Ana Miriã Pacifico

UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde
Programa de Pós Graduação em Distúrbios do Desenvolvimento
ANA MIRIÃ PACIFICO
Avaliação da expressão gênica do sistema ocitocinérgico em ratos expostos
ao status epilepticus neonatal
São Paulo
2016
ANA MIRIÃ PACIFICO
Avaliação da expressão gênica do sistema ocitocinérgico em ratos expostos
ao status epilepticus neonatal
Dissertação vinculada à linha de
pesquisa básica em Neurobiologia e
Comportamento no Desenvolvimento e
seus transtornos, apresentada ao
Programa de Pós-Graduação da
Universidade Presbiteriana Mackenzie,
como requisito para a obtenção do
título de Mestre.
Orientadora: Profª. Drª.
Monterazzo Cysneiros
SÃO PAULO
2016
Roberta
P117a
Pacifico, Ana Miriã.
Avaliação da expressão gênica do sistema ocitocinérgico
em ratos expostos ao status epilepticus neonatal / Ana Miriã
Pacifico – São Paulo , 2016.
50 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado em Distúrbio do Desenvolvimento) Universidade Presbiteriana Mackenzie, 2016.
Orientador: Profa. Dra. Roberta Monterazzo Cysneiros
Referência bibliográfica: p. 37-50.
1. Status epilepticus neonatal. 2. Ocitocina. 3. Memória
social. 4. Ansiedade. 5. Modelo Animal. I. Título.
CDD 616.8982
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus pais,
Luiz e Silvia. Por sempre me incentivar
a encarar os obstáculos da vida. Por
estarem sempre presentes em cada
passo que dou. Esse trabalho não seria
possível sem o apoio de vocês!
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus, meu senhor, minha fortaleza. Sem Ele não conseguiria enfrentar os
desafios e obstáculos que me ocorreram durante o caminho. À Ele toda honra e glória
para sempre!
Aos meus pais, Luiz e Silvia. Companheiros de todas as horas, incentivadores e
amigos. Eu não teria conseguido sem o apoio e amor de vocês. Amo vocês!
Aos meus queridos avós, Paulo e Valdete, que me incentivaram e torceram por mim
em cada etapa do trabalho.
Aos meus irmãos, Rafael e Felipe, que mesmo sem perceber me apoiaram em vários
momentos de fraqueza.
A minha cunhada querida, Gabriela, que já considero uma irmã por todas as palavras
de incentivo e apoio.
A minha orientadora Profª. Roberta, por todo incentivo. Por ter me acolhido em seu
grupo de pesquisa, ter me ensinado e me apoiado em todos os momentos deste
trabalho. Agradeço pela amizade e compreensão em vários momentos difíceis que
enfrentei durante a minha caminhada. Sem a sua orientação e paciência eu não teria
conseguido, os meus mais sinceros agradecimentos.
Aos Professores Miriam Ribeiro e Sérgio Gomes da Silva, integrantes da banca
examinadora, por todas as contribuições ao trabalho.
Aos professores Sérgio Tufik, e Mônica Levy Andersen do departamento de
Psicobiologia da Universidade Federal do Estado de São Paulo (UNIFESP), por ter
cedido o espaço e possibilitado à execução de parte desse trabalho.
Ao meu querido amigo Geraldo, pelo auxilio, amizade e companheirismo durante toda
a minha jornada. Obrigada pelas conversas, pelo auxilio nos experimentos, pela
solidariedade e apoio.
Aos alunos de iniciação cientifica: Letícia, Dayane, Ingrid, Samuel e Pedro. Obrigada
pelas palavras de incentivo, pelas conversas e por todo o companheirismo no
laboratório.
Á todos que de alguma forma ajudaram na execução do trabalho no Departamento de
Psicobiologia na UNIFESP, em especial ao Hélio, a Sueli e a Laura que sempre foram
muito prestativos. Muito Obrigada por todo o auxílio.
As queridas amigas: Ana Paula, Larissa e Lílian por todo incentivo e apoio que sempre
me deram.
Aos meus amigos: Bruno, Jônatas, Débora, Camila, Silvia, Mauricio, Martha, Matheus,
Fernanda e Lucas por todas as palavras de incentivo, pelo apoio e pela compreensão
durante todo o curso. Amo vocês.
Aos queridos amigos de trabalho: Rubens, Luciana, Beatriz, Verônica e Cristiane. Por
todo carinho e incentivo que me deram do começo ao fim do curso.
Agradeço à todos os professores do Programa de Pós Graduação em Distúrbios do
Desenvolvimento, por todos os ensinamentos e por terem contribuído na minha
formação.
Ao veterinário Alexandre e aos técnicos do Biotério: Domingos e Junior por todo o
auxílio prestado durante os experimentos.
Aos técnicos do Laboratório: Lucas e Nathalia por toda a ajuda, que nunca me foi
negada em todos os momentos em que precisei.
À Daniele, da secretaria do programa, por todo auxilio prestado durante o curso.
Aos colegas do laboratório por toda ajuda.
À todas as pessoas que não foram citadas aqui, mas que de alguma forma
contribuíram com o trabalho.
À Universidade Presbiteriana Mackenzie pela estrutura prestada, e pelo incentivo a
pesquisa por meio do MackPesquisa.
RESUMO
Estudos experimentais mostram evidências de que ratos adultos submetidos às
convulsões neonatais apresentam mudanças morfológicas e cognitivas, exibindo
também comportamento autista caracterizado pela baixa preferência pela novidade
social, déficit de discriminação social e comportamento tipo ansioso. Porém, os
mecanismos que respondem por estas alterações ainda não são conhecidos. Várias
evidências demonstram que a ocitocina (OT) está presente em regiões importantes
para reconhecimento social, tais como a amígdala medial e o hipocampo. Postulamos
que a deficiência na sinalização mediada pela OT na rede neural relacionada com o
cérebro social responda pelo prejuízo na sociabilidade e pelo aumento da
emocionalidade subsequente à convulsão neonatal. Este trabalho tem como objetivo
avaliar a memória de reconhecimento social e a expressão gênica da OT e do seu
receptor (OTR) em animais submetidos ao status epilepticus neonatal. Foram
utilizados ratos Wistar machos adultos submetidos ao status epilepticus no nono dia
de vida (P9) pela administração da pilocarpina (350 mg/kg, ip) e os controles
receberam salina 0.9% (0,1 mL/10 g). Em P90 foi avaliada a memória social pelo
paradigma de habituação/desabituação. Ao fim dos testes comportamentais, os
animais foram anestesiados e decapitados para a retirada das estruturas de estudo
(amígdala, hipocampo, e hipotálamo). Posteriormente foi realizada a análise da
expressão gênica da ocitocina e seu receptor nos tecidos citados, por meio da PCR
em tempo real. No teste de memória social os animais experimentais apresentaram
menor tempo de investigação social, indicativo de prejuízo no sistema de
motivação/recompensa e prejuízo de habituação/desabituação, sugestivo de prejuízo
na memória de reconhecimento social. A expressão gênica da ocitocina não diferiu
entre os grupos nas estruturas analisadas, mas observou-se uma pequena redução
na expressão gênica do receptor de ocitocina no hipocampo. Com isso conclui-se o
status epilepticus neonatal em ratos produz déficit na memória de reconhecimento
social e do sistema de motivação / recompensa mesolímibico. O presente trabalho
mostrou que animais submetidos ao status epilepticus neonatal apresentam redução
da exploração da novidade social, sugestivo de prejuízo no sistema de
motivação/recompensa mesolímbico e da memória de reconhecimento social que
pode estar relacionada a redução da expressão dos receptores da ocitocina no
hipocampo.
Palavras – chave: status epilepticus neonatal, ocitocina, memória social, modelo
animal
ABSTRACT
Experimental studies show evidence that rats subjected to neonatal seizures have
morphological and cognitive changes, also exhibiting autistic behavior characterized
by low preference for social novelty, social discrimination deficits and behavior type
anxious. However, the mechanisms that account for these changes are not yet known.
Several lines of evidence show that Oxytocin (OT) is present in key regions for social
recognition, such as the medial amygdala and the hippocampus. We postulate that the
deficiency in signaling mediated by OT on neural network related to the social brain
responds by impaired sociability and increased emotionality subsequent neonatal
seizure. This study aims to assess the social recognition memory and gene expression
of OT and its receptor (OTR) in animals with neonatal status epilepticus. Wistar rats
were adult males submitted to status epilepticus on the ninth day of life (P9) the
administration of pilocarpine (350 mg / kg, ip) and the controls received saline 0.9%
(0.1 ml / 10 g). In P90 social memory was evaluated by habituation/deshabituation
paradigm. At the end of behavioral testing, the animals were anesthetized and
decapitated to remove the structures of study (amygdala, hippocampus, and
hypothalamus). Thereafter it was performed gene expression analysis of oxytocin and
its receptor in the aforementioned tissues by real-time PCR. In social memory test
experimental animals had shorter social research, injury indicative of the motivation
system / reward and loss of habituation / deshabituation, suggesting impairment in
social recognition memory. The gene expression of oxytocin did not differ between the
groups in the analyzed structures, but there was a small decrease in gene expression
of oxytocin receptor in the hippocampus. Thus concludes the neonatal status
epilepticus in rats produces memory deficits in social recognition and motivation
/mesolímibic reward systems. This work demonstrated that animals subjected to
neonatal status epilepticus have reduced exploration of social novelty, suggesting
impairment in motivation system / mesolimbic reward and social recognition memory
that may be related to reduced expression of oxytocin receptors in the hippocampus.
Key - words: neonatal status epilepticus, oxytocin, social memory, animal model
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1- Protocolo do teste comportamental (habituação/desabituação).....................22
Fig. 2 – Representação gráfica do teste comportamental........................................26
Fig. 3- Expressão do RNAm para o receptor de ocitocina.........................................27
Fig. 4- Expressão do RNAm para a de ocitocina.......................................................28
SUMÁRIO
1. Introdução ............................................................................................................. 10
1.1 Crises epilépticas neonatais ............................................................................ 10
1.2. Estudos Clínicos ............................................................................................. 11
1.3 Estudos em Modelos Experimentais ................................................................ 13
1.4. Reconhecimento Social .................................................................................. 14
1.6. Ocitocina ......................................................................................................... 16
2. Hipótese ................................................................................................................ 21
3. Objetivos ............................................................................................................... 22
3.1. Objetivo Geral ................................................................................................. 22
3.2. Objetivos Específicos ...................................................................................... 22
4. Método .................................................................................................................. 23
4.1. Animais ........................................................................................................... 23
4.3. Teste de memória social ................................................................................. 23
4.4. Análise de Expressão Gênica ......................................................................... 24
4.4.1. Extração do RNA Total ............................................................................. 24
4.4.2. Eletroforese em gel de Agarose e Quantificação ...................................... 26
4.4.3. Transcrição Reversa ................................................................................. 26
4.4.4. PCR de tempo real ................................................................................... 27
4.5. Análise Estatística ........................................................................................... 27
5. Resultados ............................................................................................................ 28
5.1. Teste de Memória Social ................................................................................ 28
5.2. PCR em tempo real ......................................................................................... 28
6. Discussão .............................................................................................................. 31
7. Conclusão ............................................................................................................. 35
Referências ............................................................................................................... 36
1. Introdução
1.1 Crises epilépticas neonatais
As crises convulsivas são o distúrbio neurológico mais frequente no período
neonatal (WIRRELL et al., 2011; VASUDEVAN; LEVENE, 2013). Apesar de cerca de
40%-50% das crianças afetadas se desenvolverem normalmente, as crises podem
causar lesões que afetam funções cerebrais importantes causando epilepsia,
prejuízos cognitivos, atraso do desenvolvimento, paralisia cerebral e até mesmo óbito
(RONEN et al., 2007; TUCHMAN; CUCCARO, 2011; BERG; PLIOPLYS, 2012;
FRIEDMAN; HU, 2014). A interação entre epilepsia e o autismo é sugerida por vários
pesquisadores, isto porque, estudos demonstram que a epilepsia está presente em
até 46% dos pacientes com autismo e que a co-ocorrência da epilepsia e autismo
ocorre em cerca de 30% das crianças com outras desordens (BROOKS-KAYAL, 2010;
JENSEN, 2011).
Muitos fatores no período neonatal contribuem para um alto risco de convulsões
(NARDOU et al., 2013). As intercorrências perinatais mais frequentes são a
encefalopatia hipóxico-isquêmica, trauma no parto, infecções perinatais, hemorragia
intracraniana, intoxicação e distúrbios metabólicos (THIBEAULT-EYBALIN et al.,
2009; HUANG et al., 2011, FABBRONI; CYSNEIROS, 2014). Além de anormalidades
cerebrais congênitas e desordens genéticas que também podem desencadear crises
neonatais. Em humanos a etiologia mais comum para convulsões neonatais é a
encefalopatia hipóxico-isquêmica, que afeta aproximadamente 1-3 de 1000 nascidosvivos e é responsável por 60% das convulsões em recém-nascidos (FABBRONI;
CYSNEIROS, 2014; SYLVERTSEN, et al., 2015).
Essas crises podem ser sintomáticas ou idiopáticas. As
sintomáticas
têm
etiologia causada no parto ou no pós-parto. Já as crises idiopáticas, quando não há
uma etiologia ou fator de risco, na maioria das vezes, as causas são parte de
síndromes epilépticas geneticamente determinadas, como convulsões benignas
neonatais familiares ou não (HUANG et al., 2011).
Essa propensão do cérebro imaturo para gerar crises deriva de vários fatores
(HUANG et al., 2012). O cérebro imaturo possui propriedades fisiológicas que incluem
correntes iônicas neuronais que diferem marcadamente das do cérebro adulto, sendo
10
tipicamente mais duradouras e menos seletivas, caracterizado principalmente por
aumento de excitação e redução da atividade inibitória (MOSHE, 1993; SWANN,
2005; BEN-ARI; HOLMES, 2006; NARDOU et al., 2013).
O GABA (ácido gama-aminobutírico), é o principal transmissor inibitório no
cérebro adulto, porém exibe atividade excitatória nos neurônios imaturos e isto
acontece devido a uma elevada concentração intracelular de íons cloreto levando a
um efluxo quando à ativação de receptores do tipo GABAA (BEN-ARI, 2002; BEN-ARI;
HOLMES, 2006; NARDOU et al., 2013). Já o glutamato é o principal neurotransmissor
excitatório e se expressa depois do GABA nos neurônios imaturos. Isto porque, o
receptor NMDA (N-metil D-Aspartato) alcança a maturação no final da primeira
semana, e o receptor AMPA (alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico) tem o
seu pico de expressão em aproximadamente 10 dias de vida (SANCHEZ; JENSEN,
2001) e a maturação da rede inibitória do GABA, acontece durante as primeiras três
semanas pós-natais. Essa diferença temporal de expressão cria um desequilíbrio dos
receptores
excitatório
sobre
os
receptores
inibitórios
no
início
do
neurodesenvolvimento (THIBEAULT-EYBALIN et al., 2009; NARDOU et al., 2013).
Outros fatores que contribuem para a suscetibilidade do cérebro imaturo para
convulsões incluem a arquitetura sináptica imatura, os padrões de voltagem, e as
funções das células glia de apoio. O aumento da atividade neural associada com a
aprimorada excitação no cérebro imaturo é essencial para numerosas atividades e
processos do desenvolvimento, mas predispõe à geração de eventos sincrônicos, o
que torna o cérebro mais suscetível às convulsões (NARDOU et al., 2013).
Estudos em animais e em humanos têm mostrado evidências sugerindo que
crises convulsivas prolongadas durante o desenvolvimento cerebral podem resultar
em sequelas permanentes (GARFINKLE; SHEVELL, 2011; CASTELHANO et al.,
2010, 2013, 2015).
1.2. Estudos Clínicos
11
Como citado anteriormente, as crises neonatais são o sinal clínico mais comum
de disfunção cerebral em recém-nascidos (HOLMES, 2005). Essas crises estão
relacionadas a fatores etiológicos, associadas a altas taxas de mortalidade e ou
prejuízo do desempenho neurológico. Com os avanços na área da neonatologia, a
taxa de sobrevivência de recém-nascidos tem aumentado e as técnicas avançadas de
investigação ajudaram a descobrir diferentes fatores etiológicos, e assim o espectro
de diagnóstico diferencial tem aumentado (YILDIZ et al., 2012). Porém, a asfixia
perinatal continua a ser o fator mais comum, sendo a etiologia mais frequente (5060%) de crises neonatais (RONEN et al., 2007; TEKGUL et al., 2006; YILDIZ et al.,
2012). No geral, para os bebês nascidos a termo, a mortalidade após as crises
diminuiu na última década, e há registro de 10% de óbitos após as crises, uma queda
de 33% em relação aos relatórios dos anos 1990. Em contraste, a prevalência de
sequelas adversas no neurodesenvolvimento permanece relativamente estável,
tipicamente 46% (URIA-AVELLANAL et al., 2013). Entre as consequências
neurológicas adversas associadas às crises neonatais estão: paralisia cerebral, atraso
no desenvolvimento global, e crises epilépticas (GARFINKLE; SHEVELL, 2011; LAI et
al., 2013). As taxas de presença de sequelas variam entre 25-35%, e não apresentam
relação com a idade gestacional (YILDIZ et al., 2012).
Muitos estudos clínicos demonstram as possíveis sequelas das crises
neonatais associadas às etiologias (GARFINKLE; SHEVELL, 2011; LAI et al., 2013;
YILDIZ et al., 2012). Em um estudo longitudinal, Yildiz e colaboradores (2012)
avaliaram as repercussões da convulsão no período neonatal em pacientes com
idades cronológicas de 23-44 meses. Dos 112 recém-nascidos, 33 eram prematuros,
e 79 eram a termo. A asfixia perinatal (28,6%) e hemorragia intracraniana (17%) foram
as causas mais comuns das crises neonatais. Os pacientes apresentaram as
seguintes sequelas: 27,6% paralisia cerebral, 35,7% epilepsia e quase 50% dos
pacientes manifestou atraso no desenvolvimento em uma ou mais áreas. Atraso no
desenvolvimento global foi o distúrbio neurológico mais comum (50,8%) neste estudo.
Segundo revisão de literatura de Fabbroni e Cysneiros (2014), embora os
estudos clínicos apontem que a etiologia subjacente às crises neonatais esteja
relacionada à gravidade do prognóstico, existem outros fatores que também aparecem
como preditores independentes para o prognóstico, entre eles: a semiologia das crises
neonatais, a ultrassonografia craniana anormal, o índice de resistência anormal da
12
artéria cerebral anterior, o eletroencefalograma anormal e doenças cardíacas
congênitas. Por exemplo, um estudo realizado com bebês nascidos a termo que
tiveram convulsões neonatais posteriores à asfixia intraparto mostrou as principais
sequelas que podem ocorrer com as crianças. Ao todo foram analisadas 62 crianças,
destas 23 (37%) crianças tiveram um resultado normal, 34 (55%) sobreviveram com
uma ou mais deficiências do desenvolvimento neurológico (23 paralisia cerebral, 28
atraso no desenvolvimento global, 15 epilepsia, 18 com combinação de dois e 9 com
todos os três), além de 5 (8%) que foram à óbito (GARFINKLE; SHEVELL, 2011). Os
autores apontam que a semiologia e anormalidades no EEG em crianças que tiveram
crises são preditores de prognósticos adversos.
1.3 Estudos em Modelos Experimentais
Considerações éticas se opõem a maioria dos estudos sobre o cérebro de
recém-nascidos humanos (NARDOU et al., 2013). Então, estudos com modelos
animais são realizados em larga escala, uma vez que as variáveis podem ser
controladas, podem-se replicar as evidências observadas em humanos como também
permitir a investigação de mecanismos moleculares subjacentes aos danos
ocasionados pelas crises neonatais (HOLMES, 2005; CASTELHANOS et al., 2010).
Os modelos de crises neonatais em roedores utilizam animais com idades entre P7 e
P10, uma idade que se assemelha a maturação estrutural e funcional do cérebro
neonatal humano (BERNARD; BENK, 2015; NARDOU et al., 2013).
Em modelos animais, os danos neurológicos de longo prazo decorrentes das
crises epilépticas estão relacionados com a idade do animal no momento da
convulsão. Comparados com ratos adultos, roedores jovens têm menos perda celular,
ao invés disso, apresentam extensa plasticidade e reorganização sináptica (HOLMES
et al., 1998; SOGAWA et al., 2001; NISHIMURA et al., 2011; CORNEJO et al, 2007;
SAYIN et al., 2015). Esta resistência relativa pode ser devido a menor densidade de
sinapses ativas, menor consumo de energia, e, em geral, a imaturidade relativa de
cascatas bioquímicas que conduzem à morte celular (HOLMES, 2005).
Estudos experimentais têm demonstrado que as convulsões neonatais
produzem aumento da excitabilidade cortical e hipocampal (ISAEVA et al., 2010;
HERNAN et al., 2013; BERNARD et al., 2014),
déficits na aprendizagem e na
13
memória viso-espacial (HOLMES et al., 1998; HUANG et al., 1999; LUGO et al.,
2014b) e na flexibilidade cognitiva (KLEEN et al., 2011). Além destas, pesquisas
conduzidas pelo nosso grupo (CASTELHANO et al., 2010, 2013 e 2015) e por outros
pesquisadores (LUGO et al., 2014, BERNARD; BENK,2015; HOLMES et al. 2015)
mostram evidências que ratos adultos submetidos às convulsões neonatais exibem
comportamento autista caracterizado pela baixa preferência pela novidade social,
déficit de discriminação social e comportamento tipo ansioso (SAYIN et al., 2004; SHI
et al., 2007; CASTELHANO et al., 2013, 2015; LUGO et al., 2014). Os mecanismos
que respondem por estas alterações ainda não são conhecidos.
1.4. Reconhecimento Social
A interação social no início da vida é crucial para o desenvolvimento de
respostas fisiológicas e do comportamento animal, uma vez que favorece a
reprodução, proteção contra predadores e mudanças ambientais, além de promover
o desenvolvimento do cérebro (VIERO et al., 2010, CUSHING, KRAMER, 2005).
A interação social é entendida como a aproximação de dois ou mais indivíduos
que compartilham um mesmo ambiente. Os animais tendem a se manter em um
mesmo espaço para obter algumas vantagens como, por exemplo: garantir proteção,
alimentação, reprodução, facilitando assim a sua sobrevivência (KEVERNE; CURLEY,
2004). Em ratos, os principais comportamentos sociais observados incluem; cheirar o
corpo do animal, cheirar a região genital e o lutar de brincadeira, que também inclui o
boxear. Tais interações são essenciais para o desenvolvimento das respostas sociais
e cognitivas do animal na idade adulta (TODESCHIN, et al., 2009).
Os comportamentos sociais são complexos porque exigem a integração de
processos emocionais, cognitivos e motivacionais com estímulos gratificantes internos
e externos (ALBERS, 2012). Segundo Bos e colaboradores (2012), o comportamento
social só pode existir quando os animais são capazes de reconhecimento social. Para
o reconhecimento social é essencial a memória social. (VAN WIMERSMA
GREIDANUS, MAIGRET, 1996; HOLLANDER et al., 2007). A memória social é um
componente importante de sobrevivência em grupos de animais, e é baseada na
aprendizagem relacional de estímulos complexos em um ambiente social (LAI et al.,
2005). Ela é caracterizada por alguns autores como uma memória especifica, pois tem
14
duração maior que a da memória operacional, mas menor que uma do tipo espacial
ou aversiva (FERGUNSON, 2002).
O reconhecimento social foi estudado em roedores ao longo do tempo e tem
sido definido como a capacidade de reconhecer um familiar co-específico ao longo de
um período relativamente curto de tempo (BIELSKY; YOUNG, 2004). O
reconhecimento social permite que o animal possa reagir adequadamente a estímulos
sociais através de uma variedade de contextos que envolvem a detecção,
incorporação, integração, reconhecimento e processamento de informações sobre
indivíduos da mesma espécie. Ele ocorre pelo simples fato de um animal reconhecer
o outro como familiar (MARKHAM, JURASKA, 2007; CLIPPERTON-ALLEN, et al.,
2012). Esse processo simples envolve uma série de mecanismos como a detecção
inicial do sujeito, pela memória, com a lembrança eventual do encontro posterior
(MARKHAM, JURASKA, 2007).
Memória de reconhecimento social pode ser definida por uma diminuição na
frequência de investigação social depois de repetidas exposições a um co-específico,
esse processo pode ser chamado de "habituação" (THOR, HOLLOWAY, 1982). Com
isso o animal passa a reconhecer o outro por memória de encontros anteriores e por
isso, a necessidade de investigar mais profundamente o familiar co-específico é
reduzida. Este processo tem três características principais: aquisição, retenção e
transferência de informação, sua contraparte é o processo de desabituação,
resultando em uma rápida recuperação da atividade sensorial inicial de investigação
(MONNIER, BOHEMER, SCHOLER, 1976; MOURA, XAVIER, 2010). Esta forma de
aprendizagem pode ser modulada por uma variedade de neuropeptídios, como a
ocitocina e vasopressina, em diferentes espécies de mamíferos, incluindo seres
humanos (MEYER-LINDENBERG et al., 2011).
Os paradigmas de reconhecimento social são muito utilizados para avaliar a
memorial social de animais sem a necessidade de treinamento prévio (ENGELMANN;
WOTJAK; LANDGRAF, 1995). O paradigma habituação-desabituação envolve
exposição do animal teste para um animal estímulo uma única vez (THOR,
HOLLOWAY, 1982) ou repetidas exposições (GUAN, DLUZEN, 1994; CHOLERIS et
al., 2003). Quando o mesmo animal estímulo é apresentado repetidamente, o animal
teste tipicamente exibe uma diminuição na investigação social (habituação, passo 1).
15
Quando um novo estímulo social é posteriormente apresentado, ocorre o aumento da
investigação social pelo animal teste (desabituação; passo 2). Esta desabituação
permite descartar que a resposta de habituação foi simplesmente devido a uma perda
de interesse para todos os estímulos sociais (ENGELMANN et al., 1995; CHOLERIS
et al., 2003).
É bem estabelecido que o reconhecimento social é uma forma única de
aprendizagem e de memória que utiliza mecanismos neurais distintos específicos para
o processamento social, e é um componente importantíssimo para o “cérebro social”
(BIELSKY, YOUNG, 2004). Depois de reconhecido o outro indivíduo como familiar, há
uma resposta de investigação olfativa. Desse modo, ratos podem diferenciar membros
da colônia, de intrusos, sendo assim muito importante para a demarcação do território
e formação de grupos (MOURA, XAVIER, 2010; LUKAS et al., 2011). Em roedores, o
reconhecimento de um indivíduo co-específico depende principalmente de pistas de
natureza olfativa, da sensibilidade para a mescla de odores que define cada indivíduo,
conhecida como sua “assinatura olfativa” (THOR, HOLLOWAY, 1982; BURMAN,
MOURA, XAVIER, 2010).
No cérebro de roedores, quando essas assinaturas olfativas se ligam aos
receptores expressos pelos neurônios sensoriais do principal epitélio olfativo e do
órgão vomeronasal, esses neurônios transmitem a informação sensorial para o bulbo
olfatório e bulbo olfatório acessório, respectivamente. Estes se projetam para a
amígdala medial que transfere a informação até o hipocampo pelo septo lateral, mas
a contribuição de cada uma dessas estruturas no processamento da informação social
ainda não está clara (BIELSKY, YOUNG, 2004; GUR, TENDLER, WAGNER, 2014).
Há uma ampla evidência que mostra que a amígdala medial é importante para
reconhecimento social (BIELSKY; YOUNG, 2004; CHOLERIS et al., 2007), assim,
como é uma estrutura onde a OT (ocitocina) é abundante (FERGUSON et al., 2001),
é concebível, então, que as ações de estrogênio e da ocitocina dentro desta estrutura
estão envolvidas no reconhecimento social.
1.6. Ocitocina
16
A Ocitocina (OT) é um neuropeptídio formado por nove aminoácidos cíclicos
produzida no núcleo paraventricular (PVN) e no núcleo supra-ótico (SON) do
hipotálamo dos mamíferos. A OT atua influenciando um imenso número de funções
fisiológicas complexas do sistema nervoso central e periférico. Fisiologicamente, ela
é liberada na corrente sanguínea pelo lobo posterior da hipófise, principalmente por
exocitose, a partir dos terminais dos neurônios magnocelulares em resposta a vários
estímulos e é distribuída pelo cérebro de acordo com mecanismos diferentes para
cada estímulo (FERGUSON, YOUNG, INSEL, 2002; VIERO et al., 2010). Esses
neurônios também podem atingir outras regiões do cérebro, como o sistema límbico
via axônios colaterais ou por populações de neurônios parvocelulares no PVN que
atingem regiões como: o septo medial, hipocampo, e a amígdala (LUKAS; NEUMANN,
2013). Além de liberar a OT pelos terminais de axônios como uma neurotransmissora,
a liberação central da OT como uma neuromoduladora pode ocorrer tanto a partir de
dendritos como do corpo celular, explicando os níveis basais no fluido extracelular de
regiões distintas do cérebro (NEUMANN; LANDGRAF, 2012).
No cérebro, a OT é projetada ao longo das projeções axonais para diferentes
áreas incluindo o núcleo estriado, o núcleo supraquiasmático, a substância negra,
área tegmental ventral, núcleo da rafe, o locus coeruleus e densamente ao longo do
tronco cerebral e da medula espinhal, podendo atuar como neuromoduladora ou
neurotransmissora, e, assim, influenciar a neurotransmissão nestas áreas (MEYERLINDENBERG et al., 2011; GORDON et al., 2013; CARSON et al., 2013). As
dinâmicas temporal de liberação central e periférica de OT podem diferir
substancialmente dependendo do estímulo. Além disso, vários fatores de estresse
mostraram que provocam a liberação de OT no hipotálamo e nas regiões límbicas,
enquanto a secreção do neuropeptídio no sangue permanece praticamente inalterada
(NEUMANN; LANDGRAF, 2012).
Ivell e Richter (1984) clonaram o gene da OT, o que permitiu um melhor
mapeamento da distribuição do mRNA de OT em todo o sistema nervoso dos
mamíferos. O receptor de OT (OTR) é um poliptídeo de 389 aminoácidos que possui
sete domínios transmembrana que pertencem à classe de receptores acoplados à
proteína G e são expressos em diversas regiões anatômicas como: nas glândulas
mamarias, nos ovários, nos rins, no útero, no coração, nos ossos e nas células de
diversas regiões do sistema nervoso central dos mamíferos como: no bulbo olfatório
17
e tubérculo, no neocórtex, no hipocampo, na amígdala, no núcleo acumbens e no
hipotálamo ventromedial (GIMPL; FAHRENHOZ, 2001; LEE et al., 2009). Juntamente
com a distribuição regional e densidade de OTR, a quantidade de OT liberada em
cada local determina, em grande parte, a atividade do sistema ocitocinérgico no
cérebro, contribuindo assim, para a regulação do comportamento emocional e social
(NEUMANN; LANDGRAF, 2012).
OT é bem conhecida por seu papel na formação de pares e no cuidado parental
(DONALDSON, YOUNG, 2008; INSEL et al., 2010; BARTZ et al., 2010). Contudo,
pode também desencadear a agressão materna contra indivíduos de mesma espécie,
especialmente contra outros do sexo feminino, isto porque, enquanto OT inibe
agressão dirigida aos filhotes, ela pode aumentar simultaneamente ataques contra
intrusos (DEBIEC; 2005; PEDERSEN; BOCCIA, 2006). A agressão maternal é
estudada em roedores, introduzindo um estranho de ambos os sexos na gaiola da
mãe, na presença de seus filhotes (ALMEIDA et al., 2014). Essa agressão materna
pode estar associada a baixos níveis de medo (GAMMIE et al, 2004;. LONSTEIN;
GAMMIE, 2002).
O medo, o estresse e a ansiedade também estão relacionados com a OT. Em
roedores, por exemplo, a administração de OT exerce efeitos ansiolíticos em ambos
os gêneros (NEUMANN, 2008; BOS et al. 2012). Isto porque ela inibe respostas do
eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal a uma variedade de fatores de estresse
(NEUMANN, 2008). A administração de OT atenuou o sistema neuroendócrino
induzido por eventos estressores e as respostas moleculares do eixo HPA em
roedores (WINDLE et al., 2004) e em seres humanos (HEINRICHS; DOMES, 2008).
Estes efeitos são, pelo menos parcialmente, mediados por ações da OT no núcleo
central da amígdala e no PVN (NEUMANN, 2008). Isto porque, a OT diminui as
respostas ao medo através dos seus efeitos nas projeções inibitórias gabaérgicas,
que se originam no núcleo central da amígdala, perturbando a integração das
informações, e as inibindo de forma que elas não sejam projetadas para outras áreas
do cérebro que respondem ao medo (VIVIANI et al. 2011; GORKA et al., 2015).
Porém, as associações de estresse e ansiedade com a OT e seus papéis comuns na
modulação do comportamento social, ainda não são totalmente compreendidos
(CRESPI, 2015).
18
A OT também é liberada durante as relações sociais e sexuais, altas
concentrações são detectadas no líquido cérebro-espinhal em ratos machos após a
ejaculação. Em fêmeas, injeções de OT aumentam a receptibilidade aos machos,
enquanto que injeções do antagonista para o receptor de ocitocina (OTRA) inibe o
comportamento sexual (CALIGIONI et al., 2007).
As respostas comportamentais, que são dependentes de estímulos sociais,
estão relacionadas com a OT. Evidências em estudos sugerem que as respostas
mediadas pela OT aos estímulos sociais de um co-específico familiar levam a
interação social (BAUMGARTNER, et al., 2008; FERGUSON et al., 2001).
O papel da OT no reconhecimento social foi confirmado em estudos com
camundongos knockout para o OTR, que exibiram prejuízo da memória social
(CHOLERIS et al., 2003; TAKAYANAGI et al., 2005). Por outro lado a administração
intranasal de OT afeta muitos aspectos da sociabilidade humana, podendo aumentar
o olhar em direção à região dos olhos (GAMER et al, 2010; GUASTELLA et al, 2010),
proporcionando um maior reconhecimento de expressões faciais (DOMES et al, 2007;
SAVASKAN et al, 2008) e comportamentos sociais complexos, como: confiança,
avaliação de risco social e empatia (BAUMGARTNER et al, 2008; HURLEMANN et al,
2010; KOSFELD et al, 2005).
Atualmente, estudos de administração intranasal de OT foram realizados em
pacientes com vários transtornos psiquiátricos, incluindo os Transtornos do Espectro
do Autismo (ANDARI et al., 2010; GUASTELLA et al., 2010), Depressão (PINCUS et
al., 2010; MAH et al., 2013), Transtorno de Estresse Pós-Traumático (SENG et al.,
2013), Esquizofrenia (AVERBECK et al., 2011; GOLDMAN et al., 2011; PEDERSEN
et al., 2011) e Fobia Social (GUASTELLA et al., 2009 ; LABUSCHAGNE et al., 2011).
A administração de OT em pacientes com esquizofrenia, melhorou o reconhecimento
de emoções (GOLDMAN et al., 2011). A OT pode promover a aproximação social e
compreensão social, em pacientes com autismo (ANDARI et al., 2010). Estudos em
humanos mostraram que a ocitocina pode estar relacionada a esses comportamentos,
pois, quando administrada por via intranasal pode reduzir comportamentos repetitivos
em indivíduos com autismo (HOLLANDER et al., 2003).
Todos os animais, ao longo de suas vidas, enfrentam constantemente
situações
que
fornecem
desafios
(por
exemplo,
agressão
e
19
predação) ou oportunidades (por exemplo, reprodução, seleção de habitat) e em todos
os casos faz-se necessário avaliar a relevância do estímulo externo e integrá-los com
o sistema neurofisiológico e experiências anteriores para configurar uma resposta
adaptativa a cada uma das situações que são apresentadas. Neste contexto, dois
importantes circuitos neurais exercem um papel crucial, a saber, a rede neural do
comportamento social e o sistema de recompensa. A rede neural do comportamento
social descrita por Newman (1999) é formada por estruturas reciprocamente
conectadas, como hipotálamo anterior, area pré-óptica medial, hipotálamo
ventromedial, substância cinzenta periaquedutal, septo lateral e amígdala estendida
(leito do núcleo da estria terminal e amígdala medial). O sistema de recompensa é
também formado por estruturas reciprocamente conectadas tais como, o septo lateral,
núcleo accumbens, estriado, ventral pálido, amígdala lateral, área tegmental ventral e
hipocampo. Esses dois circuitos estão interconectados pelo septo lateral e pela
amígdala estendida (leito do núcleo da estria terminal e amígdala medial) e ambas as
regiões desempenham um papel importante no comportamento social, bem como no
processamento
da
recompensa.
A
partir
do
conhecimento
dos
papéis
desempenhados pelas diferentes estruturas, isoladamente ou funcionalmente
integradas, e da sinalização neuroquímica envolvida com ambos os sistemas ( por
exemplo, ocitocina, dopamina e vasopressina), O’CONNELL e HOFMANN (2011)
propôs que ambos os circuitos formam uma rede ampla de tomada de decisão social,
denominada em inglês de social decision-making (SDM) que regula o comportamento
adaptativo. Os comportamentos sociais são complexos porque exigem a integração
de processos emocionais, cognitivos e motivacionais e a atividade da rede codifica as
informações sociais de uma forma altamente dinâmica, de tal maneira que o
comportamento social adaptativo é mais fortemente dependente do padrão de
atividade da rede, do que da atividade de locus individuais (GOODSON; KABELIK,
2009).
Levando-se em consideração o papel da ocitocina na emocionalidade e no
comportamento social (NEUMANN; LANDGRAF, 2012; DONALDSON, YOUNG,
2008; ENGELMANN et al., 1996; MORGAN et al., 2004; MATSUZAKI et al., 2015),
este trabalho irá explorar o envolvimento do sistema ocitocinérgico no comportamento
autista de ratos submetidos às convulsões neonatais.
20
2. Hipótese
A deficiência na sinalização mediada pela ocitocina na rede neural relacionada
com o cérebro social responde pelo prejuízo na sociabilidade e no aumento da
emocionalidade subsequente à convulsão neonatal.
21
3. Objetivos
3.1. Objetivo Geral
Avaliar a memória de reconhecimento social e a expressão gênica da ocitocina
(OT), do receptor de OT (OTR) em animais submetidos ao status epilepticus neonatal.
3.2. Objetivos Específicos

Comparar a memória de reconhecimento social entre os animais controles e os
submetidos ao status epilepticus neonatal.

Comparar a expressão do RNA mensageiro da ocitocina, do receptor OTR nas
regiões cerebrais relevantes para a memória social.
22
4. Método
4.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos adultos submetidos ao status epilepticus
neonatal aos 9 dias pós-natal e controles que receberam salina 0.9%. Com o intuito
de reduzir o uso de animais, segundo a lei Arouca - nº 11.794, de 8 de Outubro de
2008, foram utilizados os animais do projeto de pesquisa previamente aprovado pelo
CEUA (106/02/2014) da Universidade Presbiteriana Mackenzie. Foram utilizados 16
animais do grupo controle e 17 experimentais que foram mantidos no Biotério Central
do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS) da Universidade Presbiteriana
Mackenzie.
4.2 Indução de Status Epilepticus (SE)
Ratos Wistar machos com 9 dias pós-natal, que corresponde o período de
neonato a termo (HALOPAINEN, 2008) foram divididos aleatoriamente em 2 grupos.
O grupo experimental recebeu pilocarpina (350 mg/kg, ip) e grupo controle recebeu
salina 0,9% (0,1 mL/10 g) (CASTELHANO et al., 2010, 2013, 2015). Quatro horas
após a indução do status epilepticus os animais retornaram para as respectivas
gaiolas.
4.3. Teste de memória social
Os testes comportamentais foram iniciados aos 90 dias de vida pós-natal. Para
avaliar a memória social do animal, foi realizado o paradigma de habituação e
desabituação. O teste foi filmado para auxiliar na avaliação e mensuração dos
parâmetros observados. Os animais foram habituados na sala de experimentação 60
minutos precedentes às sessões. O teste sempre foi realizado no mesmo horário para
diminuir os efeitos circadianos, sendo os animais dos diferentes grupos observados
de forma alternada. No intervalo entre as sessões, os equipamentos foram limpos com
23
uma solução de etanol 5%, a fim de evitar possíveis rastros de odor deixados pelo
sujeito anterior.
Fig. 1- Protocolo do teste comportamental (habituação/desabituação).
O protocolo utilizado foi adaptado do descrito por Guan e Dluzen (1994). Para
habituação com o ambiente do teste, o animal foi colocado no centro de uma arena
circular de acrílico branco com 60 cm de diâmetro x 50 cm de altura (Insight Ltda,
Brasil) concomitantemente com uma caixa de acrílico (23.5 cm x 21 cm x 32 cm)
contendo pequenos orifícios para permitir detecção das pistas olfativas, vazia. Após
esse período, deu-se início ao teste. Para a primeira exposição, um rato adulto,
desconhecido (estímulo social), foi introduzido dentro da caixa de acrílico por 3
minutos. O procedimento foi repetido 3 vezes (S1 –S3) com intervalos de 6 minutos.
Nos intervalos, o animal teste foi removido da arena, e o equipamento foi limpo com
etanol 5%. Nas duas sessões subsequentes (S4-S5), um novo animal estímulo da
mesma idade do anterior foi utilizado. Foram mensurados o tempo dos contatos
olfativos entre os animais. Ao final do teste de memória social os animais foram
anestesiados e decapitados, os cérebros de 5 animais do grupo controle e 5 animais
do grupo experimental foram dissecados para a análise da expressão gênica os
demais foram armazenados para análises futuras.
4.4. Análise de Expressão Gênica
4.4.1. Extração do RNA Total
24
Os animais foram mortos por decapitação sob anestesia profunda (Uretana 1,2
mg.kg) em seguida, os tecidos foram dissecados (hipotálamo, amígdala e hipocampo)
e armazenados em freezer -80C até o momento da análise. A determinação da
expressão gênica dos genes da ocitocina e do receptor de ocitocina, foi realizada por
meio da extração do RNA mensageiro (RNAm) e da análise do mesmo por PCR em
tempo real, sendo que para isso o RNA total do tecido foi extraído com o auxílio da
solução de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Os tecidos foram pesados tendo
todos no máximo 100mg cada. Primeiramente foi adicionado o Trizol (400µl) e o tecido
foi triturado no homogeneizador (IKA T25 digital Ultra-Turrax). Após cada tecido o
homogeneizador foi higienizado (Extran 10%, álcool 70%, HCL 0,1M, água destilada,
RNAse e água destilada autoclavada). Depois de homogeneizado foi adicionado 600µl
de Trizol e foi deixado por 5 minutos em temperatura ambiente. Após os 5 minutos foi
adicionado 200µl de clorofórmio, os tubos foram homogeneizados por 15 segundos e
deixados por 3 minutos em temperatura ambiente. Então, os tubos (Eppendorf 5415R)
foram centrifugados à 4°C por 15 min a 12000g rcf. Após a centrifugação o material
apresentava-se em 3 fases: transparente (RNA), branca (DNA) e rosada (Trizol). Foi
retirado então a primeira fase (transparente), procurando se retirar o máximo sem
encostar na segunda fase (DNA) para evitar contaminação. O RNA, então, foi
precipitado com 500µl de isopropanol e as amostras ficaram incubando por 10 minutos
à temperatura ambiente. Foram levadas novamente à centrifuga refrigerada à 4°C por
10 minutos a 12000g rcf. O sobrenadante dos tubos foi retirado cuidadosamente para
não movimentar o pellet. Então, foi adicionado 1ml de etanol 75%. Os tubos foram
passados no vórtex (Thermolyne Type 16700 Mixer) até o pellet se soltar do fundo do
tubo. Novamente o material foi levado à centrifuga refrigerada, à 4°C por 5 minutos a
10.000g rcf. Foi retirado novamente o sobrenadante com muito cuidado para que o
pellet continuasse no fundo do tubo. O material foi secado à temperatura ambiente
por 3 minutos. Com o material seco foi adicionado de 30 a 40µl de H2O DEPEC
(dependendo do peso inicial do tecido). Então, os tubos foram incubados por 10
minutos à temperatura entre 55°C-60°C no banho seco (Boekel Model 110002). Após
esse período de incubação os tubos foram colocados em gelo por 1 hora e
posteriormente armazenados no freezer -80°C.
25
4.4.2. Eletroforese em gel de Agarose e Quantificação
Após a extração do RNA foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a
determinação da presença do RNA. Para isso foi preparado o gel de agarose a 1%
(1gr de agatose, 100 ml de solução tampão diluída 10x, 1µL de Brometo). O gel foi
preparado e deixado polimerizando previamente. Para a corrida em gel foram
utilizados 2µl de amostra em 2µl de loading. Para o marcador foi adicionado 2µl de
tampão em 2µl de loading. O gel foi acomodado na cuba e as amostras foram
colocadas uma em cada poço sendo o primeiro poço do marcador. A fonte de
eletroforese (Biotech ESP 301 e ESP 1001) foi acertada para 20 minutos de corrida (
395 A, 100 W, 9V). Após a corrida, o gel foi levado à um Transiluminador UV (Uvitec
Cambridge - software FireReader) onde foi fotografado.
Após a constatação da presença de RNA, foi realizada a quantificação no Nanodrop
(ThermoScientific ND-8000). O equipamento foi limpo com H20 MiliQ, e a mesma água
foi utilizada para quantificar o branco. Após a quantificação do branco, o software da
maquina foi configurado para quantificação de RNA e as amostras foram identificadas.
Então, foi utilizado 2µl de cada amostra para a quantificação. Após a quantificação os
valores foram salvos. O RNA foi armazenado em freezer -80°C.
4.4.3. Transcrição Reversa
Para a realização da transcrição reversa foi utilizado o Kit: High-Capacity cDNA
Reverse Transcription. Utilizando as instruções do fabricante primeiramente foram
realizados os cálculos necessários para a diluição do RNA afim de que o mesmo fique
com a concentração entre 80-100ng/µl. A diluição foi realizada utilizando H2O
Nuclease-free completando com as amostras de RNA. Foram preparados 25µl de
RNA diluído para cada amostra. Após a diluição o material foi quantificado no
Nanodrop ThermoScientific ND-8000) e os resultados salvos. Após a diluição o
material foi armazenado em gelo seco durante a preparação do Mix de reagentes para
a transcrição reversa contidos no Kit. Os reagentes (10X RT Buffer, 25x dNTP Mix e
10x RT Random Primers) foram descongelados. A enzima (MultiScribeTM Reverse
Transcriptase) foi adicionada rapidamente e novamente armazenada no freezer. O
volume do Mix de reagentes mais a enzima foi de 10µL e foi adicionado à esta mistura
mais 10µl de RNA diluído para cada amostra. Totalizando 20µl de volume total. Então,
26
os tubos foram colocados no termociclador (Biometra T3000) com a seguintes
condições de ciclagem: 10 min à 25°C, 120 min à 37°C, 5 min à 85°C e mantidos a
4°C ao fim da reação. Após o tempo de ciclagem o cDNA foi armazenado no freezer
-20°C.
4.4.4. PCR de tempo real
Para a realização do PCR de tempo real as placas (MicroAmp® Optical 96-Well
Reaction Plate - Applied Biosystems®) foram montadas da seguinte forma: 18µl de
Mix mais 2µl de cDNA. O Mix foi preparado utilizando os seguintes componentes por
amostra: 10µl de TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG , 1µl TaqMan® Gene
Expression Assay, 7µl de H2O RNAse-free. Os primers utilizados foram: A placa foi
montada em triplicata para cada amostra, cada placa foi realizada com um tecido para
2 genes (OT e OTR) mais o endógeno (GAPDH). Após a montagem da placa a
mesma foi selada e centrifugada (centrifuga Eppendorf 5810) para eliminar possíveis
bolhas de ar. Então, o software da máquina foi configurado para os seguintes
parâmetros de ciclagem: 2 min à 50°C, 10 Min à 95°C e depois 40 ciclos de: 15 seg à
95°C e 1 min à 60°C. Ao final da ciclagem os dados foram coletados e salvos para
análise. Por fim, os valores referentes à amplificação do mRNA de cada um dos genes
analisados foram determinados por meio de métodos de fluorescência e quantificados
por um termociclador e detector ThermoScientific 7500 Real-time System.
4.5. Análise Estatística
Os dados foram expressos como média + erro padrão. Os resultados dos
experimentos comportamentais foram analisados com ANOVA Mista seguido pelo
pós-teste de Bonferroni e considerados significantes para p<0.05. Os resultados da
expressão gênica foram comparados pelo teste T-Student e considerados
significantes para p<0.05.
27
5. Resultados
5.1. Teste de Memória Social
A Anova Mista revelou diferença significante entre os grupos (F(1,124)=5,64,
p= 0,0239) e entre as sessões F(4,124)= 7,604, p<0,0001), mas sem interação entre
os fatores (F(4, 124) = 2,267, p=0,0657). O grupo controle exibiu memória de
reconhecimento social, uma vez que observamos redução gradativa do tempo de
investigação mediante a exposição seriada ao mesmo animal (sessão 1-3), e aumento
do tempo de investigação na presença da novidade social (sessão 4). O grupo
experimental
exibiu
menor
interesse
em
explorar
o
animal
não
familiar
comparativamente ao grupo controle, bem como não exibiu redução significante no
tempo de investigação no decorrer da exposição seriada ao mesmo animal, tampouco
aumento significante da investigação na presença da novidade social. Os dados
sugerem que os animais do grupo experimental apresentam menor motivação para
iniciar o contato social, bem como prejuízo na memória de reconhecimento social.
Habituação /Desabituação
A
EXP
CTR
***
20
**
15
**
10
5
0
25
Investigação (seg)
Investigação (seg)
25
B
20
***
##
&&
15
*
10
Sessão 1
Sessão 2
Sessão 3
Sessão 4
Sessão 5
5
0
1
2
3
4
5
CTR
EXP
Sessões
Fig. 2 –Teste de habituação/desabituação, representada como média + erro padrão,
para grupos controle (n=16) e experimental (n=17).
5.2. PCR em tempo real
Na análise expressão gênica para ocitocina não observamos diferença
significante para o RNAm entre os grupos nas estruturas analisadas hipocampo (t=
28
, t(8) = 0,53, p=0,61), hipotálamo (t(8) = 0,82, p= 0,10 ) e amígdala (t(8) = 0,81, p=
0,43.), fig 3 A,B e C.
Expressão da Ocitocina
Hipotálamo
8
Amígdala
15
A
B
6
 Ct
 Ct
10
4
5
2
0
0
CTR
CTR
EXP
EXP
Hipocampo
15
C
 Ct
10
5
0
CTR
EXP
Fig. 3- Expressão do RNAm da ocitocina representados como média + epm no
hipotálamo (A), amígdala (B) e hipocampo (C) de 5 animais por grupo. Não foram
observadas diferenças entre os grupos nas estruturas analisadas.*, p= 0,04.
Para o receptor de ocitocina, a expressão do RNAm foi significantemente
menor no hipocampo do grupo experimental em comparação com o grupo controle
(t(8)=2,43, p= 0,04), porém sem diferenças entre os grupos para a análise do RNAm
na amígdala (t(8)=0,8543, p= 0,457) ou hipotálamo (t(8)=0,58, p= 0,58).
29
Expressão do Receptor de Ocitocina
Hipotálamo
10
Amígdala
15
A
B
10
6
 Ct
 Ct
8
4
5
2
0
0
CTR
EXP
CTR
EXP
Hipocampo
15
C
*
 Ct
10
5
0
CTR
EXP
Fig. 4- Expressão do RNAm do receptor de ocitocina representados como média +
epm no hipotálamo (A), amígdala (B) e hipocampo (C) de 5 animais por grupo. Não
foram observadas diferenças entre os grupos nas estruturas analisadas.
30
6. Discussão
Esse trabalho investigou o envolvimento do sistema ocitocinérgico por meio da
expressão dos RNAm da ocitocina e do seu receptor em estruturas relevantes desta
rede (hipotálamo, hipocampo e amígdala) e a memória de reconhecimento social em
animais expostos ao SE neonatal e que exibem comportamento autista de acordo com
pesquisas do nosso grupo (CASTELHANO et al., 2010, 2013 e 2015, LEITE et al.,
2016) e de grupos independentes (LUGO et al., 2014, BERNARD; BENK,2015;
HOLMES et al. 2015). Os resultados monstraram que os animais expostos ao SE
neonatal
apresentaram
menor
tempo
de
exploração
e
prejuízo
de
habituação/desabituação frente às repetidas exposições ao estímulo social, sugerindo
que a existência de um prejuízo no circuito de motivação/recompensa e na memória
de reconhecimento social. Os resultados também demonstraram que a expressão do
RNAm da ocitocina não diferiu entre os grupos nas estruturas analisadas, porém
observamos uma pequena redução na expressão gênica do receptor somente no
hipocampo, sugerindo o envolvimento do sistema ocitocinérgico nos prejuízos
observados contudo, realçamos a necessidade de se avaliar a expressão das
proteínas nas estruturas analisadas.
O processamento da novidade é essencialmente baseado em dois
componentes: o componente motivacional envolvido na excitação e motivação para
reagir a estímulos biologicamente relevantes, além de um componente cognitivo
necessário para processar a nova informação relacionada com a identidade do
estímulo (LEONIBUS et al., 2006). O processamento de eventos completamente
novos, em que uma recompensa primária desconhecida é apresentada, é indicada
principalmente pela relevância motivacional intrínseca. Quando um novo estímulo não
é uma novidade primária e é apresentada dentro de um evento familiar, o
processamento da novidade exige uma discriminação entre os estímulos familiares
(anteriormente experimentados) e desconhecidos (LEONIBUS et al, 2006; PETRULIS
et al, 2005), e baseia-se principalmente nos processos cognitivos mais sofisticados,
tais como a elaboração de relevância do estímulo, estímulo de discriminação e
memória de trabalho. Como a gama de funções que abrangem os mecanismos
emocionais e motivacionais incluem o reconhecimento social e a modulação da
memória social, (FEBO; FERRIS, 2014), pode-se sugerir que, além do prejuízo no
reconhecimento social no teste de memória social que realizamos, os animais
31
apresentaram baixa motivação pela novidade, isto porque o tempo de investigação
em cada sessão foi menor nos animais experimentais em comparação com os
controles.
As experiências emocionais positivas durante a interação social é uma
característica importante das relações sociais. A recompensa social e o apego são
cruciais para o bem-estar emocional, e deficiências neste domínio constituem um
elemento importante nos transtornos psiquiátricos, como o autismo, esquizofrenia e
transtornos de personalidade (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2000). No
entanto, os mecanismos neurais que medeiam as propriedades de recompensa das
interações sociais não são totalmente compreendidos, apesar do amplo conhecimento
a cerca do papel da dopamina e da ocitocina.
Os déficits na sociabilidade em indivíduos com TEA, tem sido atribuídos a
hipótese da baixa motivação social, na qual há falta de motivação para o engajamento
em atividades sociais por serem menos gratificantes, uma vez que em indivíduos com
autismo as áreas do sistema de recompensa são menos ativadas por estímulos
sociais do que no grupo com desenvolvimento típico (STAVROPOULOS; CARVER,
2013). A ocitocina participa deste circuito e interage estreitamente com as vias neurais
responsáveis pelo processamento de estímulos motivacionais relevantes (GORDON,
et al., 2011). A ocitocina estimula a via dopaminérgica mesocorticolímbica, que é
crucial para a recompensa e o comportamento motivado (LOVE, 2014). A alteração
na expressão gênica do receptor de OT no hipocampo pode somente ter prejudicado
a memória de reconhecimento social bem como ter reduzir a ativação do núcleo
accumbens e a relevância do estímulo.
Corroborando com a nossa hipótese de que o prejuízo do circuito de
motivação/recompensa possa estar envolvido com os prejuízos na sociabilidade no
nosso modelo, FINK e SMITH (1980) observaram que a destruição dos terminais
dopaminérgicos na via mesolímbica reduziu o comportamento exploratório social e
que foi restaurado pela apomorfina (agonista dopaminérgico). WATSON et al., (2012)
observaram que
o bloqueio dos receptores D3 de dopamina aumenta tanto a
discriminação social quanto a de objeto, enquanto a ativação do receptor D3 ou
bloqueio do receptor D2 de dopamina prejudica a cognição nesses paradigmas.
Finalmente, Li et al., (2009) demonstram que o SE neonatal pela administração do
lítio-pilocarpina em ratos alterou a transmissão dopaminérgica do circuito pré-frontal32
estriado. Menores níveis de dopamina e seus metabólitos foram mensurados no
estriado e no córtex pré-frontal. Esse trabalho também demonstrou que os animais
submetidos ao SE neonatal apresentaram maior sensibilização a metanfetamina na
adolescência, o que é compatível o com prejuízo no sistema de recompensa
mesolímbico.
O sistema opioidérgico está também envolvido da rede de tomada de decisão
social,
embora
a
sua
sinalização
seja
menos
explorada
e
conhecida
comparativamente a ocitocina, vasopressina e dopamina. SMITH et al., (2015)
demonstraram que o bloqueio dos receptores opióide do tipo µ, reduziu o tempo de
investigação direcionada a novidade social sem alterar o tempo de investigação
direcionada a um co-específico do mesmo núcleo social. Argumentamos que o
sistema opioidérgico pode estar envolvido nas alterações comportamentais
observadas no nosso modelo. Os animais expostos ao SE neonatal apresentam
comportamento do tipo ansioso (CASTELHANO et al., 2013, 2015) e recentemente
demonstramos que o controle da ansiedade pelo tratamento prévio com diazepam
não minimizou o déficit de discriminação social, embora tenha reduzido
comportamento relacionado a ansiedade (Leite et al., 2016). Levando-se em conta,
que os receptores opióides µ exercem um papel relevante na modulação do medo e
da ansiedade, e que a morfina quando administrada no núcleo accumbens,
hipocampo ventral ou no septo lateral reduz o comportamento relacionado à
ansiedade (LE MERRER et al., 2007, ZARRINDAST et al., 2008) e que o antagonista
do receptor quando administrado na amígdala central produz efeito oposto (WILSON
e JUNOR, 2008), é lícito argumentar que redução da sinalização media pelo sistema
opioidérgico possa contribuir para a expressão do comportamento do tipo ansioso e
para o prejuízo da sociabilidade. Corroborando com esta hipótese, BAUSCH e
CHAVKIN (1997) relataram redução da imunoreatividade dos receptores opioide µ no
hilo e na camada granular no giro denteado no modelo animal de epilepsia do lobo
temporal. Estudos futuros precisam ser conduzidos para confirmar ou refutar essa
hipótese no modelo do SE neonatal.
Considerando que vários mediadores e estruturas participam da rede de
tomada de decisão social (O’CONNELL e HOFMANN, 2011) e que poucos estudos
estão sendo realizados para se compreender os mecanismos envolvidos com o
33
prejuízo da sociabilidade neste modelo, estudos futuros deveram explorar o sistema
opioidérgico, dopaminérgico e vasopressinérgico.
34
7. Conclusão
O presente trabalho demostrou que animais submetidos ao status epilepticus
neonatal apresentam redução da exploração da novidade social, sugestivo de prejuízo
no sistema de motivação/recompensa mesolímbico e da memória de reconhecimento
social que pode estar relacionada a redução da expressão genética dos receptores
da ocitocina no hipocampo.
35
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