Tagetes erecta L.UMA PLANTA DE MÚLTIPLOS PROPÓSITOS

1
Universidade Estadual do Ceará
Márcia Maria Mendes Marques Duque
Tagetes erecta L.UMA PLANTA DE MÚLTIPLOS
PROPÓSITOS: ANTIBACTERIANA, LARVICIDA E
ANTIVIRAL
FORTALEZA – CEARÁ
2006
2
Universidade Estadual do Ceará
Márcia Maria Mendes Marques Duque
Tagetes erecta L.UMA PLANTA DE MÚLTIPLOS
PROPÓSITOS: ANTIBACTERIANA, LARVICIDA E
ANTIVIRAL
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado Acadêmico em Ciências
Fisiológicas do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Estadual do
Ceará, como requisito para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências
Fisiológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Selene Maia de
Morais
FORTALEZA – CEARA
2006
3
D946t Duque, Márcia Maria Mendes Marques
Tagetes erecta L. Uma planta de múltiplos
propósitos: antibacteriana, larvicida e antiviral / Márcia Maria
Mendes Marques Duque. _Fortaleza, 2006.
90p.
Orientadora: Selene Maia de Morais
Dissertação (Mestrado Acadêmico em Ciências
Fisiológicas)-Universidade Estadual do Ceará, Centro de
Ciências da Saúde.
1. Tagetes erecta 2. Antiviral 3. Larvicida 4.
Antimicrobiana I. Universidade Estadual do Ceará, Centro de
Ciências da Saúde
CDD: 612
4
Universidade Estadual do Ceará
Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas
Título: Tagetes erecta L. uma planta de múltiplos propósitos:
antibacteriana, larvicida e antiviral.
Autora: Márcia Maria Mendes Marques Duque
Aprovada em ____ / ____ / ______
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Selene Maia de Morais
Orientadora
Profa. Dra. Maria Erivalda Farias de Aragão
Examinadora
Prof. Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento
Examinador
5
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6
AGRADECIMENTOS
À professora Dra. Selene Maia de Morais pela sua orientação e pelo empenho para
a realização deste trabalho. Também agradeço de forma especial pelo meu
crescimento científico, tesouro precioso, que ganhei com a sua convivência.
À minha mãe da ciência professora Dra. Maria Isabel Florindo Guedes a qual só
tenho que dizer OBRIGADA.
A Dra. Fernanda Montenegro por sua colaboração para realização deste trabalho na
parte de virologia e pelo exemplo de profissional. Para mim foi um prazer tê-la
conhecido e vivido a agradável experiência de ter sido sua aluna.
A todos os que fazem o Mestrado em Ciências Fisiológicas, em especial a Dra.
Andrelina e a Dra. Cláudia.
A todos os que fazem o Laboratório de Produtos Naturais, que me acolheram e
ensinaram a ver a química de um outro foco. Em especial a Cristiane, João Jaime,
Juliana, Carol, Lisa, Onias, Davi, Rafael, Ariadne, Milena e Luciana.
A todos os que fazem o Laboratório de Bioquímica Humana, em especial a Dra.
Maria Erivalda e ao Dr. Carlucio. Aos meus coleguinhas Marlos, Victor, Marcelo e
Aline que tiveram assim como eu esse laboratório como casa, agradeço pelo
companheirismo e momentos de descontração.
A todos do Laboratório Central de Saúde Pública (LACEN), em especial a Dra.
Betinha e a Dra. Dona Lucinha como carinhosamente acostumei a trata-lhes e a
Dona Clautenes, por toda a ajuda e aos momentos alegres que passamos no
trabalho.
Pela ajuda incondicional da minha amiga Ana Raquel sem ela eu não teria
conseguido fazer esse trabalho. Agradeço de coração pela sua amizade, paciência e
pelo exemplo de força.
As minhas amiguinhas Patrícia (Paty) e Higina por estarem sempre dispostas a ouvir
nas horas de descontrole e por suas palavras de conforto, minhas duas psicólogas.
Sou grata também por ter vocês como amiga.
A Danielle peça fundamental para realização do trabalho na parte antibacteriana e a
Lívia. Obrigada pela ajuda.
À Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa (FUNCAP) pelo apoio financeiro para
a realização deste trabalho.
À minha família, meu maior tesouro, que sempre me apoiou e acreditou junto comigo
que eu seria capaz de terminar esse trabalho. Obrigada, AMO todos vocês: Pai,
Mãe, Liandra, Anderson, Eliane e Aila. Agradeço também ao Roberto, Luiz e James,
os agregados.
O que dizer das minhas amigas e “irmãs do coração” Ivonei, Alana, Rogleijiania
7
e Adriana, seria muito difícil escrever alguma coisa que pudesse descrever o quanto
são especiais para mim. Obrigada por existirem na minha vida.
Ao meu amor, marido, amigo e companheiro Adauto Neto Fonseca Duque que me
ajudou a superar os momentos mais difíceis com muita paciência, TE AMO
MUUUUUITO.
A Deus por ter me dado a vida e a família que tenho, isso já seria muito, mas me
deu também amigos.
8
SUMÁRIO
1.
2.
2.1.
2.1.1.
2.1.2.
2.1.3.
2.1.4.
2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.2.3.
2.2.4.
2.3.
2.3.1
2.3.1.1
2.3.1.2.
2.3.1.3.
2.3.1.4.
2.3.1.5.
2.3.1.6.
2.3.2
2.4.
2.5.
2.5.1.
2.5.2.
2.5.2.1.
2.5.3.
2.5.3.1
2.5.3.2.
2.5.3.3.
2.5.4.
2.5.5.
2.6.
2.7.
2.8.
3.
3.1.
3.2.
4.
4.1.
4.1.1.
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FLUXOGRAMAS E TABELAS
ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
INTRODUÇÃO
REFERENCIAL TEÓRICO
As Plantas como Recurso Terapêutico
Generalidades
Plantas Medicinais e Fitoterápicos
Fitoterapia
Óleos Essenciais
A Planta Tagetes erecta Linn
Considerações Botânicas sobre a Família Asteraceae
Considerações Botânicas sobre a Espécie Tagetes erecta L.
Potencial Uso da Planta
Componentes Bioativos de T. erecta: ação antiviral
Enterobacteriaceae: aspectos gerais
Enterobacterias Estudadas nesta Dissertação
Escherichia
Klebsiella
Enterobacter
Proteus
Serratia
Morganella
Resistência Bacteriana
Óleos Essenciais com atividade Antibacteriana
Dengue: considerações gerais
Vírus
Transmissão do Vírus
Vetores
Controle do Vetor
Controle Biológico
Controle Físico
Controle Químico
Resistência a Inseticidas
Epidemiologia
Óleos Essenciais e Componentes Isolados com Atividade Larvicida
frente ao Aedes aegypti
Diagnóstico e Tratamento do Dengue
Plantas e Compostos Químicos Naturais com Atividade Antiviral
contra o Dengue
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Objetivos Específicos
METODOLOGIA
Materiais
Material Vegetal
x
xii
xiii
xiv
xv
1
3
3
3
3
6
6
8
8
8
9
11
11
11
11
13
13
14
14
15
15
16
18
18
19
21
23
23
24
25
26
27
29
32
33
35
35
35
36
36
36
9
4.1.2.
4.1.3.
4.1.4.
4.1.5.
4.1.6.
4.2.
4.2.1.
4.2.2.
4.2.3.
4.2.4.
4.2.5.
4.2.6.
4.2.7.
4.2.8.
4.2.8.1.
4.2.8.2.
4.3.
5.
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
5.5.
5.6.
5.7.
5.8.
5.8.1.
5.8.2.
6.
6.1.
6.2.
6.3.
7.
8.
Microrganismos Testados
Ovos do Mosquito Aedes aegypti
Antígeno Viral
Cultura de Células
Reagentes
Métodos
Extração do Óleo Essencial de T. erecta.
Análise do Óleo Essencial de T. erecta
Preparação do Extra to de Raiz de T. erecta
Caracterização dos Tiofenos do Extrato Hexânico de Raiz de T.
erecta
Atividade Antibacteriana, in vitro, do Óleo Essencial de T.erecta
Teste da Suscetibilidade das Cepas Bacterianas Frente aos
antibióticos
Atividade larvicida do Óleo Essencial de T. erecta contra o Aedes
aegypti
Atividade Antiviral, in vitro, do extrato hexânico de T. erecta
Ensaio de Toxicidade
Determinação da Concentração Inibitória Mínima
Analise Estatística
RESULTADOS
Determinação Estrutural dos Constituintes Químicos do óleo
Essencial de T. erecta
Análise por HPLC dos Componentes do Extrato Hexânico de Raiz de
T. erecta
Atividade Antibacteriana, in vitro, do Óleo Essencial de T. erecta
Teste de Susceptibilidade das Cepas Bacterianas frente aos
Antibióticos
Comparação entre a Ação Antibacteriana do Óleo Essencial de T.
erecta com a dos Antibióticos
Avaliação da Concentração Mínima Inibitória (MIC)
Teste da Atividade Larvicida do Óleo Essencial de T. erecta contra o
Aedes aegypti
Atividade Antiviral in vitro
Ensaio de Citotoxidade para T. erecta frente às Células C6/36
Concentração Inibitória Mínima (MIC) do Extrato Hexânico de T.
erecta
DISCUSSÃO
Atividade Antibacteriana
Atividade Larvicida
Atividade Antiviral
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
36
36
37
37
37
38
38
38
40
40
40
42
43
43
43
44
44
45
45
55
55
58
63
69
71
74
74
74
76
76
78
80
81
82
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. A planta Tagetes erecta L.
Figura 2a. Tiofenos antivirais contra o Murine Cytomegalovirus
Figura 2b. Tiofenos portadores de atividade antiviral contra o Sindbis virus
Figura 3.
Partícula viral do Dengue.
10
12
12
20
Figura 4.
Mosquito do Aedes aegypti
22
Figura 5.
Número de casos e incidência do Dengue, no Ceará, de 1986 a
2006
Estrutura química do timol
Componentes de óleos essenciais com atividade larvicida contra
Aedes aegypti.
Extrator convencional de óleo essencial.
Cromatografia de gás-líquido acoplada a espectrometria de massa
do óleo essencial de T. erecta.
Espectro de massa do Limoneno
Espectro de massa do Z-Ocimeno
Espectro de massa do E-Ocimeno
Espectro de massa do Terpinoleno
Espectro de massa do Linalol.
Espectro de massa do Mirtenol.
Espectro de massa do Oxido de Linoneno
Espectro de massa da Piperitone.
Espectro de massa do E-anetol
Espectro de massa do Isopulegilacetato
Espectro de massa do Timol.
Espectro de massa da Piperitenone
Espectro de massa do Metil-eugenol
Espectro de massa do Trans-cariofileno
Espectro de massa do E-β-Farnesene
Espectro de massa do Biciclogermacrene
Espectro de massa do Nerolidol.
Espectro de massa do Spathulenol
Espectro de massa do Oxido de cariofilenol
Espectro de massa do Dióxido de limoneno
Figura 26. Espectro de massa do Fitol.
Cromatograma do extrato hexânico de T. erecta obtido no HPLC
Atividade antibacteriana do óleo essencial de T. erecta na
concentração de 2,5 mg/mL. (Kp – Klebsiella pneumoniae; E.c –
Escherichia coli; P.m – Proteus mirabilis; E.clo – Enterobacter
cloaceae; S.l II – Serratia liquefacies; M.m – Morganela morganii.
O gráfico mostra a percentagem de Enterobacteriaceae
susceptível; ( ) intermediário ( ) e resistente ( ) aos diferentes
antibióticos: cefepine (CPM), aztreonam (ATM), amicacina (AMI) e
ciprofloxacin (CIP).
28
Figura 6.
Figura 7.
Figura 8.
Figura 9.
Figura 10.
Figura 11.
Figura 12.
Figura 13.
Figura 14.
Figura 15.
Figura 16.
Figura 17.
Figura 18.
Figura 19.
Figura 20.
Figura 21.
Figura 22.
Figura 23.
Figura 24.
Figura 25.
Figura 26.
Figura 27.
Figura 28
Figura 29.
Figura 30.
Figura 31.
Figura 32.
Figura 33.
31
31
39
46
48
48
48
49
49
49
50
50
50
51
51
51
52
52
52
53
53
53
54
54
54
56
59
62
11
Figura 34. Estudo comparativo da suscetibilidade das cepas bacterianas 65
frente ao óleo essencial de T. erecta ( ) e ao antibiótico cefepine
( ), avaliado pelo tamanho dos halos de inibição. (Kp – Klebsiella
pneumoniae; E.c – Escherichia coli; P.m – Proteus mirabilis; E.clo –
Enterobacter cloaceae; S.l II – Serratia liquefacies; M.m –
Morganela morganii; S – sensível, R – resistente, I – Intermediário;
(-) não houve inibição.
Figura 35. Estudo comparativo da suscetibilidade das cepas bacterianas 66
frente ao óleo essencial de T. erecta ( ) e ao antibiótico Amicacina
(
), avaliado pelo tamanho dos halos de inibição (Kp – Klebsiella
pneumoniae; E.c – Escherichia coli; P.m – Proteus mirabilis; E.clo –
Enterobacter cloaceae; S.l II – Serratia liquefacies; M.m –
Morganela morganii; S – sensível, R – resistente, I – Intermediário,
(-) não houve inibição.
Figura 36 Estudo comparativo da suscetibilidade das cepas bacterianas 67
frente ao óleo essencial de T. erecta ( ) e ao antibiótico Amicacina
(
), avaliado pelo tamanho dos halos de inibição (Kp – Klebsiella
pneumoniae; E.c – Escherichia coli; P.m – Proteus mirabilis; E.clo –
Enterobacter cloaceae; S.l II – Serratia liquefacies; M.m –
Morganela morganii; S – sensível, R – resistente, I – Intermediário,
(-) não houve inibição.
Figura 37. Estudo comparativo da suscetibilidade das cepas bacterianas 68
frente ao óleo essencial de T. erecta ( ) e ao antibiótico
Ciprofloxacin ( ), avaliado pelo tamanho dos halos de inibição (Kp
– Klebsiella pneumoniae; E.c – Escherichia coli; P.m – Proteus
mirabilis; E.clo – Enterobacter cloaceae; S.l II – Serratia liquefacies;
M.m – Morganela morganii; S – sensível, R – resistente, I –
Intermediário, (-) não houve inibição.
Figura 38. Halos de inibição (mm) do óleo essencial de T. erecta, contra a 70
bactéria Klebsiella pneumoniae 6,obtido pelo método de difusão em
ágar.
Figura 39. Reta de regressão obtida do número de larvas de Aedes aegypti 70
mortas e as concentrações do óleo essencial de T.erecta após 24
h. (Equação da reta: y=0,2293x – 6,6748, sendo y o número de
larvas mortas e x a concentração do óleo essencial de T.erecta;
Coeficiente de correlação: R2=0,8992).
Figura 40. Ensaio de imunofluorescência: replicação viral do sorotipo DENV-3 75
nas células C6/36 com 10 ppm do extrato de raiz de T. erecta
Figura 41. Ensaio de imunofluorescência: 100% de inibição viral com a MIC 75
(200 ppm) do extrato de raiz de T. erecta
12
LISTA DE FLUXOGRAMAS E TABELAS
Fluxograma 1.
Fluxograma 2.
Tabela 1
Tabela 2.
Tabela 3.
Tabela 4.
Tabela 5.
Tabela 6
Tabela 7.
Metodologia de extração do óleo essencial da parte aérea de
T. erecta
Metodologia para obtenção do extrato hexânico de raiz de T.
erecta
Constituintes químicos voláteis identificados no óleo essencial
da parte aérea de T. erecta.
Resultado, das médias, dos halos de inibição (mm) da
atividade antibacteriana do óleo de T.erecta .
Resultados dos halos de inibição (mm) dos antibióticos,
cefepine (CPM), aztreonam (ATM), amicacina (AMI) e
ciprofloxacin (CIP), de acordo com NCCLS.
Resultados dos halos de inibição (mm) dos antibióticos,
cefepine, aztreonam, amicacina e ciprofloxacin, contra cepas
bacterianas.
Determinação da concentração mínima inibitória do óleo
essencial de T.erecta frente à Klebsiella pneumoniae 6
Atividade larvicida do óleo essencial de T. erecta contra larvas
de terceiro estagio do Aedes aegypti
O efeito do óleo essencial de T. ereta contra larvas do A.
aegypti após 24 horas
41
41
47
57
60
60
69
71
72
13
ABREVIATURAS
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC
American Type Culture Coletion
BTI
Bacillus thuringiensis israelensis
C 6/36
Células Clonadas das Larvas do A. albopictus
CL 50
Concentração Letal que mata 50%
DDT
Diclorodifeniltricloretano
DENV 1-4
Vírus do Dengue, Sorotipo 1-4
DL 50
Dose Letal que mata 50%
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay (ensaio imunoenzimático)
FSB
Soro Bovino Fetal
HSV
Vírus do Herpes Simples
Ik
Índices de Kovats
Kb
Kilobases
L15
Leibovitz`s Médium
LACEN
Laboratório Central de Saúde Pública
MCMV
Murine Cytomegalovirus
NUENDE
Núcleo de Controle de Endemias Transmissíveis por Vetores
OMS
Organização Mundial de Saúde
PADETEC
Parque do Desenvolvimento Tecnológico do Ceará
SCD
Síndrome do Choque do Dengue
SDS
Dodecil Sulfato de Sódio
UFC
Unidade Formadora de Colônia
ULV
Volume Ultra Baixo
14
RESUMO
As plantas medicinais são bastante utilizadas na medicina popular e ainda se faz
necessárias pesquisas para confirmação de seus efeitos terapêuticos e assim
objetivar o uso racional. Este trabalho apresenta a ação antimicrobiana e ação
larvicida contra o A. aegypti do óleo essencial da parte aérea de Tagetes erecta
Linn. Também versa sobre a atividade contra o vírus do Dengue do extrato hexânico
de raiz. A planta foi cultivada no horto de plantas medicinais do departamento de
biologia da UECE. O óleo essencial foi extraído pelo método de arraste com vapor
d’água e as raízes foram submetidas ao método de percolação com solvente para
obtenção do extrato hexânico. O estudo do óleo essencial levou a identificação de
onze constituintes, tendo como majoritários a piperitona (43,3%), isopulegilacetato
(7,4%) e mirtenol (7,2%). Já para o extrato hexanico, foi identificado o α-tertienil,
através da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Na avaliação da atividade
antimicrobiana foram utilizadas 16 cepas bacterianas (enterobactérias) das quais
duas eram cepas padrões e quatorze isolados clínicos. O método utilizado foi o de
difusão em ágar e todas as bactérias se mostraram susceptíveis ao óleo essencial.
O óleo também foi eficaz contra as larvas do Aedes aegypti que apresentou 100%
de mortalidade na concentração de 150 ppm, ação semelhante ao do inseticida
Temephos. O extrato hexânico demonstrou completa inativação do vírus DENV-3,
atividade que pode ser atribuída a presença de tiofenos nas raízes. Diante desses
resultados a planta T. erecta surge como uma fonte natural alternativa contra
enterobactérias e no combate ao Dengue. No entanto, estudos de toxicidade são
necessários para uso seguro da planta.
15
ABSTRACT
Medicinal plants are worldwide used in traditional medicine although to certify their
therapeutic effects many research experiments are needed for a rational based use.
This work describes the antimicrobial and larvicidal action against Aedes aegypti of
Tagetes erecta L. essential oil of it also reports that the hexane extract from the roots
inhibited the dengue virus. The plant was cultivated in the medicinal garden of the
Biology Department – UECE. The essential oil was extracted by steam distillation
from the aerial parts of the plant. The root hexane extract uas obtained by
percolation. The essential oil was analyzed by gas chromatography / mass
spectrometry and eleven constituents were identified. The main components were
piperitone (43%), isopulegyl acetate (7,4%) and myrtenol (7,2%). In the hexane
extract the main constituent was identified as α-tertienyl by HPLC analysis and
comparison with authentic sample. For the antimicrobial test 16 bacterial strains
(enterobacteria) were used, being two standards and fourteen clinical isolates. The
methodology used was agar difusion and all bacteria were sensitive to the essential
oil. The oil was also efficient against Aedes aegypti larvae and showed 100%
mortality at 150 ppm demonstrating similar action to the themephos insecticide. The
complete inhibition of DENV-3 virus was obtained with the root hexane extract at 200
ppm. According to these results T. erecta constitutes a new source of bioactive
compounds to combat dengue and enterobacteria.
16
1. INTRODUÇÃO
A cura de doenças através do uso de plantas é uma prática utilizada
desde os primórdios da civilização e vem ganhando cada vez mais destaque na
medicina moderna.
Pesquisas sobre as propriedades medicinais de várias plantas têm sido
bastante exploradas nos últimos anos, com o intuito de descobrir novas substâncias
que possam prevenir, tratar ou curar doenças em humanos. O Brasil está entre os
países com maior número de espécies vegetais, mas muitas delas ainda
permanecem desconhecidas tanto do ponto de vista químico quanto do
farmacológico, enquanto outras já apresentam indícios de extinção.
Os metabólitos secundários de plantas, tais como aqueles presentes em
extratos obtidos com solventes orgânicos e óleos essenciais, são fontes de produtos
biologicamente ativos e, a partir deles, tem-se produzido compostos de grande
importância terapêutica, apresentando relevantes atividades como antibacteriana,
antifúngica, antiviral, antioxidante, anti-inflamatória, herbicida, larvicida , inseticida,
entre outras. Esta variedade de ações pode ser atribuída à diversidade molecular
das plantas.
A planta Tagetes erecta L. apresenta várias atividades biológicas
relatadas por pesquisadores de diversos países. Este trabalho teve como finalidade
usar a T. erecta, cultivada no Estado do Ceará, no combate ao Dengue e como
agente antimicrobiano. Desse modo, ampliar o espectro de fontes naturais com
propriedades terapêuticas.
O Dengue é apontado como um fator de risco para a saúde pública, fato
que justifica o estudo do problema por dois enfoques: 1. o controle do mosquito,
através de um larvicida natural a base do óleo essencial das folhas de T. erecta e 2.
a cura da doença através de um antiviral preparado com o extrato hexânico da raíz
de T. erecta, rica em compostos tiofênicos.
17
A resistência dos microrganismos aos antibióticos atuais incentiva à
pesquisa por novos agentes antimicrobianos. Diante dessa afirmação, o óleo
essencial de T. erecta foi usado contra enterobacteriaceae.
18
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. As Plantas como Recurso Terapêutico
2.1.1. Generalidades
O uso de produtos naturais como recurso terapêutico é tão antigo quanto
à civilização humana e, por muito tempo, produtos minerais, vegetais e animais
constituíram as únicas fontes de medicamentos. Com o advento da Revolução
Industrial e o desenvolvimento da química orgânica, os produtos sintéticos foram
adquirindo primazia no tratamento farmacológico (Rates, 2001). Hoje, os produtos
naturais e seus derivados representam mais de 50% de todos os medicamentos de
uso clínico no mundo e as plantas contribuem com cerca de 25% desse total (GuribFakim, 2006). O crescimento da procura de drogas vegetais, como recurso
terapêutico, está relacionado a vários fatores, entre eles: a decepção com os
resultados obtidos em tratamentos com a medicina convencional (por exemplo,
efeitos colaterais, impossibilidade de cura, etc.); a consciência ecológica e a crença
popular de que o natural é inofensivo; o fato de que grande parte da população não
tem acesso aos medicamentos e a medicina institucionalizada; os efeitos
indesejáveis e prejuízos causados pelo uso abusivo e/ou incorreto de medicamentos
sintéticos (Rates, 2001).
2.1.2. Plantas Medicinais e Fitoterápicos
Para a Organização Mundial de Saúde (OMS), planta medicinal é toda
aquela, silvestre ou cultivada, que se utiliza como recurso para prevenir, aliviar, curar
19
ou modificar um processo fisiológico normal ou patológico, ou como fonte de
fármacos e de seus precursores (Arias, 1999).
As plantas medicinais são tradicionalmente usadas por populações de
todos os continentes no controle de pragas e doenças (Lavabre, 1993). Existem
evidências históricas de que as propriedades terapêuticas das plantas medicinais já
eram conhecidas desde o período Neolítico (Bhattaram, et al., 2002). No Brasil,
devido à riqueza da flora e aos conhecimentos indígenas e populares transmitidos
através de gerações, inúmeras espécies medicinais foram identificadas, passando a
ser úteis no tratamento de enfermidades (Arcoline, 2003). De acordo com a OMS
cerca de 65% a 80% da população mundial ainda depende das plantas medicinais
para suprir as suas necessidades básicas de saúde (Calixto, 2005). É nesse
contexto social que as plantas medicinais adquirem importância como agentes
terapêuticos e, por isso, seu uso, deve ser fundamentado em evidências
experimentais comprobatórias de que os riscos, da sua utilização, são suplantados
pelos benefícios. Entretanto, vale ressaltar que a planta medicinal é um xenobiótico,
isto é, um elemento estranho ao organismo humano e como tal, os produtos de sua
biotransformação são potencialmente tóxicos e assim devem ser encarados até que
se prove o contrário (Simões et al., 2004).
De acordo com Rates (2001) planta medicinal não é fitoterápico! A
legislação brasileira define fitoterápico como um “medicamento obtido por processos
tecnologicamente adequados, empregando-se exclusivamente matérias-primas
ativas vegetais”. É caracterizado pelo reconhecimento da eficácia e dos riscos de
seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Sua
eficácia e segurança são validadas através de levantamentos etnofarmacológicos de
utilização, documentações tecnocientíficas em publicações ou ensaios clínicos. Não
se considera medicamento fitoterápico aquele que, na sua composição, inclua
substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, nem associações destas com
extratos vegetais (Brasil, 2004).
No Brasil, os fitoterápicos são registrados como medicamentos e as
companhias farmacêuticas necessitam provar a segurança, qualidade e eficácia
baseadas em informações científicas. A recente integração entre iniciativa privada,
20
institutos de pesquisas e universidades reforçou as pesquisas que passaram a
receber maiores suportes do governo federal. Como resultado de tais esforços o
Acheflan, primeiro fitoterápico totalmente desenvolvido no Brasil, foi aprovado pela
Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). É um anti-inflamatório
desenvolvido a partir da planta medicinal Cordia verbenacea DC (Boraginaceae) e
produzido pelo Aché Laboratórios. Em conseqüência dessa integração outras
companhias farmacêuticas brasileiras atualmente estão interessadas por esse
mercado (Calixto, 2005).
O mercado mundial de fitoterápicos atinge cerca de 40 bilhões de
dólares/ano (Alves, 2005). Se a este valor for somada a economia informal da
utilização popular de plantas medicinais, nos países subdesenvolvidos e
desenvolvidos, o total alcança a ordem de centenas de bilhões de dólares/ano
(Garcia, 2002). O Brasil tem pelo menos três razões para disputar um mercado tão
promissor: a sua própria história, a sua biodiversidade e a capacidade técnicocientífica de seus pesquisadores. Apesar disso, somente 15% a 17% das plantas
medicinais brasileiras foram estudadas quanto ao seu potencial terapêutico (Simões
et al., 2004).
De acordo com Yunes et al., (2001) três fatores precisam ser corrigidos
para o desenvolvimento da indústria de fitoterápicos no Brasil: (i) a falta de uma
política definida, permanente e comprometida com o desenvolvimento da indústria
farmacêutica; (ii) a falta de uma integração de fato entre as várias áreas de
conhecimento
(química,
farmacologia,
botânica,
bioquímica
e
tecnologia
farmacêutica) envolvidas no processo de produção de fitoderivados; (iii) o interesse
da maioria das empresas que compõem a industria nacional de fitoterápicos no lucro
rápido e não no desenvolvimento de competitividade em nível internacional.
21
2.1.3. Fitoterapia
O tratamento de enfermidades utilizando, exclusivamente, matériasprimas vegetais é chamado de fitoterapia (Oliveira 1998). A integração da fitoterapia
na medicina científica somente ocorrerá se estes produtos atenderem aos critérios
de eficácia, segurança e qualidade exigidos para medicamentos convencionais. A
fitoterapia racional é um método alopático de tratamento médico baseado em
evidências científicas e fundamentalmente diferentes dos conceitos tradicionais
(Alves, 2005).
Os grandes laboratórios e as universidades passaram a isolar e sintetizar
substâncias (princípio ativo) retiradas de plantas, do uso popular, para produzir
novos fármacos. Mais vale ressaltar que cada planta é constituída de inúmeros
princípios ativos que agem em sinergia, ou seja, o resultado do conjunto é mais
potente e com menos efeitos colaterais que cada princípio ativo isolado. Assim, os
tratamentos fitoterápicos têm demonstrado cada vez mais a sua eficácia, embora,
como qualquer outro tipo de tratamento, requer antes um diagnóstico correto da
doença para que a planta utilizada seja realmente eficaz (Arcoline, 2003).
2.1.4. Óleos Essenciais
A utilização do óleo essencial como agente medicinal é conhecida desde
épocas remotas. Há seis mil anos, os egípcios o utilizavam em práticas religiosas
associada à cura de males, por meio do aroma. As substâncias aromáticas também
eram populares na antiga China e Índia, antes da era cristã, na produção de
incensos, porções e vários tipos de acessórios utilizados diretamente no corpo
(Tyrrel, 1990).
O primeiro escrito relatando a destilação do óleo essencial é atribuído a
Villanova (1235-1311), um físico catalão. A destilação, como método de obtenção do
óleo, foi inicialmente usada no Egito, Índia e Pérsia há 2000 anos e melhorada no
22
século IX pelos árabes. Por volta do século XIII os óleos essenciais foram feitos em
farmácias e suas propriedades farmacêuticas foram escritas em farmacopéias (Burt,
2004).
O termo óleo essencial deriva da palavra Quinta essentia formulada pelo
médico suíço Paracelsus Von Hohenheim, século XVI, para nomear um componente
de uma droga (Burt, 2004). Os óleos essenciais (OEs) são misturas complexas de
substâncias voláteis, lipofílicas, geralmente odoríficas e líquidas. Recebem a
nomenclatura mais abrangente de óleos voláteis, diferindo dos óleos fixos (misturas
de substâncias lipídicas) obtidos geralmente de sementes. Ainda podem ser
denominados óleos etéreos (devido à sua solubilidade em solventes apolares, como
os éteres), ou simplesmente essências, pois a maioria possui aroma agradável e
intenso (Simões et al., 2004).
Diferentes partes de uma planta (flores, brotos, sementes, folhas, caules,
frutos, raízes e madeira) são usadas para extrair o OE. São vários os processos
para obtenção do óleo: prensagem, fermentação, enfloração, extração e destilação
por arraste em vapor d’água, sendo o último o método mais usado para produção de
OEs (Burt, 2004). O OE obtido de diferentes órgãos de uma mesma planta pode
apresentar composição química, caracteres físico-químicos e odores bem distintos.
Cabe lembrar que a composição química de um OE, pode variar significativamente,
de acordo com a época de coleta, condições climáticas e de solo (Simões et al.,
2004).
Os OEs possuem uma variedade de compostos químicos que variam
desde terpenos, sesquiterpenos, fenóis, álcoois, ésteres, aldeídos, cetonas, até
compostos nitrogenados e sulfurados (Lavabre, 1992). Devido a sua complexa
composição, os OEs têm exibido uma variedade de propriedades terapêuticas como
bactericida (Moon et al., 2006; Celiktas et al., 2005; Pessoa et al., 2005;
Opalchenova e Obreshkova, 2003; Nakamura, 1999), fungicida (Cakir et al., 2005;
Sheng-Yang et al., 2005), antiviral (Sinico et al., 2005; Allahverdiyev et al., 2004),
antioxidante (Tepe et al., 2005; Ricci et al., 2005), analgésica, antiflamatória,
antiespamódica (Leal-Cardoso e Fonteles, 1999), antinoceptivo (Araújo Pinho et al.,
23
2005; Santos et al., 2005) além de larvicida (Dharmagadda et al., 2005; Cavalcanti et
al., 2004) e inseticida (Calmasur et al., 2006; Pavela, 2005; Prajapati et al., 2005).
2.2. A Planta Tagetes erecta L.
2.2.1. Considerações Botânicas sobre a Família Asteraceae
A família Asteraceae é o grupo sistemático mais numeroso dentro das
Angiospermas, compreendendo cerca de 1.100 gêneros e 25.000 espécies. São
plantas de aspecto extremamente variado, incluindo principalmente pequenas ervas
ou arbustos e raramente árvores. Cerca de 98% dos gêneros são constituídos por
plantas de pequeno porte, e são encontradas em todos os tipos de habitats,
principalmente, nas regiões tropicais montanhosas da América do Sul (Verdi et al.,
2005)
As plantas dessa família são extensivamente estudadas quanto a sua
composição química e atividade biológica, sendo que algumas têm proporcionado o
desenvolvimento de novos fármacos, inseticidas, entre outros (Verdi et al., 2005).
2.2.2. Considerações Botânicas sobre a Espécie Tagetes erecta L.
O gênero Tagetes, família Asteraceae, contém mais de 50 espécies das
quais T. patula, T. tenuifolia, T.lunata e T. erecta são as espécies anuais mais
cultivadas como ornamentais em todo mundo. Estas quatro espécies já eram
cultivadas no México há mais de dois milênios (Soule e Janick, 1996) e eram usadas
como ornamento, em rituais e como planta medicinal (Nuttall, 1920).
No Brasil, a espécie Tagetes erecta L. é conhecida popularmente por
“cravo de defunto”. Nos países de língua inglesa, ela é denominada marigold e
24
african marigold. No México, na América Central e nos demais paises da América do
Sul
é
conhecida
como
cempasuchi,
amarillo
e
flor
de
muerto
(www.semarnat.gob.mx/pfnm/TagetesErecta.html).
A planta é uma erva ramosa, pode chegar até 1,50m de altura (Figura 1,
p. 10), folhas opostas ou alternadas, profundamente dilaceradas e aromáticas.
Apresenta capítulos grandes de pedúnculos intumescidos no ápice, solitários e
multifloros. Aquênio linear multiestriado com sementes pretas. Há variedades de
flores dobradas, grandes, até sete centímetros de diâmetro, cor amarela-citrino e
amarelo-enxofre (Braga, 1976).
2.2.3. Potencial Uso da Planta
O cravo de defunto é uma planta originária do México e suas
propriedades terapêuticas são reconhecidas desde o tempo dos astecas. A parte
aérea é indicada para dor de estômago, vômito, diarréia, gastrite e enfermidades do
baço. As folhas quando cozidas ou em infusão são usadas no tratamento de ataques
epiléticos, bronquite, dor de cabeça, febre e afecções hepáticas. É usada também
como
anti-espasmódico
e
anti-helmíntico
(www.semarnat.gob.mx/pfnm/TagetesErecta.html). As flores cozidas são usadas
externamente no tratamento de infecções da pele (Lopez et al., 2001). Foram
verificadas atividades biológicas como inseticida (Macedo et al., 1997), larvicida
(Pathak et al., 2000) e bactericida (Mae Sri Hartati et al., 1999).
Recomenda-se o uso de T. erecta como cultura intercalada no combate
aos fitonematóides, especialmente contra espécies de Pratylenchus e Meloidogyne.
A xantofila extraída das flores é bastante utilizada como corante natural para
alimentos e bebidas. O corante também é usado como suplemento alimentar para
galinhas, visando intensificar a cor amarela na carne e gema dos ovos (Padma et al.,
1997). Na índia extrai-se das pétalas a quercetagetin, empregada no tingimento da
lã e seda (Braga, 1976).
25
Fonte: Márcia Marques
Figura 1. A planta Tagetes erecta L.
26
2.2.4. Componentes Bioativos de T. erecta: ação antiviral
A planta T. erecta possui compostos tiofênicos, α-tertenil, bitertenil e outras
substâncias cíclicas sulfuradas (Padma et al., 1997). Segundo Hudson, 1989, os
tiofenos mostrados na Figura 2a (p.12), são portadores de atividade antiviral contra
Murine Cytomegalovirus (MCMV). Na Figura 2b (p.12) os tiofenos apresentados são
ativos contra o Sindbis virus (SV).
2.3. Enterobacteriaceae: aspectos gerais
As enterobacteriaceae (enterobactérias) constituem o grupo mais comum
de bastonetes Gram-negativos, aeróbico ou anaeróbico facultativo. A família inclui
numerosos gêneros, por exemplo, Escherichia, Shigella, Salmonela, Enterobacter,
Klebsiella, Serratatia, Proteus, Morganella e outros (Brooks et al, 2000). Embora
possa ser encontrada amplamente na natureza, a maioria habita os intestinos do
homem e dos animais, seja como membro da microbiota normal ou como agente de
infecção (Trabulsi et al., 1999).
2.3.1. Enterobactérias Estudadas nesta Dissertação
2.3.1.1. Escherichia
O gênero Escherichia compreende as espécies: E. coli, E. blattae, E.
fergusonii, E. hermanti e E.vulneris. Dentre elas, a Escherichia coli é uma espécie de
grande importância prática (Trabulsi et al., 1999).
27
(a)
(b)
Figura
2.
Tiofenos
portadores
Cytomegalovirus e (b) Sindbis virus.
de
atividade
antiviral
contra
(a)
Murine
28
A espécie E. coli é constituída por uma variedade relativamente grande de
bactérias
patogênicas,
que
podem
causar
infecções
intestinais,
urinárias,
septicemias, meningites e outros tipos de infecções. Provavelmente nenhuma outra
espécie bacteriana é tão versátil em sua patogenicidade como E. coli. Além se ser
um patógeno importante, a E.coli é membro da flora intestinal normal do homem (e
dos animais), sendo encontrada nas fezes de todos os indivíduos normais. Esta
estreita associação representa a base do teste para verificar contaminação fecal da
água e dos alimentos, tão usado em saúde pública (Brooks et al, 2000).
2.3.1.2. Klebsiella
O gênero Klebsiella é subdividido em cinco espécies: K. pneumoniae, K.
oxytoca (as mais importantes clinicamente), K. ornithinolytica, K. terrigena e K.
planticola (Poschun et al., 2001).
A espécie mais isolada é K. pneumoniae, também conhecida como bacilo
de Frielander. É encontrada nas fezes de cerca de 30% dos indivíduos normais, na
nasofaringe (Brooks et al, 2000) e no intestino (Trabulsi, 1998). É um dos poucos
bacilos gram-negativos que causam pneumonia, principalmente em alcoólatras
crônicos (Carpenter, 1990). A bactéria K. pneumoniae é responsável por cerca de
10% das infecções hospitalares (Trabulsi, 1998) e, é considerada um grave
problema para crianças prematuras em unidades pediátricas, estando envolvida em
septicemia neonatal (Carpenter, 1990).
2.3.1.3. Enterobacter
Duas espécies predominam sobre todas as demais como causa de
infecções em humanos, a Enterobacter cloaceae e Enterobacter aerogenes
(Trabulsi e Alterthum, 2004). O papel desempenhado por estas espécies no
processo infeccioso, deve ser avaliado clínica e bacteriologicamente (Trabulsi,
29
1998). Uma característica importante das duas espécies é a capacidade de
contaminar equipamentos médicos e soluções para uso parental (Trabulsi e
Alterthum,
2004).
Em
decorrência
da
aplicação
endovenosa
de
líquidos
contaminados têm sido descrito vários casos de bacteremia (Trabulsi, 1998).
2.3.1.4. Proteus
Na nova classificação para as enterobactereaceae o gênero Proteus
passou a incluir somente Proteus mirabilis e Proteus vulgares (Trabulsi, 1998).
As espécies de Proteus provocam infecções em humanos apenas quando
deixam o trato intestinal. Estes microorganismos são encontrados em infecções
urinarias e produzem bacteremia, pneumonia e lesões focais em pacientes
debilitados ou naqueles que recebem infusões intravenosas. Proteus mirabilis é uma
espécie importante, principalmente, com relação a infecções urinárias adquiridas na
comunidade e em hospitais (Brooks et al, 2000).
2.3.1.5. Serratia
De três espécies encontradas de Serratia a S. marcescens é a mais
freqüente, representando 95% das amostras de Serratia isoladas de espécimes
clínicos (Trabulsi, 1998).
Muitas infecções hospitalares com isolados deste gênero é causada pela
S. marcescens que, como Enterobacter, costuma contaminar equipamentos médicos
e soluções com baixo poder desinfetante. Serratia é um importante patógeno
nosocomial que pode causar infecção urinária, bacteremias e infecções respiratórias
(Trabulsi e Alterthum, 2004). É uma bactéria que pode também atingir a corrente
sangüínea, e provocar sepse (Brooks et al, 2000).
30
2.3.1.6. Morganella
São conhecidas duas subespécies de Morganella morganii, ambas
envolvidas em infecções urinárias (Trabulsi e Alterthum, 2004) e quase sempre
associadas à infecção hospitalar (Trabulsi, 1998).
2.3.2. Resistência Bacteriana
Somente na primeira década do século XX a quimioterapia surge como
ciência, embora o uso de drogas para o tratamento das doenças infecciosas seja
conhecido desde o século XVII (Brooks et al., 2000). No ano de 1920, Alexander
Fleming descobriu o primeiro antibiótico, a penicilina, a partir do fungo Penicillium
notatum. Essa descoberta permitiu o desenvolvimento de outros compostos
antimicrobianos produzidos por organismos vivos (Madigan et al., 2000).
A essência da quimioterapia antimicrobiana é a toxicidade seletiva, matar
ou inibir o microrganismo afetando minimamente o hospedeiro (Brooks et al, 2000).
Os antibióticos e os quimioterápicos interferem em diferentes mecanismos da célula
bacteriana, causando a morte (bactericidas) ou somente inibindo o seu crescimento
(bacteriostáticos). A ação dos antibacterianos na célula bacteriana pode ocorrer em
nível de parede, membrana citoplasmática, síntese de proteínas e síntese de ácidos
nucléicos
(Trabulsi
e
Alterthum,
2004).
O
desenvolvimento
de
agentes
quimioterápicos teve impacto na medicina clínica mais do que qualquer outra
descoberta (Madigan et al., 2000).
Nas últimas décadas, observa-se um aumento da resistência bacteriana a
agentes antimicrobianos, constituindo um sério problema para o tratamento de
doenças infecciosas (Wright, 2000). A ocorrência de cepas resistentes é uma
situação agravante para a saúde pública e responsável por milhões de mortes no
mundo todo, principalmente nas infecções hospitalares (Ahmad e Beg, 2001).
31
Os mecanismos de resistência bacteriana são complexos e variados, e
ainda não são completamente conhecidos (Koneman et al., 2001). A maioria dos
microrganismos resistentes surge em decorrência de alterações genéticas e
processos subseqüentes de seleção pelos agentes antimicrobianos. Existem
mecanismos distintos pelos quais os microorganismos podem exibir resistência a
fármacos:
I.
Os microorganismos produzem enzimas que destroem o fármaco ativo;
II.
Os microorganismos diminuem sua permeabilidade ao fármaco;
III.
Os microorganismos desenvolvem um alvo estrutural alterado para o
fármaco com diminuição da afinidade
IV.
Os microorganismos desenvolvem uma via metabólica alterada, bypass, que se desvia da reação inibitória pelo fármaco;
V.
Os microorganismos elaboram uma enzima alterada que ainda tem a
capacidade de desempenhar a sua função metabólica, mas que é bem
menos afetada pelo fármaco (Brooks et al., 2000).
A resistência microbiana vem crescendo e a perspectiva para o uso de
drogas antimicrobianas no futuro ainda é incerto. Então devem ser praticadas ações
para reduzir esse problema, por exemplo, controlar o uso indiscriminado dos
antibióticos, desenvolver pesquisas para entender melhor os mecanismos genéticos
da resistência e incentivar o desenvolvimento de novas drogas sintéticas ou naturais
(Nascimento et al., 2000). Assim, as plantas, muitas delas já com ação comprovada,
surgem como uma alternativa na produção de novos agentes antimicrobianos.
2.4. Óleos Essenciais com Atividade Antibacteriana
Os óleos essenciais são considerados um dos mais importantes agentes
antimicrobianos presentes em plantas (Cowan, 1999). Muitos autores têm
demonstrado as propriedades antimicrobianas de óleos essenciais:
32
•
Delamare et al., (2005) relataram a atividade bactericida e
bacteriostática do óleo essencial de duas espécies do gênero Salvia,
Salvia officinalis e Salvia triloba, contra Bacillus cereus, Bacillus
megatherium, Bacillus subtilis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas
sobria e Krebsiella oxytoca. As espécies foram cultivadas no sul do
Brasil.
•
Foi demonstrada a atividade antimicrobiana do extrato metanólico e
do óleo essencial de Rosmarinus officinalis de três diferentes regiões
em diferentes intervalos de tempo. Os resultados indicaram que as
bactérias
testadas
(S.
aureus,
S.
epidermidis,
P.
vulgaris,
Pseudomonas aeruginosa, K. peneumonia, Enterococcus. fecalis,
Escherichia coli, B. subtilus e Candida albicans) foram mais sensíveis
ao óleo essencial e parcialmente ao extrato. Foi observado que a
ação bacteriana do óleo depende da localização e variação sazonal
(Celiktas et al., 2005).
•
O óleo essencial de Oliveria decumbens apresentou atividade contra
as bactérias Gram positivas (S. epidermis, S. aureus e B. cereus),
Gram negativas (E. coli, P. aeruginosa e S. marcenscens) e os fungos
(A. niger e C.albicans). Os componentes majoritários do óleo foram o
timol (47,06%) e o carvacrol (23,31%) (Amin et al., 2005).
•
Foi avaliado o efeito antimicrobiano do óleo essencial de Lippia aff.
Gracillis.. O óleo essencial foi efetivo frente a todas as bactérias
testadas no estudo com exceção a Pseudomonas aeruginosa. A ação
antimicrobiana e anti-séptica do óleo pode ser considerada devido à
presença do carvacrol (Pessoa et al., 2005).
•
Nakamura et al., (1999) demonstraram o efeito inibitório do óleo
essencial de Ocimum gratissium L. frente a P. mirabilis, Klebsiella sp.,
E. coli, Salmonella enteritidis, S. aureus e Shigella flexineri, mas não
33
apresentou inibição contra Pseudomonas aeruginosa. Foi atribuída a
atividade antibacteriana ao eugenol.
2.5. Dengue: considerações gerais
Dengue é uma doença virótica febril e aguda, que freqüentemente se
apresenta com dores de cabeça, dores nos ossos ou articulações e nos músculos,
erupção cutânea e leucopenia como sintomas (OMS, 2001). A doença pode se
manifestar de forma assintomática, benigna (Dengue clássico), podendo agravar-se
para suas formas mais severas: Dengue Hemorrágico (DH) e Síndrome do Choque
do Dengue (SCD) (Santos et. al., 2002; Parida et. al., 2001). A DH é caracterizada
por quatro principais manifestações clínicas: febre alta, fenômeno hemorrágico
geralmente com hepatomegalia e, nos casos mais graves, sinais de insuficiência
circulatória. Tais pacientes podem desenvolver um choque hipovolêmico, resultante
do extravasamento de plasma, esse quadro é denominado SCD e pode ser fatal
(OMS, 2001).
2.5.1. Vírus
(O vírus causador do Dengue é um arbovírus arthropod-borne viruses),
cuja transmissão se dá através da picada de um vetor artrópode (Tortora et al.,
2002). Pertence ao gênero Flavivírus, família Flaviviridae (Halstead, 1988; Gubler,
1998).
A partícula viral do Dengue (Figura 8, p. 25) tem muitas características em
comum com outros Flavivírus, possui um genoma de RNA de filamento simples
contido em um nucleocapsídeo isocaédrico de cerca de 30nm de diâmetro (Henchal
e Putnak, 1990) envolvido em um envelope lipídico (Gritsun et al., 1995), com10nm
de espessura onde se inserem proteínas de membrana e espículas glicoprotéicas,
34
tendo o vírus em sua totalidade um diâmetro entre 50 (Rosa et al., 1997) a 60nm
(Figueiredo, 1991).
O genoma deste vírus, de aproximadamente 11Kb (kilobases) de
comprimento, codifica três genes de proteínas estruturais: nucleocapsídeo (C),
proteína associada à membrana (M) e uma proteína de envelope (E) e sete genes
de proteínas não estruturais (NS) (OMS, 2001).
Atualmente são descritas quatro linhagens antigênicas para o Dengue:
DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, todas capazes de promover o Dengue
clássico e o Dengue hemorrágico (Gubler, 1998; Rigau-Perez et al., 1998; Barbosa,
1999). Os mesmos possuem diversos genótipos, que diferenciam entre si por
variações na seqüência de nucleotídeos ao nível de genes da glicoproteína E e da
junção dessa glicoproteína com a proteína NS-1 (Westaway , 1985). Anualmente, os
vírus do Dengue são responsáveis por mais de 100 milhões de casos de Dengue
clássico e 500 mil casos de Dengue hemorrágico (De Paula e Fonseca, 2004).
2.5.2. Transmissão do Vírus
A transmissão dos vírus do Dengue aos humanos ocorre através da
picada de mosquitos fêmeas do gênero Aedes (Figura 9, p.28), principalmente do
Aedes aegypti (Gubler, 2004), por meio de um repasto de sangue infectado. No
mosquito, o vírus precisa de 8-12 dias de incubação, período extrínseco, a partir de
então, o mosquito é capaz de transmitir a doença por toda a sua vida (OMS, 2001).
Machos e fêmeas dessa espécie alimentam-se de néctar e sucos
vegetais, mas depois do acasalamento a fêmea precisa de sangue para a maturação
dos ovos. E é nessa hora que ela é capaz de transmitir o vírus do Dengue ao
homem (transmissão horizontal) ou pode passar à próxima geração de mosquitos
(transmissão transovariana ou vertical
(www.ufrrj.br/institutos/it/de/acidentes/dengue).
35
Fonte: Cell v.108, n.5, p.717-725, 2002.
Figura 3. Partícula viral do Dengue.
36
2.5.2.1. Vetores
O Dengue e a Febre amarela são infecções causadas por flavivírus
(Figueiredo, 2000) e transmitidas pelo mesmo mosquito o Aedes aegypti (Gubler,
2004), o principal vetor do Dengue em áreas urbanas (Gubler, 1998), principalmente
em estações chuvosas e quentes (Rosa et al., 1997), e é uma espécie de mosquito
tropical e subtropical encontrado no mundo inteiro (OMS, 2001). Possivelmente o
Dengue foi uma virose de mosquitos em ciclos silvestres antes de se adaptar a
primatas e humanos. A provável origem africana do Aedes aegypti tem sido
reforçada pela presença de numerosas espécies do gênero flavivírus, tanto na
Etiópia como em regiões orientais africanas. O vetor se adaptou à ecologia
peridoméstica de pequenas vilas antes do tráfico de escravos (Donalísio e Glasser,
2002).
Sabe-se que além do A. aegypti, existe a participação de outros insetos
da família Culicidae e do gênero Aedes, no processo de transmissão do vírus (Rosa
et al., 1997). Dentre os potenciais vetores secundários destacam-se alguns
mosquitos do subgênero Stegomya: A. scutellaris, A. leutrocephalus, A. albopicus e
A. polynesiensis. Cada uma dessas espécies tem sua própria distribuição
geográfica, no entanto, elas são vetores menos eficientes que o A. aegypti (OMS,
2001). No entanto, os principais mosquitos transmissores do Dengue são o Aedes
aegypti e Aedes albopictus, estes, são endêmicos em muitas áreas onde estão
presentes (Lanciotti et al., 1992). No Brasil, há registro de apenas um surto de
dengue atribuído ao Aedes albopictus (Serufo et al., 1993).
O Aedes aegypti teve papel importante na re-emergência das infecções
causadas pelos vírus do Dengue em suas diversas formas clínicas. Essa virose
tornou-se um dos mais graves problemas de saúde pública no mundo. Cerca de 3,5
bilhões de pessoas vivem expostas a esse mosquito na faixa cosmotropical,
constituindo um grande desafio para os serviços de saúde (Martins e Silva, 2004)
devido à inexistência, até o momento, de uma vacina eficaz para o uso preventivo ou
curativo do Dengue.
37
acidentes/dengue.
Figura 4. Mosquito do Aedes aegypti
38
2.5.3. Controle do Vetor
O A. aegypti não é nativo das Américas, tendo sido introduzido no Brasil
provavelmente no início do século XIX. Tendo encontrado um meio ambiente
adequado à sua sobrevivência e reprodução, se expandiu geograficamente por todo
país e aumentou a sua população. Foi erradicado do país em 1957, reintroduzido em
1967 e novamente eliminado em 1973, e finalmente reintroduzido para iniciar a
reocupação de seu antigo habitat em 1976 (Penna, 2003).
A organização atual do espaço dos grandes centros urbanos e a situação
da população de mosquitos no país levou à conclusão de que a erradicação do A.
aegypti não é mais viável. O Ministério da Saúde passou então a recomendar o
controle e não mais a erradicação. Controle significa a redução permanente da
densidade vetorial. Para dimensionar o impacto das medidas de controle e orientar
ajustes das ações prescritas pelos programas para controle de vetores e epidemias,
é fundamental que sejam realizadas, periodicamente, atividades de vigilância
entomológica (Penna, 2003).
Nas últimas décadas, vem sendo recomendado o controle integrado do A.
aegypti com implementação descentralizada, envolvendo o poder público e a
sociedade. Esse tipo de estratégia teria maior sustentabilidade que aquelas verticais
centralizadas e baseadas em um único método. No controle integrado do mosquito,
as
medidas
preventivas são direcionadas,
principalmente,
aos
criadouros,
constituindo-se de ações simples e eficazes, especialmente aquelas que consistem
em cuidados a serem adotados pela população (Donalísio e Glasser, 2002).
2.5.3.1. Controle Biológico
Entre as medidas de controle biológico, os predadores do tipo peixes
larvófagos são os mais recomendados por sua fácil obtenção e manutenção,
especialmente, para bebedouros de grandes animais, fossos de elevador de obras,
39
espelhos d'água/fontes ornamentais, piscinas abandonadas e depósitos de água não
potável.
Predadores como os copépodos também vêm sendo utilizados por alguns
programas e culicídeos não hematófagos do gênero Toxorhinchites não têm
mostrado fácil aplicabilidade.
As bactérias do tipo Bacillus thuringiensis israelensis (BTI) e o Bacillus
sphaericus são específicos para o controle de larvas de culicídeos, sendo que o
primeiro apresenta melhores resultados contra o Aedes aegypti. Sua ação tóxica é
causada por uma toxina presente no corpo paraesporal do bacilo. O Bti vem sendo
utilizado no Brasil em substituição ao temephos em regiões onde foi detectada
resistência do Aedes aegypti a esse organofosforado.
Hormônios miméticos (reguladores de crescimento sintéticos) têm mostrado
bons resultados para controle de larvas de culicídeos. Atualmente, estão disponíveis
no mercado formulações de methoprene, diflubenzuron, pyripropixyfen e triflumuron,
sendo que para o Aedes aegypti, o primeiro é o mais utilizado. A incorporação do
seu uso em programas de controle desse vetor exige adequação na metodologia de
vigilância entomológica para estimar indicadores de densidade larvária (Donalísio e
Glasser, 2002).
2.5.3.2. Controle Físico
Além das medidas físicas preconizadas pelos programas de controle de
vetores, outras ainda pouco utilizadas poderiam solucionar algumas problemáticas
específicas, tais como a aplicação de produto que forma película monomolecular
sobre a superfície da água e a utilização de água quente. Para Aedes aegypti,
temperaturas de 49º C são suficientes para matar os ovos em menos de 2 minutos e
larvas e pupas em 5 minutos. Esses métodos precisam ser mais bem estudados
para a sua adequação. (Donalísio e Glasser, 2002).
40
2.5.3.3. Controle Químico
Os agentes químicos têm sido usados para controlar o A. aegypti desde o
começo do século. Nas primeiras campanhas contra a febre amarela em Cuba e no
Panamá, junto com amplas campanhas de limpeza, os hábitats larvários do Aedes
eram tratados com óleo e as casas eram limpas com piretrinas. Quando as
propriedades inseticidas do DDT foram descobertas na década de 40, esse
composto tornou-se o principal método dos programas de erradicação do A. Aegypti
nas Américas. Quando surgiu uma resistência ao DDT no inóicio dos anos 60, os
inseticidas organofosforados, incluindo o fention, o malation, o fenitrotion, e
temephos, foram usados para o controle do mosquito. Os métodos correntes de
aplicação de inseticida incluem a aplicação larvicida, o tratamento perifocal e a
pulverização ambiental (OMS, 2001).
O controle larvicida ou “focal” do A. aegypti é geralmente limitado aos
recipientes de uso domiciliar que não podem ser eliminados. Dois larvicidas podem
ser usados para tratar os recipientes que contenham água potável: grânulos de areia
temephos a 1% e metropene, regulador do crescimento do inseto na forma de
briquetes. Todos esses larvicidas apresentam uma toxicidade extremamente baixa
aos mamíferos e a água potável (OMS, 2001).
O tratamento perifocal envolve o uso de pulverizadores manuais ou
elétricos para a aplicação de formulações de inseticidas em pó hidrossolúvel ou em
concentrados emulsivos para a pulverização dos larvários e das áreas periféricas.
Esse procedimento destrói as existentes e subseqüentes infestações larvárias nos
recipientes de água não potável, além de matar os mosquitos adultos que
freqüentam esses locais. Os inseticidas corretemente usados no tratamento perifocal
são o malation, o fenitrotion, o fention e alguns pirretroides (OMS, 2001).
A pulverização ambiental é a disseminação de gotículas microscópicas de
inseticida no ar para matar os mosquitos adultos e é usada em situação de
emergência, quando um surto de dengue já está em andamento. Geralmente, são
usadas duas formas de pulverização ambiental para o controle do A. aegypti: a
41
neblina térmica e aerossóis (neblinas quentes) e névoa de volume ultra baixo (ULV).
O malation, o fenitrotion, o fention e alguns pirretroides são utilizados nas operações
de neblina térmica. Os aerossóis e névoas de ULV envolvem a aplicação de uma
pequena quantidade de inseticida líquido concentrado (OMS, 2001).
2.5.4. Resistência a Inseticidas
Em uma população de mosquitos sob pressão de inseticidas, o
desenvolvimento de resistência é um processo inevitável, que resulta do efeito
seletivo de exposição a dosagens que matam os indivíduos suscetíveis,
sobrevivendo os resistentes, que transferem essa capacidade a seus descendentes.
Além dos vários mecanismos de resistência presentes nos insetos, que permitem
sua sobrevivência após contato com o inseticida, há outra forma, chamada de
comportamental, que define o processo de seleção de indivíduos com aptidão para
evitar total ou parcialmente o contato com doses que resultariam letais (OMS, 1986).
Os fatores envolvidos no processo de resistência podem ser agrupados em
genéticos (genes que conferem resistência), biológicos (duração do ciclo biológico e
dispersão) e operacionais (intensidade da exposição da população no tempo e
espaço e nas várias fases do ciclo biológicos) (OMS, 1976).
A experiência na utilização de inseticidas orgânicos em repetidas
aplicações para controle de mosquitos vem mostrando que a resistência a esses
produtos tem surgido após um período de anos de uso contínuo. As atividades de
controle têm requerido, então, o uso de novos inseticidas ou a sua substituição por
métodos físicos e agentes biológicos, durante o maior período possível (ref).
Medidas de manejo de resistência devem ser consideradas na construção das
estratégias de controle de vetores (OMS, 1992)
42
2.5.5. Epidemiologia
Vários surtos do Dengue já foram registrados no Brasil, entre os quais
podemos citar: os do Estado de Roraima em 1981 e 1982, com infecção pelos
sorotipos DENV-1 e DENV-4 (Travassos da Rosa et al., 1998); do Rio de Janeiro em
1986 e 1987 (Figueiredo et al., 1991); de São Paulo em 1980, 1987, 1990 e 1991
(Figueiredo et al., 1995; Figueiredo, 1999 e Nogueira etb al., 1995); Bahia (Nogueira
et al., 1995); São Luís (Vasconcelos et al., 1999) (SESA-CE, 2001).
O Estado do Ceará apresenta um histórico de casos de dengue desde
1986, com três grandes epidemias nos anos de 1987, 1994 e 2001 onde foram
confirmados 22.519, 47.789 e. 34.390 casos, respectivamente (Figura 10, p. 35). O
primeiro sorotipo DENV-1 foi isolado no ano de 1986. Em 1994 detectou-se a
presença do sorotipo DENV-2 e em março de 2002 isolou-se o DENV-3. Com a
circulação simultânea de três sorotipos, grande parte dos municípios infestados pelo
Aedes aegypti, tem registrado um crescimento de casos graves da doença (SESACE, 2006). Destaca-se também o ano de 2005 com um elevado número de casos
confirmados devido, provavelmente, a distribuição irregular das chuvas com maior
dispersão do sorotipo DENV-3. Foram confirmados laboratorialmente 22.817, em
178 municípios. Em relação ao Dengue Hemorrágico foram confirmados 194 casos
em vinte e oito municípios. Destes casos cento e setenta e cinco evoluíram para
cura e dezenove foram a óbito (SESA-CE, 2006).
Até o dia 24 de março de 2006 foram notificados 3.817 casos suspeitos
de dengue em 124 municípios. Destes, 2.220 amostras foram negativos, 1.597
casos confirmados laboratorialmente, todas processadas pelo Laboratório Central de
Saúde Pública (LACEN). Destacam-se os municípios de Fortaleza (284), Piquet
Carneiro (143), Boa Viagem (130), Forquilha (76) e Cascavel (72). Em relação ao
Dengue Hemorrágico foram confirmados seis casos, sendo um em Pacatuba, um em
Crateús, um em Beberibe, um em Fortaleza, um em Guaiuba e, um em Horizonte
(SESA-CE, 2006).
43
Figura 5. Número de casos e incidência do Dengue, no Ceará, de 1986 a 2006.
44
2.6. Óleos Essenciais e Componentes Isolados com Atividade Larvicida frente
ao Aedes aegypti
Entre as atividades dos programas de controle do Dengue, a redução dos
criadouros de larvas é a chave para manter baixas densidades da população de
Aedes aegypti, e assim reduzir os riscos de epidemia da doença (Vilarinho set al.,
2003). Já existem citações na literatura cientifica sobre o uso de óleos essenciais no
controle efetivo das larvas do mosquito A. aegypti. A seguir estão citados os
trabalhos mais recentes:
•
Foram avaliadas as atividades larvicida, adulticida, ovicida e repelente
do óleo essencial extraído de 10 plantas medicinais contra três
espécies de mosquitos: Anopheles stephensi, Aedes aegypti e Culex
quinquefasciatus. O óleo essencial de Pimpinella anisum mostrou
toxicidade contra larvas de quarto estágio de A. stephensi e A. aegypti
com valores de LD95 de 115,7 µg/mL e para C. quinquefaciatus LD95
de149,7 µg/mL (Prajapati et al., 2005).
•
A atividade larvicida do óleo essencial de Tagetes patula foi testada
contra larvas do Aedes aegypti, Anopheles stephensi e Culex
quinquenfaciatus do quarto estágio. As larvas do A. aegypti (LC50
13,57 µg/mL; LC90 37,91 µg/mL) foram as mais susceptíveis seguido
por A. stephensi (LC50 12.08 µg/mL; LC90 57,62
quinquenfaciatus
(LC50
22,33
µg/mL;
LC90
µg/mL) e Culex
71,89
µg/mL)
(Dharmagadda et al., 2005).
•
Mendoça et al., (2005) avaliaram a atividade larvicida de extratos e
óleos essencias de 17 plantas brasileiras contra larvas do mosquito
Aedes aegypti. Os óleos de Anacardium occidentalis, Copaífera
langsdorffii, Carapa guianensis, Cymbopogon winterianus e Ageratum
conyzoides mostraram forte atividade larvicida com LC50 de 14,5, 41,
57, 98 e 148 µg/L, respectivamente.
45
•
Foi demonstrado o potencial larvicida dos óleos essenciais de nove
plantas do Nordeste brasileiro. Os resultados mostraram que o óleo
de Ocimum americanum e Ocimum gratissimum tiveram LC50 de 67
ppm e 60 ppm, respectivamente. Os dados sugerem a utilização do
óleo essencial destas duas espécies de Ocimum para o controle do
vetor do Dengue (Cavalcante et al., 2004).
•
O óleo essencial de Lippia sidoides e seu constiuinte principal, o timol
(Figura 11, p. 38) mostraram boa atividade em larvas do 3o estágio de
A.aegypti (Carvalho et al., 2003).
Componentes de óleos essenciais como E-nerolidol e E,E-farnesol, que
são álcoois sesquiterpênicos; os fenilpropanóides aldeído cinâmico, eugenol e safrol
e os monoterpenos β-pineno e α-pinene apresentaram bons resultados como
larvicida contra A. aegipty (Simas et al., 2004). As estruturas destes compostos
estão mostradas na Figura 12 (p.38).
46
Figura 6. Estrutura química do timol
CH3
E
CH3
E
CH3
E
H3C
OH
H3C
H3C
CH3
CH3
OH
E,E-Farnesol
E-Nerolidol
OH
O
H
α-Pineno
Aldeído cinâmico
O
OCH3
O
Eugenol
Safrol
β-Pineno
Figura 7. Componentes de óleos essenciais com atividade larvicida contra Aedes
aegypti.
47
2.7. Diagnóstico e Tratamento do Dengue
O diagnóstico do Dengue depende de fatores clínicos e possível
exposição ao vírus, como é o caso de pessoas residentes em áreas endêmicas ou
que para lá viajam. Seu diagnóstico deve ser confirmado pelo fato das
manifestações clínicas serem semelhantes a outras doenças, como aquelas
causadas por outros arbovírus: Chikungunya, Sindbis, Ross RIver, entre outros.
Consiste no isolamento viral, detecção do antígeno e detecção do ácido nucléico
viral e sorologia para a pesquisa de anticorpos (Santos et al, 2002).
Para o isolamento viral, o sangue é coletado nos primeiros três a cinco
dias da doença. A inoculação pode ser feita através da injeção intratorácica em
mosquito ou em culturas de células de mosquito Aedes albopictus (C6/36), Aedes
pseudoscutellaris (AP-61) e Toxorhynchites amboinensis (TRA-284) seguida da
identificação por imunofluorescência empregando anticorpos monoclonais tipoespecificos (Santos et al, 2002).
O antígeno pode ser detectado no soro dos pacientes através de
imunoensaios, mas esse método se aplica somente à infecção primária devido à
interferência dos anticorpos heterólogos em infecções secundárias. A detecção do
ácido nucléico viral é feita pela transcrição reversa seguida da reação em cadeia da
polimerase (RT-PCR) tem sido aplicada no diagnóstico rápido da infecção (Santos et
al, 2002).
A sorologia para pesquisa de anticorpos pode ser feita pelos testes: Teste
de
neutralização,
inibição
da
hemaglutinação,
fixação
de
complemento,
imunofluorescência e ensaio imunoenzimático (ELISA) (De Paula e Fonseca, 2004).
Não há tratamento específico nem vacina disponível para o Dengue. Seu
tratamento é baseado na sintomatologia da infecção, uma vez que não há ações
antivirais específicas. Alguns pacientes, após a detecção de sinais indicadores da
DH (dores abdominais intensas, vômitos persistentes e inquietação ou letargia),
recorrem à terapia de reposição de fluidos e eletrólitos (OMS, 2001)
48
2.8. Plantas e Compostos Químicos Naturais com Atividade Antiviral contra o
Dengue
Alguns produtos naturais são potenciais candidatos ao controle do vírus do
Dengue:
•
Galagtomanas sulfactadas demonstraram atividade antiviral contra o
vírus da Febre amarela e do Dengue. Foram feitos testes in vitro,
onde os compostos foram acessados em células C6/36 e in vivo em
camundongos (Lucy et al., 2003).
•
Foram avaliados os efeitos antivirais, in vitro, de interferon, ribavirin,
6-azauridine e glicyrrhizina contra 11 flavivirus patogênicos ao
homem, dentre os principais: dengue, encefalite japonesa e febre
amarela. Estes compostos foram eficientes também nos testes in vivo
(Jean et al., 2002).
•
Uma série nova de híbridos da galactama extraídos da alga vermelha
Gymnogongrus torulosus, foi avaliada in vitro para suas propriedades
contra o vírus do Herpes simples (HSV-2) e o vírus do dengue
(DENV-2). Estes compostos foram muito ativos contra ambas as
viroses (Pujol et al., 2002).
•
Foram estudados os possíveis efeitos antivirais de flavonóides
extraídos das plantas mexicanas Tephrosia madrensis, Tephrosia
viridiflora e Tephrosia crassifólia contra o vírus do Dengue. Glabranine
e
7-O-methyl-glabranine
isolados
de
espécies
de
Tephrosia
exerceram um efeito dose-dependente in vitro (Sanchez et al., 2000).
•
Foi demonstrado em estudos, in vitro e in vivo, o potencial inibidor do
extrato aquoso das folhas de neem (Azadirachta indica Juss) contra a
replicação do vírus do Dengue (DENV-2), acessados em células C6/36
49
(células clonadas da larva de A.albopictus). O composto puro,
Azadiractina, não revelou inibição na replicação do vírus em ambos
os testes in vitro e in vivo (Parida et al., 2002).
•
Metabólitos isolados de invertebrados marinhos que previamente
mostraram bioatividade contra o vírus do Herpes simples (HSV-1) ou
o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), foram testados em um
novo bioensaio in vitro usando o vírus DENV-1. Os compostos
gimnocromo D e isogimnocrome D foram altamente potentes contra o
vírus da Dengue (Laille et al., 1998).
50
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar a ação antibacteriana e larvicida do óleo essencial de Tagetes erecta
L e a ação antiviral do extrato hexânico da raíz.
3.2. Objetivos Específicos
•
Extrair e identificar os constituintes químicos do óleo essencial de Tagetes
erecta;
•
Preparar o extrato hexânico da raíz de T. erecta e identificar os tiofenos por
HPLC;
•
Avaliar a atividade antibacteriana, in vitro, do óleo essencial de T. erecta
contra enterobactérias;
•
Testar a susceptibilidade das cepas bacterianas a antibióticos ativos contra
enterobactérias;
•
Estabelecer a menor concentração do óleo essencial T. erecta que inibe o
crescimento bacteriano;
•
Avaliar a atividade larvicida do óleo essencial de T.erecta frente às larvas do
Aedes aegypti e determinar a CL 50 e CL 90
•
Avaliar a atividade, in vitro, do extrato hexânico da raiz de T. erecta contra o
vírus do Dengue;
51
4. METODOLOGIA
4.1. Materias
4.1.1. Material Vegetal
A planta Tagetes erecta L., foi cultivada no horto de plantas medicinais do
Departamento de Biologia da UECE e a coleta se realizou, aproximadamente, quatro
meses após o plantio, durante o período da floração. Foi preparada uma exsicata e
depositada no Herbário Prisco Bezerra do Departamento de Biologia da UFC, sob o
número de registro 35649.
4.1.2. Microrganismos Testados
Foram utilizadas cepas de: Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031),
Escherichia coli (ATCC 25922), provenientes da American Type Culture Coletion
(ATCC), adquiridos na Fiocruz. As outras bactérias estudadas foram isoladas do
Hospital Walter Cantidio da Universidade Federal do Ceará e fornecida pelo
Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do Ceará: Klebsiella
pneumoniae (1-9), Proteus mirabilis, Enterobacter cloaceae, Serratia liquefaciens II e
Morganella morganii.
4.1.3. Ovos do Mosquito Aedes aegypti
As cartelas de ovos do Aedes aegypti utilizadas neste experimento foram
fornecidas pelo NUENDE (Núcleo de Controle de Endemias Transmissíveis por
Vetores- Secretaria de Saúde do Estado do Ceará).
52
4.1.4. Antígeno Viral
O sorotipo DENV-3 utilizado neste experimento foi isolado de amostras
sanguíneas de pacientes infectados com o vírus do Dengue. A presença do vírus foi
confirmada pelos testes de Imunofluorescência e RT-PCR (Reverse TranscriptasePolymerase Chain Reaction). Os testes foram realizados no Laboratório Central de
Saúde Pública (LACEN-CE).
4.1.5. Cultura de Células
As células C6/36 (células clonadas da larva do A. albopictus) foram
fornecidas pelo Instituto Evandro Chagas (Centro de Referência para Dengue no
Brasil) e mantidas no laboratório em meio L15 (Leibovitz’s medium).
4.1.6. Reagentes
Müeller-Hinton ágar (Acumedia) e Brain Heart Infusion (Acumedia) em
caldo foram utilizados no preparo dos meios de cultura para os testes
antimicrobianos. Os antibióticos Cefepime 30 µg (CPM), Aztreonam 30 µg (ATM),
Amicacina 30 µg (AMI) e Ciprofloxacinaa 5 µg (CIP) foram utilizados para o teste de
susceptibilidade das cepas em estudo. Para o preparo do meio L15 foi utilizado
triptona, aminoácidos, L-glutamina e os antibióticos penicilina, estreptomicina e
fungizon.
53
4.2. Métodos
4.2.1. Extração do Óleo Essencial de T. erecta
A extração do óleo essencial da parte aérea de T.erecta foi feita a partir
do material fresco, logo após sua coleta, através do método de destilação por
arraste com vapor d’água em aparelho tipo Claevenger (Craveiro et al., 1976) (Fig.
13, p. 46). O óleo após tratamento com sulfato de sódio anidro, foi acondicionado em
vidro fechado sem iluminação sob refrigeração até o momento da utilização
conforme fluxograma 1 (p. 48).
4.2.2. Análise do Óleo Essencial de T. erecta
A análise da composição química do óleo essencial foi feita em
cromatógrafo de gás–líquido, acoplado a espectrômetro de massa (CGL/EM),
equipado com coluna capilar de DB- 1 dimetil-polisiloxane com 30 m de
comprimento e 0,25 mm de diâmetro interno. Foi mantido um fluxo de 1mL/min de
hélio como gás de arraste; gradiente de aumento de 50-180 °C a 4 °C/min e 180-280
°C a 20 °C/min; temperatura do injetor de 250 °C. Os espectros de massa foram
obtidos por impacto eletrônico de 70eV (Craveiro et al.,1984).
Os constituintes químicos foram identificados a partir da indicação de
estrutura proposta pela consulta a biblioteca do espectrômetro de massa pela ordem
dos índices de Kovats (IK) e comparação visual dos espectros de massa com
espectros registrados na literatura (Adams, 2001). Os espectros apresentados neste
trabalho foram obtidos em aparelhos do Parque de Desenvolvimento Tecnológico do
Ceará (PADETEC).
54
Fonte: Davi Magalhães
Figura 8. Extrator convencional de óleo essencial.
55
4.2.3. Preparação do Extrato de Raiz de T. erecta
As raízes de T. erecta foram trituradas mecanicamente e submetidas à
extração com hexano à temperatura ambiente por uma semana. Em seguida, a
solução resultante foi filtrada e o solvente evaporado em rotaevaporador para a
obtenção do extrato hexânico (Fluxograma 2, p.48).
4.2.4. Caracterização dos Tiofenos do Extrato Hexânico de Raiz de T. erecta
Os componentes tiofênicos, do extrato da raiz, foram caracterizados por
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O extrato hexânico foi passado
numa coluna C18 e injetado no HPLC. As condições do aparelho foram descritas por
Norton et al., (1985). Como padrão foi utilizado uma solução de 2, 2’:5’, 2”terthiophene (tertienil).
4.2.5. Atividade Antibacteriana, in vitro, do Óleo Essencial de T. erecta.
O método utilizado foi o de difusão em agar (Sinclair e Dhingra, 1995 com
modificações). Placas com Müeller-Hinton ágar, foram perfuradas assepticamente
em pontos eqüidistantes, com o auxilio de um tubo de Duran (5 mm). Um swab de
algodão estéril foi mergulhado na suspensão de microorganismos contendo 1 × 108
UFC/mL (comparável ao grau 0,5 da escala de MacFarland) e passado por toda a
superfície da placa.
Um volume de 20 µL foi retirado de uma solução de 2,5 mg do óleo
essencial em 1 mL de DMSO e colocado nos poços (Celiktas et al., 2005). As placas
foram incubadas a 37 °C por 24 horas, imediatamente, após esse período a leitura
dos halos de inibição formados foi realizada com o auxílio de um paquímetro. Todos
os testes foram realizados em triplicata
56
Fluxograma 1. Metodologia de extração do óleo essencial da parte aérea de T.
erecta
Parte aérea
Extração do óleo essencial por
arraste com vapor d’água
Óleo e Água
Separação
Óleo + traço d’água
Hidrolato
Na2SO4 anidro
Óleo essencial
Análise por CG/EM
Identificação e Quantificação
Fluxograma 2. Metodologia para obtenção do extrato hexânico de raiz de T. erecta
Raízes
Percolação com hexano (1 semana)
Evaporação do solvente
Extrato hexânico
Torta
Descartada
57
Foram consideradas cepas susceptíveis aquelas que tiveram halo de
inibição superior ou igual a 7 mm (Nascimento et al., 2000).
Para determinar a MIC( concentração mínima inibitória) o método utilizado
foi de macrodiluição em ágar. Foi pesado 100 mg do óleo essencial de T.erecta e
diluído em 1% de DMSO. Em seguida, foi acrescentada água estéril. Logo após, a
solução foi filtrada em membrana de millipoli® de 0,22 µm.
Nesse teste foram feitas diluições sucessivas do óleo essencial, partindo
da “concentração mãe” de 100 mg/mL. Em frascos estéries contendo, em cada, 24
mL de meio MH foram adicionados 1 mL das diluições, finalizando as seguintes
concentrações: 4 .mg/mL (1:1), 2 mg/mL (1:2), 1 mg/mL (1:4), 0,5 mg/mL (1:16), 0,25
mg/mL (1:32), 0,125 mg/mL (1:64), 0,062 mg/mL (1:128), 0,031 mg/mL (1:256),
0,015 mg/mL (1:512), 0,007 mg/mL (1:1024), 0,004 mg/mL (1:2048), 0,002
mg/mL(1:4096), 0,0001 mg/mL (1:8192).
Foram feitas placas das soluções acima contendo bactérias em
suspensão salina na concentração de 1 × 108 UFC/mL. As bactérias foram repicadas
com o auxílio de uma alça e as placas foram incubadas a 37 °C por 24 horas. O
teste foi feito em triplicata.
Para o controle negativo foi preparado uma placa contendo 25 mL do
meio MH e a bactéria em suspensão, a fim de se confirmar o crescimento viável do
microrganismo durante o teste.
4.2.6. Teste da Susceptibilidade das Cepas Bactérianas frente aos Antibióticos
O método utilizado foi o de Kirby-Bauer, conhecido como método de
difusão em disco. As placas de Petri, contendo meio MH são impregnadas com as
bactérias em suspensão salina (1 × 108 UFC/mL.) com a ajuda de um swab. Disco
estéril, dos diferentes antibióticos, foi depositado em pontos eqüidistantes sobre o
58
ágar, com o auxilio de uma pinça também estéril. As placas foram incubadas a 37 °C
por 24 horas, imediatamente, após esse período foram feitas às leituras dos halos.
O tamanho dos halos foi comparado com os da tabela aprovada
internacionalmente pela NCCLS (2003). A medição foi realizada com o auxílio de um
paquímetro. Todos os testes foram realizados em triplicata
4.2.7. Atividade Larvicida do Óleo de Tagetes erecta contra o Aedes aegypti
Foram utilizadas concentrações de 40, 50, 60, 80, 100, 150 ppm do óleo
essencial de T. erecta para avaliação da atividade larvicida. Uma “solução-mãe”
(200 ppm) foi preparada dissolvendo-se 40 mg do óleo em 1 mL de DMSO,
completando o volume com água até 200 mL. A partir dela foram obtidas as diversas
concentrações através de diluições.
Foi realizado controle negativo com DMSO e positivo com Temephos nas
concentrações de 150 e 40 ppm, o experimento foi realizado em triplicata e para
cada concentração foram utilizadas 25 larvas. A leitura das larvas mortas foi feita
após 6, 12, 24,36 e 48 horas (Dharmagadda et al., 2005).
4.2.8. Atividade Antiviral, in vitro, do extrato hexânico de T. erecta.
4.2.8.1. Ensaio de Citotoxicidade
Para o teste de citotoxicidade, as monocamadas de células C6/36 foram
crescidas em tubos. Diluições de 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50 e 10 ppm
do extrato hexânico de raiz de T. erecta foram acessadas às monocamadas de
células. Os tubos foram incubados a 370C por 24 horas. Foi feito observações
59
durante oito dias, verificando mudanças na morfologia celular ou efeitos tóxicos
visíveis (danos ou lise celular) através de microscópio invertido.
4.2.8.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC)
Foram adicionados aos tubos com células C6/36 infectadas com vírus
DENV-3, 10 µL das concentrações não citotoxicas do extrato hexânico de raiz de T.
erecta. Através do ensaio de imunofluorescência foi avaliado o potencial inibitório do
extrato contra a replicação do vírus do Dengue. A MIC foi considerada como mínima
concentração de extrato que teve completa inativação da infectividade do vírus do
DENV-3.
4.2.9. Análise Estatística
A CL50 e CL90 das larvas do Aedes aegypti foi calculada através da
equação da reta de regressão linear, que correlacionou à concentração do óleo
essencial (ppm) com o número de larvas mortas. O coeficiente de correlação de
Pearson e os erros padrões também foram calculados
60
5. RESULTADOS
5.1. Determinação Estrutural dos Constituintes Químicos do Óleo Essencial de
T. erecta
A análise da composição química do óleo essencial de T. erecta foi
realizada utilizando-se cromatografia de gás-líquido acoplada a espectrometria de
massa (CG/EM) (Figura 14, p 46.) e a identificação dos constituintes químicos foi
realizada por interpretação do cronograma dos índices de Kovats (IK) e comparação
visual dos espectros de massa com espectros registrados na literatura (Adams,
2001).
A tabela 1 (p.47) sumariza os constituintes químicos identificados no óleo
essencial de T. erecta. Foi possível identificar 21 compostos voláteis, referente aos
picos mais intensos do cromatograma em um total de 91,6%. Destacam-se como
majoritários a piperitona (43,3%) (Figura 22, p.50), isopulegilacetato (7,43%) (Figura
24, p.51) e mirtenol (7,25%) (Figura 20, p.49). Os espectros de massa e estruturas
dos constituintes são mostrados nas figuras 15 a 32 (p.48 a 53).
61
Figura 9. Cromatografia de gás-líquido acoplada a espectrometria de massa do óleo
essencial de T. erecta.
62
Tabela 1 – Constituintes químicos voláteis identificados no óleo essencial da parte
aérea de T. erecta.
CONSTITUINTES
IK
TR
%OETE
Limoneno
1029
9,48
4,17
β-(Z) ocimeno
1037
9,93
0,50
β-(E) ocimeno
1050
10,38
1,20
Terpinoleno
1089
12,08
2,50
Linalool
1097
12,82
0,48
Mirtenol
1196
15,00
7,25
Óxido de limoneno
1134
16,62
0,61
Piperitona
1253
21,12
3,30
E-anetol
1283
22,42
1,22
Isopulegilacetato
1281
23,06
7,43
Timol
1290
23,21
2,10
Piperitenona
1343
25,35
5,46
(E)-metil- eugenol
1401
28,79
1,09
Trans- β-cariofileno
1418
29,29
6,65
E(β)Farneceno
1459
31,40
2,03
Biciclogermacreno
1500
33,15
1,89
Nerolidol
1533
36,61
0,88
Espatulenol
1578
37,05
0,69
Oxido de Cariofileno
1583
37,24
0,65
48,91
0,38
51,63
1,02
Dióxido do limoneno
Fiitol
TOTAL
1943
91,6
Ik – índice Kovats obtidos na literatura (Adams, 2001); TR – Tempo de retenção;
%OETE- Porcentagem dos constituintes químicos do óleo essencial de T. erecta.
63
Figura 10. Espectro de massa do Limoneno.
Figura 11. Espectro de massa do Z-Ocimeno
Figura 12. Espectro de massa do E-Ocimeno
64
Figura 13. Espectro de massa do Terpinoleno
Figura 14. Espectro de massa do Linalol.
Figura 15. Espectro de massa do Mirtenol.
65
Figura 16. Espectro de massa do Oxido de Limoneno.
Figura 17. Espectro de massa da Piperitona.
Figura 18. Espectro de massa do E-anetol
66
.
Figura 19. Espectro de massa do Isopulegilacetato.
Figura 20. Espectro de massa do Timol.
Figura 21. Espectro de massa da Piperitenona.
67
OMe
OMe
Figura 22. Espectro de massa do Metil-eugenol.
Figura 23. Espectro de massa do Trans-βcariofileno.
Figura 24. Espectro de massa do E-β-Farnesene.
68
Figura 25. Espectro de massa do Biciclogermacrene.
Figura 26. Espectro de massa do Nerolidol.
Figura 27. Espectro de massa do Spatulenol
69
Figura 28. Espectro de massa do Oxido de cariofilenol
Figura 29. Espectro de massa do Dióxido de limoneno.
Figura 30. Espectro de massa do Fitol.
70
5.2. Análise por HPLC dos componentes do extrato hexânico da raíz de T.
erecta.
O extrato hexânico total foi passado numa coluna C18 e injetado no HPLC. O
cromatograma mostrado na figura 33 (p.56) apresenta quatro picos. O constituinte
químico representado no pico 1 foi identificado como tertienil por co-injeção de
amostra autêntica adquirida da Sigma. Não foi possível identificar os demais
constituintes.
5.3. Atividade Antibacteriana, in vitro, do Óleo Essencial de T. erecta
A tabela 2 (p.57) apresenta os valores dos halos de inibição (mm)
observados para o óleo essencial de T. erecta frente aos microrganismos Klebsiella
pneumoniae (ATCC 10031), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae
(1-9), Proteus mirabilis, Enterobacter cloaceae, Serratia liquefaciens II e Morganella
morganii, após 24 horas de incubação a 37ºC. O experimento foi realizado em
triplicata.
71
Figura 33. Cromatograma do extrato hexânico de T. erecta obtido no HPLC
72
Tabela 2. Resultado, das médias, dos halos de inibição (mm) da atividade
antibacteriana do óleo de T.erecta .
Microorganismos
Halo de inibição (mm)
Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031)
18,6
Klebsiella pneumoniae (ACNE)
13,8
Klebsiella pneumoniae 1
12,6
Klebsiella pneumoniae 2
19,5
Klebsiella pneumoniae 3
13,6
Klebsiella pneumoniae 4
14,6
Klebsiella pneumoniae 5
17,5
Klebsiella pneumoniae 6
15,3
Klebsiella pneumoniae 7
24,0
Klebsiella pneumoniae 8
11,0
Klebsiella pneumoniae 9
18,8
Escherichia coli (ATCC 25922)
19,0
Proteus mirabilis
14,3
Enterobacter cloaceae
14,1
Serratia liquefaciens II
32,3
Morganela morganii
22,3
73
De acordo com os resultados obtidos o óleo essencial de T. erecta, por
apresentar atividade contra todos os microrganismos testados, possui potencial
antibacteriano na concentração de 2,5 mg/mL, mostrando zona de inibição superior
a 7 mm (Figura 34, p. 59). Em relação à Serratia liquefaciens II, Klebsiella
pneumoniae 7 e Morganela morganii, com halos de 32,3, 24,0 e 22,3 mm,
respectivamente, o óleo essencial apresentou os maiores resultados de inibição.
Entretanto, para Klebsiella pneumoniae 8 (11,0 mm), o óleo demonstrou a menor
inibição.
5.4. Teste de Susceptibilidade das Cepas Bactériana frente aos Antibióticos
Neste estudo, foi investigada a prevalência da resistência de membros da
família Enterobacteriaceae, isolados clínicos e cepas padrões, frente a quatro tipos
de antibióticos destinados ao tratamento desses microrganismos. A tabela 3 (p.60)
mostra o tamanho dos halos de inibição padronizados pela NCCLS (2003) para cada
tipo de antibiótico: cefepime, aztreonam, amicacina e ciprofloxacina.
Os resultados da susceptibilidade das cepas bacterianas frente aos
antibióticos estão apresentados na tabela 4 (p.60). O método usado foi o de difusão
em disco.
74
Figura 34. O gráfico mostra os halos de inibição das bactérias, sendo susceptíveis
ao óleo de T. erecta quando apresentam um halo superior a 7 mm. (Kp – Klebsiella
pneumoniae; E.c – Escherichia coli; P.m – Proteus mirabilis; E.clo – Enterobacter
cloaceae; S.l II – Serratia liquefacies; M.m – Morganela morganii.
75
Tabela 3. Resultados dos halos de inibição (mm) dos antibióticos, cefepime (CPM),
aztreonam (ATM), amicacina (AMI) e ciprofloxacina (CIP), de acordo com NCCLS.
ANTIBIOTICOS
Resistente
Intermediário
Sensível
COM
≤14 mm
15-17 mm
≥ 18 mm
ATM
≤15 mm
16-21 mm
≥ 22 mm
AMI
≤14 mm
15-16 mm
≥ 17 mm
CIP
≤15 mm
16-20 mm
≥ 21 mm
Tabela 4. Resultados dos halos de inibição (mm) dos antibióticos, cefepime,
aztreonam, amicacina e ciprofloxacina, contra cepas bacterianas.
Halos de inibição (mm)
Bactérias
K pneumoniae
(ATCC 10031)
K pneumoniae
(ACNE)
Klebsiella
pneumoniae 1
Klebsiella
pneumoniae 2
Klebsiella
pneumoniae 3
Klebsiella
pneumoniae 4
Klebsiella
pneumoniae 5
Klebsiella
pneumoniae 6
Klebsiella
pneumoniae 7
Klebsiella
pneumoniae 8
Klebsiella
pneumoniae 9
Escherichia coli
(ATCC 25922
Proteus
mirabilis
Enterobacter
cloaceae
Serratia
liquefaciens II
Morganela
morganii
CPM
ATM
AMI
CIP
30,0 S
32,0 S
20,0 S
31,0 S
38,0 S
38,0 S
25,0 S
40,0 S
29,0 S
31,0 S
20,0 S
24,0 S
23,5 S
31,0 S
20,0
S
24,0 S
9,0 R
10,0 R
18,0 R
7,5 R
32,0 S
32,0 S
15,0 I
(-)
15,0
I
20,5
I
33,0 S
14,0
R
14,0
R
10,0
R
12,0 R
(-)
25,0
S
30,0
S
23,5 S
26,0
11,5
R
11,0
R
12,5 R
(-)
31,5
S
33,5
S
22,2 S
28,6
S
40,0
S
40,0
S
29,0
S
40,0
S
S
33,0 S
19,0 I
24,0 S
(-)
34,0 S
36,0 S
22,0 S
34,0 S
(-)
(-)
13,0 R
14,0 R
S sensível; I- intermediário; R- resistente; (-) não houve inibição
28,0
S
19,0 S
35,5
S
18,5 I
76
Cefepime (CPM); aztreonam (ATM); amicacina (AMI); ciprofloxacina (CIP)
De acordo com a tabela 4 (p.60), três bactérias (Klebsiella pneumoniae 3,
6 e 8), isoladas de ambiente hospitalar, se mostraram resistentes a todos os
antibióticos. Oitos cepas foram sensíveis a todos antibióticos, dentre elas: duas
cepas padrões de Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031), Klebsiella pneumoniae
(ACNE) e uma de Escherichia coli (ATCC 25922). Dos isolados clínicos Klebsiella
pneumoniae 1, 2, 7 e 9 e Enterobacter cloaceae apresentaram susceptibilidade.
Cinco cepas mostraram ação variada diante dos diferentes antibióticos, as Klebsiella
pneumoniae 4 e 5, Proteus mirabilis, Serratia liquefaciens II e Morganela morganii.
A figura 35 (p. 62) mostra a percentagem de suscetibilidade dos vários
microrganismos aos diferentes antibióticos. Com base nos resultados obtidos o
Amicacina (AMI) é o mais potente para as enterobacterias desse estudo, com 75%
dos microrganismos susceptíveis a ele. 37,5% das bactérias foram mais resistentes
ao antibiótico Ciprofloxacina (CIP) que mostrou a menor ação inibitória.
77
Figura 35. O gráfico mostra a percentagem de enterobacteriacea susceptível; (
intermediário (
) e resistente (
)
) aos diferentes antibióticos: cefepime (CPM),
aztreonam (ATM), amicacina (AMI) e ciprofloxacina (CIP).
78
5.5. Comparação entre a Ação Bacteriana do Óleo de T. erecta com a dos
Antibióticos
A figura 36 (p.65) representa uma comparação entre a susceptibilidade
das bactérias ao óleo essencial de T.erecta e o antibiótico cefepime (CPM). A ação
antibacteriana induzida pelo óleo essencial foi igual ao do CPM em oito bactérias:
Klebsiella. pneumoniae (ATCC 10031), K. pneumoniae 2, 3, 5, 7, 8, 9 e Escherichia
coli (ATCC 25922). Em cinco bactérias: K. pneumoniae (ACNE), K. pneumoniae 1, 4,
Proteus mirabilis e Enterobacter cloaceae, a ção do óleo foi menor. Ação superior do
óleo foi visto contra K. pneumoniae 6, Serratia liquefaciens II e Morganela morganii.
Os dados pertencentes à comparação entre o potencial antimicrobiano do
óleo essencial e do antibiótico aztreonam (ATM) contra as cepas bacterianas estão
apresentados na figura 37 (p.66). O óleo teve ação igual em cinco cepas, das quais
podemos citar: Klebsiella pneumoniae 3, 5 7, 8 e Morganela morganii. A ação
induzida pelo óleo foi inferior ao ATM em nove bactérias: Klebsiella. pneumoniae
(ATCC 10031), Klebsiella pneumoniae (ACNE), Klebsiella. pneumoniae 1, 2, 4 e 9,
Escherichia coli (ATCC 25922), Proteus mirabilis e Enterobacter cloaceae. Ação
superior do óleo foi observado em Klebsiella pneumoniae 6 e Serratia liquefaciens II.
Os resultados da comparação entre a susceptibilidade das bactérias ao
óleo essencial e do antibiótico Amicacina (AMI) estão mostrados na figura 38 (p.67).
A ação antibacteriana induzida pelo óleo essencial foi igual ao da AMI em onze
bactérias: Klebsiella. pneumoniae (ATCC 10031), K. pneumoniae 2, 3, 4, 5, 7, 8, e 9,
Escherichia coli (ATCC 25922), Serratia liquefaciens II e Morganela morganii.. Em
quatro bactérias: K. pneumoniae (ACNE), K. pneumoniae 1, Proteus mirabilis e
Enterobacter cloaceae a ação do óleo foi menor. Ação superior do óleo foi visto
contra K. pneumoniae 6,
79
A figura 39 (p.68) mostra a comparação entre o potencial antimicrobiano
do óleo e do antibiótico ciprofloxacina (CIP) contra as cepas bacterianas. O óleo teve
ação igual em tres cepas, das quais podemos citar: Klebsiella pneumoniae 3, 7, e
Serratia liquefaciens II A ação induzida pelo óleo foi inferior ao CIP em sete
bactérias: Klebsiella. pneumoniae (ATCC 10031), Klebsiella pneumoniae (ACNE),
Klebsiella. pneumoniae 1, 2, e 9, Escherichia coli (ATCC 25922) e Enterobacter
cloaceae. Ação superior do óleo foi observada com Klebsiella pneumoniae 4, 5, 6 e
8,. Morganela morganii e Proteus mirabilis
80
Figura 36. Estudo comparativo da suscetibilidade das cepas bacterianas frente ao
óleo essencial de T. erecta (
) e ao antibiótico cefepime (
), avaliado pelo
tamanho dos halos de inibição. (Kp – Klebsiella pneumoniae; E.c – Escherichia coli;
P.m – Proteus mirabilis; E.clo – Enterobacter cloaceae; S.l II – Serratia liquefacies;
M.m – Morganela morganii; S – sensível, R – resistente, I – Intermediário; (-) não
houve inibição).
81
Figura 37. Estudo comparativo da suscetibilidade das cepas bacterianas frente ao
óleo essencial de T. erecta (
) e ao antibiótico Aztreonam (
), avaliado pelo
tamanho dos halos de inibição (Kp – Klebsiella pneumoniae; E.c – Escherichia coli;
P.m – Proteus mirabilis; E.clo – Enterobacter cloaceae; S.l II – Serratia liquefacies;
M.m – Morganela morganii; S – sensível, R – resistente, I – Intermediário, (-) não
houve inibição).
82
Figura 38. Estudo comparativo da suscetibilidade das cepas bacterianas frente ao
óleo essencial de T. erecta (
) e ao antibiótico Amicacina (
), avaliado pelo
tamanho dos halos de inibição (Kp – Klebsiella pneumoniae; E.c – Escherichia coli;
P.m – Proteus mirabilis; E.clo – Enterobacter cloaceae; S.l II – Serratia liquefacies;
M.m – Morganela morganii; S – sensível, R – resistente, I – Intermediário, (-) não
houve inibição).
83
Figura 39. Estudo comparativo da suscetibilidade das cepas bacterianas frente ao
óleo essencial de T. erecta (
) e ao antibiótico Amicacina (
), avaliado pelo
tamanho dos halos de inibição (Kp – Klebsiella pneumoniae; E.c – Escherichia coli;
P.m – Proteus mirabilis; E.clo – Enterobacter cloaceae; S.l II – Serratia liquefacies;
M.m – Morganela morganii; S – sensível, R – resistente, I – Intermediário, (-) não
houve inibição).
84
5.6. Avaliação da Concentração Mínima Inibitória (MIC)
Tabela 5. Determinação da concentração mínima inibitória do óleo essencial de T.erecta
frente à Klebsiella pneumoniae 6
Concentração mínima inibitória (mg/mL)
Bactéria
4
Klebsiella
pneumoniae
6
2
- -
1
-
0,5
0,25
0,125
+ + +
0,062
0,031
0,015
0,007
0,004
0,002
0,00
01
+
+
+
+
+
+
+
(+) Houve crescimento bacteriano; (-) Não houve crescimento bacteriano
Os resultados, expressos em média, para a concentração inibitória
mínima (MIC) do óleo essencial de T.erecta estão dispostos na tabela acima. O MIC
foi avaliado para a Klebsiella pneumoniae 6, pois essa cepa foi resistente a todos os
antibióticos e o óleo se mostrou efetivo contra essa bactéria (Figura 40, p.70).
Concentrações abaixo de 1 mg/mL do óleo essencial de T.erecta não inibiu o
crescimento
bacteriano
de
Klebsiella
pneumoniae
6,
na
suspensão
de
microorganismos contendo 1 × 108 UFC/mL. Assim o MIC do óleo essencial foi de 1
mg/mL.
85
Figura 40. Halos de inibição (mm) do óleo essencial de T.erecta, contra a bactéria
Klebsiella pneumoniae 6, obtido pelo método de difusão em agar.
86
5.7. Teste da Atividade Larvicida do óleo de Tagetes erecta contra o Aedes
aegypti
Os resultados do número de larvas mortas, expressos em médias, do
Aedes aegypti com o aumento da concentração do óleo e com respectivos intervalos
de tempo são apresentados na tabela 6 (p.71). Foi feito controle negativo com
DMSO e positivo com o Temefos, utilizando a maior e menor concentração usada
pelo óleo Para cada concentração foram utilizadas 25 larvas e.os testes foram
realizados em triplicatas.
Tabela 6. Atividade larvicida do óleo essencial de T. erecta contra larvas de terceiro
estagio do Aedes aegypti
Tempo
Concentração do óleo (ppm)/
quantidade de larvas mortas
150
100 80 60
50
40
Controle
positivo (ppm)
150
40
Controle
negativo
150
6h
25
20
11
3
2
1
25
25
0
12 h
25
20
12
3
3
3
25
25
0
24 h
25
21
14
4
3
3
25
25
0
36 h
25
22
15
4
5
5
25
25
2
48 h
25
23
15
5
5
7
25
25
2
Controle positivo: Temephos
Controle negativo: DMSO (ppm)
Na concentração de 150ppm do óleo essencial houve 100% de
mortalidade das larvas do Aedes Aegypti, fato observado também no controle
positivo, o inseticida Temephos, que se mostrou efetivo também na concentração
mais baixa (40 ppm).
87
Em detrimento da variável tempo (6, 12, 24, 36 e 48 horas de observação)
não houve variação significativa do número de larvas mortas, fato observado em
todas as concentrações (tabela 6). Em seis horas de experimento o óleo essencial T.
erecta apresentou uma alta toxicidade contra as larvas em 150 ppm.
A figura 41 (p.73) mostra o coeficiente de correlação e a equação da reta
de regressão que correlacionou o número de larvas mortas com a concentração. Foi
observada uma correlação positiva entre o aumento da concentração do óleo
essencial e o numero de larvas mortas, ou seja, a relação da mortalidade foi
diretamente proporcional à concentração do óleo. Os desvios padrões também
foram calculados.
O resultado das médias do numero de larvas mortas do A. aegypti, após
24 horas do experimento, nas diferentes concentrações foram utilizadas para o
cálculo da equação de regressão, que possibilitou determinar a concentração letal
de 50% e 90% (LC50 e LC90) mostrados na tabela 7 (p.72).
Tabela 7. O efeito do óleo essencial de T. ereta contra larvas do A. aegypti
após 24 h.
Larvas de
LC 50
LC 90
85,80 ppm
127,23 ppm
Aedes aegypti
LC50 = Concentração letal que mata 50 % da população de larvas.
LC90 = Concentração letal que mata 90 % da população de larvas.
Mortalidade
88
35
30
25
20
15
10
5
0
-5 0
y = 0,2293x - 6,6748
2
R = 0,8992
50
100
150
200
Concentração
Figura 41. Reta de regressão obtida do número de larvas de Aedes aegypti mortas
e as concentrações do óleo essencial de T.erecta após 24 h. (Equação da reta:
y=0,2293x – 6,6748, sendo y o número de larvas mortas e x a concentração do óleo
essencial de T.erecta; Coeficiente de correlação: R2=0,8992).
89
5.8. Atividade Antiviral in vitro
5.8.1. Ensaio de Citotoxicidade para T. erecta frente às Células C6/36 do
Mosquito A. albopictus.
Para o teste de citotoxicidade, as monocamadas de células C6/36 foram
crescidas em tubos. Diluições de 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 e 2000 ppm
do extrato das raízes de T.erecta foram acrescentadas às células. Foram feitas
observações diárias verificando mudanças na morfologia celular ou efeitos tóxicos
visíveis através de microscópio invertido.
Os resultados demonstraram que o extrato da raiz de T. erecta nas
concentrações de 1000 e 2000 ppm é tóxico para as células, apresentou lise celular,
demais concentrações não apresentaram toxicidade.
5.8.2. Concentração Inibitória Mínima (MIC) do Extrato Hexânico de T.erecta
Foi adicionado a tubos contendo células C6/36 infectadas com vírus DENV-3, o
extrato da raiz de T. erecta em concentrações não tóxicas para as células, ou seja,
500, 400, 300, 200, 100, 50 e 10 ppm. A presença do vírus foi confirmada pelo
ensaio de imunofluorescência.
O extrato da raiz conseguiu inibição viral de 100% nas concentrações de 500
a 200 ppm, fato não observado para as outras concentrações (Figura 42, p.87). A
MIC foi de 200 ppm, ou seja, a menor concentração que apresentou completa
inativação do vírus, confirmado por imunofluorescência como mostra a figura 43,
p.87
90
PV
PV
PV
Figura 42. Ensaio de Imunofluorescência: replicação viral do sorotipo DENV-3 nas
células C6/36 com 10 ppm do extrato de raiz de T. erecta (PV:presença do virus).
AV
AV
91
Figura 43. Ensaio de Imunofluorescência: 100% de inibição viral com a MIC (200
ppm) do extrato de raiz de T. erecta (AV: ausência de vírus)
6.DISCUSSÃO
6.1. Atividade Antibacteriana
Os
óleos
essenciais
são
fontes
potenciais
de
componentes
antimicrobianos. O mecanismo de ação antibacteriana dos óleos essenciais tem
usado uma metodologia comum, que ilustra os efeitos deletérios sobre a membrana
celular, por exemplo, permeabilidade e força protomotiva (Ultee et al., 1999).
Estudos demonstram que óleos essenciais com ação antibacteriana mostram-se
mais ativos contra cepas Gram positivas do que Gram negativas (Delaquis et al.,
2002; Mann et al., 2000), sugerindo que bactérias Gram negativas são mais
tolerantes a ação do óleo por apresentarem uma membrana externa que poderia
estar agindo como uma barreira impedindo a passagem das substâncias ativas
presentes no óleo. Vale ressaltar que as cepas bacterianas avaliadas neste estudo
são bacilos Gram negativos (enterobactérias) e o óleo essencial de T. erecta foi
efetivo contra todas as cepas (Tabela2, p.57). O método usado no estudo para
avaliar o potencial antibacteriano do óleo essencial foi o de difusão em ágar, que
segundo Natarajan et al., (2005) é o método mais adequado para estudar a atividade
antibacteriana de substâncias ativas presentes nos extratos.
Pesquisas sobre o potencial antibacteriano do óleo essencial da espécie
T. erecta são escassas na literatura científica. Podemos citar o estudo realizado por
Grover et al., (1978) que demonstraram a atividade antibacteriana do óleo essencial
das folhas de T. erecta contra bactérias Gram positivas (Bacillus subtilis e Bacillus
anthracis). Posteriormente, Garg et al., (1986) confirmaram esses resultados, pois
também testaram o óleo dessa mesma espécie frente as bactérias: Bacillus species,
Sataphylococcus albus e Bacillus subtilis ATCC 6633. Ainda foi observado a ação do
92
óleo contra bactérias Gram negativas: Salmonella, Shigella, Vibrio, Xanthomonas e
Escherichia coli ATCC 25922 e os resultados foram positivos. O óleo essencial
utilizado nesses experimentos foram obtidos de folhas de T. erecta oriundas da
Índia.
Hartarti et al., (1999) testaram o óleo essencial das folhas de T. erecta,
oriunda da Indonésia, contra bactérias Gram positivas e negativas. O óleo foi eficaz
contra B. subtitilis ATCC 6633 e não teve ação contra E. coli ATCC 25922. O
constituinte marjoritário desse óleo foi a piperitona. Resultado que se contrapõe
diante do obtido neste experimento, tendo em vista que, as cepas bacterianas
avaliadas são bacilos Gram negativos e entre elas a E. coli ATCC 25922 (Tabela 2,
p.57), a mesma cepa utilizada por Hartarti. O óleo essencial de T. erecta, oriundo do
Ceará, contém também a piperitone como principal constituinte. De acordo com
Shahverdi et al., (2004) a piperitone é usada para aumentar a atividade
antibacteriana de dois antibióticos, nitrofurano e furazolidone, contra isolados
clínicos de enterobacterias.
Segundo pesquisas o óleo essencial possue atividade antibacteriana
maior que a mistura dos compostos marjoritários (Gill et al., 2002; Mourey e
Cannillac, 2002), sugerindo que componentes minoritários podem ser críticos para a
atividade antibacteriana do óleo. De acordo com os resultados da análise química do
óleo essencial de T. erecta deste estudo, o timol, linalool, limoneno, β-cariofileno e
piperitenon aparecem como componentes minoritários (Tabela 1, p.47) que possuem
ação antibacteriana comprovada (Skocibusic et al., 2006; Oliveira et al., 2006;
Ozturk e Ercisli, 2006). Esses compostos podem estar agindo em sinergismo com a
piperitona e juntos são responsáveis pelo caráter antimicrobiano do óleo essencial
de T. erecta oriundo do Ceará, o que pode explicar a diferença de ação do óleo
essencial de espécies Tagetes.
Muitas infecções do trato gastrointestinal e urinário são causadas por
membros da família das Enterobacteriaceae. Infecções por cepas resistentes dessas
bactérias podem ocasionar sérios problemas de saúde (Shahverdi, et al., 2004). Tal
fato causa preocupação, por conta do grande número de pacientes debilitados em
hospitais, com imunidade suprimida, que sujeitos a essas infecções podem vir a
óbito (Nascimento, 2000). Segundo Brooks et al., (2000) o uso excessivo de agentes
93
antimicrobianos, particularmente em pacientes hospitalizados, leva a supressão de
microrganismos sensíveis a fármacos na microbiota intestinal, favorecendo assim a
persistência e o crescimento de bactérias resistentes, incluindo Enterobacter,
Klebsiella, Proteus, Pseudomonas e Serratia.
Neste estudo foi verificada a resistência das bactérias, isolados clínicos,
Klebsiella pneumoniae 3, 6 e 8 aos quatro antibióticos: cefepina, aztreonam,
amicacina e ciprofloxacina comumente utilizados para o tratamento das infecções
(tabela 4, p.60). Este resultado não foi surpreendente, uma vez que, a resistência de
Klebsiella a antibióticos já vem sendo conhecida e relatado por pesquisadores do
mundo todo. O tratamento dessas bactérias tem se tornado difícil pela a existências
de cepas carregando plásmidio, que codificam enzimas conhecidas como
betalactamases, que conferem multiresistências as cepas.
Essa situação tem
aumentado e causado sérios problemas a níval mundial com taxas de incidência
variando de 5% nos Estados Unidos (Seid e Astrat, 2005) e 16% na Europa
(Pudschun et al., 1998). Os maiores índices tem sido observados em surtos
epidêmicos hospitalares (Martinez-Martinez et al., 1996). No entanto, a bactéria K.
peneumoniae 6 apresentou susceptibilidade ao óleo essencial de T. erecta,
resultado bastante promissor, no que se refere, a resistência de Klebsiella a agentes
antimicrobianos. Portanto, o óleo essencial de T. erecta surge como uma fonte
natural farmacologicamente ativas, capaz de combater cepas resistentes de
enterobactérias.
As enterobactérias estão entre as bactérias mais comuns que provocam
doenças, ao lado dos estafilococos e estreptococos (Brooks et al, 2000). Também
tem papel importante nas diarréias e desinterias, especialmente na população
infantil (Cáceres et al., 1993). Fato que torna os resultados obtidos encorajadores,
quando se propuser o uso do óleo essencial como uma alternativa para o tratamento
dessas infecções. É sabido que mais estudos são necessários antes de se usar o
óleo essencial de T. erecta como recurso terapêutico no tratamento dessas
infecções, uma vez que, se faz necessário o estudo da toxicidade dessa planta,
experimento que ainda não é relatado na literatura cientifica.
6.2. Atividade Larvicida
94
Vários trabalhos procuram comprovar o potencial larvicida de diversos
óleos essenciais, inclusive de espécies do gênero Tagetes. Pathak et al., (2000)
demonstraram a suscetibilidade de larvas do A. aegypti ao óleo essencial das folhas
de T. erecta, encontrando uma LC90 de 26 ppm. Dharmagadda et al., (2005),
estudando a T. patula obtiveram uma LC50 de 13,57 e LC90 de 37,91 ppm,
apresentando como constituintes majoritários: limoneno (13,6%), terpinoleno
(11,2%), Z-β-ocimeno (8,3%) e E-cariofileno (8,0%). Já a T. erecta, utilizada neste
experimento, mostrou valores de LC50 de 85,80 ppm e LC90 de 127,23 ppm (Tabela
7, p.72), apresentando a piperitona, isopulegilacetato e mirtenol como majoritários
(Tabela 1, p.47 ).
Mudança na atividade inseticida e composição química em espécies
Tagetes é comum. Fatores como localização geográfica, parte da planta usada para
extração, etapas de desenvolvimento da planta, solvente usado para extração,
fotosensibilidade de alguns compostos no extrato e métodos usados para extração
do óleo essencial, podem interferir na atividade do óleo essencial (Dharmagadda et
al., 2005).
O potencial larvicida dos óleos essenciais das espécies do gênero
Tagetes pode ser atribuído à presença dos terpenóides, ou seja, quanto maior for a
quantidade de terpenóides maior será a ação (Dharmagadda et al., 2005). Os
terpenóides são caracterizados na literatura científica por apresentar uma forte
atividade larvicida frente ao mosquito Aedes aegypti, como por exemplo, o fenil
propanóide (http://www.sbq.org.br/ranteriores/23/resumos/0599-1/index.html).
De acordo com os resultados mostrados na tabela 6 (p.71) o óleo
essencial de T. erecta na concentração de 150 ppm apresentou a mesma ação do
inseticida Temephos, com 100% de mortallidade das larvas do A. aegypti. As ações
de vigilância desenvolvidas no Brasil, já mostram um quadro bastante preocupante
de resistência do A. aegypti ao Temephos após um período continuo de uso
(Donalísio e Glasser 2002). Em uma população de mosquitos sob pressão de
inseticidas, o desenvolvimento de resistência é um processo inevitável, que resulta
95
do efeito seletivo de exposição a dosagens que matam os indivíduos suscetíveis,
sobrevivendo os resistentes, que transferem essa capacidade a seus descendentes.
Portanto, a busca de novos produtos, seguro ao meio ambiente, como alternativa
estratégica de controle vetorial se faz necessário. A partir dos resultados sugerimos
a utilização do óleo de T. erecta como uma alternativa natural contra o vetor do
Dengue no estado do Ceará.
6.3. Atividade Antiviral
As viroses, invariavelmente, ocupam posição de destaque como fator
causador de doenças em humanos. O Dengue é hoje a mais importante arbovirose e
constitui um sério problema de saúde pública no mundo, especialmente em regiões
tropicais
onde
existem
condições
de
meio
ambiente
favoráveis
para
o
desenvolvimento e a proliferação do Aedes aegypti, principal mosquito vetor. A
hiper-endemia em muitas regiões do mundo tem aumentado a ocorrência de formas
mais severas como Dengue Hemorrágico (DHF) e a Síndrome do Choque do
Dengue (DSS) (Poersch et al., 2004).
O extrato hexânico de raíz de Tagetes erecta, oriunda do estado do Ceará,
apresentou ação antiviral contra o DENV-3, atividade que provavelmente se deve à
presença de tiofenos nas raízes, resultado confirmado através da análise por HPLC,
mostrado na figura 33 (p. 56). Os tiofenos são portadores de atividade antiviral
contra Murine Cytomegalovirus (MCMV) e Sindbis virus (SV) (Hudson, 1989). O
extrato apresentou completa inativação do vírus nas concentrações de 200, 300, 400
e 500 ppm.
Os medicamentos à base de plantas, os fitoterápicos, vêm ganhando um
espaço cada vez maior no tratamento de diversas doenças em humanos, por
apresentarem baixo custo, pouca toxicidade e facilidade de acesso (Nogueira et al.,
1995). Até o presente momento não existe nenhum tratamento preventivo ou
curativo do Dengue. Os programas de controle do inseto transmissor, através da
aplicação de repelentes e larvicidas, têm melhorado bastante o quadro geral de
96
epidemias, no entanto, não é prática definitiva para controlar o surto no estado do
Ceará. Portanto, a descoberta de um produto natural com atividade antiviral,
possível fitoterápico, é um passo muito importante no combate a esta doença e uma
economia para o estado.
7. CONCLUSÒES
O estudo da constituição química do óleo essencial da parte aérea de
Tagetes erecta L. permitiu a identificação de onze constituintes voláteis, sendo a
piperitona o majoritário, além de terpenóides: Limoneno, Z-Ocimeno, E-Ocimeno e
terpinoleno, entre outros. O extrato hexânico da raiz revelou a presença α-tertienil.
As dezesseis cepas bacterianas usadas neste experimento mostraram-se
susceptíveis ao óleo essencial de T. erecta (halo de inibição superior a 7 mm) na
concentração de 2,5 mg/mL. Resultado que corrobora o potencial antibacteriano do
óleo essencial de T. erecta contra enterobactérias, tendo em vista que, os
antibióticos amicacina, aztreonam, cefepina e ciprofloxacina, comumente utilizados,
são usados na forma pura.
O óleo essencial de T. erecta apresentou também atividade contra as
larvas do Aedes aegypti em seis horas. Na concentração de 150 ppm o óleo obteve
ação similar ao do inseticida Temephos, despontando como um produto alternativo
no combate ao Dengue.
O extrato de raiz de T. erecta demonstrou uma ação antiviral contra o
DENV-3. Este trabalho abre um caminho para a produção de um fitoterápico e
assim, proporcionar uma alternativa de combate ao Dengue..
97
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