ATIVIDADE OVICIDA E LARVICIDA IN VITRO DAS PLANTAS

Ciência Animal 1999, 9(2):67-73
ATIVIDADE OVICIDA E LARVICIDA IN VITRO DAS PLANTAS
SPIGELIA ANTHELMIA E MOMORDICA CHARANTIA CONTRA O
NEMATÓDEO HAEMONCHUS CONTORTUS
(In vitro ovicidal and larvicidal effect of the plants Spigelia anthelmia and Momordica charantia
against the nematode Haemonchus contortus)
Luiz Matos BATISTA1*, Claudia Maria Leal BEVILAQUA1, Selene Maia de MORAES2 &
Luiz da Silva VIEIRA3
1
2
3
Universidade Estadual do Ceará/Faculdade de Veterinária, Departamento de Física e Química-UECE, EMBRAPA/
CNPC
RESUMO
O desenvolvimento de resistência anti-helmíntica tem sido uma conseqüência do uso intensivo e
incorreto de anti-helmínticos. Na busca de alternativas, experimentos foram realizados com as plantas
medicinais Spigelia anthelmia e Momordica charantia para avaliar a ação das mesmas sobre a
eclosão de ovos e motilidade de larvas do nematódeo Haemonchus contortus. Larvas do parasito
foram obtidos de coproculturas e a recuperação de ovos foi feita em tamises, a partir de fezes de um
carneiro com infecção pura de H. contortus. As plantas foram usadas sob a forma de extratos nas
concentrações de 50, 10, 2, 0,4 e 0,08% no teste de eclosão de ovos e 50, 25, 12,5 e 6,25% no teste
de motilidade de larvas. O teste de eclosão de ovos foi analisado pelo teste t de Student e o de
motilidade de larvas pelo teste de Duncan, a um nível de significância de 5%. A eclosão de ovos foi
significativamente diferente apenas entre as concentrações de uma mesma planta, mas não entre
plantas. A dose inibidora de 50% (DI 50) da eclosão de ovos, às 48 horas de incubação, foi de 0,173
mg/mL para S. anthelmia e de 0,101 mg/mL para M. charantia. Diferenças nas concentrações de M.
charantia não provocaram diferenças significativas na contagem de larvas imóveis, enquanto o
efeito de S. anthelmia, no mesmo teste, variou significativamente com a concentração desta planta.
Estudos adicionais in vivo necessitam ser realizados para ratificar a validação científica demonstrada
in vitro, neste trabalho.
PALAVRAS-CHAVE: anti-helmínticos, Haemonchus contortus, Momordica charantia, nematódeo, ovino, plantas, Spigelia
anthelmia.
ABSTRACT
The development of anthelmintic resistance has been a consequence of the intensive and incorrect
use of anthelmintics. In the search for alternatives, the medicinal plants Spigelia anthelmia and
Momordica charantia were used to evaluate egg hatching and paralisation of larvae from the nematode
Haemonchus contortus. Larvae and eggs from the parasite were obtained by coproculture and recovery
of eggs using sieves, respectively, from the faeces of a sheep infected with H. contortus.
Concentrations of 50, 10, 2, 0.4 and 0.08% of extracts of the plant were used in the egg hatch test
*Autor para correspondência
Av. Paranjana, 1700, 60740-000 Fortaleza, Ceará
e-mail: [email protected]
67
and 50, 25, 12.5 and 6.25% in the test of larvae motility. The results were analyzed by comparison
of the averages of hatched eggs and paralyzed larvae; using a Duncan´s to evaluate significance at
the 5% level. The egg hatching was different among the concentrations of a same plant, but very
similar between the two plants. The 50% inhibitory doses of egg hatching were: 0.173 mg/mL for
S. anthelmia and 0.101 mg/mL for M. charantia. In the test of larvae immobilization, there were no
significant differences between the effects of the various concentrations of M. charantia, while the
effect of S. anthelmia varied significantly with the concentration of this plant. Additional in vivo
studies are important to validate the in vitro properties of the plants evaluated in this study.
KEY WORDS: anthelmintic, Haemonchus contortus, Momordica charantia, nematode, plants, sheep, Spigelia anthelmia.
INTRODUÇÃO
O nordeste concentra cerca de 36% do
rebanho ovino nacional. Entretanto, baixos
índices produtivos são verificados motivados por
problemas sanitários, stress alimentar e erros no
manejo reprodutivo dos rebanhos. Entre os
problemas sanitários, são considerados de
grande importância as nematodeoses
gastrintestinais (COSTA & VIEIRA,1983).
Nesta região, os criadores tentam
aumentar a produção ovina controlando
nematódeos gastrintestinais, apenas com o uso
de anti-helmínticos(CHARLES, 1989). Este
procedimento leva ao desenvolvimento de cepas
de nematódeos resistentes, determinando a
necessidade da renovação do estoque de antihelmínticos disponíveis comercialmente.
Enquanto isto ocorre, não há previsão do
aparecimento de novos anti-helmínticos com
novos modos de ação, na próxima década
(WALLER et al., 1995). Ao mesmo tempo,
inúmeros relatos são feitos sobre as diversas
atividades farmacológicas de plantas medicinais,
usadas empiricamente (HAMMOND et al.,
1997). Portanto, plantas medicinais podem ser
a fonte de novos anti-helmínticos com novos
modos de ação.
No entanto, a falta de estudos
científicos, que comprovem a atividade antihelmíntica de plantas, dificulta os seus usos em
Medicina Veterinária. Este trabalho teve por
objetivo pesquisar in vitro as atividades antihelmínticas das plantas Spigelia anthelmia e
Momordica charantia contra o nematódeo de
ovinos Haemonchus contortus, usando como
modelo experimental o desenvolvimento de
68
ovos e a motilidade das larvas L3, ambos
originados de ovino com mono-infecção do
parasita citado.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção de extratos aquosos de plantas
Exemplares de S. anthelmia foram
colhidos inteiros e suas folhas separadas das
outras partes da planta. As folhas de um exemplar
foram adicionadas às folhas de outros exemplares,
até somarem um peso suficiente para comporem
uma repetição do experimento. Uma repetição de
M. charantia foi composta de ramos e folhas
colhidas em um só ponto de ramificação da planta.
Folhas frescas de S. anthelmia, ou ramificações
totais de M. charantia, foram postas a desidratar
em estufa a 105ºC, durante duas horas e em
seguida, água destilada fervente foi acrescentada
às folhas ou ramificações totais. Após uma hora,
quando a água já estava fria, as folhas ou
ramificações totais foram comprimidas em um
cálice graduado com auxílio de um pistilo e feita
uma filtração em papel de filtro qualitativo,
formando-se uma solução chamada inicial, cuja
concentração foi de 1.000 mg da planta por mL
da solução. Esta primeira concentração foi diluída
seqüencialmente, usando como fator de diluição
o número 5, resultando diluições iguais a 1.000,
200, 40, 8, e 1,6 mg de planta por cada mL de
solução, para o ensaio de eclosão de ovos. No
ensaio de motilidade de larvas, o fator de diluição
foi 2 e as concentrações resultantes foram 1.000,
500, 250 e 125 mg de cada planta para cada mL
de solução. Todo este procedimento foi repetido
10 vezes.
Obtenção de ovos
Ovos de H. contortus foram obtidos de
fezes de um carneiro portador de infecção pura.
As fezes foram maceradas em gral e diluídas com
agua potável. Em seguida, foram passadas
através de quatro tamises, dispostos em ordem
decrescente de abertura de malha (500 µm; 100
µm 75 µm e 32 µm). Os ovos do nematódeo
foram recuperados do tamis com menor abertura
entre malhas e diluídos com água destilada de
modo a comporem uma suspensão, com
aproximadamente 1.000 ovos por mL.
Obtenção de larvas de terceiro estádio (L3)
Larvas de terceiro estádio de H.
contortus foram obtidas de larvaculturas
realizadas segundo UENO & GONÇALVES
(1998).
Teste de eclosão de ovos
O teste de eclosão de ovos foi realizado
em tubo de hemólise. O tempo decorrido entre a
coleta de fezes na ampola retal do carneiro
portador de infecção pura de H. contortus e o início
da incubação dos ovos, sob a ação dos extratos
das plantas, foi de duas horas. Foram adicionados
0,25 mL da suspensão de ovos, com
aproximadamente 250 ovos de H. contortus, a 0,25
mL do extrato de cada planta, obtendo-se
concentrações finais sobre ovos iguais a 50, 10,
2, 0,4 e 0,08% da planta. Um tubo de hemólise
com suspensão de ovos e água destilada constituiu
o controle. O exame do efeito de cada uma das
diluições dos extratos das plantas foi repetido dez
vezes, portanto foram usadas dez soluções
diferentes de cada diluição dos extratos das
plantas. Ao todo foram analisadas 110 unidades
experimentais. Duas alíquotas de 0,05 mL, de cada
unidade experimental, foram colocadas entre
lâmina e lamínula e examinadas ao microscópio
ótico, para calcular as médias de ovos em
desenvolvimento e larvas, às 48 h de incubação.
As variáveis quantificadas foram: ovo em
desenvolvimento celular (DC, Fig. 1), ovo
diferenciado (OD, Fig. 2), ovo larvado (OL, Fig.
3) e eclosão de larva (EL, Fig. 4). DC: O ovo do
nematódeo apresenta uma massa arredondada
formada por um grande número de células. OD:
O ovo contém uma formação interna mais
alongada do que arredondada, dobrada ao meio e
de aspecto grosseiro. OL: Ovo apresentando uma
larva fina, de corpo enovelado e com movimentos.
EL: Larva fora do ovo, imóvel ou não.
Teste de motilidade de larvas
O teste de motilidade foi realizado com
as larvas submetidas a nove tratamentos, sendo
cinco diluições dos extratos de cada planta e
tratamento controle, que constou da suspensão
de larvas sob a ação de água destilada. A unidade
experimental constou de uma placa de Petri com
a suspensão de larvas, à qual foi adicionado o
extrato da planta ou água destilada (controle).
As concentrações dos extratos das plantas foram
de 50, 25, 12,5 e 6,25%. O total de unidades
experimentais examinadas foi de 90. A contagem
de larvas móveis e imóveis foi realizada às 24 h
do início do teste e a quantidade de larvas em
cada placa foi de aproximadamente 300.
Análise estatística
Os dados de desenvolvimento de ovo
foram transformados (log(x+1)), submetidos à
analise de variância e comparados pelo teste t de
Student, segundo diferenças mínimas
significativas (dms) entre médias de
percentagens de ovos nas cinco diluições, em
cada um dos estádios de desenvolvimento de
ovos quantificados, com um nível de
significância de 5%. A análise de regressão foi
feita pelo programa CASIO FC100. A análise
estatística do teste de motilidade de larvas
constou de análise de variância feita com as
médias das percentagens das larvas imóveis de
cada diluição e teste de Duncan (dms), a nível
de 5% de significância.
RESULTADOS
Teste de eclosão de ovos de H. contortus
O teste de eclosão de ovos foi realizado
para verificar o efeito anti-helmíntico de S.
anthelmia e M. charantia. A Tab. 1 e 2 mostram
as médias transformadas das contagens de ovos
nos estádios quantificados. Diferenças
significativas (p<0,05) foram observadas entre
as médias transformadas de ovos nos estádios
69
Tabela 1. Médias transformadas (log(x+1)) do número de ovos nos vários estádios de desenvolvimento
às 48 h de incubação sob ação de S. anthelmia.
S. anthelmia
0
0,08
0,4
2
10
50
DC
1,00bC
1,00bC
1,04bC
1,14cC
1,45cB
2,54bA
Estádios de desenvolvimento de ovos
OD
OL
1,00bC
1,00bB
1,00bC
1,00bB
bC
1,04
1,08bB
cC
1,08
2,93bA
aB
3,96
2,93bA
aA
4,73
1,27cB
EL
6,92aA
5,87aB
5,81aBC
5,57aC
1,12dD
1,11cD
DC = Desenvolvimento celular. OD = Ovo diferenciado. OL = Ovo larvado. EL = Eclosão de larva. Letras minúsculas
comparam médias nas linhas e maiúsculas, nas colunas. Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes
(P>0,05). A diferença mínima significatica é de 0,2754.
DC e LE. Em uma mesma concentração, um
número médio elevado de ovos no estádio DC
corresponde a um valor médio baixo no estádio
LE, e vice-versa. Na concentração de 50% de S.
anthelmia e de M. charantia os ovos do
nematódeo permaneceram, em sua grande
maioria, nos estádios iniciais de
desenvolvimento, enquanto que na concentração
de 0,08% foi vista uma quantidade
significativamente maior (p<0,05) de larvas do
que de ovos nos estádios iniciais de
desenvolvimento. Quando as concentrações dos
extratos das plantas são diminuídos os ovos
evoluem até à eclosão, e sob altas concentrações
ocorre uma diminuição do desenvolvimento dos
ovos de H. contortus. A dose inibidora de 50%
(DI50) da eclosão dos ovos foi de 0,173 mg/mL
para S. anthelmia e 0,101 mg/mL para M.
charantia. A análise de regressão das
percentagens de eclosão de ovos revelou r de
0,68 para S. anthelmia e 0,76 para M. charantia.
Teste de motilidade de larvas
O teste de motilidade de larvas
Tabela 2. Médias transformadas (log(x+1)) do número de ovos nos vários estádios de desenvolvimento
às 48 h de incubação sob ação de M. charantia.
S. anthelmia
0
0,08
0,4
2
10
50
DC
1,00bB
1,00bB
1,00cB
1,00cB
1,00bB
2,31bA
Estádios de desenvolvimento de ovos
OD
OL
1,00bD
1,00bC
1,00bD
1,00bC
cD
1,00
1,54bB
bC
1,56
3,79aA
4,00aB
3,73aA
aA
4,73
1,33cBC
EL
6,92aA
5,07aC
5,46aB
3,54aD
1,11bE
1,01cE
DC = Desenvolvimento celular. OD = Ovo diferenciado. OL = Ovo larvado. EL = Eclosão de larva. Letras minúsculas
comparam médias nas linhas e maiúsculas, nas colunas. Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes
(P>0,05). A diferença mínima significatica é de 0,3357.
70
Tabela 3. Médias de larvas móveis às 24 h de incubação pela ação de M. charantia e S. anthelmia.
Plantas
M. charantia
S. anthelmia
Controle
6,25
55,22bA
36,16dB
33,11
Concentração das plantas (%)
12,5
25
53,38bA
55,30bB
41,63cB
82,28aA
33,11
33,11
50
58,21aB
68,15bA
33,11
Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes (P>0,05). A diferença mínima significatica é de 3,3
mostrou que M. charantia foi mais efetiva do
que S. anthelmia nas concentrações de 6,25 e
12,5%, enquanto S. anthelmia foi mais efetiva
do que M. charantia, nas concentrações de 25
e 50% (Tab. 3). Estes resultados significam que
a ação de S. anthelmia, para inibir a motilidade
de larvas de H. contortus, foi dependente da
concentração da planta, ao passo que a ação de
M. charantia não foi dependente da dose.
DISCUSSÃO
No presente trabalho foram usados
modelos experimentais que tm como variáveis
mudanças bem definidas em estádios de vida de
uma espécie parasitária com hospedeiros
perfeitamente caracterizados. Além disso, as
plantas usadas são bem conhecidas na medicina
popular humana e veterinária e têm ações
fisiológicas e farmacológicas conhecidas
(ACHENBACH et al., 1995; PESALBA &
RITA, 1988; El GENGAIHI et al., 1996).
Portanto, a exemplo dos trabalhos realizados por
AMORIM et al. (1987, 1991, 1992, 1993, 1994,
1995, 1996) que usaram plantas anteriormente
referidas e modelos experimentais com
hospedeiros e parasitas bem definidos, este
experimento pretende dar uma contribuição no
sentido de validar, cientificamente, o uso popular
das duas plantas.
Os extratos de S. anthelmia e M.
charantia apresentaram resultados semelhantes
no teste de desenvolvimento de ovos, mas
diferiram de modo evidente no teste de
motilidade de larvas, sugerindo que princípios
ativos existentes nas duas plantas agem de modo
diverso sobre larvas. Isto corrobora com relatos
anteriores de seus usos: enquanto S. anthelmia
tem aplicação como potente veneno para várias
espécies de vertebrados e invertebrados
(JEFFERIES et al., 1985). M. charantia é usada
em alguns países na alimentação humana
(ZURLO & MITZI, 1989).
No teste de motilidade de larvas o efeito
de S .anthelmia é previsto, se for levado em
consideração que S. anthelmia possui um
princípio ativo, que tem conformação
estereoquímica semelhante e função fisiológica
igual a um grupo de compostos chamados
rianoides (ACHENBACH et al., 1995;
JEFFERIES et al., 1985; PESSAH et al., 1985).
Estes compostos interagem com receptores em
células de muitas espécies de vertebrados e
invertebrados e, experimentalmente, diminuíram
a motilidade do nematódeo de vida livre
Caenorhabditis elegans (MARYON et al., 1998).
Portanto, é possível supor que os compostos
rianóides existentes em S. anthelmia provocaram
a diminuição da percentagem de larvas móveis,
verificada neste experimento.
WATERHOUSE et al. (1987)
verificaram que rianodine, disponível
comercialmente, inibia o desenvolvimento de
ovos de espécies como o ouriço do mar, enquanto
ACHENBACH et al. (1995) demonstraram que
S. anthelmia possui um princípio ativo
estereoquímica e funcionalmente relacionado a
rianodine. Por isso, presumivelmente, a ação
inibidora de S. anthelmia sobre ovos de H.
contortus pode ser creditada a este princípio
ativo.
GIRÃO et al. (1998) encontraram
diminuição do número de larvas L3 de H.
contortus recuperadas em coprocultura, sob a
71
ação de M. charantia. Esta citação corrobora com
os dois ensaios descritos neste trabalho, pois a
recuperação de larvas infectantes em
coproculturas pode ser afetada por distúrbios no
desenvolvimento dos ovos ou por diminuição da
motilidade das larvas L3.
No teste de motilidade de larvas, a
eficácia de S. anthelmia aumenta
significativamente, quando a concentração da
planta varia de 6,25 para 12,5 e 25%, mas, de
modo surpreendente, diminui com a variação de
25 para 50%. Relato semelhante foi feito por
COLES et al. (1988) usando anti-helmínticos
disponíveis comercialmente.
No decorrer dos testes com S. anthelmia
e M. charantia verificou-se que o tempo
decorrente entre a coleta de fezes e o início da
incubação dos ovos nos extratos das plantas
influía no desenvolvimento dos ovos. Este fato
não está expresso em números, nos resultados
apresentados, mas motivou o reinício do
experimento mais de uma vez, para padronização
do tempo entre a coleta de fezes e o início da
incubação dos ovos sob a ação das plantas.
Observações semelhantes foram feitas por
JOHANSEN & WALLER (1989).
S. anthelmia mostrou ação sobre o
desenvolvimento dos ovos e a motilidade das
larvas L3. Estas duas ações conferem grande
importância a testes com plantas para comprovar
atividade anti-helmíntica, especialmente se
existem possibilidades de ação tóxica da planta
usada. Esta importância foi verificada por PATEL
& CAMPBELL (1998) que encontraram ação
simultânea de um anti-helmíntico sobre larvas e
ovos em uma mesma geração de um nematódeo:
a percentagem de larvas que eclodia morria sob
a ação do anti-helmíntico. Assim, o retardamento
da eclosão de ovos e atuação sobre larvas podem
resultar numa inviabilização do total de ovos
eliminados pelo parasita. A planta tida como
tóxica, S. anthelmia (BRAGA, 1976), pode ser
usada numa concentração menor que as doses
100% letais individuais para ovos e larvas,
diminuindo o perigo de ação tóxica sobre o
hospedeiro.
Muitos trabalhos são feitos para testar
plantas medicinais, usando métodos de testes
72
de resistência anti-helmíntica, quase sempre com
muitas modificações. No entanto, os métodos
para teste de resistência anti-helmíntica usados,
podem não ser adequados para testar atividade
anti-helmíntica de plantas medicinais, devido às
diferenças entre os constituintes de antihelmínticos e extratos de plantas. Por isto, faz-se
necessário a padronização de métodos para
comprovar a existência de atividade antihelmíntica em plantas medicinais.
A validação científica do uso popular das
plantas S. anthelmia e M. charantia, verificada
neste trabalho, precisa ser ratificada e
complementada em experimentos in vivo, a fim
de que as duas plantas possam ser usadas no
controle dos nematódeos gastrintestinais de
ovinos, contribuindo para diminuir o
desenvolvimento da resistência anti-helmíntica e
facilitar o desenvolvimento da ovinocultura
nordestina.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a o Dr. Sergio Horta da
Universidade Federal do Ceará, pelo fornecimento
das plantas utilizadas neste trabalho.
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