) (n=3).
Tabela 6
77
Compostos identificados em extratos hexânicos de machos e fêmeas
virgens de Aedes aegypti por cromatografia a gás acoplada à
espectrometria de massas (CG-EM).
Tabela 7
79
Percentual de resposta de fêmeas e machos virgens de Aedes aegypti ao
odor de insetos co-específicos (Porcentagem média ± e.p.). ―*‖ Indica
diferença estatística (p<0,05 Kruskal Wallis) (n=15).
89
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Áreas com ocorrência de transmissão do vírus da febre amarela no
ano de 2009. (Fonte: CDC 2010).
Figura 2
Áreas endêmicas para dengue no ano de 2009 (Fonte: WHO 2010).
Figura 3
Áreas endêmicas para o vírus do Chikungunya (azul). (Fonte: CDC
2010).
Figura 4
25
26
28
O mundo químico dos insetos. As regiões vermelhas no corpo do
inseto indicam locais onde estão presentes as sensilas (Adaptado de:
31
Naters & Carlson 2006).
Figura 5
Separador de formas imaturas. (1) Larvas, (2) Pupas de machos
(menores), (3) Pupas de fêmeas (maiores) (Fotos: Capurro 2006).
Figura 6
43
Olfatômetro horizontal de dupla escolha. 1. A. Gaiola de liberação; B.
Tubo principal; C. Caixa de escolha; D. Tubo de escolha; E. Tubo de
liberação de estímulos. 2. a. Exaustor; b. Filtro de carvão ativado; c.
45
Banho-Maria (Fotos: Mota, 2003).
Figura 7
Representação da interpretação dos resultados ao final dos
experimentos de acordo com a localização dos insetos. A. Insetos
inativos; B+C+D. Insetos ativados; E. Insetos atraídos. B+C+D+E:
Insetos ativos (insetos que deixaram a gaiola de liberação); F. Local
45
de liberação do estímulo. A seta indica o sentido do fluxo de ar (Foto:
Leme 2010).
Figura 8
Esquema da gaiola de seleção de insetos. A. Ventilador para produção
do fluxo de ar, B. ―Gaiola de seleção‖, C. Gaiola de criação contendo
os insetos, D. Recipiente para captura dos insetos. A seta indica o
sentido do fluxo de ar.
46
Figura 9
Metodologias de seleção de insetos para teste em olfatômetro. A.
Seleção de insetos com o Capturador de manual de Castro, B. ―Gaiola
de seleção‖, C. Seleção de insetos com a ―Gaiola de seleção‖ (Fotos:
47
Leme 2010, Paixão 2010).
Figura 10
Sistema de obtenção de odor de hospedeiro. A. A seta aponta para o
filtro de carvão ativado. B. Recipiente onde era mantido o animal.
Figura 11
50
Inserção do odor dos hospedeiros no olfatômetro. A. Mangueiras de
polietileno provenientes do sistema de aeração. B. Papel de filtro
preso em clip metálico (Durante os testes a abertura para inserção do
50
estímulo era mantida fechada) (Fotos: Leme 2010).
Figura 12
Percentual médio de resposta de fêmeas de Aedes aegypti ao odor
humano separadas com ―Gaiola de seleção‖ e ―Capturador manual de
Castro‖ (% ± e.p.). Letras diferentes indicam diferença estatística
52
significativa (p<0,05 Teste t, n=15).
Figura 13
Percentual médio de respostas de machos virgens de Aedes aegypti de
diferentes idades ao odor humano em olfatômetro horizontal de dupla
54
escolha (n=15).
Figura 14
Percentual médio (± e.p.) de resposta de machos de Aedes aegypti,
virgens e copulados, ao odor de homens e mulheres em olfatômetro
horizontal de dupla escolha. Letras diferentes indicam diferença
55
estatística significativa (p<0,05 Kruskal-Wallis) (n=15).
Figura 15
Percentual médio de resposta de fêmeas de Aedes aegypti, virgens e
copuladas, ao odor de homens e mulheres (Porcentagem média ± e.p.)
(n=15). Letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05
57
teste t) (n=15).
Figura 16
Hexano (controle).
Figura 17
Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas de Aedes
aegypti realizados em diferentes tempos e filtrados.
69
72
Figura 18
Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas virgens de
Aedes aegypti em diferentes quantidades filtrados.
Figura 19
Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas virgens de
Aedes aegypti em diferentes quantidades sem filtração.
Figura 20
Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de machos virgens de
Aedes aegypti em diferentes quantidades filtrados.
Figura 21
Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de machos virgens de
Aedes aegypti em diferentes quantidades sem filtração.
Figura 22
73
74
75
76
Sobreposição dos cromatogramas de extratos de machos (preto) e
fêmeas (vermelho) destacando compostos em comum e compostos
exclusivos de um dos sexos (n=3). As informações sobre os
78
compostos indicados pelas letras estão contidas na Tabela 6.
Figura 23
Esquema do sistema de aeração utilizado nos testes com odor de
Aedes aegypti. A. Filtro de carvão ativado, B. Bifurcação para divisão
do fluxo de ar, C. Tubo de vidro com insetos (teste), D. Tubo de vidro
86
vazio (controle). E. Mangueira. A seta indica o sentido do fluxo de ar.
Figura 24
Apresentação dos estímulos no olfatômetro. A. Encaixe da mangueira
do sistema de aeração. B. Fixação do papel de filtro no tubo de
liberação de estímulo do olfatômetro com clipe de metálico (durante
87
os testes o tubo era fechado) (Fotos: Leme 2010).
Figura 25
Percentual de atratividade de fêmeas virgens de Aedes aegypti a
extratos de fêmeas co-específicas (Porcentagem média ± e.p.) em
olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3) (p<0,05 MannWhitney).
89
Figura 26
Percentual de atratividade de fêmeas virgens de Aedes aegypti a
extratos de machos co-específicos (Porcentagem média ± e.p.) em
olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3) (p<0,05 Mann-
90
Whitney).
Figura 27
Percentual de atividade de vôo de fêmeas virgens de Aedes aegypti a
extratos de insetos co-específicos (machos e fêmeas) em olfatômetro
horizontal de dupla escolha (Porcentagem média ± e.p.) (n=3)
90
(Spearman, p<0,05).
Figura 28
Percentual de atratividade de machos virgens de Aedes aegypti a
extratos de fêmeas co-específicas (Porcentagem média ± e.p.) em
olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3) (p<0,05 Mann-
91
Whitney).
Figura 29
Percentual de atratividade de machos virgens de Aedes aegypti a
extratos de machos co-específicos (Porcentagem média ± e.p.) em
olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3) (p<0,05 Mann-
92
Whitney).
Figura 30
Percentual de atividade de vôo de machos virgens de Aedes aegypti a
extratos de insetos co-específicos (machos e fêmeas) em olfatômetro
horizontal de dupla escolha (Porcentagem média ± e.p.) (n=3)
(p>0,05 Mann-Whitney).
92
LISTA DE ABREVIATURAS
CDC
Centers of disease control and prevention
CG
Cromatografia a gás
CG-EM
Cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas
HC
Hidrocarboneto cuticular
FDH
Febre da dengue hemorrágica
ICB
Instituto de Ciências Biológicas
LabEQ
Laboratório de Ecologia Química de Insetos Vetores
OMS
Organização Mundial de Saúde
OPAS
Organização Panamericana de Saúde
RT-PCR
Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction
SCD
Síndrome de choque da dengue
SVS
Secretaria de vigilância em saúde
UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais
WHO
World Health Organization
RESUMO
O presente trabalho demonstrou que o comportamento dos machos de Aedes
aegypti na presença de odor humano variou de acordo com a idade dos insetos. Assim,
machos com 24h de idade foram inativos (48%), enquanto aqueles com idade entre três
e 10 dias foram ativos (>85%). A resposta de A. aegypti, virgens e copulados, ao odor
humano (homens e mulheres) mostrou que a cópula foi importante para a atração.
Machos copulados foram atraídos tanto por odor de homens quanto de mulheres e
apresentaram atividade de vôo de 50%. Enquanto os machos virgens não foram atraídos,
mas apresentaram atividade de vôo superior a 70%. As fêmeas, virgens e copuladas,
foram atraídas por odor de homens e mulheres, porém, apenas 32% das fêmeas virgens
foram atraídas por odor de mulheres.
A caracterização química dos compostos presentes na cutícula de A. aegypti da
população brasileira permitiu identificar ácidos, aldeídos e hidrocarbonetos. Foram
identificados 28 compostos, 25 das fêmeas e 23 dos machos, sendo 5 exclusivos de
fêmeas (4-metil-3-penten-2-one/ 2-pentenal,2-metil/ 2-pentanone,4-mercapto-4-metil/
benzaldeído e triacontano) e 3 de machos (ciclohexene,1-metil-4-(1-metiletenil)/
tridecano e eicosano).
Em testes avaliando a resposta dos mosquitos ao odor de insetos co-específicos
foi demonstrado que os machos foram atraídos por odor de machos virgens vivos. As
fêmeas não foram atraídas pelo odor dos insetos vivos, entretanto, o odor de machos
virgens foi importante para a ativação do vôo (54%). Testes avaliando a resposta de A.
aegypti a extratos de insetos co-específicos demonstraram que os extratos de machos e
fêmeas foram atrativos para ambos os sexos. Entretanto, tal atratividade, assim como a
atividade de vôo, foi dependente da quantidade de insetos nos extratos.
ABSTRACT
This work demonstrated, that the behavior of Aedes aegypti males in the
presence of human odor varied according to the insects’ age. Males aged 24 hours were
inactive (48%), while those aged between three and 10 days were active (> 85%). The
response of virgin and mated A. aegypti to the odor of humans (men and women)
showed that mating was important for attraction. Copulated males were attracted to the
odor of men and women and showed flight activity of 50%, while virgin males were not
attracted but showed flight activity of over 70%. Virgin and copulated females were
attracted by the odor of men and women, but only 32% of virgin females were attracted
to the odor of women. Acids, aldehydes and hydrocarbons were identified from
brazilian A. aegypti cuticles. 28 compounds, 25 of females and 23 of males were
identified. 5 of them were exclusive for females (4-methyl-3-penten-2-one/ 2pentenal,2-methyl/ 2-pentanone,4-mercapto-4-methyl/ benzaldehyde e triacontane) and
3 of them exclusive for males (ciclohexene,1-methyl-4-(1-methylethenil)/ tridecane e
eicosane).
Tests evaluating the mosquitoes response to the odor of conspecific insects
showed, that males were attracted to the odor of virgin males. Females were not
attracted to the insects’ odor, however, the odor of virgin males was important for flight
activation (54%). Tests evaluating the response of A. aegypti to extracts of conspecific
insects showed that extracts of males and females were attractive to both sexes.
However, this attractiveness as well as flight activity was dependent on the amount of
insects in extracts.
20
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1 .O mosquito Aedes (Stegomyia) aegypti
O mosquito Aedes (Stegomyia) aegypti (Diptera, Culicidae) destaca-se pelo
volume de estudos devido à sua importância em saúde pública (WHO 2001). Descrito
originalmente no Egito, o que deu origem ao nome da espécie, esse vetor tem
populações selvagens e domésticas (Belkin 1962). Cosmopolita, o mosquito apresenta
distribuição em focos delimitados, a qual se relaciona com a ocorrência de transporte
acidental e está em constante expansão territorial (Forattini 2002, Lozovei 2001, OPAS
1995). A ampla distribuição de A. aegypti, bem como sua rápida expansão, está
relacionada com a ocorrência de transporte acidental o que, provavelmente, permitiu
que o inseto chegasse às Américas no período colonial (séculos XVI e XIX) durante a
ocorrência do tráfico de escravos (Forattini 2002, Lozovei 2001).
O A. aegypti é considerado um mosquito tropical e subtropical com distribuição
entre os paralelos de 35º de latitude Norte e 35º de latitude Sul, que correspondem à
isoterma de inverno de 10°C (Forattini 2002, Reiter 2010). Caracterizado como um
inseto de regiões quentes, o mosquito foi registrado em 21 estados nos Estados Unidos,
muitos dos quais podem apresentar temperaturas abaixo de -20°C. Como esses insetos
não sobrevivem em ambientes muito frios, provavelmente devem permanecer em locais
protegidos durante períodos com temperaturas muito baixas (Reiter 2010).
Esse vetor é conhecido nas Américas por seu alto grau de antropofilia e
normalmente está associado à presença humana (Forattini 2002), pois nas habitações
humanas, ou próximo a elas, as fêmeas do mosquito podem encontrar abrigo e
hospedeiros para o repasto sanguíneo (Forattini 2002).
21
1.2 Aspectos da biologia de Aedes aegypti
O A. aegypti possui um ciclo de vida do tipo holometábolo, ou seja, durante seu
desenvolvimento o inseto passa por quatro estágios (ovo, quatro ínstares larvais, pupa e
adulto) com forma de alimentação e habitat distintos (Lozovei 2001).
A oviposição acontece no período diurno com um pico matutino (6h às 8h) e outro
vespertino (16h às 18h) (Cobert & Chadee 1992, Gomes et al. 2006). O número médio
de ovos por postura é 120, o qual depende da quantidade de sangue ingerido durante o
repasto sangüíneo (Forattini 2002). A eclosão das larvas ocorre cerca de dois dias após a
oviposição, caso as condições ambientais sejam favoráveis, e tem como principal
estímulo o contato com a água do criadouro (Forattini 2002). As formas imaturas se
desenvolvem em água doce e parada, com pouca matéria orgânica em decomposição
(Cônsoli & Lourenço-de-Oliveira 1998).
Os adultos são alados com corpo coberto por escamas escuras e prateadas e
possuem hábitos diurnos com pico da atividade de hematofagia durante os períodos
matutino (6h e 7h) e vespertino (17h, 18h e 19h) (Cônsoli & Lourenço-de-Oliveira
1998, Forattini 2002, WHO 1969).
1.3 Comportamento de alimentação e de localização de hospedeiros realizados pelo
Aedes aegypti
Tanto os machos quanto as fêmeas de mosquitos se alimentam de néctar de plantas
(Bidlingmayer & Hem 1973, Clements 1999, Foster & Takken 2004, Forattini 2002,
Healy & Jepson 1988, Jepson & Healy 1988, Mauer & Rowley 1999, Thorsteinson &
Brust 1962). A alimentação açucarada é importante fonte de energia para o vôo dos
22
mosquitos, sendo mais disponível que a alimentação sanguínea e capaz de conferir
maior longevidade (Jepson & Healy 1988, 1971, Tsunoda et al. 2010). Além disso, a
busca por alimentação açucarada é considerada como o principal fator para dispersão e
migração desses insetos (Hocking 1953). As plantas e os animais produzem compostos
voláteis como consequência de suas atividades metabólicas, os quais podem ser
utilizados por muitos insetos para a localização de fontes alimentares e sítios de
oviposição (Chapman 1988). Os voláteis de plantas aos quais os mosquitos respondem
incluem os monoterpenos cíclicos ou bicíclicos e óleos essenciais de plantas (Takken &
Knols 1999).
Os machos de A. aegypti se alimentam exclusivamente de néctar de plantas, tendo
preferência por néctares ricos em sacarose (Prasad & Daniel 1988). Estes insetos,
independente da sua idade ou estado fisiológico, são atraídos pelos voláteis emanados
das plantas, (Clements 1999, Forattini 2002, Healy & Jepson 1988, Hocking 1953,
Mauer & Rowley 1999, Thorsteinson & Brust 1962). As fêmeas respondem aos voláteis
das plantas tanto quanto os machos, contudo preferem néctares ricos em glucose
(Clements 1999, Jepson & Healy 1988, Prasad & Daniel 1988, Thorsteinson & Brust
1962, Vargo & Foster 1982). Além disso, as fêmeas realizam a hematofagia, pois é pela
alimentação sanguínea que o inseto obtém os aminoácidos que serão utilizados na
maturação dos ovos (Cônsoli & Lourenço-de-Oliveira 1998, Forattini 2002, Klowden &
Briegel 1994).
As fêmeas do mosquito podem se alimentar tanto em humanos quanto em animais,
porém, exibem um comportamento altamente antropofílico (Barata et al. 2001, Forattini
2002). A importância do hospedeiro vertebrado para as fêmeas permitiu que as mesmas
utilizassem uma série de estratégias para localização de tal fonte alimentar (Clements
1999, Dekker et al. 2005, Kline et al. 2006).
23
A atratividade das fêmeas a hospedeiros vertebrados já é bastante conhecida
devido à importância da alimentação sanguínea para a manutenção do ciclo do inseto,
bem como de seu papel na transmissão de patógenos (Cônsoli & Lourenço-de-Oliveira
1998, Forattini 1996, Steib et al. 2001, Taken 1991, Takken & Knols 2010), e seu
estudo vem permitindo o avanço no monitoramento do vetor com o uso de atraentes
sintéticos de odor humano em armadilhas específicas para sua captura (Kröeckel et al.
2006, Maciel-de-Freitas 2006, Paixão 2007).
Apesar dos machos de mosquitos responderem principalmente ao odor de plantas,
algumas espécies de Aedes e Mansonia respondem ao odor de hospedeiros vertebrados,
sendo normalmente encontrados próximos a eles (Hartberg 1971, Jaenson 1985, McIver
et al. 1980, Takken & Knols 2010). Acredita-se que esse comportamento ocorra com o
objetivo de encontrar fêmeas à procura de repasto sanguíneo, o que facilitaria o
encontro de fêmeas para realização da cópula (Clements 1999, Hartberg 1971, Jaenson
1985, McIver et al. 1980).
O uso de armadilhas iscadas com compostos atrativos para coleta de fêmeas de
A. aegypti é bastante conhecido (Eiras & Geier 2002, Geier & Eiras 2003, Irish et al.
2008). Tanto as armadilhas iscadas com compostos sintéticos de voláteis de plantas
quanto aquelas com compostos sintéticos de odor humano são específicas para a coleta
de fêmeas, No entanto, elas também capturam grandes quantidades de machos de
culicídeos (Ázara 2009, Gama 2006, Kröeckel et al. 2006, Maciel-de-Freitas et al. 2006,
Paixão 2007).
24
1.4 Importância do Aedes aegypti em Saúde Pública
As fêmeas de A. aegypti apresentam um comportamento conhecido como
―persistência na atividade de sugar‖, ou seja, uma vez interrompidas durante a
hematofagia, retornam para picar o hospedeiro, ou procuram outro hospedeiro para
completar o repasto sanguíneo (Forattini 2002). Tal comportamento faz com que as
mesmas sejam vetores de grande eficiência, pois a capacidade de transmissão de
patógenos de um indivíduo para outro é aumentada. Outro fator importante é o aumento
da resposta a estímulos dos hospedeiros pelas fêmeas que já completaram pelo menos
um ciclo gonotrófico. Essa característica permite que fêmeas mais velhas e
epidemiologicamente mais importantes na transmissão de patógenos localizem o
hospedeiro com mais facilidade (Klowden & Fernandez 1995, Forattini 2002).
Além de provocarem grande desconforto ao hospedeiro devido à picada, as fêmeas
de A. aegypti podem transmitir uma série de patógenos ao homem e a outros animais,
principalmente viroses como: a febre amarela urbana, o vírus do chikungunya, a dengue
e a febre hemorrágica da dengue (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND
PREVENTION – CDC 2010, Lozovei 2001, Reiter 2010).
A febre amarela é uma doença causada por um arbovírus da família Flaviviridae,
gênero Flavivirus, e se mantém nos ciclos silvestres em primatas não-humanos
(Vasconcelos 2003, OPAS 2010). O A. aegypti atua como vetor do vírus no ambiente
urbano e, apesar de não serem relatados surtos urbanos nas Américas desde 1954, a
presença do mosquito mantém o risco de epidemia. Na região africana é comum a
ocorrência de surtos urbanos e rurais, podendo causar milhares de mortes por ano
(WHO 1997, CDC 2010) (FIG. 1).
25
Figura 1. Áreas com ocorrência de transmissão do vírus da febre amarela no ano de
2009. (Fonte: CDC 2010).
A dengue, também causada por um Flavivirus, é a arbovirose de maior importância
atualmente e se destaca como um dos principais problemas de saúde pública mundial
(WHO 2001). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), 2,5 a 3,0
bilhões de pessoas vivem em áreas com risco de transmissão (WHO 2001), dessas 50 a
100 milhões se infectam por ano, em mais de 100 países (FIG. 2). A doença pode se
manifestar de diversas formas, entre elas a Febre da Dengue, a Febre da Dengue
Hemorrágica (FDH) e a Síndrome de Choque da Dengue (SCD). Esta última pode levar
até 50% dos doentes não tratados ao óbito (WHO 1997, WHO 2001). Do total de
doentes, cerca de 550 mil são hospitalizados e 20 mil morrem em consequência da
doença, em sua maioria crianças (WHO 2001). Estudos soroepidemiológicos no Brasil
demonstraram que mais de 70% da população urbana do país já contraiu a doença e que
atualmente os 4 sorotipos existentes circulam em 22 dos 27 Estados brasileiros
(Siqueira et al. 2005, SVS 2010). Siqueira et al.(2005) verificaram que 70% dos casos
de dengue descritos nas Américas entre os anos 2000 e 2005 ocorreram no Brasil.
26
Conforme a Tabela 1, pode ser verificado que após cinco anos, o número de casos
brasileiros ainda se destaca no continente americano (SVS 2009, 2010, OPAS 2010).
Apesar de não realizarem alimentação sanguínea, o papel dos machos de Aedes na
manutenção da circulação viral é de grande importância devido às formas de
transmissão vertical e venérea (Kow et al. 2001, Tu et al.1998).
Figura 2. Áreas endêmicas para dengue no ano de 2009 (Fonte: WHO 2010).
27
Tabela 1. Número de casos e óbitos de Dengue e Dengue Hemorrágica no Brasil e nas Américas durante os últimos cinco anos e percentual de casos
brasileiros em relação ao total de casos no continente americano. * Dados até a 17ª semana epidemiológica (DADOS: OPAS 2010, SVS 2009, 2010).
2006
2007
2008
2009
2010 *
Total
Brasil
Américas
Brasil
Américas
Brasil
Américas
Brasil
Américas
Brasil
Américas
Brasil
Américas
Dengue
clássica
346.550
(62,8%)
552.141
559.954
(62,2%)
900.782
734.384
(80,8%)
908.926
406.883
(44,4%)
917.311
730.587
(80%)
913.530
Dengue
Hemorrágica
628
(4,3%)
14.453
1.541
(5,8%)
26.413
9.957
(30,7%)
25.696
4.281
(16,9%)
25.268
6.438
(34,8%)
18.516
22.845
(20,7%)
110.346
Óbitos
67
(34,7%)
193
158
(49,8%)
317
212
(69,3%)
306
166
(44,7%)
371
321
(72%)
446
924
(56,6%)
1.633
2.778.358
4.192.690
(66,3%)
28
A febre do chikungynya é uma doença viral causada por um vírus do gênero
Alphavirus, família Togaviridae, e foi isolada pela primeira vez na Tanzânia em 1953
(Simon 2007). Desde então, foram relatadas epidemias em várias áreas da África e da
Ásia (FIG. 3). Recentemente, foram relatados casos em áreas da Europa, Estados
Unidos, Canadá e Guiana Francesa o que tem caracterizado a doença como reemergente e em constante expansão (CDC 2010, Simon 2007). Raros pacientes
desenvolvem uma forma mais grave da doença, normalmente ocorre em pessoas mais
velhas, porém, existe a preocupação da ocorrência da doença em viajantes, uma vez que
eles podem transportar o vírus para regiões não endêmicas (CDC 2006).
Figura 3. Áreas endêmicas para o vírus do Chikungunya (azul). (Fonte: CDC 2010).
1.5 Ecologia química de insetos
A comunicação é de fundamental importância no comportamento animal e é
definida como um processo que envolve a transmissão de sinais entre organismos
(Cardé & Bell 1995). O termo normalmente utilizado para denominar as substâncias
químicas envolvidas na comunicação entre os seres vivos é semioquímicos (Nordlund &
Lewis 1976, Mori 1998, Prasad & Daniel 1988), porém, Dicke & Sabelis (1988)
propuseram o uso do termo infoquímicos considerando a possibilidade do composto ser
29
benéfico ou prejudicial do ponto de vista evolutivo (Nascimento & Sant’Ana 2001).
Dentro dos infoquímicos existem duas categorias de substâncias: (1) feromônios:
substâncias que mediam interações entre organismos da mesma espécie, e podem ser
classificados como feromônios sexuais, de defesa, de recrutamento, de trilha e outros
(Vander Meer et al. 1998, Wilson & Hooldobler 1990); (2) aleloquímicos: substâncias
que mediam interações entre indivíduos de espécies distintas, sendo classificados de
acordo com o tipo de organismo que está sendo beneficiado na comunicação. Quando é
benéfica apenas para a espécie emissora (alomônio), quando benéfica para a espécie
receptora (cairomônio) ou benéfica para ambas as espécies (sinomônios) (Vilela &
Della-Lucia 2001).
Ecologia Química, portanto, é a ciência que permite o estudo dos infoquímicos,
procurando identificar e sintetizar substâncias que possam levar informações entre os
organismos e investigando o papel desses compostos no comportamento e na ecologia
dos seres vivos (Aldrich 2008).
Os seres vivos que mais utilizam compostos voláteis para desempenhar suas
funções vitais (localização e seleção de hospedeiros vertebrados e plantas nas quais se
alimentam, além da identificação e localização de parceiros para a cópula) são os
insetos e as principais ferramentas utilizadas para isso são o olfato e o paladar (Bohbot
et al. 2010, Naters & Carlson 2006, Prasad & Daniel 1988, Vilela & Della-Lucia 2001).
Devido à sua importância em agricultura e saúde pública os insetos são intensamente
estudados em Ecologia Química e um grande número de compostos atrativos é
conhecido atualmente para esses organismos (Naters & Carlson 2006) (FIG. 4).
Tanto adultos quanto formas imaturas de mosquitos respondem a uma grande
variedade de estímulos de natureza química. O conhecimento desses compostos é de
30
extrema importância para entender melhor a biologia, a ecologia e o comportamento dos
mosquitos (Bohbot et al. 2010, Mulla 1979).
O estímulo químico nos insetos é percebido por células receptoras
(quimioreceptores) localizadas em sensilas olfativas. Estas sensilas são responsáveis
pela conversão dos estímulos químicos (odores) em potenciais elétricos, originando uma
resposta motora (Bohbot et al. 2010). As sensilas estão presentes principalmente nas
antenas, podendo ocorrer em mandíbulas, palpos, tarsos e outros apêndices, inclusive
em ovipositor. Elas podem ser generalistas, quando respondem a uma grande variedade
de odores, normalmente voláteis de plantas, ou especialistas quando respondem a uma
ou poucas substâncias, normalmente feromônios (Sutcliffe 1994).
A seletividade e a sensibilidade da antena a um determinado odor estão
diretamente relacionadas à concentração do estímulo químico, ao tamanho e a forma da
antena, assim como ao número, tipo e localização das sensilas olfativas presentes em
determinada espécie (Birch & Haynes 1982).
De acordo com Mclver (1982) na antena de A. aegypti ocorrem cinco tipos de
sensilas tais como: pequenas celônicas, largas celônicas, ampuláceas, tricóideas e
basicônicas. Baseando nas informações ultraestruturais e na contagem cuidadosa de
tipos de sensilas, Mclver (1982) calculou que 93% dos neurônios dos nervos flagelares
de A. aegypti carregam informações olfativas (odores).
31
Figura 4. O mundo químico dos insetos. As regiões vermelhas no corpo do inseto indicam
locais onde estão presentes as sensilas (Adaptado de Naters & Carlson 2006).
1.6 Feromônios sexuais em insetos
Os feromônios sexuais aumentam a probabilidade de sucesso no encontro de
parceiros para a cópula (Justum & Gordon 1989). O primeiro estudo que sugeriu a
presença de feromônio sexual na ordem Diptera foi realizado em Drosophila
(Sturtevandt 1915). Posteriormente, o bombykol, produzido por fêmeas da mariposa do
bicho-da-seda (Bombyx mori), foi o primeiro feromônio sexual demonstrado (Rogoff et
al.1964) e identificado em insetos (Carlson et al. 1971). A partir de tal descoberta,
houve um grande avanço no estudo e identificação de tais compostos em outras espécies
de insetos (Cardé & Minks 1997, Justum & Gordon 1989, Wicker-Thomas 2007).
Dentro da ordem Diptera foram identificados feromônios sexuais para membros
das subordens Nematocera e Brachycera – Cyclorrapha (Wicker-Thomas 2007). Dentre
os Nematocera já foram identificados feromônios para as famílias: (1) Cecidomyiidae,
32
(2) Sciaridae, ambas com uma série de feromônios produzidos pelas fêmeas e (3)
Psychodidae, com o feromônio 9-metilgermacreno-B e um terpeno produzidos pelos
machos (Wicker-Thomas 2007). Na subordem Brachycera – Cyclorrapha foram
identificados feromônios das famílias: (1) Tephritidae, produzidos por machos (exceto
em Batrocera oleae), (2) Agromyzidae e (3) Glossinidae, produzidos pelas fêmeas, (4)
Calliphoridae, produzidos pelos machos, (5) Faniidae, (6) Muscidae e (7)
Drosophilidae, produzidos tanto por machos quanto por fêmeas (Antony & Jallon 1982,
Blomquist et al. 1987, Carlson et al. 1971, Carriere & McNeil, 1990, Davis & Carlson
1989, Headrick & Goeden 1994, Mazomenos & Haniotakis 1981, Pomonis et al. 1993,
Wall 1989).
A existência de feromônios sexuais ainda não foi comprovada para nenhum
representante da família Culicidae (Wicker-Thomas 2007), entretanto, Cabrera & Jaffé
(2007) evidenciaram, em estudos comportamentais com A. aegypti, a existência de um
feromônio produzido pelas fêmeas que seria capaz de atrair machos e fêmeas da
espécie, além de um provável feromônio de agregação produzido pelos machos e que
também atuaria na atratividade de fêmeas.
1.7 Orientação dos insetos
A resposta dos insetos a determinado estímulo presente no ambiente é
caracterizada de acordo com o tipo de movimento, ou mesmo sua ausência, sua direção
e sentido e a natureza do estímulo (Matthews & Matthews 1988). Em geral, a resposta
dos insetos pode ser direcionada (taxia) ou não direcionada (quinese). No primeiro tipo
podem ocorrer respostas locomotoras orientadas em direção à fonte do estímulo
(positiva), caracterizando a atração, ou em direção contrária à fonte de estímulo
33
(negativa), nesse caso demonstrando o potencial de repelência de um composto
(Fraenkel & Gunn 1961). São tipos de taxia: (1) quimiotaxia, orientação frente a um
agente químico, (2) anemotaxia, orientação em resposta ao vento e (3) fototaxia,
resposta de acordo com a luz. Dentre os tipos de quineses podemos citar (1) a
ortoquinese, movimento randômico de um organismo em reposta a um estímulo e a (2)
clinoquinese, mudança aleatória na taxa ou freqüência de giro durante o vôo (Fraenkel
& Gunn 1961, Matthews & Matthews 1988).
1.8 Bioensaios comportamentais
A realização de bioensaios comportamentais é importante para o estudo da função
dos odores na comunicação química de insetos, pois permite qualificar e quantificar a
resposta motora do inseto estudado a determinado estímulo. Os bioensaios realizados
com aparelhos de olfatometria são de grande valor no estudo do comportamento de
insetos anemotáxicos (que utilizam o fluxo de ar para orientação), como o A. aegypti.
Nesses organismos o comportamento de busca da fonte do estímulo químico é realizado
por meio de uma pluma de odor que tem a função de guiar os insetos até a fonte
(Sant’Ana & Stein 2007).
Os olfatômetros são aparelhos construídos com material inerte para odor, como:
vidro, acrílico e alumínio, e possuem um ponto de liberação do estímulo e um ponto de
liberação do organismo a ser testado, cujo comportamento pode ser monitorado
diretamente por um observador, ou indiretamente, através de filmagem e análise de
vídeo. O modelo do olfatômetro pode variar baseado em características do organismoalvo e nas questões a serem avaliadas no estudo (Eiras & Mafra-Neto 2001). Um fluxo
de ar filtrado, umidificado e com velocidade controlada, passa pela fonte do estímulo
34
formando uma pluma retilínea em direção ao inseto e levando os compostos químicos
até eles (Sant’Ana & Stein 2007, Eiras & Mafra-Neto 2001). Nos bioensaios realizados
com olfatômetro devem ser consideradas tanto as variáveis endógenas (sexo, idade,
estado nutricional, fecundação, etc.) quanto as exógenas (temperatura, horário da
avaliação, luminosidade, umidade relativa, etc.) para que a confiabilidade dos resultados
obtidos não seja comprometida (Eiras & Mafra-Neto 2001).
2. JUSTIFICATIVA
Os machos de culicídeos, apesar de não realizarem repasto sangüíneo, ficam
próximos ao hospedeiro vertebrado possivelmente para encontrar fêmeas para a cópula
(Hartberg 1971, Jaenson 1985). Entretanto, a maioria das informações relacionadas a tal
comportamento é resultado de trabalhos realizados com fêmeas, existindo poucos
trabalhos específicos para machos (Hartberg 1971, Jaenson 1985, McIver et al. 1980,
Takken & Knols 2010) a despeito de sua importância e capacidade de alterar o
comportamento e a fisiologia das fêmeas, responsáveis pela transmissão dos agentes
etiológicos de diversas patologias (Klowden 1995, Polestrock et al. 2002). Além disso,
a significância dos machos infectados com o vírus da dengue na transmissão da doença
não pode ser subestimada, uma vez que a ocorrência de transmissão viral de machos
infectados com vírus da dengue para fêmeas durante a cópula é de grande importância
para a manutenção da circulação viral (Kow et al. 2001, Rosen 1987a, Rosen 1987b, Tu
et al.1998).
Trabalhos pioneiros relatam que machos são atraídos para cópula pelo som
produzido pelo batimento de asas de fêmeas co-específicas e que esse tipo de estímulo é
eficiente a curtas distâncias (McIver et al. 1980, Nijhout & Sheffield 1979, Roth 1948).
35
Desta maneira, a atratividade dos machos às fêmeas, realizada a longas distâncias, seria
dependente, provavelmente, do feromônio sexual. Sabe-se que fêmeas de A. aegypti
produzem uma substância não-volátil, provavelmente um feromônio de contato, que
permanece ativa até três semanas após a morte do inseto e que atuaria no
reconhecimento de fêmeas co-específicas (Clements 1963), entretanto, ainda não foi
descrito um feromônio que possa atuar a longas distâncias, exercendo o papel de
feromônio sexual.
Os hidrocarbonetos cuticulares podem exercer papel de feromônio sexual e/ou
de agregação em dípteros, incluindo espécies dos gêneros Aedes (Priestman & Horne
2002, Kruger & Pappas 1991, Kruger & Pappas 1993, Pappas et al. 1994), Anopheles
(Phillips et al. 1990, Millligan et al. 1986,), Culex (Chen et al. 1990), Culicoides (Linley
& Carlson 1983, Kremer et al. 1979), Culiseta (Lang 1977, Lang & Foster 1976),
Dermatobia (Gulias-Gomes et al. 2008), Glossina (Langley et al. 1981, Nelson &
Carlson 1986), Lutzomyia e Phlebotomus (Gebre-Maciel et al. 1994, Lane et al. 1985,
Mahamat & Hassanali 1998), Musca (Chaudhury et al. 1972), Simulium (Phillips et al.
1986, Millest 1992), Stomoxys (Meola et al. 1977) e Tabanus (Hoppe et al. 1990).
Polestrock et al. (2002) descreveram alterações nas proporções de alguns
hidrocarbonetos cuticulares de fêmeas de A. aegypti após a cópula (n-heptadecano, npentacosano e n-hexacosano), apontando um potencial como compostos que interferem
na atratividade/reconhecimento das fêmeas. Ahmadi e McClelland (1985) verificaram o
aumento na atratividade das fêmeas de A. aegypti ao hospedeiro associado à presença de
fêmeas co-específicas em testes de olfatômeto. Posteriormente, Cabrera e Jaffé (2007)
descreveram a existência de um possível composto volátil, produzido por fêmeas de A.
aegypti e a existência de um feromônio de agregação produzido por machos que
aparentemente atua na atração de fêmeas e machos co-específicos.
36
A resposta de machos de A. aegypti a estímulos olfativos de localização de
hospedeiros e sua relação com o encontro de fêmeas para a cópula e a existência de
feromônios sexuais para a espécie são dois assuntos pouco estudados, apesar de sua
relevância para a biologia e o comportamento desse vetor. Portanto, o presente trabalho
teve o objetivo de avaliar as respostas olfativas de machos de A. aegypti ao odor de
diferentes hospedeiros vertebrados e a atratividade de machos e fêmeas aos seus
respectivos extratos, visando investigar a existência de feromônios sexuais e/ou de
agregação e sua identificação química. O conhecimento da capacidade reprodutiva do
mosquito, da existência de feromônios e da resposta de machos ao hospedeiro
vertebrado pode auxiliar em programas de controle do vetor, além de fornecer
informações sobre sua ecologia e a relação entre a captura de machos por armadilhas
iscadas e a presença de fêmeas no ambiente.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar a resposta olfativa de machos de A. aegypti ao odor de hospedeiros
vertebrados e de insetos co-específicos e investigar a existência de feromônios nessa
espécie.
3.2 Objetivos específicos
- Quantificar a resposta olfativa de machos virgens de A. aegypti de diferentes idades ao
odor humano (1-10 dias).
37
- Comparar a resposta olfativa de machos e fêmeas de A. aegypti, virgens ou não, ao
odor humano.
- Avaliar o comportamento de machos de A. aegypti frente ao odor de diferentes
hospedeiros vertebrados.
- Avaliar a resposta comportamental de machos de A. aegypti a cairomônios sintéticos.
- Verificar a presença de hidrocarbonetos cuticulares em machos e fêmeas de A. aegypti
através da técnica de Cromatografia à Gás (CG).
- Avaliar a resposta de machos e fêmeas de A. aegypti ao odor de insetos co-específicos
vivos.
- Avaliar a resposta de machos e fêmeas de A. aegypti a extratos hexânicos de insetos
co-específicos.
38
Capítulo I
Resposta de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762) ao odor de hospedeiros
vertebrados em olfatômetro horizontal de dupla escolha
39
1. Introdução
Os estímulos químicos desempenham um importante papel no comportamento
dos mosquitos e são as substâncias de maior importância na comunicação desses
indivíduos (Takken & Knols 2010). Os cairomônios são utilizados por insetos
hematófagos no processo de localização do hospedeiro e podem ser muito (CO2,
acetona, etc.) ou pouco voláteis (ácido lático, ácidos graxos, etc.) (Takken & Knols
2010). A detecção dos cairomônios de seus hospedeiros preferenciais pelas fêmeas torna
a busca e o encontro da fonte alimentar mais eficiente (Reiter 2010).
Muitos cairomônios humanos já foram identificados e tiveram seu papel na
atratividade de fêmeas de A. aegypti demonstrado (Acree et al. 1968, Eiras & Jepson
1991, Geier & Boeckh 1999, Smith et al. 1970). Dentre eles podemos citar: (1) o CO2,
com eficiente papel no desencadeamento do comportamento de vôo de mosquitos
(Dekker et al. 2005, Eiras & Jepson 1991, Geier et al.1996), (2) o ácido lático, atrativo
apenas na presença de amônia, CO2 ou ácidos graxos, como o ácido capróico (Acree et
al. 1968, Eiras & Jepson 1991, Geier & Boeckh 1999, Smith et al. 1970), (3) a amônia
(Geier et al.1999) e (4) a acetona, atrativa quando associada ao ácido lático (Bernier et
al. 2003, Geier et al.1999). Alguns compostos como as aminas, os aminoácidos e os
alcoóis foram descritos como atraentes de mosquitos, entretanto os resultados dos
estudos referentes a tais compostos permanecem contraditórios (Geier & Boeckh 1999).
A armadilha BG-Sentinel® é específica para fêmeas de A. aegypti e Aedes
albopictus à procura de hospedeiro vertebrado para realização de repasto sanguíneo e
utiliza o atraente sintético de odor humano BG-Lure® como estímulo químico. Esse
atraente é composto por três cairomônios: ácido lático, ácido capróico e amônia,
utilizados pelas fêmeas para localização de hospedeiros (Eiras & Geier 2002, Geier &
40
Eiras 2003). Em testes de laboratório com liberação e recaptura de fêmeas de A. aegypti
a armadilha BG-Sentinel® capturou 90% dos insetos liberados em apenas 10 minutos
(Geier & Eiras 2003). Posteriormente, estudo realizado por Kröeckel et al. (2006) em
área urbana contendo muitos hospedeiros humanos comprovou que não há diferença
significativa entre a armadilha BG-Sentinel® e a isca-humana no que diz respeito à
atração de fêmeas do mosquito. Apesar de específica para fêmeas, alguns trabalhos
relatam a coleta de grande quantidade de machos de culicídeos pela armadilha e
relacionam tal captura à provável busca de hospedeiro, apesar de não realizarem
alimentação sanguínea (Ázara 2009, Kröeckel et al. 2006, Maciel-de-Freitas 2006,
Paixão 2007).
Hartberg (1971) descreveu pela primeira vez o encontro de machos de A. aegypti
próximos a hospedeiros vertebrados. Posteriormente, estudos realizados para captura de
fêmeas de mosquitos utilizando hospedeiros vertebrados, em isca humana ou em
armadilhas iscadas, relataram a coleta de grande número de machos e demonstraram a
existência de algum tipo de resposta desses insetos aos hospedeiros vertebrados
utilizados pelas fêmeas como fonte de alimentação sanguínea (Jaenson 1985, McIver et
al. 1980, Takken & Knols 2010). Em estudo de captura de fêmeas com armadilhas de
sucção usando isca animal, McIver et al. (1980) verificaram a atração de machos de
Mansonia sp. aos hospedeiros vertebrados, mas não puderam afirmar se tal atração era
dependente de estímulos químicos. Jaenson (1985) observou grande captura de machos
de Aedes dianteus (57%) em armadilhas de sucção iscadas com diferentes hospedeiros
vertebrados, utilizadas com o propósito de capturar fêmeas. Apesar do estímulo sonoro
produzido pelo batimento das asas de fêmeas de A. aegypti ser considerado como o
responsável pela atração de machos (Roth 1948), a cópula em laboratório ocorre mais
freqüentemente na presença de um hospedeiro vertebrado, além disso, a presença desse
41
hospedeiro tornaria os machos mais ativos aumentando a formação de ―enxames‖
(Cabrera & Jaffé 2007).
O objetivo do presente trabalho foi avaliar a resposta olfativa de adultos de A.
aegypti, virgens e copulados, a cairomônios de diferentes hospedeiros vertebrados.
2 Material e métodos
2.1 Criação dos insetos
Os ovos que deram origem à colônia de A. aegypti do insetário do Laboratório
de Ecologia Química de Insetos Vetores (LabEQ) foram coletados no Campus
Pampulha da UFMG (Belo Horizonte - MG) com armadilhas de oviposição
(ovitrampas). Posteriormente, pools de larvas foram submetidos a testes (RT-PCR) no
Laboratório de Virologia (Departamento de Microbiologia – ICB/UFMG) para verificar
a presença de vírus da dengue. O insetário foi mantido a 27,0  2 ºC, 70,0  10% de
umidade relativa e 12L:12E de fotoperíodo.
Os ovos foram colocados em cubas plásticas, com aproximadamente cinco cm
de profundidade, contendo água desclorada e ração de réptil (Reptolife®) para a eclosão
e desenvolvimento das larvas até atingirem o estádio de pupa. Para a manutenção da
colônia as pupas foram separadas diariamente e colocadas em potes plásticos, os quais
foram colocados em gaiolas de tela fina (30x30x30cm, Bug-Dorm®) para emergência
dos adultos, que foram aí mantidos e alimentados com solução açucarada (10%). Para a
manutenção da colônia, as fêmeas receberam repasto sanguíneo em alimentador
artificial adaptado de Ahmed (1999 apud Roque 2002), duas vezes por semana. Cones
42
de papel de filtro foram colocados dentro das gaiolas para serem utilizados como
substrato de oviposição (Eiras & Jepson 1991).
Os insetos utilizados nos experimentos foram separados por sexo ainda no
estágio de pupa para garantir que todos fossem virgens. As pupas foram separadas de
acordo com seu tamanho utilizando um separador de formas imaturas (FIG. 5). Em
geral, pupas menores são de machos, enquanto as maiores são de fêmeas (Cônsoli &
Lourenço-de-Oliveira 1994). Após a separação, os recipientes com pupas foram
colocados em diferentes gaiolas teladas (30x30x30cm, Bug-Dorm®) e, para controle da
idade, esses recipientes foram trocados de gaiola diariamente. Para evitar o contato dos
insetos com o odor do sexo oposto as gaiolas eram mantidas em salas separadas e
verificadas diariamente para que, caso houvesse algum inseto do sexo oposto na gaiola,
esse fosse descartado. Como não existem na literatura relatos sobre a mudança de
comportamento de insetos mantidos em laboratório por longos períodos, optou-se por
utilizar adultos de A. aegypti das gerações F70 a F90, colônia é mantida no insetário do
LabEQ por cinco anos.
Para os testes com insetos copulados era mantida uma gaiola de criação
(30x30x30cm, Bug-Dorm®) contendo machos e fêmeas de A. aegypti, os quais eram
utilizados a partir do terceiro dia após a emergência do adulto. Devido à presença de
ambos os sexos nas mesmas gaiolas e a idade cronológica dos mosquitos pressupõe-se
que os mesmos eram copulados. Portanto, será usado o termo de insetos copulados nesta
situação. Não foi confirmado se as fêmeas estavam copuladas devido ao grande número
de insetos utilizados nos testes comportamentais.
43
3
2
1
Figura 5. Separador de formas imaturas. (1) Larvas, (2) Pupas de machos (menores), (3) Pupas
de fêmeas (maiores) (Fotos: Capurro 2006).
2.2 Bioensaios em olfatômetro horizontal de dupla escolha
Foram realizados 15 bioensaios por estímulo avaliado de acordo com Geier et al.
(1996), utilizando aproximadamente 10 insetos/ teste, com o objetivo de quantificar a
resposta olfativa dos insetos frente à fonte de estímulo. A quantificação da resposta foi
medida pelo número de insetos testados que responderam ao estímulo (Geier et al.
1996).
Olfatômetro horizontal de dupla escolha: consiste de uma arena experimental
em acrílico transparente composta por um tubo principal (90 cm de comprimento x 12
cm de diâmetro) e dois tubos de escolha (36,5 cm de comprimento e 12 cm de
diâmetro), conectados em laterais opostas de uma caixa de escolha (FIG.6). O fluxo de
ar que passava pelo olfatômetro, velocidade de 0,32 m/s, foi gerado por um exaustor
(Qualitas ®, CQ1T4 SC - Motor WEG, potência: 0,5 HP) e em seguida era filtrado em
um filtro de carvão ativado e aquecido/ umidificado em um banho-maria adaptado
(Mota 2003).
44
Antes do início de cada teste, os insetos permaneceram nas gaiolas de liberação
por um período de 15 minutos para a sua aclimatização, recebendo apenas o ar
purificado. O estímulo foi apresentado no olfatômetro cinco segundos antes do início
dos testes por meio de um fluxo de ar em sentido horizontal. Após esse período, o
compartimento da gaiola de liberação foi aberto permitindo que os mosquitos voassem
contra o vento e dentro da pluma de odor para a caixa de escolha. Os primeiros testes
realizados com machos tiveram a duração de três minutos, os demais tiveram a duração
de um minuto. A resposta obtida foi avaliada pela diferença entre o número de insetos
encontrados nos diferentes compartimentos em um determinado período de tempo (FIG.
5) (Geier et al. 1996, 1999, Mota 2003).
O comportamento exibido foi interpretado de acordo com a localização dos
mosquitos no interior da arena logo após o encerramento do teste. Foram considerados:
(1) inativos: os mosquitos que não deixaram a gaiola de liberação; (2) ativados: aqueles
insetos que permaneceram no tubo principal, na caixa de escolha e nos tubos de escolha;
(3) atraídos: os insetos que permaneceram no interior de um tubo de escolha (Mota
2003) e (4) ativos: todos os insetos que deixaram a gaiola de liberação voando contra o
fluxo de ar no interior da arena, ou seja, aqueles insetos que apresentaram “atividade de
vôo” durante os experimentos. Nesse caso, os percentuais de insetos ativados e insetos
atraídos foram somados ao final dos experimentos (Geier e Boeckh 1999, Mota 2003)
(FIG. 7).
45
a
D
E
E
D
b
C
B
A
1
c
2
Figura 6. Olfatômetro horizontal de dupla escolha. 1. A. Gaiola de liberação; B. Tubo
principal; C. Caixa de escolha; D. Tubo de escolha; E. Tubo de liberação de estímulos. 2. a.
Exaustor; b. Filtro de carvão ativado; c. Banho-Maria (Fotos: Mota, 2003).
Figura 7. Representação da interpretação dos resultados ao final dos experimentos de acordo
com a localização dos insetos. A. Insetos inativos; B+C+D. Insetos ativados; E. Insetos atraídos.
B+C+D+E: Insetos ativos (insetos que deixaram a gaiola de liberação); F. Local de liberação do
estímulo. A seta indica o sentido do fluxo de ar (Foto: Leme 2010).
2.3 Experimento 1. Avaliação da metodologia de captura dos insetos para teste
As fêmeas de A. aegypti utilizadas nos testes de olfatometria são capturadas com
o uso de um aparato que utiliza o comportamento das fêmeas de procura por hospedeiro
para realização de repasto sanguíneo como princípio básico. Um sistema de exaustão
46
permite que o odor de uma mão humana, posicionada no recipiente para captura dos
insetos, seja levado até os insetos condicionados em uma gaiola de criação
(30x30x30cm, Bugdorm) no interior da ―gaiola de seleção‖ (50x50x50cm). Assim, as
fêmeas à procura de alimentação sanguínea, voam ativamente para dentro do recipiente
para captura (Posey & Schrek 1981) (FIG. 8).
D
A
C
B
Figura 8. Esquema da gaiola de seleção de insetos. A. Exaustor para produção do fluxo de ar,
B. ―Gaiola de seleção‖, C. Gaiola de criação contendo os insetos, D. Recipiente para captura dos
insetos. A seta indica o sentido do fluxo de ar.
A captura de machos utilizando a ―Gaiola de seleção‖ não é eficiente. Desta
maneira, fazia-se necessário buscar uma metodologia que fosse eficaz para capturar os
insetos e que não os danificassem, principalmente nas antenas, pois isso poderia
prejudicar as respostas.
Foram realizados testes no olfatômetro utilizando 10 fêmeas de A. aegypti com
idade entre cinco e 10 dias e em condições fisiológicas para a busca por hospedeiro
vertebrado e a realização de alimentação sanguínea. As fêmeas foram mantidas em
jejum, sem alimentação açucarada e água, por 24h antes do experimento e foram
separadas utilizando duas metodologias: (1) ―Capturador manual de Castro‖ (Buxton
1928) e (2) ―Gaiola de seleção‖ (FIG. 9). Foram realizadas 15 repetições utilizando
47
como estímulo o odor humano pela inserção dos dedos da mão diretamente no
olfatômetro, o controle foi apenas com ar.
A
B
C
Figura 9. Metodologias de seleção de insetos para teste em olfatômetro. A. Seleção de insetos
com o Capturador manual de Castro, B. ―Gaiola de seleção‖, C. Seleção de insetos com a
―Gaiola de seleção‖ (Fotos: Leme 2010, Paixão 2010).
Trinta insetos de ambos os sexos foram separados pelas duas metodologias,
anestesiados
em
freezer
(-20ºC)
e,
posteriormente
observados
em
um
estereomicroscópio para verificar se a morfologia externa foi alterada, (ex: perda de
antena, pata e asas).
2.4 Experimento 2: Respostas de machos virgens de Aedes aegypti de diferentes
idades ao odor humano
Os testes foram realizados com a liberação de grupos de aproximadamente 10
machos virgens de mesma idade a cada bioensaio (idade entre um a 10 dias). Um
voluntário (sexo feminino, 28 anos, não fumante) inseria os dedos da mão no tubo de
liberação do estímulo, enquanto o tubo controle estava vazio, contendo apenas o ar
purificado. A posição dos estímulos foi invertida a cada repetição para evitar tendência
48
de respostas (Mota 2003). Foram realizadas 15 repetições, cada uma com três minutos
de duração.
2.5 Experimento 3: Respostas de machos e fêmeas, virgens e copulados, ao odor de
diferentes hospedeiros humanos
Os bioensaios foram realizados com machos e fêmeas, virgens e copulados, com
idade entre três e 10 dias, coletados com um capturador manual de Castro. Foram
utilizadas fêmeas sem repasto sangüíneo e em jejum por 24 horas. A escolha da idade
dos machos utilizados foi baseada nos resultados do experimento 2.
O odor de cinco voluntários do sexo feminino e cinco do sexo masculino foi
avaliado em olfatômetro horizontal de dupla escolha a partir da inserção dos dedos da
mão direita do voluntário diretamente no tubo de liberação do estímulo (Geier &
Boeckh 1999, Geier et al. 1999). Entre os voluntários não havia nenhum fumante e suas
idades eram as seguintes: (1) Mulheres: KP 28, LH 23, LL 25, RC 19 e TR 19 anos
(média de idade 22,8 anos), (2) Homens: BP 19, CL 20, CG 19, GO 20, IC 18 anos
(média de idade 19,2 anos). Quinze minutos antes do início dos testes os voluntários
lavavam as mãos com detergente neutro e água de torneira e houve o cuidado de evitar
qualquer contato com produtos cosméticos ou perfumes antes dos testes (Geier e
Boeckh 1999, Geier et al. 1999).
49
2.6 Experimento 4: Respostas de machos virgens de Aedes aegypti ao odor de
diferentes hospedeiros vertebrados
Foi avaliada a resposta de machos virgens de A. aegypti ao odor de diferentes
hospedeiros vertebrados: codorna (Coturnix coturnix) e camundongo (Mus musculus),
comparando-os ao odor humano, e a alguns compostos utilizados na localização de
hospedeiros ( ácido lático e o atraente sintético de odor humano: BG-Lure®) (QUADRO
1). Foram utilizados aproximadamente 10 machos virgens com idade entre três e 10 dias
por bioensaio.
Quadro 1. Forma de apresentação dos estímulos avaliados em olfatômetro para machos de
Aedes aegypti.
Estímulo
Apresentação do estímulo
Odor de camundongo
Aeração
Odor de codorna
Aeração
Odor humano
Inserção dos dedos da mão
BG-Lure®
Papel de filtro
Ácido lático
50 µL (85%) em papel de filtro
Obtenção de odor dos hospedeiros: foi realizada através de um sistema de lavagem de
gás (FIG. 10) que permitia que um fluxo de ar passasse pelo corpo do hospedeiro
vertebrado. Um compressor (1/5Hp Piston Mini Air Compressor for Airbrush/ TC-20B)
gerava um fluxo de ar, que era purificado em um filtro de carvão ativado, e depois
direcionado para dentro de um recipiente plástico devidamente vedado contendo o
animal (camundongo Mus musculus e codorna Coturnix coturnix). Mangueiras de
50
polietileno de mesmo tamanho (90 cm) foram utilizadas para interligar todos os
componentes do sistema. Ao sair do recipiente, o fluxo de ar estava carregado com
estímulos olfativos dos hospedeiros, os quais foram apresentados no olfatômetro por
orifícios para o encaixe de mangueiras (FIG. 11). O controle dos testes com
camundongo e codorna foi realizado com um fluxo de ar proveniente do sistema de
aeração que passava por um recipiente plástico nas mesmas condições daquele que
continha o animal, porém vazio (FIG. 11). A apresentação do odor humano ocorreu
como no experimento 2 e, neste caso, o controle foi realizado apenas com o ar do
olfatômetro.
A
B
Figura 10. Sistema de obtenção de odor de hospedeiro. A. A seta aponta para o filtro de carvão
ativado. B. Recipiente onde era mantido o animal.
A
B
Figura 11. Inserção do odor dos hospedeiros no olfatômetro. A. Mangueiras de polietileno
provenientes do sistema de aeração. B. Papel de filtro preso em clip metálico (Durante os testes
a abertura para inserção do estímulo era mantida fechada) (Fotos: Leme 2010).
51
A. Apresentação de cairomônios liberados pelos hospedeiros
BG-Lure®: o odor do atraente sintético BG-Lure® foi transferido para um papel
de filtro limpo (1cm2, J. Prolab® 40) esfregando-o por cinco minutos, no atraente,
segundo a metodologia de Schreck et al. (1990). Posteriormente, o papel de filtro foi
fixado no tubo de apresentação do estímulo do olfatômetro com um clip metálico (FIG.
11B). O controle foi realizado apenas com papel de filtro limpo.
Ácido lático: Os testes com ácido lático (85% de pureza e forma L, Synth®,
Alemanha) foram realizados com 50µL de uma solução do composto diluído em
metanol (85%) em papel de filtro. O controle foi realizado com 50µL de metanol em
papel de filtro (Geier & Boechk 1999).
2.7 Análise estatística
O número dos insetos que responderam aos estímulos avaliados foi convertido
em percentagem e, posteriormente, foram calculados os percentuais médios (± e.p.). Os
dados sofreram transformação do tipo arco-seno (transformação angular) (Sokal &
Rolhlf 1981) e foram analisados quanto à normalidade usando o teste Lilliefors. Quando
os dados eram normais foram utilizados: teste t para comparar os valores de atratividade
entre o estímulo testado e o controle, e ANOVA, seguido pelo teste de Tukey, para
comparação entre diferentes tratamentos. Os testes de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis
foram utilizados para dados não-paramétricos avaliando a resposta dentro de um mesmo
tratamento e entre diferentes tratamentos, respectivamente. A correlação de Spearman
foi utilizada para avaliar a correlação entre idade e resposta dos machos e entre o
número de insetos nos extratos e a resposta dos mosquitos avaliados nos testes em
olfatômetro. As análise foram realizadas utilizando o programa estatístico BioEstat 5.0
(Ayres et al. 2005).
52
3 Resultados
3.1 Experimento 1: Avaliação da metodologia de captura dos insetos para teste
As fêmeas foram atraídas pelo odor humano no olfatômetro nos dois testes
realizados (FIG. 12) (p<0,05, teste t). O percentual de mosquitos ativos (atividade de
vôo durante os experimentos) foi superior a 70% nos dois casos (FIG. 12). Esses
resultados demonstraram que a resposta dos mosquitos selecionados pelas duas
metodologias foi semelhante (p>0,05, ANOVA).
Mão
Controle
Mosquitos ativos
100
90
Resposta (%)
80
70
60
a
a
50
40
30
20
10
b
b
0
Gaiola de seleção
Capturador manual
Figura 12. Percentual médio de resposta de fêmeas de Aedes aegypti ao odor humano separadas
com ―Gaiola de seleção‖ e ―Capturador manual de Castro‖ (% ± e.p.) (p>0,05 ANOVA). Letras
diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05 Teste t, n=15).
A partir da análise da morfologia externa dos mosquitos após a captura
observou-se que a integridade física da maioria dos insetos foi mantida com o uso do
capturador manual de Castro (TAB. 2). Um total de cinco insetos capturados com a
gaiola de seleção (uma fêmea e quatro machos) estava com as pernas danificadas.
53
Tabela 2. Quantidade de Aedes aegypti danificados após captura com capturador manual de
Castro e gaiola de seleção (n=30).
Asas
Capturador manual de
Castro
♀(n=30)
♂(n=30)
0
0
Gaiola de Seleção
♀(n=30)
0
♂(n=30)
0
Antenas
0
1
1
0
Pernas
1
0
0
4
Total
1
1
1
4
Foi possível verificar que não houve diferença entre as respostas das fêmeas
separadas pelas duas metodologias e que o ―Capturador manual de Castro‖ se mostrou
tão eficiente quanto a ―Gaiola de seleção‖, no que diz respeito à integridade física dos
insetos e resposta em olfatômetro. Portanto, os testes seguintes foram realizados
utilizando insetos capturados com o capturador manual de Castro.
3.2 Experimento 2: Respostas de machos virgens de Aedes aegypti de diferentes
idades ao odor humano
O percentual de machos inativos com um dia de vida foi 54% e, a partir do
segundo dia de idade até o terceiro, observou-se o aumento do percentual de insetos
ativos (68,4% e 87%, respectivamente) (FIG. 13). Observou-se que os insetos ativos
demonstraram uma resposta dependente da idade dos insetos com até três dias
(coeficiente de Spearman = 1,0, p<0,0001), porém para as demais idades não foi
observada diferença significativa (coeficiente de Spearman = -0,14, p>0,05).
Machos de A. aegypti não foram atraídos para o odor humano, pois observou-se
uma resposta maior para o controle por mosquitos de cinco a 10 dias de idade (p<0,05
Mann-Whitney). Entretanto, a maior parte dos machos com idade superior a dois dias
54
permaneceu ativa, ou seja, sobrevoando o tubo principal, a caixa de escolha e os tubos
de escolha (>60%) (FIG. 13). Observou-se que os mosquitos atraídos responderam nos
primeiros segundos após o início do experimento, saindo da gaiola de liberação e
voando em direção aos tubos de escolha. Por esse motivo, os experimentos seguintes
tiveram apenas um minuto de duração.
Mão
Controle
Mosquitos ativos
100
90
80
Resposta (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Idade
Figura 13. Percentual médio de respostas de machos virgens de Aedes aegypti de diferentes
idades ao odor humano em olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=15) (Spearman =1,0,
p<0,01).
3.3 Experimento 3: Respostas de machos e fêmeas, virgens e copulados, ao odor de
diferentes hospedeiros humanos
As respostas de machos e fêmeas de A. aegypti, virgens e copulados, nos testes
com voluntários humanos variaram de acordo com o sexo do voluntário e com o
hospedeiro avaliado (TAB. 3). Os voluntários do sexo masculino foram mais atrativos
que os voluntários do sexo feminino (p<0,05; Kruskal-Wallis) e, dentro do mesmo sexo,
foram encontrados voluntários mais atrativos que outros, caracterizando a variação na
atratividade individual (p<0,05; Kruskall-Wallis) (TAB. 3).
55
Os resultados obtidos nos testes com machos copulados mostrou atratividade
desses insetos ao odor de voluntários do sexo masculino (p<0,0001 Mann-Whitney) e
feminino (p<0,05 Teste t) (FIG. 14). Entretanto, foi observado que machos virgens,
apesar de não serem atraídos pelo odor humano, apresentaram um comportamento de
vôo (percentual de mosquitos ativos) maior que dos machos copulados (FIG. 14).
Figura 14. Percentual médio (± e.p.) de resposta de machos de Aedes aegypti, virgens e
copulados, ao odor de homens e mulheres em olfatômetro horizontal de dupla escolha. Letras
diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05 Kruskal-Wallis) (n=15).
Nos testes com fêmeas, tanto os insetos virgens quanto os copulados, foram
atraídos pelo odor de voluntários de ambos os sexos (p<0,05 - teste t), porém, a
atratividade das fêmeas virgens para o odor de mulheres foi inferior a 50%. Mais de
60% dos insetos testados foram ativos, ou seja, apresentaram atividade de vôo, frente ao
odor dos voluntários (FIG. 15).
56
Tabela 3. Percentual médio de resposta (±e.p.) de adultos de Aedes aegypti ao odor de diferentes hospedeiros humanos. ● Voluntários do sexo feminino. °
Voluntários do sexo masculino. * Significativamente atrativo comparado com o controle (t-test ou Mann-Whitney, p<0.05).
Fêmeas
Machos
Virgem
Copulado
Virgem
Copulado
Voluntários
1●
Mão
9,7±2,8
Controle
16,0±2,9 (p>0,05)
Mão
57,3±4,9
Controle
13,2±3,0 (p<0,05)
Mão
28,7±4,1
Controle
31,0±4,2 (p>0,05)
Mão
23,0±2,7
Controle
26,8±2,9 (p>0,05)
2●
18,2±6,9
13,3±3,9 (p>0,05)
53,3±3,5
9,2±1,9 (p<0,05)
11,8±2,9
26,4±3,45 (p>0,05)
7,7±5,3
2,7±4,0 (p>0,05)
3●
31,3±6,1
22,2±2,3 (p<0,05)
71,3±3,7
1,8±0,9 (p<0,01)
18,6±3,9
25,2±3,65 (p>0,05)
14,7±3,4
11,9±3,6 (p>0,05)
4●
58,0±5,5
6,0±4,7 (p<0,01)
67,3±5,5
4,2±1,7 (p<0,01)
15,9±3,8
20,0±4,0 (p>0,05)
18,2±4,3
4,1±3,9 (p<0,05)
5●
36,8±2,1
19,0±4,1 (p<0,05)
58,7±6,2
9,9±3,8 (p<0,05)
22,0±1,4
29,9±1,7 (p>0,05)
29,4±3,0
15,0±2,8 (p<0,05)
6°
54,5±9,2
14,0±3,9 (p<0,05)
73,4±2,6
9,1±3,5 (p<0,01)
19,0±3,4
20,0±3,4 (p>0,05)
31,2±4,2
18,2±3,1 (p<0,05)
7°
73,4±4,2
5,6±2,3 (p<0,01)
74,3±3,7
6,4±1,8 (p<0,01)
30,3±4,5
25,4±5,4 (p>0,05)
33,0±5,8
18,0±3,9 (p<0,05)
8°
60,2±6,9
5,2±1,7 (p<0,01)
90,5±2,2
1,5±0,8 (p<0,01)
22,6±2,9
24,2±4,8 (p>0,05)
13,3±3,4
4,3±1,7 (p<0,05)
9°
66,0±6,3
11,0±3,1 (p<0,01)
72,5±3,3
1,8±0,9 (p<0,01)
18,9±4,4
24,0±2,7 (p>0,05)
32,3±5,5
16,4±3,44 (p<0,05)
10°
71,0±6,0
7,4±2,8 (p<0,01)
67,4±4,5
11,2±3,9 (p<0,05)
24,5±4,3
21,0±4,9 (p>0,05)
26,4±4,4
12,4±3,02 (p<0,05)
57
Figura 15. Percentual médio de resposta de fêmeas de Aedes aegypti, virgens e copuladas, ao
odor de homens e mulheres (Porcentagem média ± e.p.) (n=15). Letras diferentes indicam
diferença estatística significativa (p<0,05 teste t) (n=15).
3.4 Experimento 4: Resposta de machos virgens de Aedes aegypti ao odor de
diferentes hospedeiros vertebrados
O camundongo e a codorna não foram atrativos para machos de A. aegypti,
porém, foram importantes para o desencadeamento do comportamento de vôo dos
insetos (>60%) (TAB. 4). Nos testes em que houve competição entre odor animal e odor
humano, houve diferença entre mão humana e codorna, sendo a mão mais atrativa que a
codorna (p<0,05 ANOVA) (TAB. 4).
Nos testes com cairomônios sintéticos, foi observada atratividade apenas para o
atraente sintético BG-Lure® (p<0,05 – Mann-Whitney), porém a resposta foi inferior a
40%. Assim como nos demais testes empregando odor de hospedeiro vertebrado, o
estímulo desencadeou a atividade de vôo da maioria dos machos avaliados (>80%)
(TAB. 4).
58
Tabela 4. Percentual médio de resposta de machos de Aedes aegypti em olfatômetro horizontal
de dupla escolha a diferentes hospedeiros vertebrados e a compostos de localização de
hospedeiros. a Tubo de apresentação do estímulo no olfatômetro. * Diferença significativa entre
os estímulos (p<0,05, Mann-Whitney) (n=15). b Os valores apresentados em ―Mosquitos ativos‖
se referem à soma dos percentuais médios de mosquitos ativados, mosquitos no Tubo A e
mosquitos no Tubo B.
Tubo Aa
Experimento
Mosquitos
ativosb
Tubo B a
Estímulo
%
(e.p.)
Estímulo
%
(e.p.)
%
(e.p.)
Ar
10,7
(8,2)
Ar
13,0
(9,9)
58,7
(15,0)
Mão
28,7
(16,2)
Ar
31,0
(17,0)
76,7
(19,0)
15,0
(9,2)
Ar
23,0
(10,8)
61,0
(12,5)
1
2
3
Camundongo
4
Codorna
37,0
(15,2)
Ar
53,0
(14,9)
94,0
(5,6)
5
Codorna
39,0
(12,2)
Camundongo
51,0
(10,2)
95,0
(4,2)
6
Codorna *
28,0
(10,2)
Mão *
48,0
(7,8)
93,0
(6,4)
7
Camundongo
25,0
(13,7)
Mão
33,0
(10,2)
72,0
(12,7)
8
BG-Lure® *
33,7
(13,6)
Papel de *
filtro limpo
27,7
(11,7)
82,6
(13,7)
9
Ác. Lático
12,5
(9,7)
Solvente
(metanol)
10,4
(10,2)
73,4
(23,0)
59
4 Discussão
O funcionamento da ―Gaiola de seleção‖ é baseado na resposta dos insetos ao odor
humano, pois eles devem ser atraídos pela mão até o recipiente que os acondicionará
(Posey & Schrek 1981), assim os machos não são capturados de maneira eficiente. Os
estímulos químicos são detectados por células receptoras presentes nas sensilas
olfativas, as quais estão localizadas nas mandíbulas, palpos, tarsos e, principalmente,
nas antenas (Lews 1984, Matthews & Matthews 1988). Assim, a integridade física dos
insetos é importante para a detecção de tais estímulos, bem como por seu
comportamento (Clements 1999, Sant’Ana & Stein 2007). Por esse motivo, a escolha da
metodologia de seleção é tão importante, pois poderia comprometer os resultados caso
danificasse os insetos. Os resultados apresentados demonstraram que a coleta de insetos
com o ―Capturador manual de Castro‖ não influenciou na resposta dos mesmos.
Portanto, este método foi usado para coletar os mosquitos utilizados nos demais
experimentos.
O comportamento dos machos de permanecerem próximos ao hospedeiro vertebrado
é algo bastante curioso devido ao fato dos machos não necessitarem de alimentação
sanguínea (Hartberg 1971). Muitos autores já observaram tal fenômeno e sugerem que
ele é devido à necessidade desses insetos de encontrarem fêmeas para a cópula
(Clements 1999, Hartberg 1971, Jaenson 1985, McIver et al. 1980, Takken & Knols
2010). O fato de machos com idade inferior a dois dias serem inativos frente ao odor
humano aponta para a necessidade de desenvolvimento das sensilas olfativas
responsáveis pela detecção dos voláteis do hospedeiro (Clements 1999, Davis 1984),
como ocorre com as fêmeas do mosquito (Davis 1984). Entretanto, esse comportamento
também pode indicar a importância da localização dos cairomônios de hospedeiros
vertebrados por machos de mosquitos para auxiliar no encontro de fêmeas para a
60
cópula. As respostas obtidas nos insetos com idade superior a dois dias demonstraram
que, apesar da atratividade dos machos ter sido inferior a 40%, o odor humano foi um
estímulo importante para o desencadeamento do comportamento de vôo dos machos e,
provavelmente possui um papel determinante na formação de enxames por esses insetos
(Cabrera & Jaffé 2007). Além disso, poucos segundos após o início dos testes
comportamentais em olfatômetro, já foram observadas respostas como início do vôo e
atratividade ao odor humano, como acontece para fêmeas (Geier & Boeckh 1999).
A diferença de atratividade entre voluntários dos sexos maculino e feminino
observada durante esse estudo corrobora com o encontrado na literatura para fêmeas de
A. aegypti (Geier et al 1996) e outros insetos hematófagos, sendo o sexo masculino mais
atrativo que o sexo feminino, provavelmente, devido às diferenças hormonais entre
homens e mulheres (Brady 1997, Brouwer 1960, Lindsay et al. 1993, Schofield &
Sutcliffe 1996, Schreck et al. 1990). Da mesma maneira, a diferença de atratividade
apresentada por voluntários de um mesmo sexo demonstraram uma variação individual
na atratividade que é devida às diferentes concentrações dos cairomônios utilizados
pelos insetos para localização do hospedeiro (ácido lático, amônia, etc) e à combinação
de tais compostos (Chapman 1988, Dekker et al. 2005, Eiras & Jepson 1994, Geier et al.
1996, Geier et al. 1999, Geier & Boeckh 1999, Smallegange et al. 2005, Steib et al.
2001).
Fêmeas de A. aegypti podem realizar o repasto sanguíneo mesmo antes de copular,
entretanto, sabe-se que a cópula é um estímulo de grande importância para o início da
atividade hematofágica (Clements 1999, Cônsoli & Lourenço-de-Oliveira 1994,
Forattini 2002), por esse motivo, a atratividade de fêmeas que já copularam foi superior
a resposta das fêmeas virgens. A diferença de resposta entre machos virgens e
copulados demonstra uma relação entre a busca por hospedeiro e a realização de cópula
61
uma vez que machos virgens, apesar de não responderem ao odor humano,
apresentaram atividade de vôo elevada, provavelmente formando um enxame, ao
contrário do que foi observado para os machos que já haviam copulado (Ferguson et al.
2005, Klowden 1995, Nijhout & Sheffield 1979). Entretanto, nos testes com o atraente
sintético BG-Lure®, os machos virgens não apenas apresentaram atividade de vôo
elevada como foram atraídos pelo estímulo avaliado, o que explicaria a captura de
machos em armadilhas iscadas com tal atraente (Kröeckel et al. 2006, Maciel-de-Freitas
2006, Paixão 2007, Ázara 2009). Cabrera & Jaffé (2007) descreveram o aumento do
comportamento de enxame de machos virgens de A. aegypti na presença de um
hospedeiro vertebrado, mostrando a importância do hospedeiro para o vôo desses
insetos. Como os machos não realizam atividade hematofágica, sua resposta frente ao
odor do hospedeiro, provavelmente, é diferente da resposta apresentada pelas fêmeas.
Nos testes de competição entre odores de diferentes hospedeiros vertebrados
(codorna e camundongo) e odor humano foi possível observar maior resposta dos
machos frente ao odor humano, caracterizando o comportamento antropofílico já
descrito para fêmeas do inseto (Dekker et al. 2005, Forattini 2002, Mukwaya 1976). Ao
testar a preferência dos machos de A. aegypti para camundongo ou codorna, foi
observado que o camundongo foi mais atrativo, entretanto a atividade de vôo dos
insetos foi maior nos testes com codorna. Tanto a amônia quanto a uréia, podem atuar
sinergisticamente com os demais cairomônios do hospedeiro. Assim, como o
camundongo urinou durante os testes, a presença de amônia e uréia pode ter aumentado
a atividade de vôo dos mosquitos (Braks et al. 2001, Geier et al.1999). É possível que a
liberação de CO2 pelos animais testados, associada aos demais cairomônios, tenha
influenciado as respostas obtidas, pois esse é um cairômonio bastante utilizado pelas
fêmeas de A. aegypti para localização do hospedeiro (Takken & Knols 2010). A
62
quantidade de CO2 liberada depende do metabolismo e da atividade do animal, assim, a
diferença de tamanho entre os hospedeiros indica que a quantidade de CO2 liberada pela
codorna seja maior que a liberada pelo camundongo, o que sugere que a presença desse
composto exerça um papel de menor importância na atratividade dos mosquitos
machos. Kröckel et al. (2006) observaram em estudo realizado com armadilhas BG Sentinel® contendo atraente sintético de odor humano (BG - Lure®) que a presença de
CO2 nas armadilhas não influenciava a quantidade de machos capturados, indicando que
tal composto não é um fator crucial para atração de machos. Desta maneira, outros
fatores podem estar relacionados à atratividade desses insetos para os hospedeiros
vertebrados.
O estudo do comportamento dos machos de A. aegypti frente a hospedeiros
vertebrados vem sendo negligenciado devido ao seu pequeno papel na transmissão de
patógenos, sendo este o primeiro trabalho realizado com o objetivo de avaliar as
respostas olfativas desses mosquitos à cairomônios de hospedeiros vertebrados.
Entretanto, a importância de tais insetos na manutenção da circulação de viral na
natureza, não deve ser esquecida, pois as formas de transmissão vertical e venérea são
uma realidade (Kow et al. 2001, Tu et al. 1998). O presente estudo esclarece
características importantes do comportamento dos machos para localização de
hospedeiros vertebrados e aponta para a necessidade de mais estudos sobre o tema.
63
Capítulo II
Padronização da extração e identificação química dos compostos presentes na
cutícula de adultos virgens de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762)
64
1 Introdução
Os hidrocarbonetos cuticulares (HCs) presentes nos insetos são importantes por
conferirem permeabilidade, protegendo contra a dessecação e a penetração de
microrganismos e produtos químicos (Blomquist & Jackson 1979). Sintetizados pelos
próprios insetos, sua composição química é uma expressão do genótipo desses
organismos, ocorrendo, por esse motivo, uma grande variação em sua produção (Havert
et al. 1991, Phillips et al. 1988). Tal variação permitiu que a identificação dos HCs fosse
utilizada como importante característica taxonômica em insetos (Havert et al. 1991,
Kremer et al. 1979, Lang 1977, Langley et al. 1981, Linley & Carlson 1983, Meola et
al. 1977, Milligan et al. 1986, 1988, Phillips et al. 1988, Steiner et al. 2007) uma vez
que seu estudo permite a determinação de diferenças espécie-específicas (Phillips et al.
1988), caracterizada pela presença de determinado composto, bem como sua
quantidade, podendo variar de acordo com a espécie, idade, localização geográfica ou
mesmo sexo (Lockey 1991).
Além da importância taxonômica, os HCs também exercem um papel relevante na
comunicação química dos insetos, podendo atuar como feromônios sexuais e/ ou de
agregação, feromônios de alarme, cairomônios, secreções de defesa, reconhecimento de
castas e marcadores territoriais (Gulias-Gomes et al. 2008, Batista-Pereira et al. 2004,
Kremer et al. 1979, Lang 1977, Langley et al. 1981, Linley et al. 1983, Meola et al.
1977, Phillips et al. 1988, Steiner et al. 2007), o que sugere que sua produção seja
precisamente controlada (Phillips et al. 1988).
O avanço na análise de hidrocarbonetos cuticulares ocorreu nos anos 1970 com
o surgimento de técnicas sensíveis como a cromatografia gasosa (CG) (Phillips et al.
1988), que permite analisar os padrões de hidrocarbonetos de determinado inseto e
65
calcular suas concentrações (Collins et al. 1993, Phillips et al. 1988, Priestman & Horne
2002). A CG é uma metodologia utilizada para separar substâncias de uma amostra
podendo ser utilizada para identificação de compostos a partir da comparação entre o
tempo de retenção de uma amostra padrão e da amostra que se deseja avaliar (Collins et
al. 1993, Jones & Oldham 1999). Essa técnica envolve uma série de processos físicoquímicos de separação dos compostos de uma mistura em função de suas características
moleculares e se destaca pela facilidade em efetuar não apenas a separação, mas
também a quantificação das espécies químicas. O primeiro estudo empregando a CG em
dípteros foi realizado por Carlson & Service (1979) e permitiu distinguir adultos do
complexo Anopheles gambiae diferenciando An. gambiae s.s de An. arabiensis.
A cromatografia a gás acoplada a espectometria de massas (CG-EM) permite a
identificação dos compostos presentes em uma amostra. Nessa técnica, o composto é
bombardeado no espectrômetro de massas por um feixe de elétrons, obtendo assim
espectro de fragmentos iônicos. A partir da análise do espectro é possível identificar os
diferentes compostos através da comparação com espectros existentes na literatura e do
cálculo dos índices de retenção (IR) ou Kovats (IK). O cálculo desses índices é
realizado a partir da injeção da amostra e de uma mistura de hidrocarbonetos com tempo
de retenção conhecidos (Adams 2007, Silverstein et al. 2007).
A identificação de HCs de formas imaturas e adultos de A. aegypti foi realizada
para a cepa Rockefeller (Cabrera & Jaffé 2007, Mendki et al. 2000, Priestman & Horne
2002, Seenivasagan et al. 2009). Através do estudo dos HCs de larvas de A. aegypti foi
possível identificar e caracterizar o feromônio de oviposição n-heneicosano (C21H44)
(Mendki et al. 2000, Seenivasagan et al. 2009), encontrado em larvas, água de
criadouros (Seenivasagan et al. 2009) e adultos (Priestman & Horne 2002). Priestman e
Horne (2002) identificaram 42 hidrocarbonetos cuticulares em extratos de adultos do
66
mosquito. Cabrera e Jaffé (dados não publicados) identificaram HCs de machos e
fêmeas de A. aegypti da cepa Rockfeller encontrando seis compostos exclusivos do sexo
masculino: os ésteres etanoato de 1-etildecila e E-9-octadecen-12-inoato de metil, o
ácido Z-8,11,14-eicosatrienoico, o aldeído undecanal, o acilglicerídeo 1,3-diacetil9,12,15-octadecatrienoilglicerídeo e o alceno Z,Z-3-metil-4,6-hexadecadieno. Essa
diferença na composição química dos HCs entre os sexos pode indicar que esses
compostos sejam utilizados para o reconhecimento de parceiros para a cópula, descrito
para dípteros do gênero Drosophila (Blows et al. 2004, Hine et al. 2004, Petfield et al.
2005) e para Dermatobia hominis (Gulias-Gomes et al. 2008). Sabe-se que cada espécie
de inseto possui seu próprio código de comunicação química baseado nas diferenças
estruturais dos compostos feromonais. Diversas pesquisas foram realizadas com insetos
e demonstraram que a composição do feromônio pode variar dependendo da sua região
de origem (Hadley 1977). Essas diferenças podem influenciar diretamente na eficiência
da comunicação interespecífica. A variação da composição química de feromônios,
muitas vezes representados por HC, também foi descrita na literatura para insetos de
diferentes ordens, sendo bastante conhecido em Lepidoptera (Batista-Pereira et al.
2006), Isoptera (Batista-Pereira et al. 2004) e em dípteros dos gêneros Phlebotomus e
Lutzomyia (Araki et al., 2009, Bauzer et al., 2007, Hamilton et al. 2005).
A identificação dos HCs para adultos de A. aegypti da população brasileira ainda
não foi realizada e, como sua composição pode variar de acordo com a localização
geográfica dos insetos, tal análise é de grande importância. Estudos detalhados a
respeito dos HCs de adultos de A. aegypti, sua identificação, bem como a realização de
testes comportamentais, podem esclarecer o papel desses compostos na comunicação
química de adultos de A. aegypti.
67
O objetivo deste capítulo foi padronizar a metodologia de extração de compostos
presentes na cutícula de adultos de A.aegypti de população brasileira e realizar a
identificação química dos mesmos.
2 Material e métodos
2.1 Criação de Aedes aegypti para o preparo dos extratos
Os insetos utilizados para preparo dos extratos foram criados como descrito no
capítulo I, entretanto, todos os mosquitos utilizados foram alimentados com solução de
sacarose (10%) (Syntech 99% de pureza) com a finalidade de evitar variações nos
padrões de HCs devido à alimentação (Jaffé K., comunicação pessoal).
2.2 Extração do odor de adultos de Aedes aegypti
Foram realizadas extrações do corpo de adultos virgens de A. aegypti, machos e
fêmeas, utilizando diferentes parâmetros.
2.2.1 Padronização da extração de compostos cuticulares de Aedes aegypti
Foram preparados extratos hexânicos de adultos virgens de A. aegypti,
totalizando três repetições por metodologia avaliada.
(1) Os primeiros extratos foram realizados com insetos virgens, machos e
fêmeas, com sete dias de idade, de acordo com Priestman e Horne (2002). Um pool de
25 insetos virgens foi colocado em um frasco de vidro (Supelco, Clear Screw Top Vial,
68
2 ml) e, após serem anestesiados em freezer, foi imerso em 1ml de n-hexano (Merck,
99% de pureza) e agitado por cinco minutos (Priestman & Horne 2002). O extrato foi
filtrado em pipeta de Pasteur, contendo lã de vidro por duas vezes e, em seguida, foi
concentrado com um leve fluxo de gás nitrogênio (N2) e armazenado em freezer para
posterior análise por CG.
(2) Posteriormente foi realizada nova extração com 25 fêmeas virgens, de sete
dias de idade, entretanto, os insetos não foram agitados, permanecendo no n-hexano em
diferentes tempos no freezer: 5 min, 15 min, 30 min, 60 min e 240 min. Os extratos
foram filtrados em pipeta de Pasteur contendo algodão previamente lavado com nhexano, concentrados com N2 e armazenados em freezer.
(3) Em seguida, foram realizados extratos com machos e fêmeas de A. aegypti
virgens de 5-6 dias de idade após a emergência do adulto. Os insetos foram anestesiados
em freezer e, posteriormente, foi adicionada quantidade de hexano suficiente para cobrilos (Jaffé, K. comunicação pessoal) em frasco de vidro (Supelco, Clear Screw Top Vial,
2 ml) mantido em freezer durante o período de extração. Foram realizados extratos de
20, 50, 100, 200, 300 e 400 insetos adultos para cada um dos sexos com tempo de
extração de 30 min para todas as amostras e sem agitação. Foram preparados extratos
filtrados e extratos sem filtração, neste caso, o sobrenadante foi retirado após o período
de extração e concentrado com N2. Posteriormente, foi realizada a comparação entre a
quantidade de compostos extraídos nos extratos filtrados com algodão e nos extratos
que não passaram pelo processo de filtragem.
Os extratos utilizados para análise no CG-EM foram preparados com 200 insetos
virgens de acordo com o item 3 sendo, posteriormente, filtrados e concentrados com N2
e acondicionados em frascos âmbar (Supelco, Clear Screw Top Vial, 2 ml) em freezer.
69
Todos os controles foram realizados com 1µl de n-hexano (Merck, 99% de pureza)
(FIG. 16).
Figura 16. Padrão cromatográfico do hexano (controle).
2.2.2 Cromatografia a gás (CG)
Para análise por CG os extratos de machos e fêmeas de A. aegypti foram resuspendidos em 20 μl de n-hexano, dos quais 1μl foi injetado diretamente no
cromatógrafo (Priestman & Horne, 2002) utilizando uma seringa de vidro (Hamilton,
10μl, Nevada) no modo Splitless (pressão da coluna: 130 KPa) . Os extratos foram
analisados em CG Shimadzu 17-A equipado com uma coluna DB-1 (100%
dimetilpolisiloxano) (30m x 0,25mm I.D., 0,25 µm de espessura do filme, J & W
Scientific), usando hélio como gás de arraste. A temperatura do injetor foi 315oC e do
detector 320ºC (FID). O programa de corrida teve 50 min. de duração e foi iniciado com
a temperatura de 100o C, aumentando para 230o em uma taxa de 10o C a cada 2 min e,
posteriormente 5o C/min até 300o C (Mahamat & Hassanali 1998).
2.2.3 Cromatografia a gás acoplada ao espectrômetro de massas (CG - EM)
A cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG - EM) foi
utilizada para identificar os compostos PR esentes nos extratos dos dois sexos de acordo
70
com sua composição. Os testes de CG – EM foram realizados no laboratório de
Ecologia Química, no departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de
Pernambuco (Recife).
Foram analisadas amostras preparadas com 200 insetos virgens com o emprego
de um cromatógrafo a gás (Hewlett-Packard 5890, Series II) acoplado a um
espectrômetro de massa (MSD 5971). Foi utilizada uma coluna DB-5 (sílica fundida)
(30m x 0,25mm i.d. J&W Scientific) com temperatura inicial de 35°C por 2 min,
aumentando para 220°C a 10°C/min. O hélio (He) foi utilizado como gás de arraste com
fluxo de 1mL/min. Para injeção no CG-EM os extratos foram re-suspendidos em 20µl
de hexano e filtrados em pipeta de Pasteur contendo algodão previamente lavado
(Autran et al. 2009, Navarro-Silva et al. 2009). Foi injetado um volume de 1µL do
extrato no modo splitless e os espectros foram obtidos com uso de um feixe eletrônico
de 70 eV e gravados na faixa m/z 40 – 550 a uma velocidade de 0,5 scan/s. Foram
realizadas três repetições e inicialmente, a identificação dos compostos presentes nos
extratos foi realizada pela comparação entre seus índices de retenção (IR) ou de Kovats
(IK) com índices descritos na literatura para os prováveis compostos (Adams 2007,
Silverstein et al. 2007). Esses índices foram calculados de acordo com a equação de Van
den Dool e Kratz (1963) ou Kovats a partir da co-injeção dos extratos (0,8µL) e padrões
de hidrocarbonetos (C11 – C36) (0,2µL), totalizando 1µL (Adams 2007).
Posteriormente, os espectros obtidos foram comparados com aqueles presentes na
biblioteca do sistema CG-EM (Lab Solutions - GCMS Solutions - Shimadzu), da
biblioteca digital NIST MS Search 2.0 (NIST 2005) e com dados reportados na
literatura (Adams 2007, Silverstein et al. 2007).
71
3. Resultados
3.1 Padronização da extração de compostos cuticulares de Aedes aegypti e
análise no cromatógrafo a gás
Devido ao processo de agitação do frasco contendo os insetos, os extratos
preparados apresentaram um grande número de escamas. Por esse motivo, foi
necessário filtrá-los duas vezes para a remoção das escamas antes da injeção no CG. A
necessidade de filtrar o extrato mais de uma vez, bem como o uso da lã de vidro, pode
prejudicar a extração devido à retenção de alguns compostos (Trigo, J.R. 2008
comunicação pessoal) e interferir na quantidade de compostos extraídos, por isso, os
extratos realizados posteriormente foram preparados sem agitar e filtrados com algodão
lavado em n-hexano.
Os extratos realizados sem agitar e filtrados com algodão em diferentes tempos
apresentaram uma grande quantidade de picos (FIG. 17) e permitiu observar que quanto
maior o período de extração, maior a concentração das substâncias extraídas.
72
5min
15min
30min
1h
4h
Figura 17. Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas de Aedes aegypti
realizados em diferentes tempos de extração e filtrados.
As extrações com diferentes quantidades de insetos foram realizadas para auxiliar na
escolha dos extratos que posteriormente seriam utilizados em testes comportamentais,
em olfatômetro horizontal de dupla escolha. A comparação entre a quantidade de
compostos presentes nos extratos filtrados e sem filtração permitiu observar que no
processo de filtração alguns compostos foram retidos (TAB. 5) (FIG. 18 a FIG. 21). Foi
observada maior quantidade de picos nos extratos quando preparados sem filtração
73
(FIG. 19 e 21) (TAB. 5). À medida que aumentava a quantidade de insetos nos extratos,
tanto de machos quanto de fêmeas, o número de picos obtidos também aumentou (FIG.
18 a FIG. 21).
20
50
100
200
300
400
Figura 18. Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas virgens de Aedes
aegypti em diferentes quantidades filtrados.
74
20
50
100
200
300
400
Figura 19. Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de fêmeas virgens de Aedes
aegypti em diferentes quantidades sem filtragem.
75
20
50
100
200
300
400
Figura 20. Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de machos virgens de Aedes
aegypti em diferentes quantidades filtrados.
76
20
50
100
200
300
400
Figura 21. Padrão cromatográfico de extratos hexânicos de machos virgens de Aedes
aegypti em diferentes quantidades sem filtragem.
77
Tabela 5. Média de picos presentes em extratos hexânicos de adultos virgens de Aedes
aegypti (machos e fêmeas) filtrados e sem filtragem, seguindo metodologia de Jaffé
(comunicação pessoal 2009) (n=3).
N.
°
Extratos ♀
Extratos ♂
insetos
Filtrado
Sem filtragem
Filtrado
Sem filtragem
20
3
7
2
4
50
4
12
3
14
100
50
63
5
15
200
21
71
9
16
300
28
59
11
22
400
62
83
52
73
3.2 Cromatografia a gás acoplada ao espectrômetro de massas (CG - EM)
A análise por CG-EM permitiu identificar 50,18% dos compostos presentes nos
extratos de fêmeas e 62,76% daqueles presentes nos extratos de machos virgens (TAB.
6). Alguns dos compostos identificados eram exclusivos de um dos sexos. Os
compostos 4-metil-3-penten-2-ona, 2-pentenal,2-metil, 2-pentanona,4-mercapto-4-metil,
benzaldeído e tridecano, foram encontrados apenas em fêmeas, e ciclohexene,1-metil-4(1-metiletenil), tridecano e eicosano, apenas em machos (FIG. 22). Os demais
compostos identificados eram comuns a ambos os sexos, entretanto, apresentando
quantidades diferentes (TAB. 6).
78
6
1
2
34
5
7
9
10
8
15
16
14
11
12
13
15
17
16
22
23
25
27
24
19 20 21
18
26
28
Figura 22. Sobreposição dos cromatogramas de extratos de machos (preto) e fêmeas
(vermelho) destacando compostos em comum e compostos exclusivos de um dos sexos
(n=3). As informações sobre os compostos indicados pelos números encontram-se na
Tabela
6.
79
Tabela 6. Compostos identificados em extratos hexânicos de machos e fêmeas virgens
de Aedes aegypti por cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CGEM). (L) literatura, (C) calculado.
Kovats
Kovats
Composto
Nome do composto
(L)
(C)
% (♀)
% (♂)
1
Octano
800
-
5.33
6.06
2
4-metil-3-penten-2-one
838
838
1.18
-
3
2-pentenal, 2 metil
896
889
2.23
-
4
Nonano
900
-
2.64
0.91
5
2-pentanone, 4-mercapto-4-metil
934
925
1.47
-
6
Benzaldeído
962
963
9.11
7
Decano
1000
-
0.20
0.68
Ciclohexene, 1-metil-4-(18
metilethenil)
1033
1034
-
0.13
9
Undecano
1100
-
0.08
0.37
10
Dodecano
1200
-
0.11
0.22
11
Tridecano
1300
-
-
0.17
12
Tetradecano
1400
-
0.03
0.68
13
Pentadecano
1500
-
0.07
1.49
14
Hexadecano
1600
-
0.04
1.99
15
Heptadecano
1700
-
1.68
4.20
16
Octadecano
1800
-
0.08
3.46
17
Nonadecano
1900
-
0.29
4.70
18
Eicosano
2000
-
-
3.65
19
Heneicosano
2100
-
0.42
3.23
20
Docosano
2200
-
0.09
3.01
21
Tricosano
2300
-
0.52
2.83
22
Tetracosano
2400
-
0.62
20.7
23
Pentacosano
2500
-
3.83
3.08
24
Hexacosano
2600
-
1.80
1.65
25
Heptacosano
2700
-
14.75
5.40
26
Octacosano
2800
-
0.90
0.61
27
Nonacosano
2900
-
2.60
0.51
28
Triacontano
3000
-
0.11
-
50.18
62.76
Total
80
4 Discussão
As análises realizadas por CG permitiram selecionar a melhor forma de extração
dos HC de A. aegypti. A partir dos resultados obtidos optou-se por trabalhar com
amostras extraídas em freezer por 30 min e sem filtragem, realizadas a partir de grupos
de 200 insetos. Observou-se nos cromatogramas que, à medida que aumentava o
número de insetos, obtinha-se uma maior concentração dos compostos presentes nos
extratos. De acordo com Phillips et al. (1990) é possível realizar a comparação de
cromatogramas obtidos de extrações com diferentes quantidades de insetos, entretanto,
os resultados obtidos no presente trabalho demonstram a importância de padronização
de tal fator. De acordo com Priestman & Horne (2002), a quantidade de HCs presente
nos extratos de machos de A. aegypti foi menor que a encontrada nos extratos de
fêmeas. Esses autores relataram que essa diferença (em média 25%) provavelmente se
deva ao menor tamanho corporal dos machos, o que corrobora com os resultados
observados.
A análise dos extratos por CG-EM permitiu a identificação de compostos ainda
não descritos para A. aegypti (Priestman & Horne 2002). Provavelmente, a forma de
extração dos compostos da cutícula dos insetos foi fundamental, pois permitiu a
preservação de compostos extremamente voláteis. Entre eles, os hidrocarbonetos C8 –
C15, o benzaldeído e o ciclohexene,1-metil-4-(1-metiletenil). Em trabalho realizado em
2002, Priestman e Horne identificaram os hidrocarbonetos C16 a C31 em adultos de A.
aegypti das cepas Rockefeller e de Porto Rico, sem a menção de compostos muito
voláteis. No presente trabalho, o C20 foi detectado apenas em machos, enquanto no
trabalho desses autores não há especificação de presença do composto em apenas um
sexo. Além disso, Priestman e Horne (2002) identificaram traços de C30 em machos, ao
81
contrário do observado, uma vez que tal composto foi detectado apenas em extratos de
fêmeas. A diferença na composição química dos compostos cuticulares dos sexos pode
indicar que os mesmos sejam utilizados para o reconhecimento de parceiros para a
cópula, como descrito para dípteros do gênero Drosophila (Hine et al. 2004, Petfield et
al. 2005) e para Dermatobia hominis (Gulias-Gomes et al. 2008).
O HC n-heneicosano (C21) foi identificado inicialmente na Índia em larvas e
extratos de água de larvas do mosquito A. aegypti e foi classificado como um
importante feromônio de oviposição (Ganesan et al. 2006, Navarro-Silva et al. 2009,
Sharma et al. 2008, Seenivasagan et al. 2009), seu papel em machos de A. aegypti ainda
é incerto. Deste modo, a identificação do HC, n-heneicosano, oriundo da população
brasileira de A. aegypti tanto em machos quanto em fêmeas poderá fornecer importantes
informações a respeito da sua ecologia e isolamento comportamental e/ou reprodutivo,
além de permitir a comparação com o perfil químico de populações de Aedes de outras
localidades.
Testes comportamentais estão sendo realizados para verificar a resposta olfativa
de machos e fêmeas de A. aegypti aos compostos identificados em olfatômetro o que
pode fornecer mais informações sobre o papel da comunicação química no
comportamento desses insetos.
82
Capítulo III
Atratividade de insetos virgens de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762) ao
odor de adultos co-específicos e a extratos hexânicos de adultos
83
1 Comportamento de cópula e reconhecimento intra-específico em Culicidae
As fêmeas recém-emergidas de culicídeos podem copular logo após o
endurecimento do tegumento corporal, ao contrário dos machos, que somente se tornam
aptos após a genitália externa sofrer uma rotação de 180º, o que ocorre em média 24
horas após a emergência (Clements 1963). Assim, a idade dos machos é um fator
determinante para a ocorrência de cópula e fertilização das fêmeas (Hausermann &
Nijhout 1975, Mahmood & Reisen 1982, 1994, Ponlawat & Harrington 2007),
ocorrendo uma redução na taxa de fecundidade e na produção de gametas à medida que
a idade dos insetos aumenta (Hausermann & Nijhout 1975, Ponlawat & Harrington
2007).
Em várias espécies de mosquitos a cópula ocorre em enxames (erigamia) formados
por machos próximos à vegetação ou aos hospedeiros vertebrados e, por um fator ainda
desconhecido, as fêmeas são atraídas para esses locais (Ferguson et al. 2005, Klowden
1995, Nijhout & Sheffield 1979, Sullivan 1981). Provavelmente, o deslocamento das
fêmeas até os enxames é desencadeado por estímulos visuais (Downes 1969),
entretanto, alguns autores acreditam na existência de um feromônio sexual que poderia
atuar juntamente com tais estímulos (Cabrera & Jaffé 2007, Gomulski 1988, Takken &
Knols 2010, Polerstock 2002). Uma vez dentro do enxame, os machos detectam a
freqüência do batimento de asas das fêmeas para reconhecer parceiras co-específicas
(Roth 1948, Polerstock 2002). Essa detecção é realizada pelo órgão de Johnston,
presente apenas nos machos, e destaca-se como um importante estímulo para a
localização de fêmeas a curtas distâncias (Johnston 1955, McIver et al. 1980, Nijhout &
Sheffield 1979, Roth 1948).
84
Apesar de refratárias a mais de uma cópula (Gwadz et al. 1971), as fêmeas podem
copular várias vezes, porém, são fecundadas apenas uma vez (Gwadz et al. 1971,
Hickey & Craig 1966), sendo uma única cópula suficiente para a realização da
oviposição (Roth 1948). Os machos são capazes de copular várias vezes (Roth 1948),
podendo fertilizar diferentes fêmeas (Jones & Pilitt 1973). Durante a cópula, os machos
não apenas transferem o esperma, mas também proteínas da glândula acessória que
alteram o comportamento da fêmea (Klowden 1995). Tais proteínas impedem que a
fêmea copule novamente (Craig 1967), removem o bloqueio fisiológico que evita a
realização da oviposição (Fuchs & Kang 1978), alteram seu ritmo circadiano (Jones &
Gubbins 1977) e reduzem a busca por hospedeiro vertebrado em fêmeas com ovos. A
ausência de tais proteínas faz com que fêmeas de A. aegypti com ovos, mas sem
copular, continuem procurando por hospedeiros, o que aumentaria a possibilidade de
encontrar machos para a cópula (Klowden 1995).
O objetivo deste capítulo foi invetigar a existência de feromônios sexuais em A.
aegypti através das respostas olfativas a insetos co-específicos e a extratos do corpo de
insetos adultos.
2 Material e métodos
2.1 Criação dos insetos
Os mosquitos foram criados e mantidos em insetário a 27,0  2 ºC, 70,0  10%
de umidade relativa e 12L:12E de fotoperíodo. Os ovos foram colocados em cubas
plásticas com água desclorada e ração de réptil (Reptolife®) para a eclosão e
desenvolvimento das larvas até o estádio de pupa (10%) (Eiras & Jepson 1991). Para
85
garantir que os insetos utilizados nos experimentos fossem virgens eles foram separados
por sexo de acordo com seu tamanho ainda no estágio de pupa. Posteriormente, os
recipientes com pupas foram colocados em diferentes gaiolas teladas (30x30x30cm,
Bug-Dorm®) e, para controle da idade, foram trocados de gaiola diariamente. As gaiolas
dos diferentes sexos foram mantidas em salas distintas e verificadas diariamente, caso
houvesse algum inseto do sexo oposto, esse era descartado. Os adultos foram
alimentados com solução açucarada (10%) e todos os bioensaios foram realizados com
insetos das gerações F70 a F90.
2.2. Olfatômetro
Foram realizados testes comportamentais para avaliar as respostas olfativas de
machos e fêmeas virgens de A. aegypti (três e 10 dias) ao odor de insetos co-específicos
(machos ou fêmeas) em um sistema de aeração e a extratos de insetos co-específicos
(Geier et al. 1996, Mota 2003). Para os testes, foi utilizado um olfatômetro horizontal de
dupla escolha de acrílico, composto por um tubo principal (90cm de comprimento x 12
cm de diâmetro) e dois tubos de escolha (36,5 cm de comprimento e 12 cm de
diâmetro), conectados em uma caixa de acrílico. Foram realizados 15 bioensaios por
estímulo avaliado, utilizando aproximadamente 10 insetos/ teste (Geier et al. 1996).
Antes do início dos testes, os insetos permaneceram por 15 min nas gaiolas de
liberação para climatização. Após a apresentação do estímulo o compartimento da
gaiola de liberação foi aberto e os testes iniciado. A resposta obtida foi avaliada pela
diferença entre o número de insetos encontrados nos diferentes compartimentos em um
determinado período de tempo, como descrito no capítulo I (Geier et al. 1996, 1999,
Mota 2003).
86
2.3 Resposta de adultos de Aedes aegypti ao odor de insetos co-específicos
Um fluxo de ar (200 ml/L) gerado por um compressor (1/5Hp Piston Mini Air
Compressor for Airbrush/ TC-20B) e filtrado em filtro de carvão ativado foi
direcionado para dois recipientes cilíndricos de vidro limpos (14cm de comprimento x
4cm de diâmetro) (teste e controle), carregando os odores neles contidos (FIG. 23). No
recipiente teste foram colocados aproximadamente 30 adultos de A. aegypti virgens do
mesmo sexo, enquanto o recipiente controle estava vazio (FIG. 23). O fluxo de ar foi
levado ao olfatômetro através de mangueiras de polietileno de mesmo comprimento
(90cm) (FIG. 24a) que tinham sua posição invertida no braço do olfatômetro a cada
repetição. Foram realizadas 15 repetições para avaliar as respostas olfativas de machos e
fêmeas virgens de A. aegypti aos odores de insetos co-específicos de ambos os sexos.
C
E
A
B
D
E
Figura 23. Esquema do sistema de aeração utilizado nos testes com odor de Aedes aegypti. A.
Filtro de carvão ativado, B. Bifurcação para divisão do fluxo de ar, C. Tubo de vidro com
insetos (teste), D. Tubo de vidro vazio (controle). E. Mangueira. A seta indica o sentido do
fluxo de ar.
87
2.4 Resposta de adultos de Aedes aegypti a extratos de insetos co-específicos
Foi avaliada a resposta olfativa de A. aegypti a extratos contendo diferentes
quantidades de insetos adultos: 20, 50, 100, 200, 300 e 400. Os extratos foram
preparados como descrito no capítulo II e concentrados em fluxo de N2, posteriormente,
foram ressuspendidos em 50 µl de hexano (Merck 99%) e colocados em papel de filtro
de 1cm2. Após a evaporação do solvente o papel de filtro era preso no olfatômetro com
um clipe metálico no tubo de liberação do estímulo, que era fechado após a fixação do
papel (FIG.24b). O controle foi realizado com 50 µl de hexano em papel de filtro e a
análise estatística foi realizada como descrito no capítulo I.
A
B
Figura 24. Apresentação dos estímulos no olfatômetro. A. Encaixe da mangueira do sistema de
aeração. B. Fixação do papel de filtro no tubo de liberação de estímulo do olfatômetro com clipe
metálico (durante os testes o tubo era fechado) (Fotos: Leme 2010).
Foram avaliadas: (1) respostas olfativas de machos e fêmeas virgens de A.
aegypti, sem repasto sanguíneo, aos extratos de insetos co-específicos de ambos os
sexos em diferentes quantidades (20, 50, 100, 200, 300 e 400 insetos) e (2) respostas
olfativas de fêmeas virgens com repasto sanguíneo a extratos de 400 machos e 400
fêmeas. As fêmeas com seis dias de idade cronológica realizaram repasto sanguíneo em
88
camundongos (Mus musculus) e foram utilizadas três dias após o repasto (Gomes et al.
2006). Foram realizadas três repetições por tratamento, utilizando o mesmo extrato para
todas elas. Posteriormente, foram realizadas 15 repetições com extratos de 200 insetos
virgens para machos e fêmeas virgens.
3 Resultados
3.1 Resposta de adultos de Aedes aegypti ao odor de insetos co-específicos
As fêmeas virgens não foram atraídas para nenhum dos estímulos avaliados. Nos
testes com odor de fêmeas, apenas 24% dos insetos avaliados apresentaram atividade de
vôo. O odor dos machos, apesar de não ter sido atrativo (p>0,05 teste t), foi mais
eficiente para desencadear a atividade de vôo das fêmeas avaliadas (54%) (p<0,05
Kruskal-Wallis) (TAB. 7).
Os machos virgens foram significativamente atraídos para odor de insetos do
mesmo sexo (p<0,05 Kruskal-Wallis) (TAB. 7), mas não foi observada diferença
significativa na atividade de vôo desses insetos para os dois estímulos avaliados (odor
de fêmeas e odor de machos) (p>0,05 Kruskal-Wallis).
3.2 Resposta de adultos de Aedes aegypti a extratos de insetos co-específicos
A. Resposta de fêmeas virgens
Nos testes com extratos de fêmeas virgens, as fêmeas foram atraídas apenas por
extratos de 100 e 400 insetos (p<0,05 Mann-Whitney) (FIG. 25). Nos
testes
com
extratos de machos, as fêmeas virgens foram atraídas apenas por extratos de 100
machos (p<0,05 Mann-Whitney) (FIG. 26). A atividade de vôo das fêmeas aumentou, à
89
medida em que aumentou a quantidade de insetos nos extratos (coeficiente de Spearman
= 0,9, p<0,05) (FIG.27). Não houve diferença significativa entre os compartimentos
teste e o controle nos experimentos realizados com extratos de 200 insetos virgens
(p>0,05, Kruskal-Wallis) quando o número de repetições foi aumentado.
Tabela 7. Percentual de resposta de fêmeas e machos virgens de Aedes aegypti ao odor de
insetos co-específicos (Porcentagem média ± e.p.). ―*‖ Indica diferença estatística (p<0,05
Kruskal Wallis) (n=15).
Insetos
testados
Estímulo
(♂)
Controle
Atividade
de vôo
Estímulo
(♀)
Controle
Atividade
de vôo
♂
15 ± 1,4
3,6 ± 0,7 *
38%
6,5 ± 0,9
9 ± 1,2
33%
♀
11,9 ± 2,0
16,2 ± 2,0
54%
6,6 ± 1,1
6 ± 0,79
24%
Figura 25. Percentual de atratividade de fêmeas virgens de Aedes aegypti a extratos de fêmeas
co-específicas (Porcentagem média ± e.p.) em olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3)
(p<0,05 Mann-Whitney).
90
Teste
% de atratividade
Controle
Quantidade de insetos nos extratos
Figura 26. Percentual de atratividade de fêmeas virgens de Aedes aegypti a extratos de machos
co-específicos (Porcentagem média ± e.p.) em olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3)
(p<0,05 Mann-Whitney).
Machos
Resposta %
Fêmeas
Quantidade de insetos no extrato
Figura 27. Percentual de atividade de vôo de fêmeas virgens de Aedes aegypti a extratos de
insetos co-específicos (machos e fêmeas) em olfatômetro horizontal de dupla escolha
(Porcentagem média ± e.p.) (n=3) (Spearman, p<0,05).
B Resposta de machos virgens
Os machos virgens foram atraídos apenas pelos extratos de 300 fêmeas (FIG. 28)
(p<0,05, Mann-Whitney). Houve forte correlação positiva (coeficiente de Spearman =
91
1,0) entre o número de insetos nos extratos e a atratividade dos machos (p<0,0001).
Quanto à atividade de vôo dos insetos avaliados, não houve diferença para os extratos
de 100, 200, 300 e 400 fêmeas (p>0,05 Mann-Whitney) (FIG. 30).
Nos testes com extratos de machos co-específicos, houve atratividade para o extrato
de 400 insetos (p<0,05, Mann-Whitney) (FIG.29), com 95% dos mosquitos avaliados
apresentando atividade de vôo (FIG. 30). O extrato de 100 machos desencadeou a
atividade de vôo em 80% dos insetos testados (FIG. 30). Nos testes realizados com
aumento do número de repetições (n=15) para avaliar a resposta dos mosquitos a
extratos de 200 insetos não foi observada diferença significativa (p>0,05, KruskalWallis).
Figura 28. Percentual de atratividade de machos virgens de Aedes aegypti a extratos de fêmeas
co-específicas (Porcentagem média ± e.p.) em olfatômetro horizontal de dupla escolha (n=3)
(p<0,05 Mann-Whitney).
92
Figura 29. Percentual de atratividade de machos virgens de Aedes aegypti a extratos de
machos co-específicos (Porcentagem média ± e.p.) em olfatômetro horizontal de dupla escolha
Resposta %
(n=3) (p<0,05 Mann-Whitney).
Fêmeas
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
20
Machos
50
100
200
300
Quantidade de insetos no extrato
400
Figura 30. Percentual de atividade de vôo de machos virgens de Aedes aegypti a extratos de
insetos co-específicos (machos e fêmeas) em olfatômetro horizontal de dupla escolha
(Porcentagem média ± e.p.) (n=3) (p>0,05 Mann-Whitney).
4 Discussão
O estudo dos feromônios de insetos, além de fornecer muitas informações sobre
o comportamento desses organismos, auxilia em programas de controle e combate de
insetos-praga (Campion et al. 1989, Jutsum & Gordon 1989, Seabrook & Dyer 1983).
93
Muitos representantes da ordem Diptera possuem feromônios sexuais conhecidos, os
quais desempenham um papel importante no comportamento de corte desses insetos
(Lane et al. 1985, Ponlawat & Harrington 2007, Wicker-Thomas 2007). O uso do
feromônio sexual bombykol no controle da mariposa do bicho da seda (Bombyx mori) é
um dos exemplos mais conhecidos e, desde sua descoberta por Rogoff et al. em 1964,
vem sendo amplamente estudado (Groot et al. 2009, Roelofs et al. 2002), assim como os
feromônios de Drosophila melanogaster (Antony et al. 1985, Davis & Carlson 1989),
Haematobia irritans (Bolton et al. 1980), Musca domestica (Carlson et al. 1971, Uebel
et al. 1976), Stomoxys calcitrans (Sonnet et al. 1977, 1979). Em A. aegypti a única
maneira atualmente conhecida para o reconhecimento intra-específico e utilizada para
busca de parceiros para a cópula é a detecção do som do batimento de asas das fêmeas
pelos machos (Roth 1948). Entretanto, Cabrera & Jaffé (2007) observaram em testes
comportamentais indícios do possível reconhecimento de machos e fêmeas de A.
aegypti pela detecção de substâncias químicas específicas, provavelmente um
feromônio sexual e/ou de agregação, com aumento da atividade de vôo dos mosquitos
na presença de insetos co-específicos e formação de enxames pelos machos.
A atratividade dos machos de A. aegypti para insetos do mesmo sexo no sistema
de aeração e também a atratividade de machos e fêmeas aos extratos dos dois sexos
sugere a existência de feromônios nessa espécie. Trabalhos semelhantes em olfatometria
foram capazes de demonstrar a existência de feromônios sexuais em diferentes espécies
de Diptera. Lang e Foster (1976) demonstraram a existência de feromônio sexual em
Culiseta inornata em trabalho que avaliou a resposta de mosquitos adultos a insetos
vivos ou mortos em olfatômetro. Chaudhury et al. (1972) e Gulias-Gomes et al. (2008)
demonstraram a existência de feromônios sexuais, em Musca autumnalis e Dermatobia
94
hominis, respectivamente, pela atratividade de moscas adultas a extratos corporais de
insetos co-específicos em olfatômetro.
O aumento da atividade de vôo dos mosquitos, como descrito por Cabrera &
Jaffé (2007) também representa um comportamento importante para o encontro de
parceiros para a cópula. O aumento de vôo dos machos na presença do odor de fêmeas,
assim como sua atratividade, aponta para existência de feromônios sexuais produzidos
pelas fêmeas e reconhecidos por eles como descrito por Cabrera e Jaffé (2007). A
presença de indivíduos do sexo masculino e feminino foi um fator determinante para o
aumento da atividade de vôo dos machos. O aumento do vôo de machos na presença de
insetos do mesmo sexo demonstra um reconhecimento intra-específico que seria
responsável pelo comportamento de formação de enxames (Ferguson et al. 2005,
Klowden 1995, Nijhout & Sheffield 1979, Sullivan 1981). É provável que um
feromônio de agregação possa atuar nesse momento, atraindo mais machos para o
enxame (Klowden 1995, Justum & Gordon 1989). Cabrera e Jaffé (2007) obtiveram
resultados semelhantes em estudo que indicou a existência desses compostos em A.
aegypti devido ao aumento de insetos voando em enxames.
O aumento da atividade de vôo das fêmeas na presença de machos, assim como
a atração aos extratos, indica a existência de um composto químico de reconhecimento
sexual. Sabe-se que machos de algumas espécies de mosquitos voam formando
enxames e que as fêmeas são atraídas para esses locais, comportamento sugestivo para a
existência de um feromônio de agregação que também atue como feromônio sexual
(Klowden 1995). Em Nematocera da família Psychodidae, gênero Lutzomyia sp., foi
comprovada a existência de um feromônio de agregação produzido pelos machos
(terpeno) que também atua na atratividade das fêmeas (Hamilton et al. 1996, Spiegel et
al. 2005).
95
Apesar de todos os avanços no estudo de feromônios de insetos e a despeito da
importância do mosquito A. aegypti em saúde pública, ainda não foi descrito nenhum
feromônio sexual e/ ou de agregação para esse inseto, ou mesmo para outro
representante da família Culicidae. No presente trabalho foi observada pela primeira vez
a evidência de feromônios sexuais e/ou de agregação em extratos de adultos de A.
aegypti, com indícios da ocorrência de comunicação química entre esses insetos. Os
resultados sugerem que a investigação de feromônios em A. aegypti é promissora e
aponta para a possibilidade de utilização dos mesmos em armadilhas para controle do
vetor. O uso de feromônios no controle de insetos já está bem estabelecido na
agricultura, seja em armadilhas iscadas ou com o uso de técnicas como a interrupção da
cópula (confundimento) (Campion et al. 1989), essa última se destaca como a forma de
emprego de feromônios mais utilizada no controle de pragas. O emprego desses
compostos apresenta uma série de vantagens, como, por exemplo, não ser tóxico nem
poluir o ambiente. Além disso, como são semioquímicos espécie-específicos, sua
especificidade é elevada (Justum & Gordon 1989). A identificação de compostos que
possam atuar como feromônios em A. aegypti está em andamento e, posteriormente,
serão
realizados
testes
comportamentais
utilizando-os.
96
CONCLUSÕES
- O capturador de Castro é uma ferramenta útil para a separação de insetos para testes
em olfatômetro, sem danificá-los.
- Assim como observado para fêmeas de A. aegypti, grande parte dos machos com idade
inferior a 72 horas foram inativos frente ao odor do hospedeiro vertebrado, fato que
pode estar relacionado com o desenvolvimento das sensilas olfativas e/ou o a rotação da
genitália externa para a cópula.
- Machos com idade a partir de 72 horas têm o comportamento de vôo estimulado pela
presença de odor humano.
- Ao contrário do observado para os machos virgens, machos copulados foram atraídos
pelo odor humano, porém essa atratividade foi inferior àquela observada para fêmeas de
A. aegypti.
- O odor dos voluntários do sexo masculino foi mais atrativo que o dos voluntários de
sexo feminino tanto para mosquitos machos quanto para fêmeas, havendo também uma
variação individual na atratividade.
- Fêmeas virgens também são atraídas pelo odor humano, tal atração é maior para o
odor de voluntários do sexo masculino.
- O atraente sintético BG-Lure foi atrativo para os machos virgens
97
- Os odores da codorna e do camundongo foram importantes para estimular o
comportamento de vôo de machos virgens, o que permite concluir que os machos são
capazes de detectar cairomônios dos hospedeiros vertebrados que seriam importantes
para a formação de enxames.
- A manutenção das amostras em freezer durante o período de preparação dos extratos
foi importante para preservar compostos com volatilidade alta, o que permitiu que
novos compostos fossem identificados em A. aegypti.
- Os machos virgens de A. aegypti foram atraídos por odor de machos virgens vivos.
- A quantidade de insetos nos extratos foi determinante para o aumento da atividade de
vôo das fêmeas e a atração dos machos.
- Voláteis presentes nos extratos de machos e fêmeas virgens foram capazes de atrair
insetos co-específicos de ambos os sexos, além de estimular o comportamento de vôo.
98
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ACREE, F., TURNER, J.R., GOUCK, R. B., BEROZA, H. K., SMITH, N. L-Lactic
acid: A mosquito attractant isolated from humans. Science 161, 1346–1347. 1968.
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