Vacinas de DNA contra dengue combinadas a outras estratégias

Vacinas de DNA contra dengue
combinadas a outras estratégias
Ada M. B. Alves
([email protected])
DENGUE
Hospedeiro invertebrado - mosquito Aedes
Hospedeiro vertebrado - humanos
Vírus:
Arbovírus
Família Flaviviridae
Quatro Sorotipos:
DENV1, DENV2, DENV3, DENV4
Países/áreas de risco de transmissão de dengue
DF
DHF
San Martin et al. Am J Trop Med Hyg. 2010 82(1):128-35
Susceptibilidade e Imunidade
- Imunidade “permanente” para o mesmo sorotipo
- Imunidade temporária para outro sorotipo
O VÍRUS DA DENGUE
Modelo esquemático
E
C
M
RNA
Modificado de Lindenbach & Rice 2001
RNA
INFECÇÃO VIRAL
Célula infectada
Lindenbach & Rice 2001
VÍRUS DA DENGUE
Vacinas contra dengue
Maior dificuldade: Vacina contra os 4 sorotipos
Vacinas de subunidades: E
- Proteína E dos 4 sorotipos (produzida em células de Drosófila) - Hawaii
Biotechnology/Merck (ensaios clínicos)
- Baixa imunogenicidade (necessidade de várias doses), adjuvantes
Vacinas inativadas:
- Vírus produzido em cultura de células e inativados (GSK)
- Baixa imunogenicidade (adjuvantes)
Vacinas atenuadas:
Obtidas por passagens em cultura de células (de macaco e cachorro)
Problemas:
- Conseguir uma dose ideal com diferentes concentrações dos
diversos sorotipos
- Walter Reed Army Institute / GSK – ensaios clínicos Fase II
Vacinas com Vírus Quiméricos:
- Vírus vacinal da Febre Amarela com alguns genes dos vírus da dengue
(BioManguinhos – testes em primatas; Sanofi-Pasteur – ensaios
clínicos Fase III)
- Vírus DENV4 atenuado (DEN430) contendo genes dos outros
sorotipos (NIH – ensaios clínicos)
- Vírus DENV2 atenuado contendo genes dos outros sorotipos (Inviragen –
ensaios clínicos Fase I)
Vacinas de DNA:
- Proteínas prM/E (Navel Medical Research Center, USA – ensaios clínicos Fase I)
- Proteína C
- Proteína NS1
- Proteína NS3
Vacinas de DNA
contra dengue
Proteína E e prM/M
Anticorpos Neutralizantes
Proteína do Envelope
Modis et al., 2003
• Protein E: três domínios (I, II and III);
• Domínio III - Interação com receptores presentes na
superfície das células hospedeiras
(internalização do vírus);
- Anticorpos neutralizantes.
Construções plasmidiais
80% Envelope Protein (pE1D2)
stem-anchor region
amino acids
1
52
132
191
278
Domain I
Domain III
t-PA
E80%
pE1D2
pE2D2
398
(pE2D2)
Domain II
t-PA
296
E Dom III
493
Expressão in vitro das proteínas
recombinantes (células BHK)
Imunofluorescência
pE1D2
pE2D2
pcTPA
Marcação metabólica e
imunoprecipitação
(sobrenadante das culturas)
KDa
pE1D2
pE2D2
pcTPA
Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
TESTES DE DESAFIO
Inoculação por via intracerebral (i.c.) de
DENV-2 neuroadaptado a camundongos
Imunicação (i.m.) de camundongos Balb/c
e desafio (i.c.) com DENV-2
Sobrevivência
100
90
80
% of Survival
70
60
50
pE1D2
40
pE2D2
30
pcTPA
20
DENV-2
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Days after challenge
Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
Morbidade
(Paralisia dos membros posteriores e
comprometimento da coluna vertebral)
***
*
**
80
pE2D2 + DENV-2
pcTPA + DENV-2
60
3
pE1D2 + DENV-2
DENV-2
40
20
Degree of Morbidity
% of Morbidity
100
2
1
0
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Days after Challenge
pE1D2
pE2D2
pcTPA
DENV-2
Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
Anticorpos neutralizantes contra DENV-2
**
700
500
400
ch
al
le
ng
e
pE
2D
2
af
t
er
af
t
er
ch
al
le
ng
e
2
2
0
pE
2D
100
 



pE
1D
200
*
2
300
pE
1D
(PRNT50 titer)
600
Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
Imunizações Combinadas
Vacina de DNA
+
17DD2
Vírus Quimérico YF17D-D2
C prM
E
NS1
NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b
NS5
Vacina Tetravalente (CYD) – Sanofi Pateur
 Cerca de 4.000 crianças na Tailândia (4-11 anos)
 Três doses (0, 6 e 12 meses)
 Acompanhamento 25 meses
Casos de dengue
Sabchareon et al. 2012 Lancet 380:1559-67
Anticorpos Neutralizantes
Imunizações Combinadas
Vacina de DNA
+
17DD2
Vírus Quimérico YF17D-D2
C prM
E
NS1
NS2a NS2b NS3
NS4a NS4b
NS5
Desafio com DENV2 – pE1D2 + 17DD2
Dose / Reforço (prime/boost)
Azevedo et al. 2013 Plos One 8: e58357
Desafio com DENV2 – pE1D2 + 17DD2
Imunização Simultânea (mix)
Azevedo et al. 2013 Plos One 8: e58357
Anticorpos neutralizantes
Dose / Reforço
Imunziação
Simultânea
Elispot – IFN-g
Azevedo et al. 2013 Plos One 8: e58357
Proteína NS1
Proteção
 Altamente imunogênica: pacientes convalescentes apresentam altos níveis de
anticorpos contra NS1
 Anticorpos com fixação de complemento, lise de células infectadas
 Sem o risco de ADE
 Resposta imune de células citotóxicas T CD8+
Patogênese
 Ativação do complemento – aumento da permeabilidade vascular
(DHF/DSS)
 Anticorpos que reagem com proteínas do organismo (fibrinogênio,
trombócitos, células endoteliais)
Vacinas de DNA com o gene que codifica a
NS1 de DENV-2
t-PA
NS1
ANC
pcTPANS1ANC
t-PA
NS1
pcTPANS1
C prM
E
NS1
NS2a NS2b
NS3
NS4a
NS4b
NS5
5’
3’
E
NS1
pcENS1
E
pcENS1ANC
NS1
ANC
Western Blot
Extrato celulares
kDa
49.1
Sobrenadantes das culturas
kDa
134
82
34.8
40.6
Costa et al., Virology 358: 413-23, 2007
Especificidade dos anticorpos anti-NS1
40000
Titers
30000
20000
pcTPANS1 / intact NS1
pcTPANS1 / denatured NS1
pcENS1 / intact NS1
pcENS1 / denatured NS1
10000
0
0
2
4
6
8
10
Weeks
Costa et al., Virology 358: 413-23, 2007
Produção de IFN-g (Elispot)
Desafio I com DENV-2
Inoculação por via intracerebral (i.c.) de DENV-2
neuroadaptado a camundongos
pcTPANS1
(a)
(b)
100
pcTPA + DENV-2
80
80
DENV-2
% of Survival
% of Morbidity
100
pcTPANS1 + DENV-2
60
40
60
pcTPANS1 + DENV-2
40
pcTPA + DENV-2
DENV-2
20
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Days
Days
pcENS1
(c)
(d)
100
pcENS1 + DENV-2
100
pcDNA3 + DENV-2
80
DENV-2
% of Survival
% of Morbidity
80
60
40
20
60
pcENS1 + DENV-2
40
pcDNA3 + DENV-2
DENV-2
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Days
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Days
Costa et al., Virology 358: 413-23, 2007
Desafio II com DENV-2
Inoculação por via i.p. ou i.v. de DENV-2 isolado
de um paciente no Rio de Janeiro e não
adaptado a camundongos
Histopatologia (fígado)
Paes et al., Laboratory Investigation 89:1140-51, 2009
Níveis séricos de enzimas hepáticas (ALT e AST)
Paes et al., Laboratory Investigation 89:1140-51, 2009
Imunização com pcTPANS1 ou pcENS1 e
quantificação das alterações hepáticas
Hemoragia
*
1.2
% hemorragia
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
pcTPANS1 pcENS1
pcDNA3
DENV2
GL 200x
Costa et al., to be submited
Esteatose
Tumefação
5
4
*
***
5
*
**
**
4
3
3
2
2
1
1
0
0
pcTPANS1 pcENS1
pcDNA3
DENV2
HE 200x
pcTPANS1 pcENS1
pcDNA3
DENV2
HE 400x
Costa et al., to be submited
ALT
AST
800
1000
800
U/L
400
600
400
200
200
0
0
Non-infected
pcTPANS1
pcENS1
pcDNA3
DENV2
Non-infected
pcTPANS1 pcENS1
pcDNA3
DENV2
Plaquetas
1000
800
103 / mm3
U/L
600
600
400
200
0
Non-infected
pcTPANS1
pcENS1
pcDNA3
DENV2
Costa et al., to be submited
Lab. Biotecnologia e Fisiologia
de Infecções Virais
Ada M. B. Alves
Simone M. Costa, PhD
Antônio J.S. Gonçalves, PhD
Marciano V. Paes, PhD
Adriana S. Azevedo, PhD
Ana Cristina Nogueira, PhD
Edson R.A. de Oliveira, PhD student
Márcio M. Barradas, M.Sc
Kíssela Rabelo, M.Sc student
Juliana F.A. da Silva, M.Sc student
Paolla Beatriz A. Pinto, graduate student
Eduardo R.P. Veltri, graduate student
Rafael L.C. Silva, graduate student
COLABORATIONS
Hospital Gafrée Guinle/UNIRIO
BioManguinhos/
FIOCRUZ, Brazil
Dr. Ricardo Galler
Brazil
Dr. Carlos Alberto Basílio de
Oliveira
Dr. Marcos S. Freire
USP, Brazil
IOC/FIOCRUZ, Brazil
Dr. Luis Carlos S. Ferreira
Dra. Cecília J. Almeida
Dra. Silvia Boscardin
UFRJ
Dr. Ronaldo Mohana Borges
Ohio State University Medical
Center, USA
Dr. Gerard J. Nuovo
Financial Support
FIOCRUZ
PDTIS
PRONEX - DENGUE