Cinética de migração celular e expressão da enzima óxido nítrico
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Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Laboratório de Imunopatologia Cinética de migração celular e expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) na pele de cães imunizados com componentes antigênicos de uma nova vacina contra Leishmaniose Visceral Canina (LVC) Juliana Vitoriano de Souza Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Laboratório de Imunopatologia Cinética de migração celular e expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) na pele de cães imunizados com componentes antigênicos de uma nova vacina contra Leishmaniose Visceral Canina (LVC) Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração Imunobiologia de Protozoários. Orientador: Profa Dra. Cláudia Martins Carneiro Co-Orientador: Prof. Dr. Alexandre Barbosa Reis Ouro Preto 2008 VITORIANO-SOUZA, J. Colaboradores Colaboradores: Dr. Rodrigo Corrêa Oliveira I Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti II Mestranda Nádia Moreira das Dores II Dr. Nélder Figueiredo Gontijo III I - Laboratório de Imunologia Celular e Molecular - IRR - Fiocruz, Belo Horizonte, Minas Gerais. II - Laboratório de Imunopatologia - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais. III - Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos, Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais. i VITORIANO-SOUZA, J. Dedicatória Aos meus queridos pais Terezinha e Juarez pelo amor e exemplo de vida ii “A mente que se abre a uma nova idéia, jamais voltará ao seu tamanho original” Albert Einstein iii VITORIANO-SOUZA, J. Agradecimentos A Deus, pela presença constante em todos os dias da minha vida, por iluminar meu caminho e sempre me dar força para seguir em frente. Em especial a minha família; aos meus queridos pais (Juarez e Terezinha) e irmãos pelas orações, pelos conselhos e força dada para realizar este trabalho e principalmente, pelo grande amor depositado em mim nos momentos bons e ruins de minha vida. A minha querida família ouro-pretana: A REP. BICHO DO MATO. Agradeço por todos os momentos inesquecíveis vividos e principalmente, pelas amizades feitas durante todos esses anos. Em especial, a Tatiana, Aracely, Karla, Lizziani, Handreane, Pauline, Geórgia, Vanessa, Valdilene, Juliana, Lívia, Vívian, Karina, Isabel, Jussara, Luiza, Fernanda, Fabiana e Amanda. Vocês contribuíram muito para essa conquista. Ao professor Alexandre por todos esses anos de convivência e pela orientação. Obrigada pela oportunidade, confiança depositada, amizade, incentivo, exemplo de determinação e profissionalismo. À professora Cláudia pela orientação. Obrigada pela imensa ajuda neste trabalho e principalmente, pelo exemplo de competência, profissionalismo e equilíbrio. À Grande amiga Nádia, que esteve presente durante toda esta caminhada, da graduação ao mestrado. Obrigada pela enorme ajuda na realização deste trabalho, pelas palavras amigas durante os momentos difíceis e alegrias. Valeu muito!!! Pode ter certeza que ainda vamos rir muito de tudo isso. À Paula e Amandinha, por esses dois anos de ótima convivência e amizade. Em pouco tempo, vocês se tornaram grandes amigas que levarei sempre comigo. Obrigada pelo carinho, força e incentivo em todos os momentos. Ao Rodolfo pela imensa colaboração durante todo o trabalho e pelo exemplo de profissionalismo. Ao Wendel pela força, apoio e por se mostrar sempre disposto a ajudar. À Raquel e Rafael pela boa convivência no mestrado e laboratório. À Maria Chaves, técnica do laboratório de Imunopatologia, pela grande contribuição neste trabalho e, especialmente, pelo cuidado dedicado ao nosso laboratório e aos alunos de iniciação científica. A todos os amigos do laboratório de Imunopatologia, pela convivência e colaboração nesse trabalho. Obrigada a todos por contribuírem para o crescimento do grupo de pesquisas e por fazerem deste ambiente um excelente local de trabalho, em especial, Bruno e Rodrigo pela ajuda; Henrique, Samuel, Levi, Jamille, Fernando, Sheler, Ana, Carol, Kátia, Kelly, Taís e Lorena . Ao professor Wanderson, que apesar do pouco tempo de convívio, sempre se mostrou pronto para ajudar. À Lúcia, Érika, Fernanda, Ivo e Thiago pela convivência durante toda a graduação. A todos os amigos da pós-graduação, professores e à Cida pela atenção e disponibilidade em resolver todos os nossos pedidos. iv VITORIANO-SOUZA, J. Agradecimentos A todos os funcionários do Biotério e Canil pelo cuidado e manutenção das colônias de animais, tão importantes para a realização das pesquisas. v VITORIANO-SOUZA, J. Sumário LISTA DE GRÁFICOS .............................................................................................................viii LISTA DE FIGURAS...................................................................................................................ix LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................................................x RESUMO......................................................................................................................................xii ABSTRACT ................................................................................................................................xiii 1 - Introdução ..................................................................................................................................1 2 - Revisão da Literatura .................................................................................................................5 2.1 - Leishmaniose Visceral Canina (LVC).................................................................................6 2.2 - Vacinas contra LVC ............................................................................................................7 2.3 - Antígenos e adjuvantes vacinais .........................................................................................9 2.4 - Migração celular...............................................................................................................11 2.5 - Expressão de iNOS na pele ...............................................................................................14 3 - Justificativa ..............................................................................................................................16 4 - Objetivos ..................................................................................................................................18 4.1 - Objetivo Geral: .................................................................................................................19 4.2 - Objetivos específicos:........................................................................................................19 5 - Material e Métodos ..................................................................................................................20 5.1 - Delineamento ....................................................................................................................21 5.2 - Animais..............................................................................................................................22 5.3 - Antígenos e adjuvantes vacinais .......................................................................................22 5.4 - Grupos Experimentais.......................................................................................................23 5.5 - Processamento do material...............................................................................................23 5.6 - Imuno-histoquímica para detecção da expressão da enzima iNOS..................................24 5.7 - Análises Histopatológicas .................................................................................................25 5.8 - Análises quantitativas .......................................................................................................25 5.8.1 - Contagem diferencial (%) ..............................................................................................25 5.8.2 - Análise quantitativa do infiltrado celular na derme e hipoderme .................................25 5.8.3 - Análise quantitativa da área marcada pela enzima iNOs..............................................26 vi VITORIANO-SOUZA, J. Sumário 5.9 - Análise estatística..............................................................................................................26 6 - Resultados ................................................................................................................................27 6.1 - Análises Anátomo e Histopatológicas...............................................................................28 6.2 - Cinética de migração celular na derme de cães ...............................................................30 6.3 - Cinética de migração celular seletiva na derme superior de cães ...................................32 6.3.1 - Migração de neutrófilos na derme superior de cães .....................................................32 6.3.2 - Migração de macrófagos na derme superior de cães ....................................................33 6.3.3 - Migração de eosinófilos na derme superior de cães .....................................................34 6.3.4 - Migração de linfócitos na derme superior de cães ........................................................35 6.4 - Cinética de migração celular seletiva na derme profunda de cães ..................................36 6.4.1 - Migração de neutrófilos na derme profunda de cães ....................................................36 6.4.2 - Migração de macrófagos na derme profunda de cães...................................................37 6.4.3 - Migração de eosinófilos na derme profunda de cães ....................................................38 6.5 - Cinética de migração celular na hipoderme de cães........................................................39 6.5 - Cinética de migração celular seletiva na hipoderme de cães...........................................42 6.5.1 - Migração de neutrófilos na hipoderme de cães .............................................................42 6.5.3 - Migração de macrófagos na hipoderme de cães ...........................................................43 6.5.4 - Migração de eosinófilos na hipoderme de cães .............................................................44 6.5.2 - Migração de linfócitos na hipoderme de cães ...............................................................45 6.6 – Análise semiquantitativa da expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) na pele de cães inoculados com diferentes componentes..........................................................46 6.7 - Análise quantitativa da marcação da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) na pele de cães inoculados com diferentes componentes...............................................................47 6.8 - Correlações entre o número de núcleos de núcleos de células e área marcada pela enzima iNOS na derme e hipoderme .........................................................................................50 6.8.1 - Correlações na derme superior .....................................................................................50 6.8.2 - Correlações na derme profunda ....................................................................................51 7 - Discussão..................................................................................................................................54 8 – Conclusões...............................................................................................................................68 9 - Referências Bibliográficas .......................................................................................................68 vii VITORIANO-SOUZA, J. Lista de Gráficos LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1: Cinética do infiltrado celular na derme de cães inoculados com diferentes componentes. .................................................................................................................................30 Gráfico 2: Cinética de migração seletiva de neutrófilos na derme superior de cães inoculados com diferentes componentes .........................................................................................................33 Gráfico 3: Cinética de migração seletiva de macrófagos na derme superior de cães inoculados com diferentes componentes. ........................................................................................................34 Gráfico 4: Cinética de migração seletiva de eosinófilos na derme superior de cães inoculados com diferentes componentes .........................................................................................................35 Gráfico 5: Cinética de migração seletiva de linfócitos na derme superior de cães inoculados com diferentes componentes. ................................................................................................................36 Gráfico 6: Cinética de migração seletiva de neutrófilos na derme profunda de cães inoculados com diferentes componentes .........................................................................................................37 Gráfico 7: Cinética de migração seletiva de macrófagos na derme profunda de cães inoculados com diferentes componentes .........................................................................................................38 Gráfico 8: Cinética de migração seletiva de eosinófilos na derme profunda de cães inoculados com diferentes componentes .........................................................................................................39 Gráfico 9: Cinética de migração celular na hipoderme de cães inoculados com diferentes componentes. .................................................................................................................................40 Gráfico 10: Cinética de migração de neutrófilos na hipoderme de cães inoculados com diferentes componentes. .................................................................................................................................43 Gráfico 11: Cinética de migração de macrófago na hipoderme de cães inoculados com diferentes componentes antigênicos...............................................................................................................44 Gráfico 12: Cinética de migração de eosinófilos na hipoderme de cães inoculados com diferentes componentes ..................................................................................................................................45 Gráfico 13: Cinética de migração de linfócitos na hipoderme de cães inoculados com diferentes componentes ..................................................................................................................................46 Gráfico 14: Análise da produção da enzima iNOS na pele de cães inoculados com diferentes componentes. .................................................................................................................................48 Gráfico 15: Correlação entre o número de núcleos totais e área marcada pela enzima iNOS na derme e hipoderme ........................................................................................................................50 Gráfico 16: Correlações na derme superior...................................................................................52 Gráfico 17: Correlações na derme profunda..................................................................................53 viii VITORIANO-SOUZA, J. Lista de Figuras LISTA DE FIGURAS Figura 1: Delineamento experimental ilustrando as atividades realizadas no presente estudo. ....21 Figura 2: Alterações macroscópicas na pele de cães inoculados intradermicamente com diferentes componentes antigênicos ..............................................................................................29 Figura 3: Fotomicrografia do infiltrado celular da derme de cães imunizados com saponina, LBSap e CS. ..................................................................................................................................31 Figura 4: Fotomicrografia do infiltrado celular da hipoderme de cães imunizados com saponina, LBSap e CS. ..................................................................................................................................41 Figura 5: Fotomicrografia da IMH para detecção da enzima iNOS na derme e hipoderme de cães imunizados com LBSap.................................................................................................................49 ix VITORIANO-SOUZA, J. Lista de Abreviaturas LISTA DE ABREVIATURAS % ºC µg µL µm2 µm BCG Ca2+ CD CD4 + CD8 + CMSP DAB DTH eNOS FML Percentual Graus Celsius Micrograma Microlitro Micrômetro quadrado Micrômetro Bacillus Calmette Guérin Cálcio Cluster differenciation (grupamento de diferenciação) Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T citotóxicos/supressores Células mononucleares do sangue periférico Diaminobenzidina Reação de hipersensibilidade do tipo tardia Enzima óxido nítrico sintase endotelial Fucose manose ligante GRO-α HE h IFN-γ Ig IgG IgG 1 IgG 2 IL-1 IL-2 IL-4 IL-8 IL-10 IL-12 IL-13 IL-18 IMH iNOS ISCOMs kDa kg LC LPG LPS LTA Oncogene-α relacionada ao crescimento Hematoxilina-eosina Horas Interferon-gama Imunoglobulina Imunoglobulina da classe G Imunoglobulina da subclasse G1 Imunoglobulina da subclasse G2 Interleucina 1 Interleucina 2 Interleucina 4 Interleucina 8 Interleucina 10 Interleucina 12 Interleucina 13 Interleucina 18 Imuno-histoquímica Enzima óxido nítrico sintase induzida Complexos de Imunoestimulação Quilodálton (peso molecular) Quilograma Leishmaniose cutânea Lipofosfoglicano Lipopolissacarídeo Leishmaniose Tegumentar Americana x VITORIANO-SOUZA, J. LV LVC mg MHC MIP-1α e β mL nNOS NO NOS OCT OMS p.i. PBS PCR pH SMF SRD TCRs TNF- α UV WHO Lista de Abreviaturas Leishmaniose Visceral Leishmaniose Visceral Canina Miligrama Complexo principal de histocompatibilidade Proteína inflamatória de macrófagos 1α e β Mililitro Enzima óxido nítrico sintase neuronal Óxido nítrico Enzima óxido nítrico sintase Optimal Cutting Temperature Médium Organização Mundial de Saúde Pós-imunização Phosphate buffer saline Reação da polimerase em cadeia Potencial hidrogeniônico Sistema mononucluear fagocitário Sem raça definida Receptores de células T Fator de Necrose Tumoral tipo α Raios ultra-violeta World Health Organization xi VITORIANO-SOUZA, J. Resumo RESUMO A busca por novos imunobiológicos contra LVC, capazes de ativar uma resposta imune protetora e duradoura no cão, tem se intensificado na última década. No entanto, ainda são poucos os trabalhos que explicam os mecanismos iniciais da resposta inata pós-imunização (p.i) in situ. O presente estudo teve como objetivo central avaliar a cinética de migração celular na pele de cães frente aos distintos componentes antigênicos da vacina LBSap. Quinze cães sem raça definida (SRD) de ambos os sexos com idade variando de 8 a 12 meses, foram inoculados intradermicamente na região dorsal com diferentes componentes antigênicos e divididos em cinco grupos experimentais: (i) grupo controle salina (CS) recebeu 250 µL de salina estéril 0.9%; (ii) grupo Saponina (Sap) recebeu 1 mg de saponina; (iii) grupo Saliva (Sal) recebeu 1 ácino de glândula de Lu. longipalpis por inóculo, (iv) grupo antígeno de L. braziliensis (LB) recebeu 600 µg de proteína de L. braziliensis e (v) grupo vacina de L. braziliensis associado a saponina (LBSap) recebeu 600 µg de proteína de L. braziliensis e 1 mg de saponina. Após os tempos de 1, 12, 24, 48 e 96 horas, foram realizadas biópsias de pele. Os resultados obtidos indicaram que o adjuvante saponina isoladamente ou em associação ao antígeno de L. braziliensis induziu forte reação inflamatória aguda local acompanhada por edema, congestão e hemorragia, no entanto, essas reações não evoluíram para lesões ulceradas. A morformetria por análise de imagem da intensidade do infiltrado celular demonstrou aumento do número de núcleos celulares no grupo Sap na derme. Na hipoderme, esse aumento foi mais intenso que na derme, nos grupos Sap e LBSap. De modo geral, o perfil celular encontrado nos grupos Sap e LBSap foi composto de neutrófilos, linfócitos e eosinófilos, sugerindo um perfil misto de resposta imune (tipo1/ tipo2), fundamental para o controle da infecção. Essas análises ressaltam o papel da saponina como potente estimulador de resposta celular, importante para o início dos processos de apresentação antigênica e desenvolvimento da resposta protetora pós-imunização. No grupo Sal, observou-se aumento de eosinófilos na hipoderme demonstrando o papel da saliva como imunomodulador no início da infecção por Leishmania. Observou-se também aumento da produção de iNOS nos grupos Sap e LBSap permitindo-nos inferir que esse aumento poderia ser importante para o desenvolvimento de um microambiente composto por IFN-γ e de quimiocinas. Desse modo, podemos concluir que a imunização por LBSap e pelo adjuvante saponina produz um perfil semelhante ao de resistência a infecções por Leishmania, contribuindo para o melhor entendimento dos eventos da imunidade inata gerados pela vacina LBSap. xii VITORIANO-SOUZA, J. Abstract ABSTRACT The search for new immunobiologicals against Canine Visceral Leishmaniasis (CVL), able to activate a long-term and protective immune response in dogs, has intensified in the last decade. However, it still remains to be elucidated that mechanisms of the innate immune response in situ after immunization (a.i.). The main objective of the present study was to assess the kinetics of cell migration in the skin dogs with distinct antigenic components of the LBSap-vaccine. In the current study, 15 mixed breed dogs of both genders aging from 8-12-month old were inoculated in the dorsal region by intradermic injections and subdivided within five experimental groups: (i) saline control group (SC) received 250 µL of sterile 0.9% saline; (ii) saponin group (Sap), received 1 mg of saponin; (iii) Saliva group (Sal), received 1 acini of salivary glands of Lutzomyia longipalpis; (iv) Leishmania braziliensis antigen group (LB) received 600 µg/protein of L. braziliensis; and (v) L. braziliensis vaccine plus saponin group (LBSap) received 600 µg/protein of L. braziliensis plus 1 mg of saponin. After the times of 1, 12, 24, 48 and 96 hours, skin biopsies were performed. The results indicated that saponin adjuvant alone or combined with L. braziliensis antigen induced strong local acute inflammatory reaction accompanied by edema, hemorrhage and congestion. However, these reactions not progressed to ulcerated lesions. The image analysis by morformetry showed the intensity of cell infiltrate and an increased number of cell-nuclei in dermis of the Sap group. In hypodermis, this increase was more intense than in the dermis, observed in LBSap and Sap groups. Overall, the cell profile found in Sap and LBSap was composed of neutrophils, lymphocytes and eosinophils suggesting a profile of mixed immune response (type1/type2) potentially compatible with effective control of the etiological agent of CVL. These analyses highlight the role of saponin as a potent stimulator of cell-immune response and important on antigenic priming events and development of protective immune response after immunization. In group Sal, it was observed increase of eosinophils in the hypodermis demonstrating the role of saliva as immunomodulator at the beginning of Leishmania infection. There was also increased production of iNOS in Sap and LBSap groups. These data, allowing us to infer that this increase could be important for the microenvironment composed of cytokines and chemokines with of type-1 profile. Thus, we can conclude that immunization by LBSap and the saponin adjuvant elicited a potential innateimmune activations status compatible with effective control of the resistance to infection by Leishmania and contributing to a better understanding of the innate-immunity events induced by the LBSap vaccine. xiii 1 - Introdução VITORIANO-SOUZA, J. Introdução As leishmanioses são doenças complexas e cosmopolitas causadas pela invasão das células do sistema mononuclear fagocitário (SMF) do baço, fígado, medula óssea e pele por parasitos protozoários hemoflagelados do gênero Leishmania, transmitidos durante o repasto sangüíneo de fêmeas hematófagas dos gêneros Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo (Lainson & Shaw, 1987). Estudos recentes reforçam a hipótese de que os agentes etiológicos Leishmania infantum e Leishmania chagasi, causadores da leishmaniose visceral (LV) no Mediterrâneo e América, respectivamente, são variações da mesma espécie (Mauricio et al., 1999; Maurício et al., 2000; Lukes et al.,2007). O estabelecimento da infecção por Leishmania depende da fagocitose de formas promastigotas flageladas por células do SMF e a subseqüente transformação em amastigotas. Após essa fase, as amastigotas se multiplicam dentro de macrófagos na pele onde foram inoculadas e posteriormente se disseminam para outros órgãos, causando alterações patológicas (Pearson, 1993). Esse grupo de doenças apresenta um amplo espectro de formas clínicas, manifestando-se através de lesões ulceradas na pele, inflamação destrutiva na mucosa ou infecção visceral disseminada (kalazar) e são caracterizadas em função da complexidade biológica do parasito, reservatórios e vetores, bem como das interações parasito-hospedeiro (Saraiva et al., 1989). A LV ou kalazar é uma doença grave e freqüentemente letal, se não tratada, considerada a mais devastadora dentre as formas clínicas das leishmanioses (Desjeux, 2004). Geralmente é restrita geograficamente a regiões que são altamente infestadas pelo inseto vetor, sendo endêmica em países como Índia, Sudão, Nepal, Bangladesh e Brasil que juntos representam cerca de 90% dos casos de LV no mundo (WHO, 2005). Até o final da década de 40, a LV era um problema restrito a poucas regiões do globo e a atenção mundial estava voltada para a resolução dos problemas ocasionados pelas grandes epidemias bacterianas e virais fatais (Garg & Dube, 2006). Atualmente, essa doença encontra-se em expansão em novas áreas (Enserink, 2000) e centros urbanos (Silva et al., 2000). O número de casos relatados de LV no mundo aumentou dramaticamente nos últimos anos, devido à migração de populações das áreas rurais para os centros urbanos. Estes fatores, entre outros, contribuíram para a adaptação do ciclo de transmissão no ambiente peridomiciliar em grandes cidades do Brasil como Belo Horizonte, Montes Claros, Rio de Janeiro, Salvador, Fortaleza, Governador Valadares, Araçatuba, Santarém, Corumbá, Teresina, Natal, São Luís, Camaçari e mais recentemente, nos municípios de Três Lagoas, Campo Grande e Palmas (Arias et al., 1996; Franca-Silva et al., 2003; Ministério da Saúde, 2003; Malaquias et al., 2007). 2 VITORIANO-SOUZA, J. Introdução Além disso, diversas falhas nos programas de controle de reservatórios e vetores, somado ao caráter emergente e re-emergente da LV e sua associação às infecções oportunistas tais como a AIDS (Badaró et al., 1986; Altes et al., 1991; Gradoni et al., 1993) bem como aos recentes relatos da seleção de cepas resistentes a drogas, levou a Organização Mundial de Saúde (OMS) a considerar a leishmaniose como uma das doenças parasitárias de maior importância no mundo. Neste contexto, é importante destacar o papel dos cães como reservatório na LV devido a alta carga parasitária na pele de animais infectados (Deane & Deane, 1955), alta prevalência da doença e a demonstração de que eles são capazes de infectar flebotomíneos mesmo após o tratamento (Molina et al., 1994; Travi et al., 2001; Reis et al., 2006a,b; Giunchetti et al., 2006). O controle da leishmaniose visceral canina (LVC) preconizado pela OMS baseia-se na eutanásia dos animais infectados, uma vez que o tratamento com drogas utilizadas com sucesso em casos humanos como glucanato antimonial de sódio ou stiboglucanato de sódio, mostrou baixa eficácia em cães (Alencar, 1959; Alvar et al., 1994). Todavia, a eliminação desses cães nem sempre é aceita por razões éticas e sociais (Desjeux, 2004). Além da eutanásia dos cães soropositivos, outras estratégias são utilizadas como controle epidemiológico tais como, tratamento sistemático de todos os casos humanos e utilização de inseticidas residuais como forma de controle vetorial (Magalhães et al., 1980). Essas medidas de controle nem sempre são fáceis de serem adotadas, desse modo, alguns fatores como a gravidade da doença, acompanhada pelas limitações do tratamento e a possibilidade de surgimento de epidemias levam a OMS a estimular o desenvolvimento de vacinas contra LVC (O'Hagan & Valiante, 2003). Sendo assim, a imunoprofilaxia pode ser empregada como uma alternativa promissora para a prevenção da LVC, atuando no sentido de diminuir a incidência dos casos caninos e, conseqüentemente, da doença humana (Marzochi et al., 1985; Genaro, 1993; Hommel et al., 1995; Genaro et al., 1996; Gradoni, 2001; Handman, 2001, Desjeux, 2004; Ravindran & Ali, 2004; Requena et al., 2004). Muitos estudos têm sido realizados com a finalidade de desenvolver uma vacina segura contra LVC, com capacidade protetora e sem efeitos adversos ao hospedeiro. Entretanto, existem algumas dificuldades como a grande diversidade antigênica do parasito, bem como o fato desse protozoário acometer diferentes hospedeiros vertebrados e, desse modo, apresentar vários tipos de interação parasito-hospedeiro (Handman, 2001). A elaboração de vacinas deveria levar em consideração fatores como a escolha de moléculas utilizadas como antígenos, dos adjuvantes, via de administração e tempo requerido para a imunidade protetora (Cox, 1997). Até o momento, inúmeras vacinas foram testadas a exemplo das vacinas com parasitos mortos ou parasitos vivo-atenuados, vacinas de antígenos 3 VITORIANO-SOUZA, J. Introdução derivados de DNA recombinante, vacinas de peptídeos sintéticos, vacinas de antígenos não protéicos (lipofosfoglicano – LPG) e vacinas de DNA (Hommel et al., 1995; Gradoni, 2001; Handman, 2001; Mauel, 2002; Brodskyn et al., 2003; Ravindran & Ali, 2004; Requena et al., 2004). A falta de um modelo experimental adequado para testes de vacinas e drogas contra LVC é um agravante para o desenvolvimento de imunoprofiláticos e novos fármacos. Além disto, testes de seleção de potenciais antígenos vacinais, sejam no contexto in vitro ou mesmo in vivo, são limitados. Contudo, o cão pode ser considerado um excelente modelo para o estudo da LV humana, devido às semelhanças entre a LV canina e a doença humana (Peters & KillickKendrick, 1987) e também devido à sua importância epidemiológica como reservatório da leishmaniose visceral . O padrão imunopatológico da doença no homem e no cão é similar, com um longo período de infecção assintomática seguida por anemia, aumento dos linfonodos e febre (Abranches et al., 1991; Genaro, 1993; Reis, 2001; Giunchetti, 2004; Reis et al., 2006a,b,c; Giunchetti et al., 2006). Assim como em humanos, a infecção em alguns cães pode permanecer assintomática (Pinelli et al., 1995), uma das poucas diferenças são as dermatopatias caninas, raramente detectadas em humanos (Hommel et al., 1995; Reis, 2001; Giunchetti et al., 2006). Outro agravante ao estudo da LVC é a falta de marcadores imunológicos e reagentes para o cão, o que retarda o progresso da imunologia canina em detrimento dos estudos em humanos e camundongos (Moreno & Alvar, 2002; Reis et al., 2005; Reis et al., 2006a; Giunchetti et al., 2008a). Considerando a importância da LVC no contexto mundial, como uma importante protozoonose amplamente distribuída, no presente estudo foi utilizado o cão como modelo experimental. Neste sentido, se propôs avaliar a cinética de migração celular utilizando antígenos e adjuvantes vacinais que compõem um imunobiológico (candidato à vacina contra LVC) recentemente, desenvolvido pela UFOP e FIOCRUZ. Este trabalho pretende contribuir para o estudo dos aspectos relacionados à cinética do infiltrado inflamatório na pele como estratégia adicional para o estabelecimento de biomarcadores para avaliação de parâmetros relacionados a inocuidade de diferentes componentes deste imunoprofilático anti-LVC. 4 2 - Revisão da Literatura VITORIANO-SOUZA, J. Revisão da Literatura 2.1 - Leishmaniose Visceral Canina (LVC) A infecção de cães por parasitos do gênero Leishmania apresenta caráter bastante variável, podendo desenvolver infecção sintomática resultando em morte, enquanto outros permanecem assintomáticos, ou ainda apresentam poucos sinais clínicos, sendo assim chamados de oligossintomáticos (Abranches et al., 1991; Genaro, 1993; Reis, 2001; Reis et al., 2006a). As principais manifestações clínicas da LVC são linfoadenopatia, anemia, diarréia, alopecia, dermatite, onicogrifose, perda de peso, caquexia, problemas de locomoção e conjuntivite (Genaro, 1992; Giunchetti et al., 2006; Reis et al., 2006b). Muitos trabalhos relacionam a sintomatologia da LVC a mudanças imunológicas envolvendo células T. Essas mudanças incluem ausência de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) para antígenos de Leishmania (Cardoso et al., 1998; Solano-Gallego et al., 2000), diminuição do número de células T no sangue periférico (Pinelli et al., 1994; Bourdoiseau et al. 1997; De Luna et al., 1999; Martinez-Moreno et al., 1995; Reis, 2001; Reis et al., 2006c), ausência de IFN-γ e da produção de IL-2 por células mononucleares do sangue periférico (CMSP) in vitro (Pinelli et al., 1994). Todavia, observam-se altos títulos de anticorpos antiLeishmania, presentes em animais sintomáticos, sugerindo que esses não são protetores (Pinelli et al., 1994; Martinez-Moreno et al., 1995; Reis, 2001; Santos-Gomes et al., 2002; Reis et al., 2006b). A resistência a LVC tem sido associada com a ativação da resposta tipo 1 através da produção de IFN-γ, IL-2 e TNF-α. O principal mecanismo efetor envolvido na resposta protetora de cães infectados por Leishmania é a ativação de macrófagos por IFN-γ e TNF-α para destruir amastigotas intracelulares, utilizando a via L-arginina do óxido nítrico (NO) (Pinelli et al., 1994; Reis et al., 2006a; Reis et al., 2006b; Reis et al., 2006c; Lage et al., 2007). A produção de NO a partir do aminoácido L-arginina pela óxido nítrico sintase induzida (iNOS) é um mecanismo chave na defesa por fagócitos nos mamíferos (Nathan et al., 2000). O papel das citocinas tipo 2 ainda não é bem definido na LVC. Evidências demonstram que CMSP de cães assintomáticos estimulados com antígenos de Leishmania apresentam transcritos de mRNA de IL-2, IFN-γ e IL-10, ou seja, um padrão misto de citocinas tipo 1 e tipo 2. Além disso, recentemente nosso grupo de pesquisa demonstrou que 100% dos cães com alta densidade parasitária no baço expressam IL-10 e que parte destes animais apresentam níveis relativos de IFN-γ (Lage et al., 2007) demonstrando a participação da IL-10 na modulação da resposta imune juntamente com a presença de IFN-γ na LVC natural. 6 VITORIANO-SOUZA, J. Revisão da Literatura 2.2 - Vacinas contra LVC No século 20, o desenvolvimento e uso de vacinas tornaram-se uma das mais importantes ferramentas contra doenças infecciosas. No campo das doenças parasitárias, é importante ressaltar que o entendimento dos padrões similares de resposta protetora na LV nos modelos murinos, caninos e em humanos possibilitou a descoberta e o estudo de novos imunobiológicos resultando até o momento, na descrição de três classes de vacinas, que representam diferentes gerações de antígenos vacinais. No Brasil, a LEISHVACIN® foi o protótipo de uma vacina utilizada contra LVC, sendo desenvolvida inicialmente contra Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) pelo grupo liderado pelo Prof. Wilson Mayrink do departamento de Parasitologia da UFMG, representando uma vacina de primeira geração. Essa vacina era composta inicialmente por antígenos de promastigotas sonicadas de cinco cepas de Leishmania, sendo sua composição modificada mais tarde apresentando apenas uma cepa de L. (L.) amazonensis (PH8) a fim de facilitar a padronização do antígeno vacinal (Mayrink et al.,1979; Mayrink et al.,1985; Mayrink et al., 1986; Genaro et al., 1996; Marzochi et al.,1985). Em 1996, Mayrink et al. testaram uma vacina em cães compostas por L. braziliensis (Cepa MCAN/BR/1972/C348) associada ao adjuvante BCG (Bacillus Calmette-Guérin) que demonstrou proteção de 90% dos animais vacinados acompanhados por 470 dias em um estudo fechado de Fase I e II em canil (Mayrink et al., 1996). Um outro ensaio vacinal conduzido em canil, contou com a avaliação de uma outra vacina anti-LVC agora composta por L. amazonensis (IFLA/BR/1967/PH8) e L. braziliensis (MCAN/BR/1972/C348) associada ao adjuvante BCG (Fujiwara, 2003; Giunchetti et al., 2008b). Os resultados de imunogenicidade evidenciaram indução da atividade linfoproliferativa in vitro em células T Leishmania-específicas, com expansão de linfócitos T Thy-1+ e T CD8+ circulantes (Giunchetti et al., 2008a), que vem sendo atribuídos a um perfil imunofenotípico de resistência contra LVC (Reis et al., 2006c). Recentemente, o Laboratório Fort Dodge adquiriu a patente de uma vacina de segunda geração contra LVC, conhecida por LEISHMUNE® e licenciada pelo Ministério da Agricultura. Essa vacina foi desenvolvida pelo grupo de pesquisas liderado pela Dra. Clarissa Palatinik de Sousa da UFRJ. A LEISHMUNE® é composta pelo antígeno complexo glicoprotéico ligante de fucose e manose (FML - presente na superfície do parasito) associado com o adjuvante saponina (Palatnik et al., 1990). Estudos com essa vacina demonstraram que a combinação desse antígeno com saponina atingiu uma proteção média de 87,7% e 84% respectivamente em hamsters e camundongos Balb/C (Palatnik de Sousa et al., 1994a; Palatnik de Sousa et al.,1994b). Em 1996, foram realizados estudos em área endêmica de São Gonçalo de Amaranto – RN para testar a 7 VITORIANO-SOUZA, J. Revisão da Literatura eficácia da vacina FML, onde se observou através de testes sorológicos e de intradermorreação, uma proteção de 92% no grupo vacinado, correspondendo a 76% de eficácia vacinal (Da Silva et al., 2001). Outros trabalhos com a LEISHMUNE® também demonstraram sua alta eficácia em campo (Borja-Cabrera et al., 2002). Atualmente, nosso grupo de pesquisa vem se dedicando ao estudo de novas composições vacinais contra LVC. No entanto, esses estudos iniciaram-se com a entrada do Prof. Odair Genaro (in memorian) no grupo de pesquisas do Prof. Mayrink na década de 80. Desde então, muitos trabalhos foram realizados utilizando o modelo canino e antígenos brutos de promastigotas de cepas dermatotrópicas de Leishmania. Diante dos resultados promissores de uma vacina de antígeno bruto, composta por promastigotas de Leishmania dermatotrópicas (Mayrink et al., 1996), e com o estabelecimento de novas metodologias para avaliação imunológica por nosso grupo, que possibilitaram uma avaliação mais acurada do sistema imune canino e conseqüentemente da história natural da LVC (Reis, 2001; Giunchetti, 2004; Reis et al., 2005; Giunchetti et al., 2006; Reis et al., 2006a; Reis et al., 2006b; Reis et al., 2006c; Giunchetti et al., 2008a); Neste sentido, recentemente foi proposto o estudo de dois novos imunobiológicos compostos por antígenos brutos de promastigotas de L. braziliensis associados ao adjuvante saponina (LBSap) e/ou saliva de Lutzomyia longipalpis (LBSapSal) (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008a). Os resultados obtidos até o momento demonstraram que esses imunobiológicos (LBSap e LBSapSal) apresentam forte capacidade indutora de imunogenicidade relacionada aos altos níveis de isotipos IgG anti-Leishmania, associados aos altos níveis de linfócitos, particularmente linfócitos T CD8+ circulantes e linfócitos T CD8+ L. chagasi-específicos. Além disto, outros fatores demonstraram que estes imunobiológicos são indutores de uma resposta imune compatível com o controle efetivo do agente etiológico da LVC, tais como intensa atividade linfoproliferativa L. chagasi-específica e aumento da produção de NO durante a estimulação in vitro por antígenos solúveis de L. chagasi (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008a). Estes resultados estimularam nosso grupo de pesquisa a dar continuidade aos estudos, focalizando em novas avaliações destes imunoprofiláticos. Neste sentido, apesar da administração destas vacinas em cães terem se mostrado seguras (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008a), a reação no local do inóculo (edema ou formação de nódulos) nos animais que receberam o adjuvante saponina de forma isolada ou combinada nas diferentes vacinas avaliadas, estimularam a proposição de uma nova 8 VITORIANO-SOUZA, J. Revisão da Literatura avaliação buscando o estudo de novos biomarcadores que auxiliassem na compreensão destes eventos. Além disto, importantes perguntas poderiam ser respondidas neste trabalho como: (i) “Quais são as populações celulares presentes nos eventos precoces e tardios no local do inóculo vacinal?”, (ii) “O antígeno, adjuvante e a saliva de Lu. longipalpis selecionam de forma diferente as populações celulares que migram para o local do inóculo?”. Para responder a estas e outras perguntas nós estabelecemos um protocolo experimental para estudar estes eventos por meio da avaliação da cinética da resposta inflamatória e da expressão da enzima iNOS em diferentes regiões da pele. 2.3 - Antígenos e adjuvantes vacinais A busca por novos imunobiológicos por nosso grupo resultou em estudos que estimulam a utilização de antígenos brutos como potenciais candidatos a vacina contra LVC, uma vez que estes antígenos são capazes de promover resposta imune celular e reduzir a taxa de infecção (Mayrink et al., 1996) ou mesmo estimular a modulação do sistema imune, desencadeando uma resposta celular com envolvimento de linfócitos T CD8+ (Araújo, 2006), importantes para resistência à infecção por L. chagasi (Reis et al., 2006c). Nas últimas décadas, diversos estudos buscaram avaliar novos adjuvantes, no entanto, seu mecanismo de ação continua pouco compreendido. Considerando o papel imunogênico, vários adjuvantes têm sido avaliados em vacinas como o BCG, citocinas que promovem a resposta tipo 1, saponina, emulsões de óleo, polímeros, lipopolissacarídeos, ISCOMs (complexos de imunoestimulação) e adjuvante completo de Freund (Vogel et al., 1995; Edelman, 1997). Os adjuvantes são componentes essenciais para os protocolos vacinais, amplamente definidos pela sua habilidade de aumentar in vivo a capacidade imunogênica de antígenos que são co-administrados (Afrin & Ali, 1997). O seu uso pode ser justificado por vários motivos: (i) melhora a imunogenicidade de antígenos; (ii) aumenta a duração de resposta imune; (iii) modula a avidez, a especificidade e a distribuição de isotipos ou subclasses de anticorpos; (iv) estimula a imunidade mediada por células; (v) promove a imunidade das mucosas; (vi) aumenta a resposta imune em indivíduos imaturos ou senescentes; (vii) diminui a dose de antígeno na vacina e conseqüentemente, reduz os custos de produção (Singh & O’Hagan, 2003). Dentre os vários adjuvantes podemos citar a saponina que possui um grande potencial inflamatório. Esse adjuvante pertence a um grupo quimicamente heterogêneo de glicosídeos esteróis ou glicosídeos triterpenos, comumente encontrado em cascas, caules, raízes e flores de plantas como, por exemplo, da Quillaja saponaria Molina. Saponinas possuem a habilidade de 9 VITORIANO-SOUZA, J. Revisão da Literatura modular a resposta imune mediada por células, bem como aumentar a produção de anticorpos e possuem a vantagem de necessitarem de uma baixa dose para exercerem seu papel de adjuvante (Oda et al., 2000). Além da capacidade estimuladora dos componentes da imunidade específica, saponinas também apresentam algumas reações imunes não específicas como inflamação (de Oliveira et al., 2001) e estimulam a resposta imune ao antígeno promovendo a síntese de várias citocinas como IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10 (Cox & Couter, 1997). Possivelmente, as saponinas são os adjuvantes ideais para serem utilizados em ensaios vacinais contra Leishmania spp (Ravindran & Ali, 2004), pois além de apresentarem baixo custo, possuem formulação simples e geralmente são consideradas seguras (Cox & Coulter, 1997). Recentemente, muitos trabalhos têm utilizado o extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis, cuja importância na transmissão de Leishmania chagasi na América já é amplamente reconhecida na literatura, por aumentar a infecciosidade em camundongos desde os trabalhos pioneiros realizados por Titus & Ribeiro (1988). Na saliva de flebotomíneos existe uma variedade de moléculas anti-coagulantes, antiplaquetárias e vasodilatadoras que facilitam o repasto sangüíneo e afetam diretamente a homeostase, bem como as respostas inflamatória e imune do hospedeiro vertebrado. Muitas dessas moléculas são imunogênicas e levam a produção de anticorpos e/ou de uma resposta celular pró-inflamatória aumentando a habilidade dos patógenos de se estabelecerem em seus hospedeiros (Ribeiro et al., 1986). Kamhawi et al. (2000) demonstraram que a exposição anterior de camundongos a saliva ou a picadas de flebotomíneos não infectados antes da inoculação por L. major tem efeito protetor associado a uma forte resposta de hipersensibilidade retardada com a produção de IL-12 e IFN-γ no sítio de inoculação. Este estudo foi fundamental, pois a partir de então, diversos pesquisadores passaram a considerar os constituintes da glândula salivar como promissores antígenos vacinais. Belkaid et al. (1998) demonstraram além da produção de anticorpos específicos antisaliva, a presença de intenso infiltrado inflamatório composto por neutrófilos, eosinófilos e macrófagos no local da picada por flebotomíneos. Outros autores observaram que a injeção de soro de camundongos, previamente incubado com saliva induziu rápido infiltrado composto por neutrófilos e macrófagos, sugerindo a participação de complexos imunes no início do processo inflamatório (Silva et al., 2005). Teixeira et al. (2005) observaram em modelo de bolhas de ar para o estudo de inflamação em camundongos, aumento do recrutamento de macrófagos promovido por extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis. A capacidade da saliva de flebotomíneo induzir imunidade mediada 10 VITORIANO-SOUZA, J. Revisão da Literatura por células pode ser caracterizada pelo desenvolvimento de uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia, caracterizada por infiltrado celular no local da picada (Belkaid et al., 2000). A reação inflamatória induzida pela saliva de flebotomíneo poderia, primariamente, representar uma estratégia de sobrevivência, uma vez que o local de inflamação possui maior fluxo sanguíneo que a pele normal e assim facilitaria a alimentação do inseto. Em etapas posteriores, o recrutamento de células não adequadamente ativadas, provocado pela modulação da saliva, seria um evento importante para o estabelecimento do parasito, favorecendo seu desenvolvimento nos macrófagos (Andrade et al., 2007). Considerando a importância da saliva de flebotomíneo no estabelecimento da infecção por Leishmania, levantamos a hipótese de que uma vacina composta por saliva de Lu. longipalpis induziria a produção de anticorpos anti-saliva que neutralizariam as funções imunomoduladoras da saliva, contribuindo para aumentar os níveis de proteção em posteriores repastos sanguíneos por flebotomíneos infectados. Estes eventos representariam uma estratégia adicional para aumentar o repertório antigênico vacinal e conseqüentemente, a eficácia de imunoprofiláticos anti-Leishmania. Desse modo, devido à importância desses antígenos e adjuvantes na composição da vacina contra LVC testada pelo nosso grupo, a análise histológica da pele de cães em diferentes tempos torna-se relevante, podendo contribuir para o entendimento da resposta imune inicial desencadeada na imunização pelos diferentes componentes antigênicos através da cinética de migração celular. Estes eventos são fundamentais para uma melhor compreensão das alterações relatadas no local do inóculo vacinal na presença do adjuvante saponina e da saliva de Lu. longipalpis (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008a). 2.4 - Migração celular A migração celular representa uma propriedade de fundamental importância das células imunes, uma vez que permitem a mobilização dessas para o local da infecção por patógenos. O início e a manutenção da inflamação dependem de diversas famílias de moléculas, tais como prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, aminas vasoativas, citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas. Estas moléculas agem sobre o endotélio, tornando-o permissivo à migração de células inflamatórias (Springer, 1995). O processo de migração leucocitária pode ser dividido em quatro etapas distintas: marginação, processo onde os leucócitos assumem posição periférica em relação às células endoteliais e é influenciado pela modificação das condições hemodinâmicas; captura e rolamento, onde ocorre adesão transitória de leucócitos ao endotélio; adesão, firme união ao 11 VITORIANO-SOUZA, J. Revisão da Literatura endotélio e; diapedese, onde ocorre a passagem de leucócitos entre as células endoteliais em direção ao tecido inflamado/lesionado (Muller, 2003). Durante o processo inflamatório ocorre influxo de células, acúmulo de mediadores inflamatórios, como as citocinas, e aumento na deposição da matriz extracelular. Citocinas regulam tanto a iniciação quanto a manutenção ou resolução da resposta imune inflamatória, além disso, elas direcionam o tipo de resposta imune e os mecanismos efetores que medeiam a resistência a patógenos. Entretanto, algumas citocinas quando produzidas em excesso, podem induzir alterações em decorrência da liberação demasiada de substâncias tóxicas, incluindo proteases e espécies reativas de oxigênio (Homey et al., 2006). Na infecção aguda, neutrófilos são recrutados rapidamente para o local de inflamação e dominam o influxo inicial de leucócitos. Esse papel imediato de neutrófilos na defesa imune os torna ideais para controlar o recrutamento de outros tipos celulares para o local da infecção, tais como células T, monócitos, macrófagos e células dendríticas imaturas (van Gisbergen et al., 2005). Mais tarde, monócitos/macrófagos substituem a população dominante de neutrófilos, sugerindo um padrão de recrutamento bimodal envolvendo a troca de neutrófilos por monócitos/macrófagos (Ryan et al., 1997). Os monócitos recrutados para o local lesado transformam-se em macrófagos fagocíticos, população de células predominante na fase mais tardia da infecção. Macrófagos são considerados a mais importante célula reguladora na reação inflamatória. Eles fagocitam, digerem e matam organismos patogênicos, além de destruir neutrófilos remanescentes (Li et al., 2007). Interessantemente, trabalhos sugerem a participação de neutrófilos na polarização da resposta tipo 1. Embora produzam IL-12 e possam migrar em direção a células T no linfonodo, essa interação é ineficiente. Todavia, a comunicação de neutrófilos com células dendríticas, que potencialmente interagem com células T poderia direcionar para essa resposta de maneira indireta, uma vez que algumas evidências indicam que antígenos fagocitados e processados por neutrófilos são transferidos para células dendríticas para apresentação para células T (Potter et al., 2001). Os eosinófilos são também recrutados para os sítios inflamatórios principalmente em resposta a estímulos alérgicos do trato respiratório, trato gastrointestinal e pele e, geralmente estão relacionados a infecções helmínticas (Terui et al., 2000). A presença de eosinófilos pode estar associada com a fase inicial da infecção por Leishmania (Belkaid et al., 2000) e IL-4 tem sido descrito como forte indutor da migração de eosinófilos (Sanz et al.,1998). Paranhos et al., (1993) detectaram eosinofilia em cães inoculados intradermicamente com saliva de Lu. 12 VITORIANO-SOUZA, J. Revisão da Literatura longipalpis. Observações similares foram vistas em processo inflamatório em camundongos imunizados com uma proteína recombinante de 15 KDa de P. papatasi (Valenzuela et al., 2001) Os macrófagos podem ser descritos como formas evolutivas dos monócitos circulantes que saíram do sangue e fixaram residência nos tecidos. Seu papel relaciona-se a destruição dos fatores etiológicos da inflamação ou complementar a função dos neutrófilos na resposta aguda através da produção de citocinas (Parham, 2001). Entretanto, sua ação principal fica evidente nas inflamações crônicas atuando como células apresentadoras de antígeno (APCs) aos linfócitos T na imunidade específica. Uma vez ativados, os macrófagos liberam uma variedade de citocinas que possuem funções importantes na imunidade inata e ao mesmo tempo na preparação do cenário para que a resposta imune adaptativa se desenvolva (Egan et al, 1996; Terui et al, 2000). Os linfócitos T desempenham seu papel na inflamação aumentando a resposta dos macrófagos pela produção de citocinas pró-inflamatórias. Enquanto os linfócitos B atuam na produção de anticorpos e estabelecimento de imunidade específica (Egan et al, 1996; Terui et al, 2000; Parham, 2001). Estudos sobre o papel de neutrófilos no início da infecção por L. major demonstraram expressão de mRNA para citocinas tipo 1 e quimiocinas em camundongos resistentes, não sendo observado esse padrão em camundongos susceptíveis. Entretanto, observou-se que a depleção de neutrófilos resultou em exacerbação das lesões em camundongos BALB/c infectados por L. major, sugerindo função protetora de neutrófilos (Chen et al., 2005). Contrário a esses trabalhos existe uma outra linha de pesquisadores que defendem o papel de neutrófilos através da sua manutenção no local da infecção, como reservatórios para uma tardia liberação de Leishmania (Aga et al. 2002; Beil et al., 1992). Desse modo, neutrófilos participariam do início da infecção, permitindo a sobrevivência desses parasitos até a chegada de macrófagos, onde estas células fagocitariam os neutrófilos sem ativarem os mecanismos microbicidas, instalando desse modo a infecção (Aga et al. 2002). É importante citar que na resistência a infecção por Leishmania, além de linfócitos T CD4+ , também os linfócitos T CD8+ são requeridos durante o controle primário da infecção com L. major na pele (Belkaid et al., 2002). Embora seja descrito que a principal função protetora dessas células seria na liberação de IFN-γ no sítio da infecção, elas poderiam também participar na citólise das células infectadas no local da infecção (Tsagozis et al, 2003). Visto que a imunidade contra agentes infecciosos requer a ação coordenada de componentes da imunidade inata e adaptativa, o estudo do recrutamento celular torna-se relevante, uma vez que o número de células e a composição no estágio inicial depois do estímulo 13 VITORIANO-SOUZA, J. Revisão da Literatura influenciarão futuras respostas e o desenvolvimento da resposta imune adquirida (Teixeira et al., 2005). 2.5 - Expressão de iNOS na pele A pele, o maior órgão do corpo, é composta por três principais camadas: a epiderme, a derme e camada subdermal ou hipoderme. Os principais tipos celulares presentes são queratinócitos, melanócitos, células endoteliais, adipócitos e células de Langerhans, além de glândulas sebáceas e sudoríparas. Dentre suas diversas funções, a pele atua como uma eficiente barreira física, secretando substâncias microbicidas contra agentes agressores (Bos & Kabsenberg, 1986), ela reage aos estímulos antigênicos disparando o processo inflamatório e uma potente resposta de células T (Larregina et al., 2001). Na LVC, a pele exerce uma função de destaque na infecção natural por Leishmania, visto que se apresenta como local de entrada desse protozoário através da picada de fêmeas hematófagas de flebotomíneos. Em cães susceptíveis a LVC, observa-se a disseminação do parasito da pele através dos histiócitos (macrófagos do conjuntivo), células de Langerhans e células dendríticas para diversos órgãos como baço, fígado, medula óssea, linfonodo, rim, pulmões e trato digestório (Slappendel et al., 1998; Giunchetti et al., 2006). Além disso, observa-se que a pele é um importante reservatório de parasitos em cães infectados por L. chagasi ou L. infantum independente da forma clínica apresentada (Abranches et al., 1991). Considerando a pele como um órgão extremamente susceptível a infecções de etiologias diversas, a produção de NO parece ser um elemento chave particularmente no controle in situ de patógenos intracelulares (Bogdan, 2001). Além da resposta inespecífica da defesa do hospedeiro, a síntese de NO na pele é responsável por um papel chave na modulação da resposta a estímulos externos tais como calor, raios ultravioletas, resposta a infecção através de citocinas e cicatrização, bem como no desenvolvimento de certas condições patológicas (Cals-Grierson & Ormerod, 2004). O NO é uma molécula gasosa simples, habitualmente encontrada no ar atmosférico em pequenas quantidades, altamente tóxica devido à presença de radical livre (elétron extra), altamente reativa e difusível. Essa molécula é sintetizada pela enzima NOS (óxido nítrico sintase) em dois passos de oxidação do aminoácido L-arginina produzindo em partes iguais Lcitrulina e NO (Miranda et al., 2000). Atualmente são identificadas três principais isoformas de NOS, tais como: NOS1, originalmente isolada do tecido neuronal (nNOS); NOS2 (iNOS), uma isoforma induzida e 14 VITORIANO-SOUZA, J. Revisão da Literatura NOS3 (eNOS), predominante em células endoteliais (Michel et al., 1997). Elas existem como homodímeros com peso molecular entre 130 – 160 KDa e requerem alguns co-fatores para sua função [flavina dinucleotídeo, flavina mononucleotídeo, tetrahidrobiopterina e nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida (NADPH)]. Além disso, precisam estar ligadas a calmodulina, no entanto, somente NOS1 e NOS3 requerem a ligação Ca2+-calmodulina, enquanto NOS2 apresenta uma menor dependência em relação ao cálcio (Nathan et al., 1994b). As isoformas de NOS constitutivas são expressas em vários tipos celulares com fenótipos maduros e podem ser moduladas por hormônios circulantes (Molero et al., 2002). A isoforma NOS2 pode ser induzida em resposta a citocinas inflamatórias (IL-1, TNF-α e IFN-γ) ou em combinação de citocinas e polissacarídeos de bactérias (LPS) (Stuehr et al., 1991). A síntese de NO tem sido observada em macrófagos, neutrófilos, linfócitos T helper, fibroblastos, células epiteliais, osteoclastos, osteoblastos, condrócitos, células endoteliais, células de Langerhans e, recentemente, em mastócitos (Flora Filho et al., 2000), podendo ter vários efeitos, dependendo do tipo de célula que o produz, do sítio de liberação e da concentração produzida (Moncada et al., 1993). As funções do NO até hoje descobertas são complexas e antagônicas, podendo ser benéfica ou potencialmente tóxica conforme a concentração ou depuração tecidual (Bogdan, 2001). Dentre as principais funções do NO, pode-se citar a manutenção da homeostase tecidual, incluindo vasodilatação, neurotransmissão e inibição da agregação e adesão plaquetárias (Kendall et al., 2001). O NO também atua na resposta de defesa contra fungos, bactérias, protozoários, bem como células tumorais. Essa molécula pode causar dano ao DNA e morte celular via apoptose, induzindo fragmentação do DNA (Moncada et al., 2002). Estudos de Qadoumi et al. (2002) oferecem evidências da expressão diferencial de iNOS em humanos com leishmaniose cutânea (LC). Análises imuno-histoquímicas da pele revelaram que a alta expressão da proteína iNOS em lesões clássicas de LC está relacionada ao número pequeno de parasitos, enquanto que a baixa expressão de iNOs é acompanhada pelo aumento do número de parasitos. Considerando a importância do NO como mecanismo de controle de patógenos intracelulares, aliado ao fato de ser induzido por citocinas importantes que auxiliam na manutenção do microambiente de uma resposta do tipo 1, a exemplo do INF-γ, a avaliação deste mediador na forma da iNOS torna-se altamente relevante para se predizer o potencial imunoprotetor in locu. Neste sentido, o perfil de expressão da iNOS poderia indicar a capacidade de diferentes estímulos teciduais em induzir uma resposta imune tipo 1, importante para imunobiológicos candidatos a vacinas contra patógenos intracelulares. 15 3 - Justificativa VITORIANO-SOUZA, J. Justificativa A busca por novos imunoprofiláticos contra LVC deve focalizar na prospecção de antígenos capazes de intervir no sistema imune do cão, favorecendo o desenvolvimento de eventos imunológicos específicos relacionados à eliminação do parasito, sendo inócuo ao hospedeiro, protegendo contra a infecção por Leishmania spp. Dessa forma, a imunização deve gerar uma resposta imune compatível ao perfil de reposta do tipo 1 que diminuia o risco de transmissão do parasito. Para alcançar esses objetivos, novos protocolos têm sido desenvolvidos utilizando o modelo canino e a utilização de novos antígenos e adjuvantes. Neste contexto, o entendimento dos eventos iniciais da resposta imune ativada por antígenos vacinais torna-se de grande importância no direcionamento para resposta imune protetora no cão após a imunização com candidatos vacinais. Além disto, esta abordagem tornase uma importante estratégia de avaliação de candidatos vacinais, pois possibilita o estabelecimento de biomarcadores para nortear as avaliações de alterações no local do inóculo vacinal, que compreendem importantes alterações pós-vacinais. Neste sentido, no intuito de ampliar os estudos sobre a resposta imune desencadeada pelo imunobiológico contra LVC recentemente patenteado por pesquisadores do Laboratório de Imunopatologia/NUPEB/UFOP em colaboração com o Laboratório de Imunologia Celular e Molecular/IRR/FIOCRUZ, torna-se altamente relevante a avaliação no modelo canino da resposta a este imunoprofilático e seus constituintes. Assim, pretende-se contribuir para a melhor compreensão dos eventos iniciais pós-vacinais fundamentais para nortear o aprimoramento de vacinas contra a LVC. 17 4 - Objetivos VITORIANO-SOUZA, J. Objetivos 4.1 - Objetivo Geral: • Avaliar a cinética de migração celular e a expressão da enzima iNOs na pele de cães frente a componentes vacinais (L. braziliensis, extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis, saponina e L. braziliensis associado a saponina) de uma nova vacina contra Leishmaniose Visceral Canina. 4.2 - Objetivos específicos: Nos intervalos de tempo de 1, 12, 24, 48 e 96 horas após o inóculo: • Avaliar as alterações macroscópicas decorrentes dos inóculos intradérmicos dos diferentes componentes vacinais; • Avaliar o estabelecimento do processo inflamatório que se desenvolve na pele de cães após a imunização intradérmica dos diferentes componentes vacinais; • Quantificar as populações celulares mais freqüentes encontradas no local do inóculo intradérmico dos diferentes componentes vacinais; • Avaliar a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) no local do inóculo intradérmico dos diferentes componentes vacinais. 19 5 - Material e Métodos VITORIANO-SOUZA, J. Material e Métodos 5.1 - Delineamento Nessa primeira figura estão representadas de forma esquemática as atividades realizadas nesse trabalho. 15 cães CS SAP Sal LB LBSAP Biópsias da pele de cães após inóculos Cinética de migração celular 1 12 24 48 96 horas Processamento, inclusão em parafina e microtomia (4-5 µm) Contagem Diferencial (%) IMH para detecção de iNOS HE Análises Subjetiva e Morfométrica Figura 1: Delineamento experimental ilustrando as atividades realizadas no presente estudo. 21 VITORIANO-SOUZA, J. Material e Métodos 5.2 - Animais Foram utilizados 15 cães sem raça definida (Canis familiaris) de ambos os sexos, com idade entre 8 a 12 meses, provenientes da colônia de cães do canil do Biotério Central da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). Os cães foram vermifugados a partir do 21° dia de nascimento e receberam mais duas doses de antihelmínticos com intervalos de 21 dias. A primeira dose da vacina contra cinomose, adenovírus tipo 2, coronavírus, parainfluenza, parvovírus e leptospirose canina (Vanguard ® HTLP 5/CV-L, Pfizer Animal Health, New York, NY, USA) foi aplicada quando os cães atingiram 45 dias de idade, as outras duas doses foram dadas em intervalos de 21 dias. Antes dos experimentos, todos os animais foram tosados e não foram observadas reações alérgicas. Foram utilizados três animais em cada grupo. 5.3 - Antígenos e adjuvantes vacinais O imunobiológico foi preparado a partir de antígeno de L. (Viannia) braziliensis (cepa MHOM/BR/75/M2903). Esta vacina foi recentemente patenteada pela UFOP em parceria com pesquisadores do Instituto de Pesquisas René Rachou IRR-FIOCRUZ/ MG (Instituto Nacional de Propriedade Industrial – patente PI 0601225-6, 17 de fevereiro de 2006). A concentração do antígeno vacinal (LB) foi de 600 µg/mL diluído em solução salina estéril 0,9%. O adjuvante saponina (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, U.S.A.) foi diluído em solução salina estéril 0,9% (1mg/dose) no momento do inóculo para evitar perda na estabilidade. A formulação de LBSap foi realizada através da associação do antígeno vacinal (600 µg/mL) e do adjuvante saponina (1mg/dose) diluídos em salina estéril 0,9%. Utilizou-se o extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis (1 ácino/dose) cedida pelo Laboratório de Entomologia/ICB/UFMG, a partir de colônia vinda de Teresina (Piauí) e Abaetetuba (Pará) obtidas conforme protocolo estabelecido por Cavalcante et al. (2003). Os antígenos foram inoculados intradermicamente na região dorsal dos cães em duplicata para observar possíveis variações. Os inóculos foram realizados através de injeções de 250 µL (volume total) com os diferentes componentes vacinais. Antes do procedimento, a área foi demarcada com caneta para delimitar o local de biópsia. Cada animal, após ser anestesiado (Thiopentax®, São Paulo, Brazil; 7 mg/kg de peso corporal), recebeu em seu dorso os estímulos de todos os componentes antigênicos vacinais: saponina (Sap), antígeno vacinal (LB), antígeno vacinal associado a saponina (LBSap) e saliva de Lu. longipalpis (Sal), sendo que entre esses foram inoculados controles salina (CS) para detectar possível extravasamento da reação inflamatória. A distância entre cada inóculo foi de 22 VITORIANO-SOUZA, J. Material e Métodos aproximadamente 3 cm. Após os tempos de 1, 12, 24, 48 e 96 horas pós-imunização (p.i.) foram realizadas biópsias de pele para a avaliação da cinética de migração celular provocada pelos diferentes componentes vacinais. Também foi observada antes de cada biópsia a presença de alterações no local do inóculo provocadas pelos componentes antigênicos em cada tempo. Todas as alterações foram fotografadas. 5.4 - Grupos Experimentais Grupo Adjuvante: Saponina (Sap); Grupo Saliva: Extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis (Sal); Grupo Antígeno vacinal: Leishmania braziliensis (LB); Grupo Vacina: Antígeno vacinal de L. braziliensis associado ao adjuvante saponina (LBSap); Grupo Controle: Salina estéril 0,9% (CS); Utilizou-se biópsias de pele normal sem estímulo de cada animal, a fim de observarmos possíveis variações no controle salina. 5.5 - Processamento do material As biópsias foram realizadas no Biotério da Universidade Federal de Ouro Preto, onde foram retirados os fragmentos de pele, previamente demarcados, das regiões dos diferentes inóculos (CS, Sap, Sal, LB, LBSap) além de fragmento de pele normal sem estímulo (CN). O material coletado foi divido em três amostras, sendo duas amostras congeladas (freezer -70° C), para posteriores experimentos de PCR e imuno-histoquímica (IMH). Nas amostras coletadas para IMH foi acrescentado OCT (Optimal Cutting Temperature Médium, Tissue Tek, Leica Microsystem Nussloch GmbH, Wehrheim, Germany). A terceira amostra foi fixada em formol tamponado (pH 7,2), processada no histotécnico (OM CM 69, Metal. OMA LTDA, São Paulo, Brasil), incluída em parafina e cortada em micrótomo na espessura de cinco µm. Estes procedimentos operacionais são padrões do laboratório de Imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB/UFOP), seguindo as normas de controle de qualidade do laboratório. Desse material, retiraram-se dois cortes histológicos de cada bloco que foram depositados separadamente em lâminas de vidro, sendo uma corada pelo método da Hematoxilina & Eosina (HE) e a outra submetida à IMH para detecção da expressão da enzima iNOS. 23 VITORIANO-SOUZA, J. Material e Métodos 5.6 - Imuno-histoquímica para detecção da expressão da enzima iNOS Para a realização da IMH anti-iNOs, inicialmente os cortes foram desparafinizados em xilol (dois banhos de 15 minutos cada) e hidratados em concentrações decrescentes de álcoois (100, 90, 80 e 70%) em banhos de cinco minutos cada. Em seguida, os cortes foram lavados em água corrente por cinco minutos. Após essa etapa, realizou-se o bloqueio da peroxidase endógena, onde os cortes foram incubados por 30 minutos a temperatura ambiente em uma solução de peróxido de hidrogênio (180 mL de álcool metílico + 20mL de peróxido de oxigênio 30%). Seguiu-se a lavagem em PBS por três banhos de cinco minutos cada. A recuperação antigênica dessa reação foi realizada através de solução citrato pH 6,0 por 20 minutos em forno de microondas. Depois de retiradas do forno de microondas, ainda na solução citrato, as lâminas foram deixadas em temperatura ambiente até seu resfriamento e logo após, seguiu-se três banhos de PBS de cinco minutos cada. As bordas das lâminas foram secas e aplicou-se o soro normal de cavalo (R.T.U. Vectastain Universal Elite ABC; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA). Essas lâminas foram incubadas por 30 minutos em câmara úmida a 37º C, com o objetivo de bloquear sítios antigênicos inespecíficos. Após o término do bloqueio, secou-se o excesso de soro normal de cavalo e os cortes foram incubados por 12hs à 18hs em câmara úmida a 4°C com o anticorpo policlonal IgG de coelho anti-iNOS (Rabbit anti-Mouse iNOS, SC-651, Santa Cruz Biotechnology, INC., CA, USA) diluído 1:200 em solução diluente de anticorpo com componentes redutores de background (DakoCytomation, Via Real, Carpinteria, USA). Após o período de incubação, seguiu-se a lavagem em três banhos de PBS por cinco minutos cada e novamente, os cortes foram incubados com o anticorpo biotinilado (R.T.U. Vectastain Universal Elite ABC; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) por 30 minutos a 37ºC. Após a incubação com o anticorpo biotinilado, procedeu-se a lavagem das lâminas com três banhos de PBS de cinco minutos cada. Os cortes foram então incubados com o complexo ABC (R.T.U. Vectastain Universal Elite ABC; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) por 30 minutos em câmara úmida a 37°C. Seguiu-se a lavagem em PBS, três banhos de cinco minutos cada. A revelação da reação foi obtida através da incubação das lâminas em solução de DAB (50mg de Diaminobenzidina em 250 mL de PBS e 500 µL de Peróxido de Hidrogênio 30%) por cinco minutos. 24 VITORIANO-SOUZA, J. Material e Métodos A reação foi interrompida através da lavagem dos cortes em água corrente por cinco minutos. Para realizar a contra-coloração, utilizou-se a Hematoxilina de Harris por 10 segundos à temperatura ambiente seguida pela lavagem dos cortes, por cinco minutos, em água corrente. O material foi desidratado em álcool absoluto e seco em estufa 56°C. Após a secagem dos cortes na estufa, as lâminas foram montadas com Bálsamo do Canadá (Pró-Cito) e lamínula para posteriores análises. Estes procedimentos operacionais são padrões do laboratório de Imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB/UFOP), seguindo as normas de controle de qualidade do laboratório. 5.7 - Análises Histopatológicas As lâminas coradas por HE e submetidas à reação de imuno-histoquímica foram avaliadas no microscópio óptico, quanto à intensidade do infiltrado inflamatório, bem como às células inflamatórias predominantes e sua distribuição na derme superior, derme profunda e na hipoderme. Avaliou-se também a presença de células iNOS positivas, sua localização, sua distribuição e intensidade de marcação. A avaliação de intensidade foi realizada utilizando-se os seguintes parâmetros: (-) ausente, (+) discreto, (++) moderado e (+++) intenso. 5.8 - Análises quantitativas 5.8.1 - Contagem diferencial (%) Foi realizada contagem diferencial (em %) das principais células inflamatórias (macrófagos, linfócitos, neutrófilos e eosinófilos) na pele de cães imunizados com diversos antígenos. A pele dos cães foi subdividida em derme superior, derme profunda e hipoderme a fim de melhor visualizar a migração dos diversos tipos celulares entre as diferentes camadas da pele. 5.8.2 - Análise quantitativa do infiltrado celular na derme e hipoderme As células inflamatórias presentes na derme (superior e profunda) e hipoderme foram quantificadas através da aquisição de 20 imagens aleatórias (área total percorrida igual a 1,5 x 106 µm2) de cada camada. As imagens visualizadas pela objetiva 40x foram digitalizadas 25 6 - Resultados VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 6.1 - Análises Anátomo e Histopatológicas Na análise macroscópica não se notou nenhuma reação adversa nos animais imunizados, com exceção de edema com induração local na pele de cães dos grupos inoculados com o adjuvante saponina (Sap e LBSap) a partir de 12 horas pós-imunização (p.i.). Essa alteração manteve-se durante toda a cinética, não resultando em lesões ulceradas. Nos demais grupos não houve notificação de qualquer alteração. Durante o recorte do material para biopsia, observou-se que o local da pele inoculado com Sap e LBSap apresentava-se edemaciado, hiperemiado com focos hemorrágicos no tempo de 12 horas. Nos tempos seguintes, em alguns animais verificou-se necrose na região da pele de cães desses mesmos grupos. Não se observou qualquer alteração nas demais regiões inoculadas com os outros antígenos (Figura 2). As principais alterações histopatológicas observadas na pele de cães imunizados com diferentes componentes antigênicos foram edema, congestão, hemorragia e degeneração nas fibras musculares quando associada a intensa inflamação focal. Estas observações foram freqüentes em toda a cinética, dos tempos iniciais (1 e 12 horas p.i) até o mais tardio (96 horas p.i.) nos grupos inoculados com Sap e LBSap. No grupo Sal e LB observaram-se apenas discreta hemorragia nos tempos iniciais (12 e 24 horas p.i.) da cinética. 28 VITORIANO-SOUZA, J. LBSap Resultados CS Sal CS Sap CN LB CS CS LB A CN Sap CS Sal CS LBSap B C D E LBSap Sap F Sap LBSap G H 1,86 cm CS Figura 2: Alterações macroscópicas na pele de cães inoculados intradermicamente com diferentes componentes antigênicos. Em A, está representada a distribuição dos componentes vacinais no dorso do animal; em B e C, inóculo intradérmico; em D, são mostradas as alterações macroscópicas nos grupos Sap e LBSap; em E, está representada a fotomicrografia da pele invertida, onde observam-se as reações provocadas pelos grupos Sap e LBSap; em F, G e H, são representados os grupos Cs, Sap e LBSap, demonstrando edema e focos hemorrágicos nos grupos Sap e LBSap, além de uma região com presença de exsudato purulento em LBSap (H). 29 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 6.2 - Cinética de migração celular na derme de cães A cinética de migração celular na derme de cães está representada no Gráfico 1 e Figura 3. Nessa cinética não foram observadas diferenças significativas entre os grupos analisados em relação aos diferentes tempos. Foi observado na derme aumento (P<0.05) do infiltrado celular após imunização com Sap nos tempos de 1 (130,8±30,1),12 (187,2±38,9), 24 (154±32,81) e 96 horas p.i. (254,8±57,34) em relação ao grupo CS (57±12,15; 58,62±13,24; 44,07±2,917 e 40,35±5,798), respectivamente; e em 12 (187,2±38,9) e 24 (154±32,81) e 96 horas p.i. (254,8±57,34) em relação ao grupo Sal (82,7±21,48; 68,35±16,13 e 35±21,21). Adicionalmente, em 96 horas p.i. observou-se aumento (P<0.05) do infiltrado em Sap (254,8±57,34) em relação a LB (35±5,162). No tempo de 24 horas p.i., observou-se ainda aumento (P<0.05) do infiltrado no grupo LB (119,3±43,53) em relação a CS (44,07±2,917). 400 Número de núcleos 200 0 1h 400 1h 12h 24h 48h 24h 12 h 96h 48h 96h 200 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 1: Cinética do infiltrado celular na derme de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 30 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 24 h 96 h Controle 1h B C D E F G H I LBSap Saponina A 50 µm Figura 3: Fotomicrografia do infiltrado celular da derme de cães imunizados com saponina, LBSap e CS. Nessa figura está representado o infiltrado celular discreto observado nestes grupos nos tempos de 1, 24 e 96 horas p.i (aumento de 40x, barra: 50 µm). 31 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 6.3 - Cinética de migração celular seletiva na derme superior de cães 6.3.1 - Migração de neutrófilos na derme superior de cães Buscando-se ampliar o estudo do infiltrado inflamatório para se determinar os tipos celulares que seriam recrutados para o local do inóculo pelos componentes antigênicos da vacina LBSap foi realizada a contagem diferencial de células na derme profunda e hipoderme, sendo os resultados expressos em percentual. No Gráfico 2, estão demonstrados os resultados da cinética de neutrófilos na derme superior, bem como as comparações entre os grupos estudados. Em relação a cinética, o grupo Sap induziu aumento (P<0.05) de neutrófilos no tempo de 12 horas p.i. (42±8,485) em relação ao tempo inicial de 1 hora p.i. (6±0). Por outro lado, nos tempos de 48 (9,5±2,121) e 96 horas p.i. (9±12,73), o grupo Sap apresentou redução (P<0.05) neutrófilos quando comparado ao tempo de 12 horas p.i. (42±8,485). A avaliação entre os diferentes inóculos considerando a população de neutrófilos na derme superior, revelou aumento (P<0.05) no grupo Sap (42±8,485) quando comparado aos grupos CS (4,5±6,364), Sal (6,5±0,7071), LB (13,67±10,21) e LBSap (6,667±3,215) no tempo de 12 horas p.i. 32 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 100 Percentual de neutrófilos (%) 50 a b b 0 1h 100 1h 12h 24h 48h 24 h 12 h 96h 48 h 96 h 50 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 2: Cinética de migração seletiva de neutrófilos na derme superior de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. No Gráfico da cinética, as diferenças estatísticas estão representadas pelas letras “a” e “b”, referentes aos tempos de 1 e 12 horas p.i, respectivamente. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 6.3.2 - Migração de macrófagos na derme superior de cães No Gráfico 3, estão representados os resultados de cinética de macrófagos na derme superior, bem como as comparações entre os grupos estudados. A avaliação da cinética de migração de macrófagos indicou redução no tempo de 12 horas p.i. (47,67±2,082) no grupo imunizado com Sap em relação ao tempo de 1 hora p.i. (82,33±4,041). Na avaliação entre os diferentes inóculos foi observado queda no número de macrófagos do grupo Sap (47,67±2,082) quando comparado ao CS (85±7,071) no tempo de 12 horas p.i. De forma similar, foi observada redução de macrófagos no grupo LBSap (43,67±4,726) em 48 horas p.i. em relação aos grupos CS (71,33±11,55), Sal (68,67±10,97) e LB (83,33±4,619) (P<0.05). 33 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados Percentual de macrófagos (%) 100 50 a 0 1h 100 1h 12h 24h 12 h 48h 24 h 96h 48 h 96 h 50 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 3: Cinética de migração seletiva de macrófagos na derme superior de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. No Gráfico de cinética, a diferença estatística está representada pela letra “a” referente ao tempo de 1 hora. As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 6.3.3 - Migração de eosinófilos na derme superior de cães No Gráfico 4, estão demonstrados os resultados de cinética de eosinófilos na derme superior, bem como as comparações entre os grupos estudados. Na avaliação da cinética de migração de eosinófilos observou-se aumento significativo (P<0.05) desse tipo celular no tempo de 96 horas p.i. (5±0) em relação aos tempos de 12 (0±0), 24 (0±0) e 48 horas p.i. (0,3333±0,5774) no grupo LBSap. A análise estatística entre os grupos não revelou diferença significativa. 34 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados Percentual de eosinófilos (%) 10 b,c,d 5 0 1h 10 1h 12h 24h 48h 24 h 12 h 96h 48 h 96 h 5 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 4: Cinética de migração seletiva de eosinófilos na derme superior de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. No Gráfico de cinética, as diferenças estatísticas estão representadas pelas letras “b”, “c” e “d”, referentes aos temos de 12, 24 e 48 horas p.i. respectivamente. 6.3.4 - Migração de linfócitos na derme superior de cães Na avaliação da cinética de migração de linfócitos na derme superior observou-se aumento (P<0.05) de linfócitos no grupo LBSap no tempo de 48 horas p.i. (40,67±6,11) em relação ao tempo de 1 hora (9,333±0,5774). Nas cinéticas dos demais grupos, não foram observados diferenças como demonstrado no Gráfico 5. Adicionalmente, a avaliação considerando a comparação entre os grupos revelou aumento (P<0.05) de linfócitos nos grupos Sap (24,67±3,786) e LBSap (24,67±4,041) no tempo de 24 horas em relação ao CS (13,67±3,512), Sal (7,667±1,528) e LB (10,67±4,726). No tempo de 48 horas, observou-se um aumento (P<0.05) do número de linfócitos no grupo LBSap (40,67±6,11) quando comparado aos grupos CS (16,67±4,509) e LB (12,33±1,528). 35 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados Percentual de linfócitos (%) 100 50 a 0 1h 100 1h 12h 24h 48h 24 h 12 h 96h 48 h 96 h 50 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 5: Cinética de migração seletiva de linfócitos na derme superior de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. No Gráfico de cinética, a diferença estatística está representada pela letra “a” referente ao tempo de 1 hora. As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 6.4 - Cinética de migração celular seletiva na derme profunda de cães 6.4.1 - Migração de neutrófilos na derme profunda de cães No Gráfico 6, estão demonstrados os resultados de cinética de neutrófilos na derme profunda, bem como as comparações entre os grupos estudados. Ao longo da cinética não houve diferença significativa em nenhum grupo estudado. Na análise comparativa entre os grupos, notou-se aumento (P<0.05) de neutrófilos no grupo Sap (38,33±11,59) em 48 horas p.i. em relação ao grupo LB (3±1,732). 36 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 100 Percentual de neutrófilos (%) 50 0 1h 100 1h 12h 24h 12 h 48h 24 h 96h 48 h 96 h 50 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 6: Cinética de migração seletiva de neutrófilos na derme profunda de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 6.4.2 - Migração de macrófagos na derme profunda de cães A cinética de migração de macrófagos na derme profunda, bem como as comparações entre os grupos está representada no Gráfico 7. Em relação a cinética, nenhuma diferença estatística entre os grupos ao longo do tempo foi observada. A análise comparativa entre grupos mostrou redução (P<0.05) do percentual de macrófagos no grupo LBSap (17,67±10,02 e 38,67±7,767) quando comparado ao CS (77,67±8,145 e 77,33±4,509) nos tempos de 24 e 48 horas p.i., respectivamente. Adicionalmente, houve redução significativa em 48 horas p.i. do percentual de macrófagos no grupo LBSap (38,67±7,767) quando comparado ao grupo LB (80,67±9,452). Também, foi verificado no grupo Sap (48,33±11,68) redução (P<0.05) de macrófagos quando comparados aos grupos CS (77,33±4,509) em 48 horas p.i. 37 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 100 Percentual de macrófagos (%) 50 0 1h 100 1h 12h 24h 12 h 48h 96h 48 h 24 h 96 h 50 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 7: Cinética de migração seletiva de macrófagos na derme profunda de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 6.4.3 - Migração de eosinófilos na derme profunda de cães No Gráfico 8, está representada a avaliação da cinética de migração de eosinófilos onde se observa aumento (P<0.05) desse tipo celular no tempo de 96 horas p.i. (21±5,657) no grupo Sap em relação a todos os tempos anteriores: 1 (0,3333±0,5774), 12 (0±0), 24 (0,3333±0,5774) e 48 horas (2,667±1,155). De forma similar, neste mesmo tempo, também foi observado aumento (P<0.05) de eosinófilos no grupo LBSap no tempo de 96 horas p.i. (23,5±21,92) em relação ao tempo de 12 (0±0) e 24 horas p.i. (0,3333±0,5774). Na comparação entre os grupos não foram observadas diferenças significativas no número de eosinófilos ao longo dos tempos. Na derme profunda, não foram observadas diferenças ao longo dos tempos e nem entre os grupos avaliados, quanto à migração de linfócitos. 38 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 40 b,c a,b,c,d Percentual de eosinófilos (%) 20 0 1h 1h 40 12h 24h 12 h 48h 96h 48 h 24 h 96 h 20 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 8: Cinética de migração seletiva de eosinófilos na derme profunda de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. No Gráfico de cinética, as diferenças estatísticas estão representadas pelas letras “a”, “b”, “c” e “d”, referentes aos tempos de 1, 12, 24 e 48 horas p.i, respectivamente. 6.5 - Cinética de migração celular na hipoderme de cães Os principais resultados do infiltrado celular total na hipoderme de cães imunizados com diferentes componentes antigênicos estão representados no Gráfico 9 e Figura 4. Na análise da cinética foi observado aumento (P<0.05) do infiltrado celular nos grupos Sap (791,4±80,63; 994,6±118,5 e 1098±268,4) e LBSap (529±120,3; 711,7±124 e 598,4±217,1) a partir de 12 horas até 48 horas p.i. quando comparado ao tempo inicial de 1 hora (160,1±14,21- Sap e 77,07±22,45LBSap). Na análise comparativa do infiltrado celular entre os grupos foi observado aumento (P<0.05) do infiltrado celular nos grupos Sap (791,4±80,63; 994,6±118,5 e 1098±268,4) e LBSap (529±120,3; 711,7±124 e 598,4±217,1) nos tempos de 12, 24 e 48 horas quando comparados com CS (65,53±21,59; 60,43±25,41 e 49,03±14,09), Sal (79,75±45,27; 93,17±63,99 e 64,83±10,88) e LB (248,4±81,62; 210,4±123,6 e 94,85±32,6). Além disto, o grupo Sap (791,4±80,63; 994,6±118,5 e 1098±268,4) apresentou aumento significativo do infiltrado celular nos mesmos tempos de 12, 24 e 39 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 48 horas quando comparado ao grupo LBSap (529±120,3; 711,7±124 e 598,4±217,1). Adicionalmente, no tempo de 1, o grupo Sap (160,1±14,21) apresentou aumento do infiltrado celular em relação aos grupos CS (39,82±8,476), e em 96 horas, aumento de Sap (596,2±271,5) em relação a CS (41,13±5,197) e Sal(36,6±11,38), respectivamente. 1500 a a 1000 a a a a Número de núcleos 500 0 1h 1500 1h 12h 24h 48h 48h 24h 12h 96h 96h 1000 500 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 9: Cinética de migração celular na hipoderme de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. No Gráfico de cinética, a diferença estatística está representada pela letra “a” referente ao tempo de 1 hora. As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 40 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 24 h 96 h Controle 1h B C D E F G H I LBSap Saponina A 50 µm Figura 4: Fotomicrografia do infiltrado celular da hipoderme de cães imunizados com saponina, LBSap e CS. Nessa figura está representado o infiltrado celular intenso observado nestes grupos quando comparado ao controle nos tempos de 1, 24 e 96 horas p.i (aumento de 40x, barra: 50 µm). 41 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 6.5 - Cinética de migração celular seletiva na hipoderme de cães 6.5.1 - Migração de neutrófilos na hipoderme de cães No Gráfico 10, estão representados os resultados referentes a cinética de neutrófilos na hipoderme. A hipoderme foi o terceiro compartimento cutâneo avaliado. Neste sentido, a avaliação cinética de neutrófilos revelou redução (P<0.05) do percentual de neutrófilos no grupo LBSap, no tempo de 96 horas p.i. (35±11,31) quando comparado aos tempos de 1 (67,33±4,619) e 24 horas p.i. (66,67±5,508). Adicionalmente, foi observado no grupo LB redução (P<0.05) de neutrófilos nos tempos de 48 (16,67±9,074) e 96 horas p.i. (19,5±9,192) em relação aos tempos de 1 (51,33±13,65), 12 (64,67±1,155) e 24 horas p.i. (66,67±6,658). Na análise comparativa entre grupos foi observado aumento (P<0.05) de neutrófilos nos grupos Sap (56,67±29,67) e LBSap (67,33±4,619) em relação ao CS (11,33±4,041), no tempo inicial de 1 hora p.i., similarmente, foi observado no tempo de 24 horas aumento (P<0.05) de neutrófilos nos grupos Sap (76,67±6,658), LB (66,67±6,658) e LBSap (66,67±5,508) quando comparado aos grupos CS (29±11,31) e Sal (37,33±16,5). No tempo de 48 horas foi observado aumento (P<0.05) de neutrófilos nos grupos Sap (65,67±4,041) e LBSap (48,67±3,512) quando comparado aos grupos CS (22,33±2,517), Sal (22±11,53) e LB (16,67±9,074). 42 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 100 a Percentual de neutrófilos (%) 50 a,c b a,b,c b a,b,c 48h 96h 0 1h 1h 100 12h 24h 12 h 24 h 48 h 96 h 50 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 10: Cinética de migração de neutrófilos na hipoderme de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão No Gráfico de cinética, as diferenças estatísticas estão representadas pelas letras “a”, “b” e “c”, referentes aos temos de 1, 12 e 24 horas p.i., respectivamente. As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 6.5.3 - Migração de macrófagos na hipoderme de cães No Gráfico 11, estão representados os resultados referentes a cinética de macrófagos na hipoderme. Na cinética de migração de macrófagos, notou-se redução significativa (P<0.05) desta população celular no grupo CS (39±22,72) em 12 horas p.i. em relação ao tempo de 1 hora p.i. (74,33±2,309) No grupo LB, no entanto verificou-se aumento significativo (P<0,05) de macrófagos no tempo de 48 horas p.i. (66±11) em relação aos tempos de 12 (25,67±5,859) e 24 horas p.i. (27±5,196). A análise comparativa entre grupos mostrou redução (P<0.05) do percentual de macrófagos no tempo de 1 hora considerando os grupos Sap (18,33±5,033) e LBSap (19,33±7,024) quando comparados aos CS (74,33±2,309) e Sal (52,33±14,74), e de forma similar no grupo LB (39±8,544) em relação ao grupo CS (74,33±2,309). No tempo de 24 horas p.i., observou-se redução de 43 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados macrófagos nos grupos Sap (14,67±6,658) e LBSap (15,33±6,028) em relação ao grupo CS (57,33±9,292). Subseqüentemente, no tempo de 48 horas foi observada redução (P<0.05) de macrófagos nos grupos LBSap (26±2) e Sap (8,333±4,163) em relação aos grupos CS (66,67±3,215), Sal (60,33±23,44) e LB (66±11). 100 b,c Percentual de macrófagos (%) 50 a 0 1h 100 1h 12h 24h 12 h 48h 24 h 96h 48 h 96 h 50 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 11: Cinética de migração de macrófago na hipoderme de cães inoculados com diferentes componentes antigênicos: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. No Gráfico de cinética, as diferenças estatísticas estão representadas pelas letras “a”, “b” e “c” referentes aos temos de 1, 12 e 24 horas p.i., respectivamente. As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 6.5.4 - Migração de eosinófilos na hipoderme de cães No Gráfico 12 estão representados os resultados referentes a cinética de eosinófilos na hipoderme. Observou-se aumento de eosinófilos (P<0.05) no grupo Sap nos tempos finais de 48 (7±2,646) e 96 horas p.i. (13±2,828) em relação aos tempos de 1 (0,3333±0,5774), 12 (0,6667±0,5774) e 24 horas p.i. (1,667±1,528). Também, nós observamos aumento significativo no tempo de 96 horas p.i. (13±2,828) em relação ao tempo de 48 horas p.i. (7±2,646). 44 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados Na análise comparativa entre grupos, verificou-se um aumento (P<0.05) de eosinófilos no tempo de 1 hora p.i. no grupo Sal (5±3,606) quando comparado ao grupo LB (0±0). Este aumento de eosinófilos no grupo Sal (5,333±2,309) se manteve no tempo de 12 horas p.i. quando comparados aos grupos CS (0,3333±0,5774), Sap (0,6667±0,5774), LB (0±0) e LBSap (0,6667±1,155). 40 Percentual de eosinófilos (%) 20 a,b,c,d a,b,c 0 1h 40 1h 12h 24h 12 h 48h 96h 48 h 24 h 96 h 20 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 12: Cinética de migração de eosinófilos na hipoderme de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. No Gráfico de cinética, as diferenças estatísticas estão representadas pelas letras “a”, “b”, “c” e “d” referentes aos tempos de 1, 12, 24 e 48 horas p.i., respectivamente. As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 6.5.2 - Migração de linfócitos na hipoderme de cães A cinética de migração de linfócitos na hipoderme está representada no Gráfico 13. Na avaliação de migração de linfócitos foi observado aumento (P<0.05) no grupo Sap no tempo de 48 horas p.i. (19±4) em relação ao tempo de 24 horas p.i. (7±5,292). No entanto, nenhuma diferença significativa foi observada na análise entre os grupos. 45 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 100 Percentual de linfócitos (%) 50 c a 0 1h 100 1h 12h 24h 12 h 48h 24 h 96h 48 h 96 h 50 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 13: Cinética de migração de linfócitos na hipoderme de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. No Gráfico de cinética, as diferenças estatísticas estão representadas pela letra “c” referente ao tempo de 1 hora p.i., respectivamente. 6.6 – Análise semiquantitativa da expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) na pele de cães inoculados com diferentes componentes Após a realização da imuno-histoquímica para detecção da enzima iNOS, as lâminas foram avaliadas de maneira semiquantitativa para análise da imunorreatividade de iNOS na derme e hipoderme, bem como em queratinócitos, glândulas sebáceas e sudoríparas. Desse modo, os padrões utilizados foram denominados como ausente (-), discreto (+), moderado (++) e intenso (+++). No grupo Sap observou-se imunorreatividade em todas as camadas da pele (derme e hipoderme), bem como anexos. Essa marcação variou de moderada a intensa nos queratinócitos, discreta a intensa na derme, ausente a intensa na hipoderme. Em relação ao grupo Sal, a marcação nos queratinócitos oscilou de moderada a intensa, durante toda a cinética. Na derme, a intensidade de marcação variou de discreta a intensa e na hipoderme houve variação de ausente a intensa. 46 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados Já no grupo LB, observou-se o mesmo padrão de marcação de queratinócitos observado nos grupos acima descritos, variando de moderada a intensa durante toda a cinética. Na derme, a intensidade de marcação variou de discreta a intensa, sendo observada na hipoderme oscilação da intensidade de ausente a intensa. Resultados encontrados no grupo LBSap em relação aos queratinócitos e à derme, demonstraram intensa marcação em todos os tempos da cinética. Na hipoderme, a intensidade variou de moderada a intensa (Figura 5). Interessantemente, observamos no grupo CS imunorreatividade em relação ao queratinócitos, variando de discreta a intensa. Essas marcações também foram observadas na derme e hipoderme com intensidade variando de ausente a intensa. Houve também marcação nas glândulas presentes, fibroblastos e células endoteliais em todos os grupos analisados. Como observado nos resultados supracitados, a intensidade de marcação variou dentro do mesmo grupo demonstrando perfil heterogêneo que poderia refletir a diferença na maturidade de células recém-migradas para o local do inóculo após estímulos vacinais. 6.7 - Análise quantitativa da marcação da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) na pele de cães inoculados com diferentes componentes Buscando ampliar o estudo da cinética do infiltrado inflamatório utilizando a vacina LBSap e seus constituintes bem como do extrato de glândula salivar de Lu. Longipalpis foi empregada a análise de imagem para um estudo quantitativo dos níveis de iNOS na pele dos cães. A avaliação longitudinal da produção da iNOS revelou um aumento (P<0.05) nos grupos Sap (1258±264) e LBSap (1304±289,8) no tempo de 12 horas p.i. em relação ao tempo inicial de 1 hora p.i. (353,3±52,75-Sap e 306,8±6,445-LBSap). Na análise comparativa entre grupos observou-se que o grupo LB (496,7±163,6) apresentou aumento na área marcada para iNOS no tempo de 1 hora (P<0.05) quando comparado ao grupo CS (117,4±86,99). Em 12 horas p.i., tanto o grupo Sap (1258±264) como LBSap (1304±289,8) apresentaram áreas marcadas para iNOS maiores (P<0.05) em relação aos grupos CS (269,6±170,5), Sal (613,5±189,3) e LB (376,6±68,23). No tempo de 24 horas, o grupo LBSap (1166±366,4) manteve o aumento (P<0.05) de área marcada para iNOS quando comparado aos grupos CS (146,9±136,5) e LB (454,4±238,3). De forma similar, no tempo de 48 e 96 horas p.i. foi observado aumento (P<0.05) da área marcada para iNOS no grupo LBSap (1028±142,9 e 1022±416,9) quando comparado aos grupos CS (130,2±12,38 e 68,35±46,16), Sal (468,2±161,4 e 205,2±93,07) e LB (438,3±89,87 e 346±280,8). Além disto, de maneira semelhante ao grupo LBSap, o grupo Sap (1157±357) apresentou aumento (P<0.05) da área marcada para iNOS 47 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados no tempo final de 96 horas em relação aos grupos CS (68,35±46,16), Sal (205,2±93,07) e LB (346±280,8). Os resultados referentes a análise quantitativa da enzima iNOS estão representados no Gráfico 14. 2000 a a Área marcada (mm2) 1000 0 1h 2000 1h 12h 24h 12 h 48h 96h 24 h 48 h 96 h 1000 0 CS Sap Sal LB LBSap Tempo Gráfico 14: Análise da área marcada pela enzima iNOS na pele de cães inoculados com diferentes componentes: CS (controle salina), Sap (saponina), Sal (extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis), LB (antígeno de L. braziliensis) e LBSap (antígeno de L. braziliensis associado a saponina). As análises foram realizadas nos tempos de 1, 12, 24, 48 e 96 horas p.i. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. No Gráfico de cinética, a diferença estatística está representada pela letra “a” referente ao tempo de 1 hora p.i. As diferenças significativas (P<0.05) da análise comparativa entre os grupos estão demonstradas pelas linhas. 48 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 1h 12 h 96 h 50 µm 50 µm Derme 50 µm A 50 µm C 50 µm Hipoderme 50 µm B D 25 µm E 50 µm F 50 µm I 25 µm G H J Figura 5: Fotomicrografia da IMH para detecção da enzima iNOS na derme e hipoderme de cães imunizados com LBSap. Nessa figura está representada a intensa área marcada pela enzima iNOS neste grupo nos tempos de 1, 12 e 96 horas p.i na derme e hipoderme (A – F, aumento de 40x, barra: 50 µm); em G, neutrófilos iNOS-positivo (aumento 100x, barra: 25µm) do grupo Sap; em H-J, controle negativo da reação. 49 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados 6.8 - Correlações entre o número de núcleos de núcleos de células e área marcada pela enzima iNOS na derme e hipoderme Foi realizada análise de correlação entre a expressão da enzima iNOS e número de núcleos de células nos diferentes grupos experimentais, onde observou-se na derme correlação positiva entre número de núcleos de células totais presentes derme e área marcada pela enzima iNOS no grupo Sap (P = 0.0265 e r = 0.6924). Já na hipoderme, verificou-se correlação positiva entre número total de núcleos de células e área marcada da pela enzima iNOS no grupo LBSap (P=0.0427 e r=0.5683). Nos demais grupos não houve correlações entre esses parâmetros avaliados (Gráfico 15). Derme Número de núcleos/1,5x106 µm2 400 Sap Hipoderme 1000 LBSap 500 200 P=0.0427 P=0.0265 r=0.6924 0 0 1000 r=0.5683 0 2000 Área marcada pela 0 iNOS/ 1,5x106 1000 2000 µm2 Gráfico 15: Correlação entre o número de núcleos totais e área marcada pela enzima iNOS na derme e hipoderme. Neste Gráfico está demonstrada a associação positiva nos grupos Sap ( ) e LBSap ( ) na derme e hipoderme, respectivamente, bem como os valores de P e r (correlação de Pearson). 6.8.1 - Correlações na derme superior Utilizando-se o teste de Pearson, foi possível verificar algumas correlações na derme superior. Neste sentido, o grupo Sal apresentou correlação negativa entre o percuntual de neutrófilos e a área marcada pela enzima iNOS (P=0.0476 e r=-0.6072) e entre neutrófilos e número de núcleos de células (P=0.0289 e r=-0.6277). Observou-se nesse grupo correlação positiva entre macrófagos e área marcada pela enzima iNOS (P=0.0024 e r=0.8113). 50 VITORIANO-SOUZA, J. Resultados Nesta camada, pôde-se notar ainda, associação positiva no grupo LB entre o percentual de macrófagos e área marcada pela enzima iNOS (P=0.0445 e r=0.5876). Os resultados referentes as correlações na derme superior estão representados no Gráfico 16. 6.8.2 - Correlações na derme profunda As correlações observadas na derme profunda estão representadas no Gráfico 17. No grupo Sal, como demonstrado acima na derme superior, verificou-se correlação negativa entre o percentual de neutrófilos e o número de núcleos de células (P=0.0446 e r=-0.5434). No grupo Sap notou-se correlação positiva entre eosinófilos e número de núcleos celulares (P=0.0402 e r=0.5742). No grupo LBSap observou-se correlação entre o percentual de macrófagos e a área marcada pela enzima iNOS (P=0.0346 e r=-0.5880). Na hipoderme não foi observada nenhuma correlação significativa. 51 VITORIANO-SOUZA, J. 100 SAL Resultados 100 P=0.0476 LB r=-0.6072 50 50 P=0.0445 0 0 500 1000 iNOS 100 SAL P=0.0289 macrófagos (%) Neutrófilos (%) r=0.5876 0 0 500 1000 iNOS 100 SAL r=-0.6277 50 50 P=0.0024 r=0.8113 0 0 100 0 200 0 500 1000 iNOS Número de núcleos Gráfico 16: Correlações na derme superior. Neste Gráfico estão representadas as correlações no grupo Sal ( ): neutrófilos (%) x área marcada pela iNOS; neutrófilos (%) x número de núcleos; macrófagos (%) x área marcada pela enzima iNOS. No grupo LB ( ), associação entre macrófagos (%) x área marcada pela enzima iNOS. Os valores de P e r estão demonstrados no gráfico (correlação de Pearson). 52 VITORIANO-SOUZA, J. 20 P=0.0446 SAL r=-0.5434 Eos inófilos (%) Ne utrófilos (%) 100 Resultados 50 0 0 100 P=0.0402 r=0.5742 10 Sap 0 200 200 0 400 Número de núcle os Macrófagos (%) 100 P=0.0346 r=-0.5880 LBSap 50 0 1000 0 2000 iNOS Gráfico 17: Correlações na derme profunda. Neste Gráfico estão representadas as correlações existentes no grupo Sal ( ): neutrófilos (%) x número de núcleos; no grupo LBSap ( ): macrófagos (%) x área marcada pela enzima iNOS; no grupo Sap ( ) eosinófilos (%) x número de núcleos. Os valores de P e r estão demonstrados no gráfico (correlação de Pearson). 53 7 - Discussão VITORIANO-SOUZA, J. Discussão A Leishmaniose Visceral (LV) é uma das mais relevantes e importantes doenças parasitárias (WHO, 2005) em expansão em diversas regiões do mundo (Enserink, 2000). O caráter emergente e re-emergente dessa protozoonose deve-se a diversas falhas no controle de reservatórios e vetores, a associação do parasito às infecções oportunistas tais como a AIDS (Badaró et al., 1986; Altes et al., 1991; Gradoni et al., 1993), bem como aos recentes relatos da seleção de cepas resistentes a drogas. Um dos pontos fundamentais do controle da LV preconizado pela OMS e pelo Ministério da Saúde do Brasil (2003) baseia-se na eutanásia dos cães infectados, uma vez que o tratamento com drogas utilizadas com sucesso em casos humanos como glucanato antimonial de sódio ou stiboglucanato de sódio mostra baixa eficácia em cães (Alencar, 1959; Alvar et al., 1994; Baneth & Shaw, 2002; Noli & Auxilia, 2005). Todavia, a eliminação desses cães nem sempre é aceita por razões éticas e sociais (Desjeux, 2004). Diante dessas dificuldades, a imunoprofilaxia pode ser empregada como uma alternativa promissora para a prevenção da LV, atuando no sentido de diminuir a incidência dos casos caninos e conseqüentemente, da doença humana (Marzochi et al., 1985; Genaro, 1993; Hommel et al., 1995; Genaro et al., 1996a; Gradoni, 2001; Handman, 2001; Desjeux, 2004; Ravindran & Ali, 2004; Requena et al., 2004). Até o momento diversas vacinas anti-LVC utilizando diferentes antígenos e adjuvantes foram testadas no Brasil, sendo algumas delas com resultados muito promissores (Genaro et al., 1996; Mayrink et al.,1996; Palatnik et al., 1990; Palatnik de Sousa et al., 1994a; Palatnik de Sousa et al.,1994b; Da Silva et al., 2001; Borja-Cabrera et al., 2002; Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008a; Giunchetti et al., 2008b). Buscando o desenvolvimento de uma vacina eficaz e segura, nosso grupo de pesquisa vem estudando dois novos imunobiológicos contra LVC. Os resultados obtidos demonstraram que estas vacinas (LBSap e LBSapSal) apresentam forte capacidade indutora de imunogenicidade estimulando altos níveis de isotipos IgG anti-Leishmania (IgG1 e IgG2) e de linfócitos, particularmente linfócitos T CD8+ circulantes e linfócitos T CD8+ L. chagasi- específicos in vitro. Além disto, outros fatores demonstraram que estes imunobiológicos induzem uma resposta imune compatível com o controle efetivo do agente etiológico da LVC, tais como intensa atividade linfoproliferativa L. chagasi-específica e aumento da produção de NO durante a estimulação in vitro por antígenos solúveis de L. chagasi (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008a). É importante ressaltar que nestes estudos foram observadas alterações no local do inóculo vacinal, quando a saponina foi utilizada como adjuvante ou quando associada aos antígenos vacinais. No entanto, estas alterações 56 VITORIANO-SOUZA, J. Discussão apresentaram-se brandas, e as vacinas LBSap e LBSapSal foram consideradas seguras para utilização em cães. A avaliação das alterações no local do inóculo vacinal através dos aspectos anatomopatológicos (macroscópicos) como formação de edema e úlceras, ou pelos aspectos histopatológicos e/ou imunopatológicos como produção de NO, dosagem de citocinas e quimiocinas representam biomarcadores importantes para análise da inocuidade vacinal e da imunogenicidade no contexto da resposta imune inata que ocorre in situ, ou seja, no local da vacinação. A compreensão destes eventos nos permitirá em breve propor um novo protocolo de pré-testes para selecionar futuros potenciais candidatos vacinais e a conduzir os ensaios de fase I e II, no sentido de prosseguir para os ensaios clínicos de campo. Desta forma, Sesardic (2006) propõe a avaliação de estudos pré-clínicos para a identificação da melhor composição vacinal, que se apresente inócuo e segura, como controle de qualidade adicional para o desenvolvimento de candidatos vacinais. Neste sentido, o presente estudo buscou avaliar o processo inflamatório induzido por antígenos e adjuvantes vacinais no local do inóculo durante uma cinética incluindo os tempos de 1, 12, 24, 48 e 96 horas. Considerando, que a imunidade contra agentes infecciosos requer a ação orquestrada de componentes da imunidade inata e adaptativa, o estudo do recrutamento celular torna-se muito relevante, uma vez que o número de células e a composição do infiltrado celular no estágio inicial depois do estímulo influenciarão futuras respostas e o desenvolvimento de uma resposta imune adquirida (Teixeira et al., 2005). Embora muitos pesquisadores concentram esforços na análise do perfil de citocinas da reação inflamatória (Cohen, 1976; Dunn et al.,1989; Berg et al., 1995), o estudo do perfil celular apresenta grande importância, visto que é indicador do processo inflamatório local e implica diretamente no perfil de citocinas presentes nesse microambiente (Stwart et al., 1984; De Souza, 2000). Neste sentido, importantes trabalhos realizados por Tafuri (1992) e Tafuri et al., (1993) buscaram avaliar a cinética celular por meio do perfil histopatológico da intradermorreação de Montenegro (IRM) na pele de cães procedentes de áreas endêmicas para Leishmaniose Tegumentar. Estes autores, avaliaram a cinética de aspectos histopatológicos em diferentes tempos (6, 12, 24, 48 e 72 horas, 7 e 14 dias) após a inoculação de dois antígenos Leishvacin® e P10.000G. Neste estudo, foi observado que em 24 horas, ocorre um infiltrado inflamatório discreto composto por neutrófilos, e subseqüentemente, após 48 e 72 horas, composto principalmente por intenso infiltrado de células mononucleares, com declínio da intensidade da reação após 7 e 14 dias do inóculo. É importante ressaltar que os trabalhos realizados por Tafuri 57 VITORIANO-SOUZA, J. Discussão (1992) e Tafuri et al., (1993) assemelham-se a nosso trabalho considerando o modelo experimental utilizado, mas difere em relação à região onde foram realizados os inóculos. No presente estudo decidiu-se pela realização dos inóculos na região dorsal em primeiro lugar porque a drenagem linfática da região abdominal é extremamente heterogênea e em segundo lugar para evitar o contato direto com a baia, o que poderia, eventualmente, interferir no experimento. Adicionalmente, Moreira (2008) ao avaliar a cinética de migração celular na derme de hamsters inoculados com componentes antigênicos das vacinas LBSap e da Leishmune®, observou intenso infiltrado celular promovido pelo adjuvante saponina e pela vacina Leishmune® em relação ao grupo controle (salina). De forma interessante, esse aumento não foi observado no grupo LBSap sugerindo que nesse modelo, o antígeno de Leishmania atuaria na modulação da resposta da saponina. Esses antígenos promoveram recrutamento seletivo de populações celulares no grupo saponina onde houve migração precoce (1, 12 e 24 horas) e persistente (88, 96 e 168 horas) de macrófagos e diminuição de neutrófilos no tempo tardio (168 horas) associado ao aumento de linfócitos (96 e 168 horas), reforçando o papel do adjuvante saponina na indução do tráfego celular conforme sugerido por Kensil (1996). Sendo assim, buscando ampliar o entendimento de como antígenos e adjuvantes vacinais poderiam induzir resposta imune, torna-se importante avaliar no modelo cão potenciais vacinas contra LVC para minimizar possíveis variações em decorrência das particularidades das respostas observadas entre diferentes modelos experimentais (Gradoni, 2001). Desse modo, nós decidimos analisar os eventos da resposta imune celular “recentes” como a migração celular e expressão da enzima iNOS, induzidos pelos componentes antigênicos da vacina LBSap, usando a região dorsal de cães como modelo experimental de vacinação intradérmica. Os resultados obtidos através das observações macroscópicas demonstraram apenas inchaço local após o inóculo com Sap e LBSap, sugerindo o envolvimento de inflamação aguda local em resposta ao adjuvante saponina, importante para desencadear resposta imune específica (Jancar, 2001). No entanto, o fato dessas alterações não evoluírem para lesões ulceradas, nos permite inferir que a saponina sozinha ou associada ao antígeno não apresenta alterações significativas no local do inóculo, mostrando-se segura para ser empregada como adjuvante vacinal. Giunchetti et al. (2007) também observaram resultados similares em cães vacinados com LBSap demonstrando que a vacina é bem tolerada, bem como o adjuvante saponina. Outros estudos com adjuvantes, como BCG usados em vacinas humana e canina anti-Leishmania (Mayrink et al., 1996; Giunchetti et al., 2008b), também relatam fortes reações inflamatórias, muitas vezes associadas com lesões cutâneas ulceradas, responsáveis pelo recrutamento inicial 58 VITORIANO-SOUZA, J. Discussão de células inflamatórias. Parra et al. (2007), ao analisarem a toxicidade e inocuidade da Leishmune® observaram que as principais reações notificadas como dor, anorexia e inchaço local foram moderadas, indicando que a vacina foi bem tolerada e todos os efeitos foram espontaneamente revertidos, antes da imunização subseqüente. Algumas observações histopatológicas como edema, hemorragia e congestão foram verificadas em maior intensidade nos grupos Sap e LBSap. Essas reações locais são observadas freqüentemente em imunizações vacinais com este adjuvante e podem variar de acordo com a pureza da saponina utilizada (Kensil, 1996). Em um trabalho utilizando inóculo de 1 mg de saponina pela via subcutânea em ovelhas, observou-se reações inflamatórias variando de moderadas a intensas com edema e duração do evento por volta de 2 a 3 dias (Houdayer et al.,1978). No presente estudo, alterações discretas foram observadas em biópsias de pele de cães inoculados apenas com Sal e LB nos tempos de 12 e 24 horas p.i. Estas alterações podem ser resultantes da própria imunização que induziu um discreto processo inflamatório associado ao aumento da permeabilidade vascular no local. Provavelmente estas alterações foram menos intensas em função da ausência do adjuvante saponina nestes grupos. De forma interessante, a quantificação do infiltrado celular na derme através da morfometria por análise de imagem revelou que o adjuvante saponina apresenta papel importante para o recrutamento celular nos tempos de 1, 12, 24 e 96 horas p.i. na derme de cães, representado pelo aumento do número de células no infiltrado inflamatório no grupo Sap. Esses resultados estão de acordo com outros estudos, que descrevem o papel de saponina na modulação da resposta imune celular, no aumento da produção de anticorpos, em reações imunes não específicas como a inflamação e também no tráfego celular (de Oliveira et al., 2001; Kensil, 1996). Nos demais grupos, não foram observadas diferenças quando se avaliou a derme. Na hipoderme, o aumento do número de células observado nos grupos Sap e LBSap revelou ser maior em relação a derme, possivelmente, devido à maior vascularização desta camada. Em nosso estudo, observamos aumento do infiltrado celular na hipoderme de cães dos grupos Sap e LBSap nos tempos de 12, 24 e 48 horas quando comparados com CS, Sal e LB. Além disto, o grupo Sap apresentou aumento do infiltrado celular nos mesmos tempos (12, 24 e 48 horas) quando comparado ao grupo LBSap. Adicionalmente, no tempo de 1 hora, o grupo Sap apresentou aumento do infiltrado celular em relação aos grupos CS, e em 96 horas, aumento em relação aos grupos CS e Sal. Durante toda a cinética, o grupo Sap induziu maior recrutamento celular em relação ao grupo LBSap. Novamente, esses resultados corroboram para o papel do adjuvante saponina no tráfego celular em direção ao local do inóculo. Além disto, é possível 59 VITORIANO-SOUZA, J. Discussão especular que há uma modulação no recrutamento celular em alguns tempos da cinética, quando associado o antígeno de L. braziliensis ao adjuvante saponina. Uma vez que se observou o aumento do infiltrado celular, acionado pelos componentes antigênicos vacinais, durante diversos momentos da cinética, decidiu-se avaliar também qual seria o perfil de células recrutadas nas diferentes camadas da pele (derme superior, derme profunda e hipoderme). Na derme superior, foi observado maior recrutamento de neutrófilos no grupo Sap, enquanto nos grupos Sap e LBSap houve aumento de linfócitos associado à redução de macrófagos. Já na derme profunda, maior recrutamento de neutrófilos no grupo Sap e redução de macrófagos nos grupos LBSap; e na hipoderme, maior recrutamento de neutrófilos e redução de macrófagos nos grupos Sap e LBSap e aumento de migração de eosinófilos no grupo Sal. De modo geral, encontramos um perfil bem semelhante nos grupos Sap e LBSap com aumento de neutrófilos e linfócitos em alguns tempos da cinética e queda de macrófagos quando comparado aos demais grupos, no entanto, verificamos também na análise longitudinal de eosinófilos, um importante aumento nos últimos tempos no grupo Sap na derme profunda e hipoderme e no grupo LBSap na derme superior e profunda. Esses resultados nos permitiram verificar e destacar a participação de neutrófilos na resposta imune inata induzida por vacina e adjuvantes. Esta hipótese ganha força, considerando os diversos estudos em que tem sido discutido o papel de neutrófilos como um tipo celular com funções mais complexas que simples células fagocitárias, demonstrando seu papel na determinação da resposta imune e cooperação com outros tipos celulares para melhorar a resposta efetora do sistema imune (Appelberg, 2006). Similar a esses resultados, em trabalhos realizados por Moreira (2008) em nosso laboratório, utilizando-se o modelo hamster, verificou-se aumento de neutrófilos circulantes no grupo inoculado com saponina, sugerindo o papel de neutrófilos durante o processo de imunização. Além disto, trabalhos recentes têm mostrado o papel de neutrófilos na imunidade adquirida como célula apresentadora de antígenos para linfócitos T virgens (Beauvillain et al., 2007), uma vez que neutrófilos seriam as primeiras células a migrarem, em grande quantidade para o local da infecção. Assim, eles poderiam se acumular precocemente no local da infecção, antes das células dendríticas e macrófagos, e poderiam interagir com células T CD8+ antes das células dendríticas (Beauvillain et al., 2007). De fato, tem sido descrito, o importante papel da utilização de saponina como adjuvante na indução de células T CD8+ (Kensil, 1996; BorjaCabrera, 2004; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008a) e, neste contexto, os neutrófilos poderiam ter uma importante contribuição. É importante ressaltar ainda, que outros autores sugerem que neutrófilos poderiam atuar de forma indireta na apresentação de antígenos bem 60 VITORIANO-SOUZA, J. Discussão como no recrutamento de outros tipos celulares tais quais as células T, monócitos, macrófagos e células dendríticas imaturas, por meio de produção de quimiocinas (Scapini et al., 2000). A comunicação entre neutrófilos e células dendríticas imaturas poderia resultar na maturação das últimas, e assim no aumento da capacidade de apresentação de antígenos e proliferação das células T (Appelberg, 2006). Considerando o exposto e os resultados obtidos neste trabalho, é possível hipotetizar que os neutrófilos estariam exercendo um papel altamente relevante na linha de frente da resposta celular imediata decorrente do processo de imunização e, orquestrando as demais células a migrarem após algumas horas para o local do inoculo, participando efetivamente do início da resposta adaptativa. Desta maneira, os neutrófilos poderiam apresentar um papel importante no direcionamento da resposta imune através da produção de quimiocinas. Após ativação, estas células produziriam diversas quimiocinas (IL-8, GRO-α, MIP-1α e β) que atuariam em receptores de células tipo 1. Desta forma, tem sido relatado que os neutrófilos, através da secreção de quimiocinas, induziriam uma polarização para a resposta de células tipo 1, pela atração preferencial desse tipo celular para o local do inóculo (van Gisbergen et al., 2005). Sendo assim, novas abordagens para o estudo de vacinas baseadas na indução de linfócitos T citotóxicos, através do uso preferencial de adjuvantes que favoreçam o recrutamento seletivo de neutrófílos seriam muito relevantes. A avaliação cinética longitudinal realizada neste trabalho revelou aumento de eosinófilos nos grupos Sap e LBSap nos tempos finais (48 e 96 horas). Este aumento sugere que a imunização com estes antígenos possa ter gerado um perfil de reposta mista tipo1/tipo2 e nos permite hipotetizar que essas células, juntamente com os neutrófilos participariam efetivamente na resposta inata e no direcionamento da resposta específica para o local da imunização. De fato, tem sido proposto que a imunização com as vacinas LBSap ou LBSapSal em cães, induziriam um perfil de resposta imune humoral compatível com uma resposta mista do tipo 1 e tipo 2 (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008a). De forma interessante, Moreira (2008) não relatou nenhuma alteração na contagem desse tipo celular, sugerindo que a ausência de diferença nesse trabalho deve-se aos distintos modelos avaliados, sendo um em cão e outro em hamster, que em muito diferem quanto ao tipo de resposta. Um interessante estudo realizado por Pearson et al. (1987) demonstrou que eosinófilos apresentam capacidade microbicida frente a Leishmania. Esses resultados sugerem que a ativação de eosinófilos em microambientes contendo IFN-γ levaria a estimulação da produção de vários mediadores inflamatórios. Assim, o recrutamento de eosinófilos observado poderia representar um mecanismo leishmanicida adicional que compensaria a ausência do envolvimento 61 VITORIANO-SOUZA, J. Discussão precoce de macrófagos (Beil et al., 1992; Oliveira et al., 1997 e 1998; Watanabe et al., 2004). Em camundongos BALB/c, os neutrófilos são as células predominantes nos primeiros três dias após infecção por Leishmania, acompanhados de um discreto infiltrado de eosinófilos (Andrade et al., 1984; Beil et al., 1992). Após análise histopatológica, observou-se a presença de parasitos íntegros e destruídos no interior de neutrófilos e também de eosinófilos, sugerindo a participação destas células no controle inicial da infecção por Leishmania (Lima et al., 1998). Em relação a queda percentual de macrófagos, poderíamos associá-la ao intenso recrutamento inicial de neutrófilos, células mais prevalentes da inflamação aguda (Terui et al., 2000) e não à inibição da migração dessas células pelos componentes antigênicos, visto que os macrófagos são células importantes na apresentação antigênica em vacinas que utilizam saponina (Kensil, 1996). Sendo assim, a presença desses dois tipos celulares no mesmo infiltrado nos permite sugerir que esteja ocorrendo cooperação entre macrófagos e neutrófilos. Neutrófilos apoptóticos seriam fagocitados por macrófagos e assim transfeririam seus componentes microbicidas, contribuindo para o aumento da apresentação antigênica (Appelberg, 2006). Soehnlein et al. (2007) demonstraram que os produtos secretados por neutrófilos disparam uma resposta ativa em monócitos e macrófagos que aumentam funcionalmente, a capacidade fagocitária e a formação de radicais reativos de oxigênio. Estes fenômenos sugerem que esse mecanismo contribuiria para estimular as funções dos macrófagos na imunidade inata. Estudos recentes, realizados em nosso laboratório no modelo hamster, observaram que a saponina promove um recrutamento precoce e persistente de macrófagos e que os demais grupos vacinais demonstram uma manutenção dos níveis normais desta população celular (Moreira, 2008). Esses resultados diferem dos nossos apresentados acima, onde em alguns tempos, observamos redução dessa população no período inicial da cinética avaliada. Talvez essas diferenças possam ser explicadas pelo fato de que, no cão, houve um recrutamento superior de neutrófilos em detrimento dos outros tipos celulares. Além disto, o aumento de linfócitos nos tempos de 24 horas dos grupos Sap e LBSap e em 48 horas no grupo LBSap na derme superior, demonstra mais uma vez, o papel do adjuvante saponina agindo de forma rápida e efetiva no recrutamento celular para o local do inóculo (Kensil, 1996). A co-participação dessas células da imunidade adaptativa em conjunto com a resposta inata foi recentemente descrita por Berg & Forman (2006). Este seria um mecanismo adicional, uma vez que os linfócitos T CD8+ produziriam IFN-γ através da interação com citocinas IL-12 e IL-18, independente do mecanismo de interação TCR-MHC, e desse modo, atuariam na destruição de células infectadas, participando do controle de vários tipos de infecção e inicialização da resposta específica (Berg & Forman, 2006). A presença de linfócitos T CD4+ 62 VITORIANO-SOUZA, J. Discussão também é crucial, uma vez que produzem IFN-γ ativando macrófagos, aumentando a capacidade microbicida e produção de citocinas que atuarão na indução da resposta adaptativa e no controle da infecção por Leishmania (Bittar et al.,2007). Esses resultados corroboram com os de Moreira (2008) onde também houve envolvimento desse tipo celular no grupo LBSap, embora no cão esse recrutamento tenha sido mais precoce (24 e 48 horas) que no modelo hamster (96 e 168 horas). Rezende (2003), utilizando a análise por citometria de fluxo, mostrou que adjuvantes associados a uma vacina anti-rábica inoculada através de uma bolha de ar no dorso de camundongos Swiss foram capazes de promover recrutamento intenso de neutrófilos, de macrófagos e de linfócitos nos tempos de 24 e 72 horas, importante para o estabelecimento da resposta específica. Diante do exposto, podemos inferir que o recrutamento seletivo de linfócitos principalmente linfócitos T CD8+ produtores de IFN-γ iriam contribuir para uma resposta imune protetora contra LVC. É importante notar que o grupo inoculado apenas com extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis apresentou recrutamento similar ao observado com inóculo de salina, tanto na derme quanto na hipoderme. Em estudos com camundongos BALB/c, verificou-se um infiltrado celular inflamatório compreendido por neutrófilos, macrófagos e eosinófilos depois de repetida exposição a picadas de Lu. longipalpis. Adicionalmente, observaram que inóculos de extrato de glândula salivar em animais não expostos induzia um recrutamento similar aos animais inoculados com salina (Silva et al., 2005). O maior recrutamento de eosinófilos observado no inóculo do grupo Sal sugere o desenvolvimento de uma resposta do tipo 2 importante para criar um microambiente que permita o estabelecimento de parasitos do gênero Leishmania na infecção natural. Entretanto, de forma interessante, alguns autores relatam que indivíduos expostos a sucessivas picadas de insetos apresentam um perfil de resposta mista (tipo 1/tipo 2), onde a resposta imune do hospedeiro seria iniciada com uma resposta DTH positiva e posteriormente, predominaria uma resposta de hipersensibilidade imediata até seu desaparecimento (Silva et al., 2005). Belkaid et al. (1998), demonstram o surgimento de proteção resultante da pré-exposição ao extrato de glândula salivar de Phlebotomus papatasi, já observada em habitantes de áreas endêmicas para leishmanioses. O grupo LB também não promoveu intenso recrutamento celular, demonstrando a importância da utilização concomitante de um adjuvante para melhorar a imunogenicidade desse antígeno no local do inóculo vacinal. 63 VITORIANO-SOUZA, J. Discussão Outra questão importante levantada neste trabalho seria se o recrutamento dessas células inflamatórias poderia contribuir para o desenvolvimento de um microambiente favorável ao desenvolvimento de uma resposta eficaz contra futuras infecções por Leishmania. Nos últimos anos, trabalhos mostraram que a expressão de iNOS após inflamação ou infecção (Nathan & Xie, 1994 a, b) é bem caracterizada e aceita como componente chave da resposta adaptativa a estímulos estranhos ou patógenos virulentos e este aumento de NO relaciona-se ao controle da infecção por parasitos do gênero Leishmania (Hall & Titus, 1995). Desse modo, avaliamos a expressão da enzima iNOS na pele de cães imunizados com diferentes componentes antigênicos. A análise semiquantitativa demonstrou que ocorre expressão da enzima em todos os grupos, incluindo o CS, nas diferentes camadas da pele. Esses resultados nos permitem inferir que todos os estímulos foram capazes de aumentar a expressão da enzima iNOS, contribuindo para a produção de NO, participando desde processos de resposta não-específica até na modulação da resposta imune (Bogdan, 2001). A expressão de iNOS no grupo controle salina sugere a participação do NO na fisiologia da pele normal. Esses resultados corroboram com os trabalhos de Shimizu et al. (1997) que observaram marcação pela enzima iNOS em queratinócitos de pele normal de humanos, que poderia ser importante no controle da proliferação dos queratinócitos. Outra possível justificativa para a presença de iNOS na pele normal poderia ser devido a exposição de animais aos raios ultra-violeta (UV) (Kuhn et al., 1998), uma vez que os animais são de uma região tropical. Uma outra abordagem adotada neste estudo teve como objetivo realizar a quantificação da área marcada pela enzima iNOS. Neste sentido, foi observado no tempo inicial de 1 hora, maior área marcada pela iNOS no grupo LB. Este resultado pode ser justificado pela presença de macrófagos recrutados por este estímulo, considerados grandes produtores de NO, na derme superior. Os grupos Sap e LBSap apresentaram maior área marcada em relação aos demais grupos, sendo que esse aumento observado foi significativo a partir de 12 horas até o tempo final em LBSap e no grupo Sap nos tempos de 12 e 96 horas. As maiores produções de iNOS nesses grupos provavelmente estão relacionadas ao grande número de células recrutadas para o local, que uma vez ativadas, produziriam grandes quantidades de NO para a erradicação do parasito. Além disto, esses resultados também são demonstrados nas correlações entre número de núcleos e expressão de iNOS nos grupos Sap e LBSap na derme e hipoderme. É importante ressaltar que a enzima iNOS é expressa em uma variedade de tipos celulares, incluindo macrófagos, neutrófilos e fibroblastos em resposta a uma variedade de estímulos tais como citocinas e LPS (Liew, 1997). Vários trabalhos têm demonstrado que citocinas do tipo 1 como IFN-γ, TNF-α e IL-18 induzem a expressão de iNOS (Liew & 64 VITORIANO-SOUZA, J. Discussão O’Donnell, 1993; Bogdan et al.,1993), enquanto, citocinas do tipo 2 (IL-4, IL-13 e IL-10) diminuem a atividade leishmanicida em modelo murino e em humanos por regularem negativamente a expressão de iNOS (Vouldoukis et al., 1997). Considerando essas afirmações, algumas ponderações são importantes para tentar explicar as principais correlações entre a iNOS e os tipos celulares (%). Neste sentido, na derme superior, os grupos Sal e LB apresentaram correlação positiva entre o percentual de macrófagos e a área marcada pela iNOS, sugerindo que estes estímulos ativariam os macrófagos para produção de NO. No entanto, é importante ressaltar que alguns trabalhos demonstraram claramente que componentes da saliva de Lu. longipalpis, como o “maxadilan”, inibem a produção de NO (Hall & Titus, 1995), peróxido de hidrogênio (H2O2) (Titus & Ribeiro, 1990) e apresentação de antigênica por macrófagos (Theodos & Titus, 1993). Entretanto, devemos considerar que a saliva dos fleblótomos possui um amplo repertório de moléculas farmacologicamente ativas que interferem com a homeostase, inflamação e resposta imune (Titus & Ribeiro, 1990). Desse modo, essas moléculas poderiam atuar na ativação de macrófagos e assim, disparariam uma resposta imune específica contra esses antígenos. Valenzuela et al. (2002) hipotetizaram que proteínas salivares de P. papatasi (como por exemplo, PpSP15) poderiam induzir uma resposta DTH e macrófagos ativados liberariam radicais de oxigênio, NO e IL-12, atuando como microbicidas em parasitos do gênero Leishmania. Adicionalmente, as correlações negativas no grupo Sal entre iNOS e a população de neutrófilos, bem como entre neutrófilos e o número de núcleos presentes no local do inóculo, sugerem que o extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis não foi capaz de induzir uma resposta inflamatória aguda com presença de neutrófilos. Como mencionado anteriormente, a importância da atuação destas células nos mecanismos adicionais de resistência, como por exemplo na participação da elaboração de uma resposta imune do tipo 1, a baixa capacidade indutora de neutrófilos na presença de extrato salivar de Lu. longipalpis, poderia refletir em uma maior susceptibilidade a infecção por Leishmania (Charlab et al.,1999; Cavalcante et al., 2003; Titus et al., 1988). Na derme profunda, verificou-se que além da correlação negativa no grupo Sal entre neutrófilos e o número de células (inflamação), ocorreu também uma correlação positiva no grupo Sap, entre número de células e eosinófilos, sugerindo a contribuição destas células na resposta inata provocada pelo forte poder adjuvante da saponina. Alguns trabalhos descreveram que a atividade inicial de iNOS ocorre primariamente durante a resposta do tipo 1 e que em um tempo mais tardio atuaria no controle da resposta que 65 VITORIANO-SOUZA, J. Discussão poderia causar danos locais (Bogdan, 2001). Esses resultados nos permitem inferir que o adjuvante saponina (sozinho ou em associação com antígeno de L. braziliensis) induziria um microambiente no local do inóculo capaz de estimular a polarização do sistema imune para um perfil de resistência determinante do sucesso de vacinas contra LVC. Considerando que alguns patógenos infecciosos, como Leishmania, são capazes de inibir a expressão de iNOS, contribuindo para a limitada expressão inicial de iNOS durante a infecção (Nandan et al., 1999), a associação do antígeno de L. braziliensis com saponina parece ser muito promissora. O papel do NO em reações inflamatórias na pele é complexo, pois, em baixas doses possui propriedades pró-inflamatórias por induzir vasodilatação e recrutamento de neutrófilos, enquanto que em altas concentrações, regula negativamente a expressão de moléculas de adesão, suprime ativação e induz apoptose de células inflamatórias (Ross et al., 2001). Desse modo, o NO participaria do balanço de resposta tipo 1/tipo 2. Esses altos níveis de NO observados nos grupos imunizados com saponina poderiam estar relacionados aos altos níveis de citocinas tipo 1 (IFN-γ e TNF-α) (Kaim et al., 2006), fundamentais para a ativação de mecanismos efetores, como produção de NO para o controle de parasitos do gênero Leishmania. De maneira geral, os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a vacina LBSap, bem como o adjuvante saponina, isoladamente foram capazes de induzir um intenso infiltrado celular na pele de cães, necessário para os eventos iniciais de apresentação antigênica. Além disto, este trabalho mostrou que estes componentes são seguros, uma vez, que não evoluíram para lesões ulceradas locais em todos os tempos da cinética. O recrutamento seletivo de neutrófilos e a intensa área marcada pela enzima iNOS provocados por Sap e LBSap produziu um perfil que se assemelha ao observado em resistência a infecções por Leishmania. 66 8 – Conclusões VITORIANO-SOUZA, J. Conclusões Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o adjuvante saponina e a vacina LBSap mobilizam uma forte reação inflamatória no local do inóculo ativando os mecanismos da imunidade inata e adaptativa, importantes nos processos de apresentação de antígenos contribuindo para a eficiência da imunização. Além disto, os grupos Sap e LBSap induziram apenas um pequeno edema local, demonstrando-se seguras e inócuas. O microambiente formado pelo recrutamento diferencial das células (neutrófilos, linfócitos e eosinófilos) e aumento da expressão da enzima iNOS induzidos por LBSap e Sap permite o estabelecimento de uma resposta inata capaz de direcionar uma resposta adaptativa eficaz contra futuras infecções por L. chagasi. O recrutamento de eosinófilos pelo grupo Sal reforça o papel imunomodulador de proteínas da glândula salivar de Lu. longipalpis, fundamentais no estabelecimento da infecção por Leishmania. Estes resultados reforçam a importância de uma vacina que tenha proteínas de glândula salivar de Lu. longipalpis em sua composição de forma que haja bloqueio destas funções. De modo geral, este trabalho ressalta a importância do estudo de migração celular abrindo novas perspectivas na prospecção e testes de antígenos e adjuvantes vacinais no modelo cão. 68 9 - Referências Bibliográficas VITORIANO-SOUZA, J. Referências Bibliográficas ABRANCHES, P.; SANTOS-GOMES, G.; RACHAMIN, N.; CAMPINO, L.; SCHUNUR, L.R.; FAFFE, C.L. An experimental model for canine visceral leishmaniasis. Parasite Immunology. 13: 537-550, 1991. AFRIN, F. & ALI, N. Adjuvanticity and the protect immunity elicited by Leishmania donovani antigens encapsulated in positively charged liposomes. 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