Manipulação das concentrações peri

Angela Maria Gonella-Diaza é graduada em medicina veterinária e
zootecnista pela “Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales,
UDCA” em Bogotá, Colômbia.
Possui mestrado em Ciências da Saúde Animal da “Univeridad Nacional
de Colombia” em Bogotá Colômbia. Atualmente cursa o Doutorado no
Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de medicina
veterinária e zootecnia da Universidade de São Paulo, campus
Pirassununga.
Linha de trabalho: Fisiologia e endocrinologia molecular.
Manipulação das concentrações peri-ovulatórias de esteroides sexuais afetam a
expressão gênica do oviduto em vacas Nelore
Angela Maria Gonella-Diazaa; Sónia Cristina da Silva Andradeb; Saara Carolina
Scolaria; Mariana Sponchiadoa; Guilherme Pugliesia; Fernando Silveira Mesquitac; Gustavo
Gasparinb; Luiz Lehmann Coutinhob; Mario Binellia
a
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo,
Pirassununga, SP, Brasil.
b
Laboratório de Biotecnologia Animal, ESALQ, Universidade de São Paulo,
Piracicaba, SP, Brasil.
c
Universidade Federal do Pampa, Faculdade de Medicina Veterinária, Uruguaiana,
Brasil.
*Autor para correspondência: [email protected]
INTRODUÇÃO
As tubas uterinas ou ovidutos são estruturas pares que são responsáveis pelo transporte
de gametas e embriões, e se estendem das proximidades do ovário até a união com o útero.
Três regiões são claramente distinguidas: infundíbulo, ampola e istmo. O infundíbulo tem
forma de funil e é a região que está mais perto do ovário, possui as fímbrias e faz a captação
do ovócito após a ovulação (1, 2). A ampola é uma região que inicia após o infundíbulo e se
limita até o istmo, o qual finaliza na junção útero-tubárica (2). A ampola está envolvida no
transporte do ovócito e a fertilização. Por outro lado, o istmo é responsável por capacitação
dos espermatozoides e transporte do embrião até o útero (3). Desde o descobrimento do
oviduto por Gabriele Falloppio em 1561 e até a década de 1900, acreditava-se que este era
simplesmente uma via para a passagem do espermatozoide e do embrião, sem funções
metabólicas ou fisiológicas (4). No entanto, atualmente é conhecido que o oviduto
desempenha um papel importante na formação de reservatórios de espermatozoides, na
capacitação espermática (5, 6), na fertilização (7) e no desenvolvimento embrionário precoce
(3, 8).
O oviduto é revestido por um epitélio luminal que contém dois tipos de células: ciliadas
e não ciliadas ou secretoras (9). As secreções destas células disponibilizam ao ovócito e ao
embrião, nutrientes (substratos energéticos, ions e aminoácidos) e fatores de crescimento,
que são necessários para o desenvolvimento destas estruturas (10). O conteúdo das secreções
pode ser modulado pela ação dos hormônios sexuais: estradiol (E2) e progesterona ([P4]; (3),
como evidenciado pelo aumento de volume do oviduto em torno da ovulação e redução
durante a fase luteal (11, 12).
Em bovinos, as concentrações circulantes de E2 durante o proestro-estro e de P4
durante o metaestro-diestro estão associadas positivamente com a probabilidade de sucesso
de gestação (13-15). Por exemplo, a suplementação de P4 durante os primeiros dias do diestro
regula a expressão gênica do endométrio e favorece o maior crescimento do concepto (1618). Em trabalhos recentes do nosso grupo de pesquisa, foi testado um modelo experimental
no qual, usando protocolos de sincronização de cio, dois grupos de animais foram obtidos:
vacas que ovularam um folículo maior e formaram um corpo lúteo maior (FG-CLG) e,
consequente tinham maiores concentrações de E2 no estro e P4 no diestro inicial; e vacas que
ovularam um folículo de menor diâmetro formando um CL menor (FP-CLP) com menores
concentrações de E2 e de P4. Usando este modelo, foi determinado que as vacas do grupo
FG-CLG, tem uma expressão gênica endometrial diferenciada (19, 20) e uma maior taxa de
concepção (Pugliesi et al 2014; dados não publicados), quando comparadas com as vacas do
grupo FP-CLP.
No presente estudo, objetivamos avaliar se, estas mudanças nas concentrações de E2 e
P4 nos grupos FG-CLG e FP-CLP expostas acima, modificam a expressão gênica no oviduto.
Para isto, utilizamos a metodologia do sequenciamento de RNA (RNAseq) para a obtenção
do transcriptoma da ampola. O transcriptoma constitui os RNA mensageiros (mRNA) que se
encontram dentro do tecido, ou seja, as moléculas que levam a informação dos genes para a
tradução em proteínas.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido na Universidade de São Paulo, no campus Pirassununga.
Vacas multíparas e não-lactantes (n=41), da raça Nelore (Bos indicus), com condição
corporal entre 3 e 4 (0=magro, 5=obeso), foram utilizadas. As vacas foram mantidas em
sistema de pastejo extensivo (Brachiaria brizantha), e com sal mineral e água ad libitum. Os
animais foram aleatoriamente distribuídos em dois grupos e submetidos a um protocolo de
sincronização de cio a base de P4/E2. As vacas receberam um dispositivo intravaginal de
liberação de P4 (1g, Sincrogest, Ouro Fino Saúde Animal, Cravinhos, SP) e 2 mg de benzoato
de E2 (BE; Sincrodiol, Ouro Fino Saúde Animal) foi aplicado por via intramuscular (im). Os
animais do grupo FG-CLG, receberam um tratamento adicional com análogo de
prostaglandina F2α (PGF2α; cloprostenol sódico; Sincrocio, Ouro Fino Saúde Animal) por
via im no dia da inserção do dispositivo. O dispositivo foi removido 8,25 ou 8,75 dias após
sua inserção nos grupos FG-CLG e FP-CLP, respectivamente. Estas duas mudanças visaram
permitir: 1) o desenvolvimento folicular em um ambiente de baixa P4 pela aplicação
adicional de uma dose de PGF2α no momento da inserção do dispositivo no grupo FG-CLG;
e 2) propiciar maior tempo para o crescimento do folículo pré-ovulatorio durante o proestro.
Um análogo de GnRH (10 µg; acetato de buserelina, Sincroforte, Ouro Fino Saúde Animal)
foi administrado via im no Dia 0 para a indução da ovulação. Os animais foram abatidos no
dia 4 (Dia 0 = tratamento com GnRH). Amostras de sangue para a mensuração de das
concentrações circulantes de P4 foram colhidas diariamente entre os Dias 0 e 4, e amostras
de tecido do oviduto ipsolateral ao corpo lúteo e de duas regiões (ampola e istmo) foram
obtidas logo após ao abate.
A técnica de radioimunoensaio foi utilizada para mensurar as concentrações
plasmáticas de E2 no Dia 0 e P4 no Dia 4. Nas amostras de ampola e istmo, realizou-se
extração de RNA total. Três amostras por grupo foram selecionadas para a determinação do
transcriptoma da ampola; empregou-se 1 μg de RNA total e o protocolo TruSeq da Illumina
Technologies (San Diego, CA). As amostras foram sequenciadas na plataforma Illumina
HiSeq 2000. Posteriormente, análises de bioinformática foram realizadas para identificar os
transcritos e sua abundância. Finalmente, sete amostras por grupo foram usadas na validação
dos resultados do sequenciamento pela técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR),
metodologia que permite avaliar a expressão de genes individuas pela quantificação relativa
do número de transcritos para este determinado gene.
RESULTADOS
O modelo experimental comprovadamente resultou em um folículo pré-ovulátorio
maior (15,70 ± 0,43 mm vs. 11,31 ± 0,23 mm; P<0,01) e maiores contrações de estradiol no
Dia -1 (2,44 ± 0,19 pg/ml vs. 0,65 ± 0,15 pg/ml; P<0,01) no grupo FG-CLG quando
comparado com os animais do grupo FP-CLP. Além disso, no Dia 4 as vacas do grupo FGCLG apresentaram maior área do CL (1,39 ± 0,08 mm2 vs. 1,02 ± 0,09 mm2; P<0,01) e
maiores concentrações plasmáticas de P4 (1,40 ± 0,23 ng/ml vs. 0,80 ± 0,10 ng/ml;P<0,01).
O resultado do RNAseq revelou que 190 genes foram diferencialmente expressos entre
os dois grupos (P<0,05), sendo que 114 foram mais expressos no grupo FG-CLG e 76 mais
expressos no grupo FP-CLP. A diferença na abundância dos genes foi claramente indicada
pela expressão individual de cada gene na representação gráfica “Heat-Map”.
Através da análise de ontologia gênica, na qual os genes são agrupados de acordo com
sua função, identificou-se no grupo FG-CLG maior atividade de vias funcionais relacionadas
à: 1) resposta imune; 2) remodelamento de matriz extracelular; 3) complexo proteicolipídico; e 4) vacúolos. Por outro lado, as principais vias no grupo FP-CLP estavam
relacionadas com 1) complexo de canais de íons e cátions; 2) membrana plasmática; e 3).
Aparelho de Golgi. Pela técnica de qRT-PCR foi estudada a expressão de 22 genes de
interesse (receptores de esteroides, proteínas de choque térmico, catepsina S, lipoproteína
lipase e componentes da matriz extra-celular). Dos genes avaliados, 95% exibiram o mesmo
perfil de expressão do RNAseq.
Figura 1: “Heat-Map” construído pelo agrupamento dos 40 genes mais diferencialmente
expressos entre os grupos FG-CLG e FP-CLP. As cores do mapa mostram o nível de
expressão relativa dos genes. A cor verde indica um valor de expressão que é menor do que
o valor médio da média, enquanto que a cor vermelha indica um valor de expressão mais
elevada do que a média. Os tons da cor indicam o quão longe estão os dados do valor da
média. As colunas representam amostras individuais de FG-CLG e FP-CLP.
Tabela 1: Categorias e termos de ontologia gênica dos transcritos diferencialmente expressos
em amostras de ampola no Dia 4 após a indução da ovulação.
Número
Fold
Termo
de genes P
Enrichment
Membrana plasmática
10
< 0,01
2,94
FP-CLP Função molecular Atividade do canal de potássio 3
0,02
13,11
FP-CLP Comp. Celular
4
0,05
3,76
16
< 0,01
4,70
Resposta imune
13
< 0,01
3,78
FG-CLG biológico
Ativação de células
7
< 0,01
4,78
FG-CLG Comp. Celular
Espaço extracelular
10
< 0,01
3,11
FG-CLG Comp. Celular
Complexo proteico-lipídico
3
0,02
12,44
FG-CLG Função molecular Ligação de carboidratos
6
0,03
3,41
FG-CLG Comp. Celular
Vacúolo
5
0,04
3,84
Adesão celular
8
0,06
2,23
Grupo
Categoria
FP-CLP Comp. celular
Aparelho de Golgi
FG-CLG Função molecular Ligação ao GTP
Processo
FG-CLG biológico
Processo
Processo
FG-CLG biológico
DISCUSSÃO
O oviduto fornece o ambiente ideal para o transporte de oócitos, fertilização e
desenvolvimento embrionário inicial. Este ambiente é regulado pelos esteroides sexuais.
Diante desta importância fisiológica, objetivou-se com o presente estudo investigar o efeito
de diferentes ambientes endócrinos peri-ovulatórios no transcriptoma da ampola, utilizando
um modelo experimental já consolidado (19, 21, 22), baseado no maior ou menor
crescimento do folículo dominante, e consequentemente maior ou menor desenvolvimento
do corpo lúteo resultante. Verificamos, pela primeira vez, que o ambiente endócrino peri-
ovulatório, modificado pelo crescimento e ovulação de folículos de tamanho diferentes,
mudou o transcriptoma da região da ampola no Dia 4 após a indução da ovulação, momento
em que o embrião ainda não ingressou ao útero e depende das secreções do oviduto para sua
nutrição e desenvolvimento.
Estas alterações na expressão gênica resultaram aparentemente de uma associação das
diferentes concentrações de E2 e P4 em torno da ovulação e da distribuição dos seus
receptores no tecido. A maior abundância de mRNA para vias relacionadas com a secreção
tubárica no grupo FG-CLG, pode estar relacionado com uma maior probabilidade de
sobrevivência embrionária, como indicado pela maior fertilidade de vacas de corte que
ovulam folículos maiores e possuem mais P4 circulante no diestro (15). O enriquecimento
funcional das vias associadas com a resposta imunológica, de matriz celular e as funções do
vacúolo pode estar envolvido com maior fertilidade do grupo FG-CLG. Entretanto, estudos
futuros são necessários para esclarecer as vias moleculares envolvidas em cada região do
oviduto em resposta ao níveis ótimos de E2 e P4, e para verificar como a associação entre
esses fatores aumenta a probabilidade de gestação. A determinação do padrão de genes
fundamentais para a funcionalidade do oviduto se constituiu um fator importante para
compreensão do ambiente tubárico ideal para o desenvolvimento embrionário precoce e para
otimização dos sistemas de produção in vitro de embriões.
Referencias:
1.
Getty R, Sisson S, Grossman JD. Anatomía de los animales domésticos:
Masson; 2002.
2.
Bacha WJ, Bacha LM. Color Atlas of Veterinary Histology. Third edition ed:
Wiley-blackwell. ; 2012.
3.
Saint-Dizier M, Sandra O, Ployart S, Chebrout M, Constant F. Expression of
nuclear progesterone receptor and progesterone receptor membrane components 1 and 2 in
the oviduct of cyclic and pregnant cows during the post-ovulation period. Reproductive
Biology and Endocrinology. 2012;10: 76.
4.
Brower L, Anderson E. Cytological Events Associated with the Secretory
Process in the Rabbit Oviduct. Biology of Reproduction. 1969; 1(2): 130-48.
5.
Boilard M, Reyes-Moreno C, Lachance C, Massicotte L, Bailey JL, Sirard
MA, et al. Localization of the chaperone proteins GRP78 and HSP60 on the luminal surface
of bovine oviduct epithelial cells and their association with spermatozoa. Biology of
Reproduction. 2004;71(6):1879-89.
6.
Lachance C, Bailey JL, Leclerc P. Expression of Hsp60 and Grp78 in the
human endometrium and oviduct, and their effect on sperm functions. Human Reproduction.
2007;22(10):2606-14.
7.
Caballero JN, Gervasi MG, Veiga MF, Dalvit GC, Perez-Martínez S, Cetica
PD, et al. Epithelial cadherin is present in bovine oviduct epithelial cells and gametes, and is
involved in fertilization-related events. Theriogenology. 2014;81(9): 1189-206.
8.
Lai YM, Wang HS, Lee CL, Lee JD, Huang HY, Chang FH, et al. Insulin-like
growth factor-binding proteins produced by Vero cells, human oviductal cells and human
endometrial cells, and the role of insulin-like growth factor-binding protein-3 in mouse
embryo co-culture systems. Human Reproduction. 1996;11(6):1281-6.
9.
Eriksen T, Terkelsen O, Hyttel P, Greve T. Ultrastructural features of
secretory-cells in the bovine oviduct epithelium. Anatomy and Embryology.
1994;190(6):583-90.
10.
Priedkalns J, Leiser R. Female Reproductive System. Dellmann’s Textbook
of veterinary histology Sixth edition ed: Blackwell publishing; 2006.
11.
Murray MK. Epithelial lining of the sheep ampulla oviduct undergoes
pregnancy-associated morphological-changes in secretory status and cell height. Biology of
Reproduction. 1995;53(3):653-63.
12.
Cigankova V, Krajnicakova H, Kokardova M, Tomajkova E. Morphological
changes in the ewe uterine tube (oviduct) epithelium during puerperium. Veterinarni
Medicina. 1996;41(11):339-46.
13.
Bridges GA, Mussard ML, Burke CR, Day ML. Influence of the length of
proestrus on fertility and endocrine function in female cattle. Animal Reproduction Science.
2010;117(3-4):208-15.
14.
Bridges GA, Mussard ML, Pate JL, Ott TL, Hansen TR, Day ML. Impact of
preovulatory estradiol concentrations on conceptus development and uterine gene
expression. Animal Reproduction Science. 2012;133(1-2):16-26.
15.
Peres RFG, Claro Junior I, Sa Filho OG, Nogueira GP, Vasconcelos JLM.
Strategies to improve fertility in Bos indicus postpubertal heifers and nonlactating cows
submitted to fixed-time artificial insemination. Theriogenology. 2009;72(5):681-9.
16.
Forde N, Beltman ME, Duffy GB, Duffy P, Mehta JP, O'Gaora P, et al.
Changes in the Endometrial Transcriptome During the Bovine Estrous Cycle: Effect of Low
Circulating Progesterone and Consequences for Conceptus Elongation. Biology of
Reproduction. 2011;84(2):266-78.
17.
Forde N, Mehta JP, McGettigan PA, Mamo S, Bazer FW, Spencer TE, et al.
Alterations in expression of endometrial genes coding for proteins secreted into the uterine
lumen during conceptus elongation in cattle. Bmc Genomics. 2013;14:321.
18.
Shimizu T, Krebs S, Bauersachs S, Blum H, Wolf E, Miyamoto A. Actions
and interactions of progesterone and estrogen on transcriptome profiles of the bovine
endometrium. Physiological Genomics. 2010;42A(4):290-300.
19.
Mesquita F, Pugliesi G, Scolari S, França M, Ramos R, Oliveira M, et al.
Manipulation of the periovulatory sex-steroidal milieu affects endometrial but not luteal gene
expression on early diestrus Nelore cows. Theriogenology. 2014;81(6):861-9.
20.
Mesquita FA, Silva Andrade SC, Gasparin G, Coutinho L, Binelli M. Nextgeneration sequencing transcript profile of endometrium in response to distinct periovulatory hormone milieu in Nelore Cows (Bos indicus). Proceedings of the SSR's 46th
Annual Meeting. Montreal, Quebec. 2013. p. 228.
21.
Ramos RdS, Mesquita FS, D'Alexandri FL, Gonella‐Diaza AM, Papa PdC,
Binelli M. Regulation of the polyamine metabolic pathway in the endometrium of cows
during early diestrus. Molecular reproduction and development. 2014;81(7):584-94.
22.
França M, Mesquita F, Lopes E, Pugliesi G, Van Hoeck V, Chiaratti M, et al.
Modulation of Periovulatory Endocrine Profiles in Beef Cows: Consequences For
Endometrial Glucose Transporters and Uterine Fluid Glucose Levels. Domestic Animal
Endocrinology. 2014;(Accepted manuscript). DOI: 10.1016/j.domaniend.2014.09.005.